JP2008054691A - 顆粒状微生物バイオマスの製造法とそのバイオマスからの貴重化合物の単離法 - Google Patents

Abstract

【課題】微生物バイオマスから目的の化合物を単離する方法の提供
【解決手段】微生物バイオマスから目的の化合物を単離する方法が開示されている。この方法では、微生物バイオマス（必要であれば乾物含量が２５〜８０％になるよう前処理する）が（例えば押出などによって）顆粒状にされた後、乾物含量が少なくとも８０％になるように乾燥される。バイオマスの顆粒への造粒は、その後に行われるそのバイオマスの乾燥をかなり容易にし（これは乾燥顆粒として保存できる）、その化合物の抽出時により高い収量を与える。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は微生物バイオマス（一般に発酵によって生じる微生物含有産物）の処理法であって、生成したバイオマスからの有用または貴重化合物の単離が改善されうる方法に関する。この方法は、化合物の回収前にバイオマスを（例えば押出によって）顆粒状にすることを伴いうる。

発明の背景
このところ微生物は多種多様な産物の貴重な供給源として知られている。これらの微生物産物のいくつかはその微生物細胞の内部に存在し、あるいはその微生物細胞と結合している。このような産物を比較的純粋な形で回収するには、その産物を微生物バイオマスから分離する必要がある。例えば、微生物バイオマスから親油性化合物を単離するには、通常、有機溶媒や超臨界流体（例えば液体ＣＯ₂）による抽出（浸出）処置が行われる。

バイオマスは発酵によって生じ、生成物の抽出に使用することができる。通常これは湿った細胞塊であるが、様々な前処理によってかなりの細胞破壊が起こる。細胞破壊は物理的処理（例：噴霧乾燥や凍結乾燥などの乾燥）および／または機械的破砕（均質化や粉砕などによるもの）、化学的処理（酸またはアルカリ）または酵素的処理によって起こりうる。バイオマスの乾燥は溶媒の量を減らすために望ましく、また親油性化合物を抽出する場合は、面倒なエマルジョンを防ぐためにも望ましい。

抽出準備が整ったバイオマスを得るには、通常、噴霧乾燥が使用される。噴霧乾燥機による乾燥には、次の条件が必要である：乾燥機に投入するには、バイオマスが（濃縮された）液体であるか、（ディスクまたはノズルによる噴霧が可能なように）小さな粒子を持つスラリーであるべきである。これは、微生物バイオマスに関して、スラリーの最大乾物含量が約２０〜３０％に制限され、次の乾燥段階で９０〜９５％の乾物含量にするには比較的費用がかかってしまうということを意味する。

噴霧乾燥工程は時間的には比較的短いが、製品温度はほとんどの場合（比較的）高い。これは高度な酸化とそれに伴って酸化感受性化合物が分解する危険があることを意味する。大量の細胞内脂質物質を含むバイオマスの場合、高温におけるバイオマスからの脂質の「滲出（ｓｗｅａｔｉｎｇ）」ゆえに、乾燥が困難なこともある。その場合は、乾燥機の汚損が起こるだろう。

噴霧乾燥のもう１つの欠点は、これが、目的化合物を単離するためにそれ以降に使用できる抽出工程のタイプをかなり制限するということである。例えば噴霧乾燥されたバイオマスなどの細粉品にパーコレーション抽出法を適用することは通常、不可能である。粉砕などによる微生物バイオマスの機械的破壊にも、大量の微粉（または粉塵）が生じるという同じ欠点がある。

英国特許ＧＢ １ ４６６ ８５３号（特許文献１）は、噴霧乾燥酵母粉末から油を単離するための方法に関する。酵母粉末は調理器具中、８０℃の蒸気で濡らされ、加熱される。次にその湿った粉末はペレット製造機に供給され、ペレットに変換され、フレーク化され、水分を５〜１０重量％に減らすために再び乾燥される。次に、得られたフレークはふるいにかけられ、それはペレット製造機に再利用された。この物質はパーコレーション抽出に適していた。しかしこの方法は、いったん噴霧乾燥した粉末を再水和し、高温で処理し、次に再乾燥する必要があるという点で不利である。熱および／または酸化感受性化合物の場合、このような有害な処理段階は分解を招き、したがって収量が低くなる。

国際特許出願ＷＯ−Ａ−９４／２５６４４号パンフレット（ＵＳ ５，５３９，１３３に相当）（特許文献２）は、大型藻類および／または微小藻類（海藻の一種）から多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の含量が高い脂質を単離する方法（その際、その大型藻類はアルギナート抽出やカラギーナン抽出の残渣であってもよい）に言及している。藻類から得られる物質は５０ｍｍ未満の粒子サイズと５０％を超える乾物含量を持つ。指示された値よりも大きい粒子サイズおよび／または低い乾物含量を持つ藻類物質の場合は、その物質を粉砕および／または乾燥によって前処理する必要がある。しかし、上述のように粉砕は効率のよい抽出と精製工程には不利である。

ＤＤ−Ａ−１５０６２７号（特許文献３）は、乾燥した後、大きな顆粒（８〜１２ｍｍ，外観は球状）にされる酵母（または細菌）含有バイオマスの製造に言及している。これらは２０％の水分含量を持ち、次いで粉砕される。微生物の炭素源として使用された不要なディーゼル（または炭化水素）を回収するために、石油エーテルによる抽出が行われる。残った残渣は動物飼料として使用される。

ＤＥ−Ａ−１９２３５２９号（特許文献４）は、蒸発操作を施した後、流動床での乾燥によって造粒されるバイオマスに言及している。次にこれらは粉砕もしくは破砕される。次に（汚染物質としての）残油が抽出される。先の文書と同じく、抽出される物質は不純物であって、そのバイオマスに含まれる微生物によって産生されるものではない。

ＥＰ−Ａ−０３２２２２７号（特許文献５）は、微生物にゴマ油を供給することによってアラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノール酸（ＧＬＡ）を生産する方法に言及している。

米国特許第５，３４０，５９４号（特許文献６）は、菌類からの高度不飽和脂肪酸の生産法に言及している。このバイオマスはトウモロコシ粉と混合して、得られた製品を動物飼料として使用することができる。

ＷＯ−Ａ−９２／１２７１１号パンフレット（特許文献７）は、微生物油の混合物、とくに乳児用調製粉乳の添加物として利用されるものに言及している。そのバイオマスは、濾過器で濾過および圧搾して濾過ケーキにした後、凍結乾燥される。

本発明は、先行技術に存在する問題点の一部または全部を解決しうる、バイオマスからの目的化合物の抽出法を提供しようとするものである。
英国特許ＧＢ １ ４６６ ８５３号 国際特許出願ＷＯ−Ａ−９４／２５６４４号パンフレット ＤＤ−Ａ−１５０６２７号 ＤＥ−Ａ−１９２３５２９号 ＥＰ−Ａ−０３２２２２７号 米国特許第５，３４０，５９４号 ＷＯ−Ａ−９２／１２７１１号パンフレット

微生物バイオマス（一般に発酵によって生じる微生物含有産物）の処理法であって、生成したバイオマスからの有用または貴重化合物の単離が改善されうる方法の提供。

本発明の第一の側面によれば、１種類またはそれ以上の化合物を、それら化合物の１つを産生した微生物を含む微生物バイオマスから単離する方法であって、次の段階を含む方法が提供される：
ａ） ２５％から８０％までの乾物含量を持つバイオマスを用意または入手する；
ｂ） そのバイオマスを２５％から８０％までの平均乾物含量を持つ顆粒状粒子に造粒する；
ｃ） その顆粒状粒子を乾燥して、少なくとも８０％の平均乾物含量を持つ乾燥顆粒を生産する；
ｄ） （ｃ）で得た乾燥顆粒からその化合物または各化合物を精製、抽出または単離する。

本発明の第二の側面によれば、バイオマスの顆粒状粒子を含む組成物であって、その粒子が少なくとも３０％でしかも７０％未満の平均乾物含量を持ち、かつ、バイオマスを顆粒状にすることによって得られたものである組成物が提供される。このような顆粒は、第一の側面の方法を用いて、その造粒段階（ｂ）から得ることができる。

本発明の第三の側面によれば、乾燥顆粒を含む組成物であって、その顆粒が微生物バイオマスに由来し、少なくとも８０％の（平均）乾物含量を持つものが提供される。これらの顆粒は、第一の側面の方法を用いて、その乾燥段階（ｃ）後に得ることができる。このような組成物は、バイオマスのとりわけ安定な形態であることがわかった。これは（たとえば室温で）何年間もではないとしても、何週間もの間、分解またはその特性の変化をほとんどまたは全く伴わずに保存することができる。これは、それが含有する化合物もまた、安定に保存（もしくは輸送）されうることを意味する。さらに、これは室温で保存することができるので、先行技術のバイオマス材料のように凍結したり、とりわけ低温に保存する必要がなくなる。このような安定性は、貯蔵条件がかなり安価なものになるので、明らかに有利である。

本発明の第四の側面は、バイオマスの顆粒から１種類またはそれ以上の化合物を単離する方法であって、次の段階を含む方法に関する：
ａ） 少なくとも８０％の乾物含量を持つ乾燥顆粒を用意する。ただしその顆粒は上記化合物を産生した微生物を含む微生物バイオマスから得られたものである；
ｂ） その乾燥顆粒から溶媒抽出によってその化合物または各化合物を抽出もしくは単離する。

微生物バイオマス（一般に発酵によって生じる微生物含有産物）の処理法であって、生成したバイオマスからの有用または貴重化合物の単離が改善されうる方法を提供することができる。

発明の説明
本発明の第一の側面によれば、１種類またはそれ以上の化合物を、それら化合物の１つを産生した微生物を含む微生物バイオマスから単離する方法であって、次の段階を含む方法が提供される：
ａ） ２５％から８０％までの乾物含量を持つバイオマスを用意または入手する；
ｂ） そのバイオマスを２５％から８０％までの平均乾物含量を持つ顆粒状粒子に造粒する；
ｃ） その顆粒状粒子を乾燥して、少なくとも８０％の平均乾物含量を持つ乾燥顆粒を生産する；
ｄ） （ｃ）で得た乾燥顆粒からその化合物または各化合物を精製、抽出または単離する。

驚くべきことに、バイオマスの乾燥顆粒を使用することにより、予想以上に高い単離すべき化合物の収量を達成できることがわかった。これは、その顆粒の構造が抽出に使用される溶媒の接触を最大限にしうるからだと思われる。もちろん、粒子が大きすぎると表面積が低下し、それに相応して収量が低下するだろう。しかし粒子は小さすぎてもいけない。さもなければ、それらは抽出中に使用するフィルターを詰まらせるだろう。そのため本発明の方法は、摩砕、フレーク化または粉砕する処置もしくは段階を含まない。

様々な段階における水分含量も収量に影響を及ぼしうる。乾物含量が高すぎるとバイオマスが砕け、濾過抽出法を使用する場合に不都合な微粉または粉塵を形成しうる。しかし水分含量が高すぎると、湿り過ぎていて顆粒にできないスラリーが得られる。

物質を顆粒状にする工程は当技術分野ではよく知られている。しかし、それらはどこかの段階で摩砕またはフレーク化と組み合わされることが多く、それらには上述のような不都合がある。本発明では、化合物の抽出に使用されるのは乾燥顆粒であって、粉砕型やフレーク型ではない。また造粒により、バイオマス中の細胞に与える損傷を最小限に抑えることができ、これもまた化合物の収量の増加を助長しうる。ＵＳ ５，３４０，５９４には、バイオマスの押出が開示されているが、そこでは押出成形品が動物飼料として使用されており、顆粒材がその顆粒材から特定化合物を抽出する際に高い収量を与えるだろうということは認識されていない。

バイオマスを顆粒状粒子に加工することにより、乾燥工程を援助することができる。バイオマスを顆粒型に加工しておくと、乾燥がかなり容易になり、効率も向上しうる。

また、乾燥顆粒は（とくに周囲温度または室温で）とりわけ安定であることもわかった。バイオマスはこの形態で、分解することなく、かなり長期間保存して置くことができる。理論に制約されることは望まないが、これは、化合物が顆粒の内部にあるので、ある種の化合物にとって酸化による分解の原因となりうる環境から少なくとも部分的には保護されるためだと思われる。

本発明の第二の側面によれば、バイオマスの顆粒状粒子を含む組成物であって、その粒子が少なくとも３０％でしかも７０％未満の平均乾物含量を持ち、かつ、バイオマスを顆粒状にすることによって得られたものである組成物が提供される。このような顆粒は、第一の側面の方法を用いて、その造粒段階（ｂ）から得ることができる。

本発明の第三の側面によれば、乾燥顆粒を含む組成物であって、その顆粒が微生物バイオマスに由来し、少なくとも８０％の（平均）乾物含量を持つものが提供される。これらの顆粒は、第一の側面の方法を用いて、その乾燥段階（ｃ）後に得ることができる。このような組成物は、バイオマスのとりわけ安定な形態であることがわかった。これは（たとえば室温で）何年間もではないとしても、何週間もの間、分解またはその特性の変化をほとんどまたは全く伴わずに保存することができる。これは、それが含有する化合物もまた、安定に保存（もしくは輸送）されうることを意味する。さらに、これは室温で保存することができるので、先行技術のバイオマス材料のように凍結したり、とりわけ低温に保存する必要がなくなる。このような安定性は、貯蔵条件がかなり安価なものになるので、明らかに有利である。

好ましいバイオマス造粒法は押出による方法である。これは細胞の破壊を最小限に抑えることができる。バイオマスの安定性は、細胞の破壊が最小限であると向上することがわかった。言い換えると、無傷のままの細胞の数が最適となるように本発明の方法を適応させることができる。これは、化合物を単離するために細胞が破壊される数多くの先行技術の押出とは対照的である。

本発明の第四の側面は、バイオマスの顆粒から１種類またはそれ以上の化合物を単離する方法であって、次の段階を含む方法に関する：
ａ） 少なくとも８０％の乾物含量を持つ乾燥顆粒を用意する。ただしその顆粒は上記化合物を産生した微生物を含む微生物バイオマスから得られたものである；
ｂ） その乾燥顆粒から溶媒抽出によってその化合物または各化合物を抽出もしくは単離する。

好ましい抽出法では、その化合物が適当に溶解する溶媒が使用される。好ましい抽出法はパーコレーションの使用である。この場合、溶媒は顆粒のベッドを通過することができる。この方法の場合、粒子が小さすぎてはならない（例えば粒子を摩砕または粉砕すべきでない）ことは理解されるだろう。そうでなければ「粉塵」（または微粉）が多くなり過ぎて、それらがフィルターを詰まらせることになる。大きい粒子も避けるべきであるが、これら両極端の間で、好ましくは顆粒がフィルターの細孔よりも大きくなるように最適な表面積を得ることができる。粒子は好ましくは、抽出すべき化合物に溶媒が容易に接触できるように高い多孔性を持つ。

本発明では、顆粒状粒子を作るための微生物バイオマスケーキの前処理により、以降の乾燥工程が有意に改善されうる。これによって得られる乾燥顆粒状バイオマスは、浸漬またはパーコレーション抽出にとりわけ適しうる。粒子サイズは、最適な乾燥および抽出条件に合わせて個別に調節することができる。本発明に従って前処理されたバイオマスを使用することにより、抽出に先立って細胞を破壊する必要なく、目的の化合物が有利に抽出される。

本発明の方法は、ほとんどどのタイプの微生物からでも、顆粒状粒子または乾燥顆粒の調製に使用することができる。微生物は菌類やある種の細菌のように糸状型であってもよいし、酵母、藻類および細菌のように単細胞型であってもよい。したがってバイオマスには、酵母、菌類、細菌または藻類である微生物が含まれうる。好ましい菌類はケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）のものである。例えば菌類は、クサレケカビ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ヒゲカビ属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）またはコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のものであってもよい。好ましい菌類はモルティエレラ・アルピナ種（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、ブラケスレア・トリスポラ種（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）およびアスペルギルス・テレウス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）のものである。

酵母に関する限りは、ピチア・シフェリイ種（Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ）などのピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）のものが好ましい。

細菌はプロピオン酸菌属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のものであってもよい。

バイオマスが藻類を含む場合、それは渦鞭毛藻類であり、かつ／または、クリプセコジニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）に属することが好ましい。好ましい藻類はクリプセコジニウム・コーニイ種（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）のものである。

本発明に従って調製された微生物バイオマスから単離すべき化合物は、細胞内にあってもよいし、細胞膜または細胞壁と結合していてもよく、細胞外に産生されてもよい（その後、水に不溶性になってもよい）。

単離されるべき化合物は親水性であっても、疎水性（例えば親油性）であってもよい。そのような化合物の例は、細胞内タンパク質または酵素、脂質、ビタミン類（例えばビタミンＢ₁₂）、マクロライド系抗生物質またはポリエン系抗生物質のような二次代謝産物、着香性物質またはカロチノイドである。微生物バイオマスから単離されるべき化合物は、好ましくは親油性化合物である。

本発明に従って処理されるバイオマスから抽出される化合物は高い品質を持ちうる。というのは、その処理工程には温和な条件が使用されるので、それらは（たとえあったとしても）ほんのわずかな変質しかしないからである。したがって本発明は、熱および／または酸化感受性化合物をそこから単離する必要がある微生物バイオマスの製造にとりわけ適している。

本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含有する脂質などの高い不飽和度を持つ化合物を単離するための微生物バイオマスの製造に適している。そのＰＵＦＡは、好ましくはＣ１８、Ｃ２０またはＣ２２ω−３またはω−６多価不飽和脂肪酸である。例えばその化合物は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（渦鞭毛藻類クリプセコジニウムや菌類ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）などの藻類または菌類から単離）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸またはアラキドン酸（ＡＲＡ）（クサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、フハイカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）またはハエカビ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）などの菌類から単離）、またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）（チノリモ（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ）やササノハケイソウ／ハリケイソウ（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）などの藻類から単離）でありうる。これらのＰＵＦＡはそれだけを単離することもできるし、より一般的には脂質の形で単離することができる。

本発明に従って単離することができる化合物のさらなる例には、例えばケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）の菌類属（例：ヒゲカビ属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ））から単離されるようなβ−カロチン、酵母ファフィア・ロドチマ（Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）から単離されるアスタキサンチン、酵母ピチア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｆｅｒｒｉｉ）から単離されるテトラアセチルフィトスフィンゴシン（ＴＡＰＳ）および／またはプロピオン酸菌から単離されるビタミンＢ１２がある。

抽出されうる他の化合物には、ロバスタチン、シクロスポリンおよびライドロマイシン（ｌａｉｄｌｏｍｙｃｉｎ）などの親油性／無極性化合物がある。これらのうち最初の２つは、細胞外に産生されるか、細胞壁に結合する。したがって好適な溶媒には、ヘプタン、ヘキサン、アセトン、メタノールおよびトルエン、およびエタノールがある。しかし後者の２化合物については、シクロスポリンにはイソプロピルアルコールまたは酢酸ブチルを、ライドロマイシンにはエタノールまたはメタノールを使用することができる。一般的に言って、ヘキサンは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属の生物が産生するような無極性抗生物質に適している。

その他の化合物には、多くの抗生物質を含むポリケチドやポリケチド由来の代謝産物がある。好ましいポリケチドは窒素を含有しないものであって、好ましくは少なくとも１つの６員環を含有する芳香族であってもよい。好ましいポリケチドは、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチンおよびコンパクチン（ｃｏｍｐａｃｔｉｎ）を含むスタチン類（ｓｔａｔｉｎｓ）である。その他の好ましい化合物はＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子類である。これらは血中コレステロールレベルを減少させることができる。

抽出されうるもう１つの化合物群として、エルゴステロールなどのステロイド類がある。これらは酵母とカビによって産生される。

本発明の方法は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含有脂質および／またはカロチノイドなどの親油性化合物の単離にとりわけ適している。

本発明の方法に従って単離される化合物は、人間または動物の食品（例：乳児用調製粉乳）または他の食用組成物、および化粧品、健康管理用の組成物または補給品、または医薬組成物での使用に適している。

本発明の方法では、後に行なう化合物の抽出に十分な量のバイオマスを得るために、まず選択した微生物を発酵させる。発酵条件は使用する生物に依存し、得られるバイオマス中の化合物の含量が高くなるように最適化することができる。

好適な発酵条件は、比較例２６に記載する。

この発酵工程が終了した後、単離しようとする化合物のタイプに応じて、産生生物を殺し、望ましくない酵素を失活させるために、その発酵液を低温殺菌することができる。所望であれば、濾過性を向上させるために、凝集剤および／またはその他の処理助剤を培養液に加えてもよい。

好適な凝集剤には、ＣａＣｌ₂、Ａｌ₂（ＳＯ₄）₃および極性陽イオンポリアミド類がある。これらは０．１〜２重量％の濃度で存在しうる。

好ましくはバイオマス（または培養液）を低温殺菌する。衛生的に処理できるスラリーを得るには、発酵後に低温殺菌が必要かもしれない。発酵槽内でのバイオマスの低温殺菌はいくつかの利点を持ちうる。第一に、産生生物が環境にさらされることがない。また、目的化合物の品質に影響を与える有害な酵素活性が不活化されうる。

産生生物の種に依存して、低温殺菌は６０〜１００℃の温度で行なわれる。低温殺菌は、発酵槽内への蒸気で（直接）加熱するか、熱交換器により、壁を通してまたは冷却コイルを使って、あるいは既知のプレート熱交換器などの外部熱交換器もしくはその他の適当な熱交換器によって、媒体を用いて（間接的に）加熱することにより達成できる。

クサレケカビ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）の生物についてはとくに、次に挙げる好ましい低温殺菌条件を使用することができる。

微生物を殺し、酵素活性を失活させるために、発酵液（またはバイオマス）を低温殺菌する。これは主発酵槽の接種の約１４４時間後に行なうことができる。バイオマス（または培養液）は５０〜９５℃、好ましくは６０〜７５℃、最適には６３〜６８℃で、好適に低温殺菌される。これは３０〜９０分間、好ましくは５０〜７５分間、最適には５５〜６５分間行なうことができる。これは任意の好適な加熱手段で行なうことができるが、好ましくは主発酵槽中などに直接蒸気を注入することによって行なわれる。

低温殺菌の後、培養液を放冷するか、冷却する。これは好ましくは約２５℃まで、約４時間を要しうる。

異なるバイオマスまたは発酵液に由来する２種類以上の生物が含まれる場合は、各バイオマス（または培養液）を個別に低温殺菌するか、それらを混合してから低温殺菌することができる。しかし、異なる生物に異なる低温殺菌条件を使用できるので、前者が好ましい。

通常、低温殺菌は、発酵が起こった発酵槽中で行われるだろう。しかしいくつかの生物（細菌など）については、微生物をまず発酵槽から取り出してから（例えば凝集造粒工程で噴霧乾燥する前に）低温殺菌することが、しばしば好ましい。

一般的に言って低温殺菌は有利である。なぜなら、それは微生物を殺しうるばかりでなく、さらに重要なことに、化合物に有害な影響を及ぼしうる１種類またはそれ以上の酵素を失活させうるからである。例えば低温殺菌は種々のリパーゼを失活させうる。これらは脂肪酸をトリグリセリド骨格から切り離しうる。これは高いトリグリセリド含量が好ましいＰＵＦＡには不都合である。

低温殺菌が通常、微生物の（全部ではないとしても）ほとんどを殺すことは、既に認識されている通りである。したがって乾燥顆粒では、微生物の少なくとも９５％（例えば９９％ではないとしても、少なくとも９８％）が殺されている（すなわち生きていない）。

いくつかの生物（例：ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））については、低温殺菌を行なわないことが好ましい。

低温殺菌されたバイオマスがその後の処理段階で再び汚染されるのを防止するため、増殖の危険が減少するように条件を設定することができる。一つの選択肢は、適当な酸で培養液を酸性化することである。多くの微生物種の増殖を防止するには、３〜４のｐＨ域と低い処理温度の併用で十分である。

アルコール類やソルビン酸塩などのようなその他の生物発育阻止剤も、この目的に使用できる。

熱的に安定な生成物については、より高い温度（６０〜１００℃）での処理を適用できる。

好ましい酸性化条件（例えばクサレケカビ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）の生物の場合）は次の通りである。

微生物学的な安定性を向上させるために、低温殺菌した培養液のｐＨを２〜５、好ましくは３〜４のｐＨ、最適には約３．５のｐＨに調節する。

（低温殺菌の前または後の）培養液の酸性化は、さらなる利点を持ちうる。その化合物がポリケチド（例えばスタチン）である場合、酸性化はその化合物の沈殿をもたらしうる。多くの化合物、特に水溶性の化合物については、水を除去するために培養液を濾過する際にその化合物が失われないように、さらなる処理段階の前に沈殿させることが望ましい。したがって低温殺菌の前または後に、酸性化など（ただし当業者に知られている他の任意の手段を使用することができる）によって化合物を沈殿させることができる。

ｐＨは８５％リン酸、好ましくは５５％希リン酸、最適には３３％希リン酸などの任意の適当な手段で調節することができる。

この段階で、低温殺菌されていてもよい培養液が得られる。次の段階では、微生物を周囲の媒質から分離することによってバイオマスを得る。

発酵液からバイオマスを分離するには、固液分離技術を実行することができる。その（収集された）バイオマスは、通常、微生物のタイプに依存して２０％から３５％までの範囲の乾物含量を持つ。しかし押出（とその後の乾燥）には、２５％から８０％までの範囲の乾物含量を持つべきである。

バイオマスの水分含量が（例えば押出および／またはその後の乾燥にとって）高すぎる場合は、それを脱水し、かつ／または、その乾物含量を増大させることができる。これはいくつかの方法で達成できる。第一に、バイオマスを（さらなる）脱水処置にかけることができる。当業者に知られている任意の脱水法を使用でき、望ましい乾物含量は２５または３０％から８０％まででありうる。

好ましくは機械的脱水法を使用する。しかし、機械的脱水によって到達されうる最大乾物含量は、微生物のタイプに依存して変動するだろう。ある種の微生物（例えば酵母）については、機械的脱水後のバイオマスの乾物含量は３５〜４０％のレベルを超えないだろうが、同じ処置をある種の高脂質微生物のバイオマスに施すと、４５〜６０％のより高い乾物含量になりうる。

好ましい方法は、固液分離を機械的脱水と併用することができ所望の乾物含量を得るのにとりわけ適している膜フィルタープレス（膜の圧搾を伴うろ板／枠型フィルタープレス（ｐｌａｔｅ ａｎｄ ｆｒａｍｅ ｆｉｌｔｅｒ ｐｒｅｓｓ））の使用である。

別法として、もしくは上記の方法に加えて、増粘（または乾燥）剤の添加によって、微生物バイオマスの望ましい乾物含量を増大させることもできる。これらの増粘剤は適度に乾燥しており、好ましくは抽出工程および／または化合物の特性に有害な干渉をしない。例えば増粘剤は、デンプンおよび／またはオート麦や小麦のふすまやセルロースなどといった植物繊維を含みうる。（より低い水分含量を持つ）もう１つのバイオマスを使用することもできる。このような物質は、それが押出性を改善するのであれば、どのように添加されてもよい。

例えば固液分離および／または機械的脱水の後などに、バイオマスは大きなケーキを形成する場合がある。これは造粒（例えば押出）には適さないだろう。バイオマスを造粒（例えば押出機の効率のよい給送）が可能なサイズまで小さくするには、バイオマスを適当に破砕、混練および／または混合する。この破砕および／または混練は、高剪断混合機での（短い）処理によって達成できる。任意に、増粘剤をこの工程で加えてもよい。

（破砕または混練されていてもよい）バイオマスは、引き続いて顆粒状粒子を形成させるための造粒工程にかけることができる。造粒はいくつかの異なる方法で達成することができる。

水分含量を低下（または乾物含量を増大）させるもう１つの方法は、バイオマスの、または（好ましくは）培養液からのバイオマスの分離後に、洗浄濾過などによる塩（例えばブライン）洗浄を使用することである。

本発明の好ましい態様では、望ましい粒子構造と粒子サイズが押出工程によって得られる。乾燥および／または抽出工程を最適化するには、構造やサイズなどといった粒子の特徴が重要でありうる。乾燥段階では、粒子が小さすぎると、それらは粉塵や微粉を生成しうるので問題となりうる。一方、大きすぎる粒子は流動化せず、乾燥性能を低下させうる。抽出段階では、顆粒サイズが小さすぎると、バイオマスベッドでの圧力低下が大きくなりすぎるだろうから、パーコレーション法の使用が不可能になりうる。微粉が多すぎると、以降の精製段階で問題が生じうる。大きすぎるサイズは抽出中の溶媒の効率のよい浸透を妨げうる。また、乾燥および抽出中の崩壊を防ぐためには、粒子構造が十分に緻密であるべきだが、粒子（乾燥顆粒）は、抽出中に溶媒の（効率のよい）浸透を許す多孔性を持つことが好ましい。

当業者は、望ましい構造とサイズを持つ顆粒状（バイオマス）粒子が得られるように、押出条件を調節することができる。

押出条件は、細胞破壊が最小限となるように調節することができる。最小限の細胞破壊により、不安定な酸化感受性化合物の酸化誘発性分解からの最適な保護を保証することができる。したがって押出は、どの加熱手段も伴わずに、より低温で行なわれることが好ましい。これは好ましくは２０〜３０℃の範囲（例えば、ほぼ室温）である。押出工程では、顆粒状粒子が自然に生成する場合、すなわち「押出物」が重力の影響によって自重でダイプレートからはなれ落ちることによって粒子を形成する場合がある。しかしバイオマスがダイプレートによって押し出された後、スパゲッティのように長い鎖状になる性質を持つ場合は、そのスパゲッティ状のものを切断して望ましいサイズの粒子にすることができる。

バイオマスの温度は、押出時に生産される顆粒状粒子の性質に影響を与えることがわかった。バイオマスは押出前に好ましくは６〜１５℃の温度を持つ。しかし押出機内にある時は、バイオマスの温度が（１５〜３０℃であることが好ましいのではあるが）１０〜６０℃に上昇しうる。この温度上昇はバイオマスにかけられる圧力とその乾物含量に依存するだろう。

押出工程では、バイオマスは通常、しばしばスクリューにより、バレルを通してダイプレートに向かって押しやられる。このバレルは好ましくは加熱されない。実際には、これを冷却した方が有利である。冷却剤（例：水などの水性液）の温度は１〜４℃（例えば約２℃）が適当である。

一般的に言って押出は水分含量を変化させない。（ｂ）段階での乾物含量が（ａ）段階と同じであるのは、この理由による。しかし、他の造粒法（例えば後述する方法）が水分含量を変化させ、それを減少させうる（言い換えれば、乾物含量を増大させうる）ことは理解されるだろう。例えばケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）の菌類（特にＰＵＦＡを産生するもの）を含有するバイオマスの場合、（ａ）でのバイオマスの乾物含量（これは通常、造粒（この場合は押出）によって生産された顆粒状粒子と同じである）は、３５％と６０％の間が適当であり、５０〜６０％が好ましい。乾燥後は、乾燥顆粒が好ましくは少なくとも９０％（例えば少なくとも９５％）の乾物含量を持つ。

好ましい造粒法は押出機を使用することである。押出機の優れた概説には、Ｗ． Ｐｉｅｔｓｃｈによるもの（「Ｓｉｚｅ Ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｂｙ Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ（凝集によるサイズ拡大）」Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社， １９９１， ３８５頁）がある。その機械はバッチ式押出機でも連続押出機でもよい。連続押出機については、簡単な一軸スクリュー押出機（軸方向輸送型および半径方向輸送型）を挙げることができる。同時回転型または逆回転型の二軸スクリュー押出機もある。押し出されるべきバイオマスは、多孔板（ダイプレート）を通して輸送され、いくぶんか圧縮、圧迫される。押出機のもう１つのグループには、ペレット製造機がある。この場合は、円柱状の圧迫具が多孔板上に蓄積された材料の層上を回転する。

顆粒が押出によって得られる場合は、バイオマスが押出可能な形態にあることが必要である。水分含量は、バイオマスの状態、使用する微生物および押出条件に応じて、必要であれば調節することができる。水を除去することもできるし、例えばデンプンなどの固体を添加することによって乾物含量を増大させることもできる。この方法でバイオマスを適正な稠度（通常はペーストの稠度）に調節することができる。

顆粒は化合物の抽出に使用することもできるが、これを保存が可能な安定型のバイオマスとみることもできる。顆粒はその他の用途も持ちうる。例えばバイオマスが１種類またはそれ以上の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を含有する場合、その顆粒を乳児用調製粉乳の製造に使用することができる。

本発明では、（顆粒状）粒子の形成を可能にするその他の造粒法も考えられる。例えば、多段乾燥法には噴霧乾燥と流動床の組み合せを含めることができ、この方法はやはり顆粒状粒子をもたらすことができる。

その他のタイプの造粒技術も使用できる。一般に造粒とは、サイズ拡大またはサイズ縮小によって顆粒状の固体を得る行為である。一般的にはサイズ拡大が使用される。利用できる造粒工程のタイプに関する優れた概説は、Ｗ． Ｐｉｅｔｓｃｈ「Ｓｉｚｅ Ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ ｂｙ Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ（凝集によるサイズ拡大）」（Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社， １９９１， ３８５頁）に記述されている。そこには造粒に利用できる数多くの異なる技術が記載されており、後述するいくつかの凝集法はここに含まれている。この場合は、凝集によって小さい粒子が互いに付着（凝集）して、より大きな粒子（この場合は顆粒状のもの）を形成する。したがって第一の方法が小さすぎる粒子をもたらすのであれば、より大きい（顆粒状）粒子を得るために凝集法を使用することができる。

タンブル凝集法は、通常、タンブル式および／または回転式のドラム乾燥器または円錐乾燥器と、（粒子が互いに固着するように）付着性を持つ粉末とを用いて達成される。場合によっては、特別に添加された結合剤を混合できる。この機構により、球状粒子が形成されうる。

加圧凝集は、通常、粒状物質の塊に作用する強い力を特徴とする。一般にこの方法は微粉末または「可塑性」（非弾性）物質を用いて行われる。この方法は通常、粉末材料に使用される。（ただし一定の稠度を持つ生地用の乾燥酵母生産にも使用される）。成形された粒子は最適な貯蔵に適した乾物含量まで乾燥することができる。加圧凝集は、ピストン式、ローラー式、等圧式および／または押出式圧縮機で達成することができる。このタイプの装置に関する優れた解説は上で引用したＰｉｅｔｓｃｈの著書に記述されている。

押出圧縮機は、通常、孔または開口ダイを通過する可塑性物質の流れに対する抵抗の原因となる壁面摩擦を利用する。特にスクリュー押出機では広範な混合が起こり、高いせん断力が働く。

一般に、低い融点または可塑化温度を持つ物質は直接凝集させることができる。

その他の凝集法も使用できる。例えば噴霧乾燥と流動床凝集機の併用。まずバイオマスをノズルからの噴霧によって、または噴霧乾燥器中の回転輪を用いた噴霧によって乾燥することができる。微粒子は噴霧部に再利用される。得られた粘着性粉末を流動床部でさらに凝集させる。場合によっては、粉末の再加湿により、凝集工程が改善されうる。ここに記述した技術は多段乾燥として知られている。

多段乾燥をより詳しく説明すると、バイオマスはまず噴霧乾燥される。これにより微粉末を得ることができる。噴霧乾燥の温度（吸気温度）は通常１６０〜２６０℃であり、かつ／または、排気温度は７５〜９０℃である。ここではバイオマスが小さな粒子を生成するノズルまたは高速回転ディスクによって噴霧される。次にその粒子は重力を受けて噴霧乾燥塔の底に向かって落下する。ここには乾燥を達成するための熱風（９０〜９５℃が適当）を使用できる流動床を用意することができる。ここでは凝集が起こり、粒子が互いに固着できる。この後、凝集した（顆粒状）粒子は、例えばベルト乾燥床やサブ流動床（ｓｕｂ−ｆｌｕｉｄｉｓｅｄ ｂｅｄ）での乾燥にかけられる。この工程の出発時点で、バイオマスは３０％未満の乾物含量を持ちうる。噴霧乾燥後は、これが７５〜９０％に上昇することが可能で、凝集後は９０〜９５％になりうる。乾燥後は、これが少なくとも９５％に上昇しうる。

もう１つの技術は、流動床凝集機の使用である。ここでは粉末が気流中で流動化されうる。粒子床では、粉末を濡らし凝集を促進する水が流動体に噴霧される。

一般に、上述の凝集法は可塑化されうる乾燥粉末のための方法である。例外は多段乾燥器での乾燥である。この噴霧乾燥と乾燥機後の流動床との組み合せは、多くの異なるタイプのバイオマスの凝集に適している。しかしこの方法は、熱不安定な生成物や（熱）風による酸化を受けやすい生成物に常に適しているわけではない。顆粒状乾燥バイオマスの良い製造法は、機械的に脱水した濾過ケーキの押出と、それに続く流動床乾燥やサブ流動床乾燥のような適当な乾燥段階である。

（乾燥）バイオマスのもう１つの凝集法は、（噴霧）乾燥したものの再加湿と、それに続く押出段階および例えば流動床乾燥器などでの再乾燥によって行われうる。低い融点または低い可塑化温度を持つ粉末（あるいは押出機内の力によって部分的に融解する細胞内油分を大量に含むある種の乾燥バイオマスの場合）は、押出すことができる。好適なペレットがダイプレート内で生成する。

上記（ｃ）のように、（押出またはその他の方法で）顆粒状にされたバイオマスは、好ましくはその粒子が無傷のままに保たれる条件下で、乾燥することができる。造粒工程後のバイオマスの粒子構造と粒子サイズは、そのバイオマスの効率的な乾燥を可能にすると考えられる。乾燥は、ベルト乾燥器、真空乾燥器、真空ベルト乾燥器、流動床またはサブ流動床乾燥器など、種々の乾燥器を用いて行なうことができる。当業者はバッチ法か連続法を選択することができる。

流動床またはサブ流動床乾燥器の使用が本発明の方法ではとりわけ好ましい。乾燥は空気中または窒素下に起こりうる。流動床およびサブ流動床乾燥では、床内の温度を前もって設定した値に調節することができる。これらの値は、例えば３５℃から１２０℃まで（例：５０〜９０℃、あるいは６０〜８０℃でもよい）の広い範囲に及ぶことができる。不安定な化合物をバイオマスから単離する必要がある場合は、酸化または分解の危険を減らすために、乾燥工程の温度を低い方の範囲に容易に調節することができる。

別法として、あるいは上の方法に加えて、例えば１〜２時間の真空乾燥工程を使用することもできる。

乾燥段階からはいくつかの利点が生じうる。第一に、（顆粒を形成するための）バイオマス粒子の乾燥は、長期間にわたって安定に保存できる中間物質をもたらしうる。ここではバイオマスの（比較的）高い乾物含量が、そのバイオマスから単離されるべき化合物の分解を防止しうる。このように、乾燥顆粒はバイオマス内に存在する、もしくはバイオマスと結合している化合物の安定な製剤とみなすことができる。

例えば、これらの顆粒は酵素の担体として機能することができるので、適当量の架橋剤（例：グルタルアルデヒド）を押出前にバイオマス中に混合することにより、酵素は顆粒内に固定化される。

また本発明に従って製造された乾燥顆粒は、例えば食品または飼料組成物もしくは添加物としてそのまま有利に使用できる。

これらの粒子および／または顆粒（例えば押出によって生産されたもの）は次の特性を持ちうる。

これらの顆粒はチョコレートキャンディーの形状を持つことができる。（押出された）顆粒の直径は０．１ｍｍから１２ｍｍまで（例えば０．３ｍｍから１０ｍｍまで）変動しうる。１．５ｍｍから６ｍｍまでがより好ましく、（抽出には乾燥時に）２ｍｍから３ｍｍまでの直径が最適である。顆粒の長さは直径の約２倍ないし５または６倍でありうる。そうすれば、これらは充填時に容易に取扱うことができ、また市販の抽出器で使用することができる（ベッドの透過性が保証される）。通常、顆粒の（実質上すべてではないとしても）大半が同じサイズを持つだろう。実際、全顆粒の少なくとも８０％（例えば少なくとも９０％）が指定した範囲の粒子特性を持つような極めて均一または均質な顆粒を得ることができる。

第二の側面の組成物（顆粒）は好ましくは流動性である。これらはほぼ円筒状でありうる。これは押出を使用することによって達成できる。その場合、粒子は押出に使用したダイプレートの孔よりわずかに大きいこともあるが、それとほぼ同じ直径を持ちうる。この工程では、粒子はダイプレートを出た時に自動的に生成しうる。その場合は、粒子の長さは不定になるだろう。しかし、例えばナイフ（例：ダイプレートに隣接する１つまたはそれ以上の回転刃）などの切断手段を使用すれば、粒子長に影響を与えることができて、その場合は、粒子の（全部ではないとしても）大半が実質上同じ長さを持つことになる。このような粒子の好ましい長さは少なくとも２ｍｍ（例えば少なくとも３ｍｍ）である。顆粒は、その保存または輸送がより容易になるように、「注ぐ」ことが可能なサイズと水分含量を持つことが好ましい。一般的に言ってほとんどの粒子は本質的に細長いだろうが、あるものはほぼ球状でありうる。顆粒の好ましい脂質含量は、好ましくは３０〜５０重量％である。

顆粒の嵩密度は通常４００〜１１００ｋｇ／ｍ³だろう。

上述した通り、抽出されるべき化合物への溶媒の接近が可能なように、顆粒は多孔性であることが好ましい。好ましくは、顆粒は中空の通路を持ち、それらは顆粒の中心に向かって、顆粒の中心に達しうる。通路の数は、顆粒の４０〜６０容量％、例えば４５〜５５容量％、最適には約５０容量％が中空（空気）であるような数でありうる。通路に関する限り、それらはその平均直径の１０倍〜２０倍の長さを持ちうる。一般的に言って顆粒は、顆粒の外側が基本的に中心部と同じ材質であるという点で、その組成が均一だろう。これは、外側は比較的密だが中心部は比較的空疎でありうる先行技術の酵母組成物とは対照的である。

これらの顆粒は最終的に抽出されるべき化合物に最適な温度で安定に保存することができる。

乾燥顆粒の好ましい乾物含量は８０％より高く、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、最適には９３％から９７％までの範囲である。水混和性の溶媒を抽出に使用すべき場合は、より低い乾物含量を持つ顆粒を使用できる。

このように（乾燥）顆粒は通常多孔性なので、抽出に使用される溶媒が顆粒（の内部）に容易に出入りできる。したがって押出および乾燥中に粉塵の量を最小限にすることができ（これは収量を増大させる）、抽出液の蒸発に先立って（溶媒）抽出液の余計な濾過を避けることができる。

顆粒の多孔性は、顆粒状粒子の（水分または）乾物含量に依存する。顆粒状粒子中の水はしばしば乾燥時に蒸発して（中空の）細孔を残す。乾燥顆粒の多孔性は、１５〜５０％（例えば２０〜４０％）が好ましく、２５〜３５％が最適である。多孔性の測定については後述する（実施例２５）。

顆粒中の細胞の（実質上すべてではないとしても）大半は、好ましくは無傷である（すなわち破裂していない）。特に菌類バイオマスから製造した顆粒は、全体的に０．３〜１０ｍｍの直径、好ましくは０．７〜５ｍｍの直径、最適には１〜３ｍｍの直径を持つバイオマス粒子でありうる。通例、それらの粒子は望ましい長さで自動的に生成する。そうでなければ、粒子を望ましい長さに切断してもよい。造粒が押出によってなされた場合は、その押出機のダイプレートの孔が、一般にその顆粒の直径に相当しうる。

随意に、抗酸化剤を造粒工程の前または造粒工程中に添加してもよい。これらは例えば０．１（重量）％までのトコフェロールやアスコルビン酸パルミテートを含みうる。

このように本発明は、対費用効果が高く効率のよい化合物の抽出を可能にしうる特徴を持つバイオマス材料を提供しうる。またそれらの化合物を精製、単離または（好ましくは）抽出することができる。本発明の方法は、パーコレーション抽出工程の使用を可能にすることができる。この抽出法によって与えられる利点は、その構造とサイズおよび高い乾物含量によるものと思われる。乾燥押出物では、貴重化合物をそこから抽出するのに必要な溶媒量が減少する。また、脱溶媒焙煎（すなわち使用した溶媒のバイオマスからの放出）の工程が、押出物の形態をしたバイオマスでは、より良くより効率的に行われうる。

脱溶媒焙煎の工程後に得られる押出物残渣は、飼料成分として有利に使用することができる。

９０〜９５％を超える押出物の乾物含量はその押出物の安定な貯蔵を可能にしうるが、８５％を超える乾物含量でも既に、その後の抽出工程で有意な好結果を与えうる。

抽出は好ましくは溶媒を用いて行われる。使用する溶媒は抽出すべき化合物に依存するだろうが、特にＣ_1-10アルキルエステル（例：酢酸エチル、酢酸ブチル）、トルエン、Ｃ_1-6アルコール（例：メタノール、プロパノール）、Ｃ_3-8アルカン（例：ヘキサン）および／または超臨界流体（例：液体ＣＯ₂、超臨界プロパン）を挙げることができる。先行技術では、溶媒が培養液中の微生物に対して直接使用されていた。しかし、顆粒に対して抽出を行なうことにより、必要な溶媒の量を有意に減らすことができる。出願人が行なった実験のいくつかでは、抽出を行なうために必要な溶媒は、２０〜３０倍少なくて済んだ。この結果は、使用する溶媒が減ったために経済的にかなりの節約になるというだけでなく、排出問題を最小限に抑えることにもなる。顆粒を使用することにより、溶媒にとって利用できる表面積がとりわけ広くなり、それゆえに良好な収量を得ることができる。

抽出すべき化合物が疎水性である場合は、無極性溶媒を使用することが好ましい。親水性化合物には、（アルコールなどの）極性溶媒が使用に適している。

抽出は様々な技術を用いて達成することができる。好ましい方法はフィルターを用いたパーコレーション抽出である。この場合は、カラムに乾燥顆粒を充填することができる。次に、顆粒が覆われるように溶媒（ヘキサン）を加える。溶媒はカラムの中を乾燥粒子越しに一度通過させることができるが、好ましくはそれを（閉鎖系または開放系として）再循環させる。溶媒は、好ましくは半時間〜１時間半（例えば約１時間）の時間で、３〜７回（例えば５回）再循環させるのが適当である。 図３は適当なパーコレーション抽出装置を示している。溶媒は乾燥顆粒を含むパーコレーション抽出器に添加される前に、容器に保持される。溶媒はポンプを使って循環される。精製フィルターの目的は微粉を除去することである。

その他のパーコレーション抽出器を使用することもできる。それらは向流型または逆流（ｃｒｏｓｓ−ｃｕｒｒｅｎｔ）型でありうる。前者の場合、乾燥顆粒は 、種々のセクターに分割された（円形コンベヤー（カルーセル）などの）回転する円柱中に保持することができる。溶媒はあるセクター中の顆粒をある方向に通過し、次にもう１つの（例えば隣合う）セクター中の顆粒を（好ましくは同じ方向に）通過する。これらの機械はしばしばカルーセル抽出器と呼ばれ、ドイツのＫｒｕｐｐ社から入手できる。

もう１つの技術では、溶媒とは実質上反対に移動する移動（例えば多孔性）ベルトまたはコンベヤーなどに顆粒を置くことができる。これは新しい顆粒が既に他の顆粒を通過した溶媒で抽出され、新しい溶媒は既にその溶媒での抽出にかけられた顆粒に適用されることを意味する。この配置により、効率を最大化することができる。

逆流（ｃｒｏｓｓ−ｃｕｒｒｅｎｔ）法では、別々の顆粒のバッチを新しい溶媒の一部による抽出にかける。

本発明の方法は、２種類以上の微生物の混合物から顆粒状粒子または顆粒を製造することにより、異なる微生物から２種類以上の化合物の混合物を得るためにも使用できる。この微生物の混合物は、２種類以上の微生物の発酵液を終了後に直接混合することによって、もしくは造粒（例えば押出工程）の直前に２種類以上の微生物に由来するバイオマスを混合することによって得ることができる。また、抽出工程の前に２種類以上の異なる微生物押出物を混合することもできる。

したがって好ましい本発明の方法は次のようになりうる：
ａ） １種類またはそれ以上の微生物を適当な培地中で、その微生物が目的化合物を産生しうる条件下に発酵させる。これにより培地に含まれた微生物である培養液が得られる；
ｂ） 必要であれば、その化合物を酸性化などによって沈殿または固化させる；
ｃ） バイオマスを得るために、その培養液中の培地から微生物を分離する（これは、濾過などの固／液分離によって達成できる）；
ｄ） （ａ）で得た培養液または（ｃ）で得たバイオマスを低温殺菌する；
ｅ） 必要であれば、そのバイオマスの乾物含量を、例えば乾物または乾燥物質の添加もしくは例えば脱水または乾燥技術による水分含量の低下によって増大させる；
ｆ） 得られたバイオマスを破砕および／または混練する（また随意に、１種類またはそれ以上の乾燥物質を添加して乾物含量を増大させる）；
ｇ） 顆粒状粒子を得るために押出などによりバイオマスを顆粒化する；
ｈ） 乾燥顆粒を得るために顆粒状粒子を乾燥する；
ｉ） 適当な溶媒を用いるなどして、１種類またはそれ以上の化合物を抽出する。

本発明に従って単離された化合物は高い品質を持つことができ、人間または動物の栄養物での使用に適しうる。特に本発明に従って単離された多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）含有脂質は栄養目的（具体的には乳児用調製粉乳への添加）に適している。

実施例１〜６
クサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）発酵液の加工
予め低温殺菌（６８℃、１時間）しておいたモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）の発酵液１６０Ｌを標準的なディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）ろ板／枠型フィルタープレス（ろ布タイプ：ナイコット（ｎｙｃｏｔ）２７９４）で濾過した。培養液は１．０バールの最大加圧で濾過した。１６０Ｌの培養液は２０分以内に４．３５ｍ²の総フィルター面積を通して濾過され、平均流量は約１１０Ｌ／ｍ²ｈになった。その濾過ケーキを約３ケーキ体積（約１５０Ｌ）の工程用水で洗浄した。
約３０ｋｇの湿ケーキが約２５％の乾物含量で回収された。３種類の乾燥法を使用した。

真空乾燥：
１０ｋｇの濾過ケーキを真空（約５０ミリバール）トレイ乾燥器（乾燥表面約１ｍ²）中、３５℃で減圧下に２４時間乾燥して、約９４％の乾物含量を持つ約２．５ｋｇの乾燥バイオマスを得た。その乾燥バイオマスは砕けたバイオマスといくつかの大きな塊からなった。おそらくはその大きな塊のために、真空乾燥には時間がかかった。

送風トレイ乾燥器：
１０ｋｇの濾過ケーキを、送風トレイ乾燥器（乾燥表面約１ｍ²）中、３５℃で窒素下に２４時間乾燥した。合計で約２．５ｋｇの乾燥バイオマスが約９３％の乾物含量で回収された。その乾燥バイオマスは、砕けたバイオマスといくつかの大きな塊からなる。おそらくはその大きな塊のために、送風トレイ乾燥には時間がかかった。

流動床乾燥器：
５ｋｇの濾過ケーキをＡＥＲＯＭＡＴＩＣの実験室用流動床乾燥器（ＭＰ−１型）中、約２００℃の吸気温度で乾燥した。出口温度は約４０℃だった。約４５分で湿バイオマスが乾燥され、約８１％の乾物含量を持つ乾燥バイオマス約１ｋｇが得られた。

最後の方法で回収された乾燥物を、ヘキサンを用いた６つの異なる温度における油の抽出に使用した（実施例１〜６）。１５０ｇの乾燥バイオマスを、窒素ブランケット下に９０分間、１５００ｍＬのヘキサン（加熱還流したもの）による抽出にかけた。細胞塊を濾去し、得られたミセル中の溶媒をロータベーパー（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で減圧下に蒸発させた。これにより、粗製ＰＵＦＡ油が得られた。その結果を表１に示す。室温での抽出はより低い収量を与え、高温ではより良好な収量が得られた。

この高トリグリセリド油は淡黄色油で、多少の固形物を含有していた。

実施例７と比較例８
クサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）発酵液の加工
培養液５００Ｌ（先の実施例に記述したように予め低温殺菌しておいたもの）を、約０．５バールの圧力差で、膜フィルタープレス（ＳＣＨＵＬＥ）で濾過した。その濾過ケーキを１０ケーキ体積の工程用水で洗浄した後、５．５バールで３０分間圧搾した。得られたケーキは約４６％の乾物含量を持っていた。この方法で回収されたケーキを試験用押出機（ＯＤＥＫＥＲＫＥ，バレルの直径５０ｍｍ，型彫りされたバレル）で押出した。ダイプレートはそれぞれ直径１．６ｍｍの孔を１０個持つものであった。合計で１９ｋｇの濾過ケーキを約４５分で押出した。

この方法で回収された押出物をパイロットプラント流動床乾燥器（Ｔ４ ＡＥＲＯＭＡＴＩＣ，乾燥表面０．２６ｍ²）で乾燥した。押出物を６５℃で乾燥したところ、約４５分以内に乾物含量が約８５％になった（実施例７）。

同じ実験中に、濾過ケーキの一部を押出さずに（比較例８）、真空トレイ乾燥器中４０℃で乾燥した。大きな塊ゆえに、この乾燥には極めて時間がかかった。

両方の材料をヘキサンを用いる抽出にかけた。次に挙げる材料の特徴が認められた。

乾燥押出物（実施例７）： 主としてペレット
抽出工程はかなり容易
真空乾燥バイオマス（比較例８）：ペレットと塊、大量の微粉
抽出工程は困難；濾過特性が劣等

実施例９および１０
実施例７と同じ培養液を用いる押出実験を次の押出機を使って行なった
ＬＡＬＥＳＳＥ（オランダ・アルンヘム）

実施例９では、ＬＡＬＥＳＳＥ一軸スクリュー万能押出機を使用した。このタイプの押出機は通常、スナック食品の生産に使用されている。まず試験として、すりつぶしたトウモロコシ（乾物含量約９５％）をこの押出機に投入し、加圧加熱下にトウモロコシを押出した。ダイから出ると押出物は直ちに膨張した。

このタイプの押出機のバレルは、加工されるトウモロコシを輸送するために、型彫りされたバレルであった。押出に使用するスクリューのタイプは加工する材料のタイプに依存する。スクリューは直径４８ｍｍの万能輸送スクリューまたは圧縮スクリューとした。このＬＡＬＥＳＳＥ機は７．５Ｋｗパイロット機（運転容量）である。この機械の総電力所要量は１２．１Ｋｗである。この押出機のバレルは加熱または冷却することができた。バイオマスの押出には、直径１．８、２．０および２．２ｍｍの１〜４個の孔を持つダイプレートを使用した。

クサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）バイオマスを押出す能力（冷却バレル）は約４０ｋｇ／ｈだった。この押出では、ダイプレート中の孔の長さ／直径（Ｌ／Ｄ）比を変化させた。

ＡＬＭＥＸ（オランダ・ジュトフェン）
実施例１０では、実施例７のクサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）バイオマスを用いて、ＡＬＭＥＸ社のエキスパンダー押出機を使用した。このタイプの押出機はペットフードの生産に使用されている。これはバイオマスの輸送を可能にするピンを持つ滑らかなバレルを持った。これらのピンはＬＡＬＥＳＳＥ押出機のバレル中の輪郭と同じ機能を持つ。このエキスパンダー押出機のスクリューはモジュールスクリューとした。

技術データ：
ＡＬＭＥＸ Ｃｏｎｔｉｖａｒ １５０
Ｌ／Ｄ＝１０（スクリューの長さとスクリューの直径の比）
最大スクリュー速度１８０ｒｐｍ
２２Ｋｗ（運転容量）
スクリューの直径１５０ｍｍ
水道水により冷却
ダイプレート：それぞれ直径１．８ｍｍの孔を持つ３リング

バイオマスは加工中に約２５℃まで温度が上昇した。この機械の処理能力は毎時約２５０ｋｇのクサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）押出物であった。

比較例１１
異なる方法で行なった固／液分離の比較
デカンター：
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）の発酵によって得た３５０Ｌの培養液をＦＬＯＴＴＷＥＧデカンター（Ｚ２３−３／４４１型）でデカントした。速度は約４０００ｒｐｍに設定した。差速度範囲は運転中に７．５ｒｐｍから２０ｒｐｍまで変動した。

給送量は４００Ｌ／ｈに設定した。バイオマスは洗浄しなかった。合計で３５０Ｌの培養液をデカントした。投入物の温度は８℃で、上清は１５℃だった。回収されたバイオマスの乾物含量は約２５％だった。

デカンター＋真空ドラム濾過器：
上記のデカンター実験で得た乾物含量２５％のバイオマス２０ｋｇを、１０ｋｇのＮａＣｌを溶解した５００Ｌの工程用水に懸濁した。得られたスラリーを、さらに洗浄することなく、ベルトディスチャージ付きの真空ドラム濾過器（ＰＡＸＭＡＮ，ろ布タイプ：８６５．９１２ Ｋ／５プロプロプ（ｐｏｌｙｐｒｏｐ））で濾過した。ドラムの速度は１ｒｐｍに設定し、圧力差は最大６００ミリバールに設定した。合計４００Ｌが１５分以内に濾過された。正味のフィルター表面は約０．３ｍｍ²で、平均流量は５０００Ｌ／ｍ²ｈ（濾過表面）になった。濾過速度は極めて良好だったが、「ケーキ形成性」はかなり悪かった。回収された濾過バイオマスの乾物含量は約２３％だった。

ろ板／枠型フィルタープレス：
５００Ｌの培養液をろ板／枠型フィルタープレス（スタンダードＲ＆Ｂ，ろ布タイプ：ナイコット（ｎｙｃｏｔ）２７９４）で濾過した。培養液は０．３バールの圧力差で濾過された。５００Ｌの培養液は３５分以内に５ｍ²の総フィルター面積を通して濾過され、平均流量は±１７５Ｌ／ｍ²ｈになった。濾過ケーキを約２．５ケーキ体積の工程用水で３０分洗浄した。その平均流量は４００Ｌ／ｍ²ｈになった。

そのケーキを空気で３０分間送風乾燥したところ、回収されたバイオマスの乾物含量が約２５％になった。

膜フィルタープレス：
７００Ｌの培養液を膜フィルタープレス（ＳＣＨＵＬＥ，ろ布タイプ：プロペクス（ｐｒｏｐｅｘ）４６Ｋ２）で濾過した。培養液は０．３バールの圧力差で濾過された。７００Ｌの培養液は３０分以内に６．８ｍ²の総フィルター面積を通して濾過され、平均流量は約２０５Ｌ／ｍ²ｈになった。

その濾過ケーキを３ケーキ体積（約３００Ｌ）の工程用水で７回洗浄した。その平均流量は３７５Ｌ／ｍ²ｈになった。

膜フィルタープレスがろ板／枠型プレスより有利な点は、濾過後のケーキを高圧で圧搾できるので、ケーキの乾物含量が増大することにある。ケーキを５．５バールで３０分間圧搾したところ、回収されたバイオマスの乾物含量は約４５％になった。

もう１つの実験では、１１００Ｌの培養液を膜フィルタープレス（ＳＣＨＵＬＥ，ろ布タイプ：プロペクス（ｐｒｏｐｅｘ）４６Ｋ２）で濾過した。この培養液は０．３バールの圧力差で濾過された。１１００Ｌの培養液は４５分以内に総フィルター面積１２．３ｍ²を通して濾過され、平均流量は約１２０Ｌ／ｍ²ｈとなった。その濾過ケーキを３ケーキ体積（約６００Ｌ）の１％ＮａＣｌ溶液で１８分間洗浄した。その平均流量は１６２Ｌ／ｍ²ｈになった。

そのケーキを６バールで３０分間圧搾したところ、回収された濾過ケーキの乾物含量は約５５％になった。

ケーキの圧搾と１％塩溶液による洗浄はどちらも濾過ケーキの乾物含量に有意な効果を持った。

実施例１２
異なる乾物含量を持つバイオマスの押出
実施例７に記載の方法によって得た異なる乾物含量を持つバイオマスを使って押出を行なった（表２参照）。押出は、型彫りされたバレルと万能スクリューを持つ一軸スクリュー押出機を用いて行なった。押出に使用したダイプレートは異なる数の孔を持ち、その孔の直径は２ｍｍの範囲にあった。

押出後に得られた粒子の直径は約２ｍｍだった。

性能と押出物の品質は、押出に使用するバイオマスの乾物率に依存する。２５％の乾物率が最も悪い結果を与えたが、他の微生物ではこのような低い乾物含量でも許容できる。

実施例１３および１４ならびに比較例１５
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ａｌｐｉｎａ）の従来型バイオマスおよび押出バイオマスの乾燥
真空乾燥：
従来通りに回収したバイオマス（比較例１５，押出されていないもの）を真空トレイ乾燥器で乾燥したが、４０℃で約５０時間を要した。この乾燥は塊のために極めて遅かった。この方法で乾燥したバイオマスの乾物含量は約９２．５％だった。

比較のために、５５％の乾物含量を持つ約２０ｇの押出物（実施例１１で得たもの，φ_粒子＝２ｍｍ）を、実験室規模でロータベーパー（ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で乾燥した。水槽の温度は６８℃とし、４０ミリバールの圧力を適用した。乾燥バイオマスが壁に付着し、油がわずかに滲出した点を除いて、この乾燥の性能は妥当なものだった。乾燥後の乾物含量は９２．３％だった。

流動床乾燥：
実施例１３では、バイオマス（実施例１）を使って異なる温度で乾燥を行なった。バイオマスに前処理を施さなかった場合は、バイオマスの大きな塊が完全な乾燥状態にはならなかった。この場合、乾燥バイオマスは粒子サイズに関して極めて不均質だった。

乾燥前に押出を使ってバイオマス前処理すると、乾燥の性能がかなり改善された。この場合、乾燥バイオマスの粒子サイズはより均一だった。

これらの結果の結論は、流動床乾燥は異なる形態の単離されたバイオマスを使って行いうるが、その乾燥は押出物を用いることによって改善されるということである。

もう１つの実験（実施例１４）では、異なる量（１５ｋｇと３０ｋｇ）の押出物の乾燥を、空気を用いる流動床乾燥器で行なった（８０００Ｎｍ³／ｍ²ｈ）。乾燥中に試料を採取し、その乾物含量を計算した。図１に、これら（２つの）異なる量の温度と乾物含量の間の関係を示す。

床温度は８０℃に設定した。押出バイオマスの直径は１．３ｍｍだった。乾燥後の押出バイオマスの乾物含量は約９６％だった。

実施例１６
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ
ａｌｐｉｎａ）の乾燥押出物からの脂質の抽出
異なる温度における乾燥押出物の撹拌抽出：
それぞれ９３．４％と９７．８％の乾物を含む乾燥押出物の試料１００ｇを、５００ｍＬのヘキサンまたは５００ｍＬの２−プロパノールを使って、ヘキサンについては２０℃、３５℃および５０℃で、２−プロパノールについては２０℃、４０℃および７０℃で３時間抽出した。スラリーは四口丸底フラスコ内で２枚羽根撹拌機を使って撹拌し、マントルヒーターで加熱した。最終的に蒸発したヘキサンまたは２−プロパノールを還流冷却管を使って再生利用した。

抽出中は３０分毎に、撹拌機を停止して粒子が沈降した後でフラスコから上清の試料１５ｍＬを採取した。その試料のうち１ｍＬを、予め秤量しておいた２ｍｌエッペンドルフチューブにピペットで移した。減圧下４０℃で終夜乾燥した後、そのエッペンドルフチューブを秤量し、総油量を計算した。これらの実験の結果を図２に示す。

ヘキサン抽出に関する結論：
・ 温度は抽出されうる脂質の総量に影響しなかった。すなわち比較的低い抽出温度でも良好な脂質収量を与えた。
・ 温度は脂質の総量が抽出されうる時間にわずかな影響しか持たなかった。
・ 脂質の総量は２０℃を超える温度で、５体積のヘキサンにより、バイオマスから３０分以内に抽出された。

２−プロパノール抽出に関する結論
・ 温度は抽出されうる脂質の総量に有意な影響を持った。
・ 温度は脂質の総量が抽出されうる時間に有意な影響を持った。
・ 脂質の総量は７３℃で５体積の２−プロパノールにより、バイオマスから２時間以内に抽出された。

油の組成は抽出に使用した溶媒に依存した（表３参照）。抽出溶媒の極性が高いほど、より多くのリン脂質が抽出された。油の組成が最適になるように、溶媒の極性を選択することができる。

より大きな規模では、抽出工程中の高い撹拌機速度により押出物が小さな粒子に崩壊するので、ミセルの濾過に問題が認められた。

この問題は、撹拌抽出の代わりにパーコレーション抽出を用いることによって回避された。

ヘキサンによる乾燥押出物のパーコレーション抽出
試行規模で数種類のパーコレーション抽出を行なった（工程図については図３を参照されたい）。約４０〜４５ｋｇの乾燥押出バイオマスを、ヘキサン（初期ヘキサン／バイオマス比：４．４Ｌ／ｋｇ）を使って２０℃で抽出した。ギアポンプの流量は１．５ｍ³／ｈに設定した。保持槽には約０．１バールのわずかな窒素パージを行なった。

抽出は４時間行なった（抽出中に温度が１８℃から２５℃まで上昇する）。３０分毎に、ミセルから試料を採取した。各試料のうち１００ｍｌを実験室規模で減圧下（約５０ミリバール）に２０分間、ロータベーパーにより蒸発させた（Ｔ_水槽は６４℃とした）。その結果を図４に示す。２時間後に「平衡」に達したことがわかる。その後、抽出されたバイオマスを約０．６ベッド体積のヘキサンで洗浄した。抽出中、ベッド高は変化しなかった。

蒸発に先立って、ミセルを精製フィルターに通した。我々は、この抽出中に、粒子のベッドを通したデプスフィルトレーションによって、ミセルがどんどん澄んでいくことに気づいた。

実施例１７と比較例１８
ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ
ｔｒｉｓｐｏｒａ）からのβ−カロチン油の回収
予め低温殺菌（７５℃，１５分）しておいた菌類ブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）の発酵液１０Ｌを、実験室用濾過装置を使って収集した。培養液の濾過性を向上させるためにＣａＣｌ₂を加えた（最終濃度５ｇ／ｌ）。この方法で回収されたバイオマスを実験室規模で、典型的な果実用圧搾器（柑橘用圧搾器，ＨＡＦＩＣＯ Ｄ．Ｇ．Ｍ）を使って４５％の乾物含量まで機械的に脱水（圧搾）した。この方法で回収されたケーキを、それぞれ直径１．８ｍｍの孔４つを持つダイプレートを装着したステンレス鋼製注射器を使って押出した。得られた押出物を実験室用流動床乾燥器で乾燥した（Ｔ_空気＝４０℃，乾燥時間９０分，空気流量１５０Ｎｍ³／ｈ，ＡＥＲＯＭＡＴＩＣ ＭＰ−１）。この方法で乾燥されたバイオマスの乾物含量は約９５％だった。

乾燥押出物の試料約５０ｇを、酢酸エチル（初期体積／バイオマス比；３０Ｌ／ｋｇ）によるパーコレーション抽出法で抽出した。５０℃で２時間の抽出後、抽出物を減圧濾過によって収集した。バイオマスを１ベッド体積の酢酸エチルで洗浄した。この方法で回収された抽出物を脱イオン水（抽出物／水比；５ｖ／ｖ）で２回洗浄した。８ｇβ−カロチン／Ｌの濃度に到達するまで、酢酸エチルを５０℃（Ｔ_水槽）で蒸発させた。

その濃縮物から制御された結晶化とそれに続く濾過によって、β−カロチン結晶を回収した。

混合と乾燥を行い、押出を行なわなかったバイオマスで、同じ実験を行なった（比較例１８）。混合乾燥バイオマスの抽出後の濾過性は、乾燥押出物と比較して悪かった。

実施例１９と比較例２０
酵母ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）の乾燥押出物からのＴＡＰＳの単離
酵母ピチア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ）の未低温殺菌発酵液２Ｌから、５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、バイオマスを収集した。その固相濾過ケーキを５％ＮａＣｌを含む塩溶液で洗浄した。この方法で回収された乾物量３３％のバイオマスを実験室規模で、典型的な果実用圧搾器（ＨＡＦＩＣＯ Ｄ．Ｇ．Ｍ）を使って機械的に脱水した。ケーキを２００ｋｇ／ｃｍ²で１分間脱水した。

乾物含量は４７％に上昇した。脱水されたケーキを、万能スクリューと型彫りされたバレルを用いる一軸スクリュー実験室用押出機を使って押出した（実施例１９）。ダイプレートの孔の直径は２ｍｍであった。得られた押出物を４０℃で減圧下に乾燥したところ、乾物含量は約９２％になった。その乾燥押出物２５ｇを酢酸エチル（バイオマス／溶媒比は１：５（ｗ／ｖ））により５０℃で６．５時間抽出した。

この方法で回収された抽出物を減圧下（２５０ミリバール）に５０℃で蒸発させて、ＴＡＰＳ油（約６０％テトラアセチルフィトスフィンゴシン／Ｌ油）を得た。

ＴＡＰＳ含有ピチア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ）の噴霧乾燥（比較例２０）：
ピチア・シフェリイ（Ｐｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ）の培養液約１ｋｇを、Ｂuｃｈｉ １９０実験室用噴霧乾燥器中、１８０℃（入口温度）と１１０℃（出口温度）の空気温度で噴霧乾燥した。この噴霧乾燥器の給送中は、培養液を連続的に撹拌した。培養液は１．２Ｌ／ｈの速度で乾燥器に供給された。ＴＡＰＳの初期量のＴＡＰＳ濃度を噴霧乾燥品で分析した。噴霧乾燥品では、１３％のＴＡＰＳしか回収されなかった。高温ゆえにＴＡＰＳは分解された。したがって、高い処理温度ゆえに、ＴＡＰＳの単離にはこの方法を選択できない。

実施例２１
クリプセコジニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）からのＤＨＡ油の回収
藻類クリプセコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）の発酵液（予め低温殺菌（６５℃，１時間）したもの）７Ｌから、ＢＥＣＫＭＡＮＮ ＪＭ／６Ｅの実験室用遠心機を使ってバイオマスを収集した。培養液を８００ｍＬずつに分けて５０００ｒｐｍで２分間遠心分離することにより、透明な上清を得た。

１３％の乾物含量を持つ合計２２４ｇのバイオマスが回収された。これは、発酵液の収集時のバイオマス濃度が４ｇ／ｋｇであることを意味している。乾物含量を増大させるために、回収されたこのバイオマスに３００ｇのデンプン（ＲＯＱＵＥＴＴＥ，バッチ番号１０ＥＶ００２４）を加えた。この方法で回収されたケーキを、万能スクリューと型彫りされたバレルを用いて一軸スクリュー実験室用押出機で押出した。ダイプレートの孔の直径は２ｍｍ、ダイプレートの厚さは６ｍｍなので、ダイプレートのＬ／Ｄは３であった。得られた滑らかな押出物を減圧下に５０℃で終夜乾燥したところ、ひび入り乾燥押出物が得られた。この方法で乾燥されたバイオマスの乾物含量は約９４％だった。

その乾燥押出物の試料約１８０ｇをヘキサン（初期体積／バイオマス比：５Ｌ／ｋｇ）で抽出した。６０℃で３時間の抽出後、ミセルをワットマンフィルターで濾過した。得られた抽出住みバイオマスを新たなヘキサン１０００ｍＬで１回洗浄した。この方法で回収した濾過されたミセルを６８℃（Ｔ_水槽）で蒸発させた。この方法で、粗製ＤＨＡ含有油が回収された。この油中のＤＨＡ濃度をＧＣで分析したところ３２．６％だった。この方法で回収された油は約６７％のトリグリセリド、１２％のジグリセリド、３．７％のステロールおよび約０．２％の消泡剤を含有していた（ＮＭＲ）。この油のもう１つの特徴は、そのカロチノイドのレベルだった（０．１５ｍｇ／ｍｌのβ−カロチンと５ｍｇ／ｍｌのγ−カロチン）。

実施例２２
プロピオン酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種からの
ビタミンＢ１２の回収
プロピオン酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種の大規模発酵（２８トン）から、ＢＲＰＸ−２１３−ＳＧＶ型の浄化装置（ＡＬＦＡ ＬＡＶＡＬ，３〜７トン／ｈ）を使って、約５０００のＧ−ファクターで、培養液を収集した。この方法で浄化された培養液を、カットオフが５ｋＤで約１５０ｍ²のらせん状に巻かれたポリエチレンスルホン膜（ＨＦＫ１３１−ＶＳＶ型）を持つＡＢＣＯＲ ＫＯＣＨモジュールを使った限外ろ過により２．５倍に濃縮した。得られた限外濾過物を、工程用水を用いて、濃縮された体積に応じて５００％のダイアフィルトレーションにかけた。得られたダイアフィルトレートを減圧蒸留によって３倍に濃縮し、得られた濃縮物に９０℃で２分間の熱ショックを加えた。

得られた濃縮物を顆粒状にし、ＮＩＲＯ２５０多段乾燥器（流動床噴霧乾燥器／凝集機）で乾燥した。乾燥器の吸気温度は約２５０℃で、排気温度は約７０℃だった。適用した吸気流量は約３０００ｍ³／ｈだった。これにより、製品温度は約７０〜８０℃になった。乾燥器に供給される濃縮物の密度は約１０５０ｋｇ／ｍ³だった。

乾燥顆粒の試料約２ｇを、約７５％のエタノール（この水分含量は最適な抽出／機械性能を与える）１２５ｍＬを使ってコニカルフラスコ中、周囲温度で６０分間撹拌することによる抽出に使用した（透明な抽出物）。抽出後、抽出されたバイオマスをワットマンろ紙を使って濾過した（容易な濾過）。この方法で回収された透明でピンク色の濾液をビタミンＢ１２について分析した。得られたバイオマスを２５ｍＬの約７５％エタノールで洗浄した。この方法で約９０％のビタミンＢ１２が顆粒バイオマスから抽出された（表４）。

実施例２３
クリプセコジニウム・コーニイ（Ｃ． ｃｏｈｎｉｉ）と
モルティエレラ・アルピナ（Ｍ． ａｌｐｉｎａ）の同時抽出
菌類モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）の発酵液１０Ｌとクリプセコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）の発酵液１０Ｌを互いに混合した。この混合培養液の濾過性を向上させるためにＣａＣｌ₂を加えた（最終濃度５ｇ／Ｌ）。その混合培養液を濾過し、得られたケーキを典型的な果実用圧搾器（柑橘用圧搾器，ＨＡＦＩＣＯ）で機械的に脱水した。

この方法で回収されたケーキを、型彫りされたバレル内の万能輸送スクリューと２ｍｍの孔１つを持つダイプレートとを使用する一軸スクリュー実験室用押出機によって押出した。押出物の直径は約２ｍｍだった。この方法で回収された押出物を実験室用流動床乾燥器（Ｔ_空気＝４０℃，乾燥時間約１時間，流量１５０Ｎｍ³／ｈ，ＡＥＲＯＭＡＴＩＣ ＭＰ−１）で乾燥した。この方法で乾燥されたバイオマスの乾物含量は約９２％だった。

乾燥押出物の試料約１００ｇをヘキサン（初期体積／バイオマス比：４Ｌ／ｋｇ）による抽出に使用した。周囲温度で２時間の抽出後、減圧濾過によってミセルを回収した。残った抽出済み押出物を４体積の新しいヘキサン（初期体積／バイオマス比：４Ｌ／ｋｇ）で洗浄した。洗浄ヘキサンをミセルと混合し、得られたミセルを５０℃（Ｔ_水温）で蒸発させた。この方法で、ＡＲＡ（Ｃ２０：４ω６）とＤＨＡ（Ｃ２２：６ω３）を含有する粗製ＰＵＦＡ油が回収された。

この粗製油は食用／植物油に常用される方法に従って精製することができる。

実施例２４
アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｔｅｒｒｅｕｓ）からの粗製ロバスタチンの回収
ロバスタチンを沈殿させるために、発酵液１ｋｇあたり２ｇのロバスタチンを含有する菌類アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）の（未低温殺菌）発酵液のｐＨを硫酸でｐＨ２．１に調節し、そのｐＨで１５分間撹拌した。次にその培養液を濾過し、培養液中に存在するロバスタチンの総量の３．５％しか含んでいないその濾液を捨てた。

典型的な果実用圧搾器（柑橘用圧搾器，ＨＡＦＩＣＯ）を使って湿濾過ケーキ（２３０グラム，乾物１８．５％）を機械的に脱水して４５％の乾物含量にした後、それぞれ１．８ｍｍの孔４つを持つダイプレートを装着したステンレス鋼の注射器を使って押出した。得られた押出物を真空オーブン中４０℃で終夜乾燥して、約９５％の乾物含量にした。その乾燥押出物１０ｇをトルエン（０．８５Ｌ）とアセトン（０．１５Ｌ）の混合液１Ｌにより周囲温度で１５分間抽出した。濾過による押出物の分離後、ロバスタチン含量が１．５ｇ／Ｌのロバスチン含有抽出物が得られた。

実施例２５
市販品ＦＥＲＭＩＰＡＮからのエルゴステロールの回収
ＦＥＲＭＩＰＡＮは ヒストブロカデス社（Ｇｉｓｔ ｂｒｏｃａｄｅｓ）が製造している市販の乾燥酵母である。約２グラムのＦＥＲＭＩＰＡＮ試料（バッチ番号９５１０７０２）を１００ｍＬの７０％エタノールを使って周囲温度で３０分間抽出した。得られた透明な抽出物を濾過によって抽出済のＦＥＲＭＩＰＡＮから分離した。この方法で回収された透明な濾液をＮＭＲで分析した。約２２ｇの抽出物中に０．０９ｍｇのエルゴステロールが認められた。エルゴステロールの抽出では、エタノール中の水分含量が重要である。この濃度は最適化したものではない。この実験は顆粒状酵母（押出乾燥酵母）からの貴重化合物エルゴステロールの抽出を示すために行なった例示的実験である。

実施例２５
顆粒化／押出バイオマスの利点
ＰＵＦＡバイオマスを実施例１に記述した経路（濾過、押出および乾燥）に従って加工した。

乾燥押出ＰＵＦＡバイオマスの多孔性を、ポロシメーター（ｐｏｒｏｓｉｍｅｔｅｒ）２０００（Ｐｈａｒｍｉｔａｌｉａ Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ（イタリア））およびマクロポアズ（ｍａｃｒｏｐｏｒｓｅ）ユニット１２０（Ｃａｒｌｏ Ｅｒｂａ）で測定した。その結果を表５に示す。

細孔容積分布を図５に示す。比較のため、図６に乾燥酵母（ＦＥＲＭＩＰＡＮ；Ｇｉｓｔ−ｂｒａｃａｄｅｓ社）の細孔容積分布を示す。

線（と左側のＹ軸）は累積細孔容積を表わし、ヒストグラム（と右側のＹ軸）は相対微分細孔容積分布である。これは、細孔の大部分が１０，０００〜１００，０００ｎｍ細孔直径領域に認められることを示している。

ＰＵＦＡ油を得るために、乾燥押出ＰＵＦＡバイオマス８１ｇを、向流パーコレーション抽出法で周囲温度（２０℃）のヘキサンによるカラム内での抽出にかけた。１３ベッド体積の新しいヘキサン（１ベッド体積はベッド全体を濡らすのに必要なヘキサンの量である）をバイオマスのベッドを通して流した。各ベッド体積の流出ヘキサン中の粗製油の量をヘキサンの蒸発後の重量によって決定した。

抽出条件：
・ バイオマスベッドの粒子内容量は８０ｍｌ（＝１ベッド体積）だった。
・ ３００秒につき１ベッド体積の流速。
・ 総油量の５０％が３００秒で１ベッド体積中に抽出された。
・ 乾燥バイオマスの嵩密度は５７０ｋｇ／ｍ³だった。
・ 粒子直径は０．００２５ｍだった。
・ 抽出温度は２０℃。
・ ヘキサンへの油の溶解度は無限大である。
・ バイオマスの油含量：３５．５（ｗ／ｖ）％

ＰＵＦＡを得るため、ヘキサンを実験室規模でロータベーパー中、６０℃（Ｔ_水槽）で減圧下に蒸発させた。上述のＰＵＦＡ粒子（乾燥押出物）は多孔性の均一な粒子で、抽出には理想的だった。油の交換に利用できる表面積が大きかった。したがって抽出に関する拡散制限は少ない。

比較例２６
先の実施例に記述したバイオマスと培養液を得るために使用した種々の培養条件を次の表に記載する。

発酵技術に関する参考文献
Ｍａｉｓｔｅｒ Ｈ．Ｇ．， Ｒｏｇｏｖｉｎ Ｓ．Ｐ．， Ｓｔｏｄｏｌａ Ｆ．Ｈ．， Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ Ｌ．Ｊ．「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ＩＶ． Ｐｉｌｏｔ−Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅｔｒａａｃｅｔｙｌｐｈｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ ｂｙ Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ（微生物による細胞外スフィンゴ脂質の形成ＩＶ．ハンゼヌラ・シフェリイによるテトラアセチルフィトスフィンゴシンのパイロットプラント生産）」
Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， １０， ４０１−４０６（１９６２）Ｚｕ−Ｙｉ Ｌｉ， Ｙｉｎｇｙｉｎ Ｌｕ， Ｙａｄｗａｄ Ｖ．Ｂ．， Ｗａｒｄ Ｏ．Ｐ．「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ｂｙ Ｓｔｒａｉｎ ｏｆ Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ（モルティエレラ・アルピナの株によるアラキドン酸濃縮物の生産法）」
Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． ７３， １３５−１３９（１９９５） Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ Ｍ．， Ｈｕａｎｇ Ｃ−Ｃ．， Ｂｙｎｇ Ｇ．Ｓ．， Ｔｓａｕ Ｂ−Ｒ．， Ｌｅａｃｈ Ｊ．「Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ ｍａｔｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｅｔａ−ｃａｒｏｔｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（増大したβ−カロチン産生能を持つブラケスレア・トリスポラ交配培養）」米国特許第５，４２２，２４７（１９９５）
Ｋｏｊｉｍａ Ｉ．， Ｋｏｕｊｉ Ｋ．， Ｓａｔｏ Ｈ．， Ｏｇｕｃｈｉ Ｙ．「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ₁₂ ｂｙ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ａｎｄ Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ₁₂−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ（発酵法によるビタミンＢ₁₂の生産法およびビタミンＢ₁₂産生微生物）」米国特許第４，５４４，６３３号
Ｋｙｌｅ Ｄ．Ｊ．， Ｒｅｅｂ Ｓ．Ｅ．， Ｓｉｃｏｔｔｅ Ｖ．Ｊ「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ（渦鞭毛藻類によるドコサヘキサエン酸の生産）」米国特許第５，４０７，９５７号（１９９５）

例示のために記載する実施例に関して本発明を説明する。それらには次の図面を添付する。

図１は、異なる温度における異なる量の押出バイオマスの乾燥性を示す、時間に対する温度と乾物量（％）のグラフである。 図２は、異なる温度における押出バイオマスからの油収量の温度に対するグラフである。 図３は、（既知の）パーコレーション法の作業工程図である。 図４は、抽出された油とその抽出時間の関係を示す、時間に対する油収量のグラフである。 図５は、本発明の乾燥顆粒と先行技術の顆粒のサイズ分布のグラフである。 図６は、本発明の乾燥顆粒と先行技術の顆粒のサイズ分布のグラフである。

Claims (36)

1. １種類またはそれ以上の化合物を、そのような化合物を産生した微生物を含む微生物バイオマスから単離する方法であって、次の段階を含む方法：
   ａ）２５％から８０％までの乾物含量を持つバイオマスを用意または入手する；
   ｂ）そのバイオマスを２５％から８０％までの平均乾物含量を持つ顆粒状粒子に造粒する；
   ｃ）その顆粒状粒子を乾燥して少なくとも８０％の平均乾物含量を持つ乾燥顆粒を得る；
   ｄ）（ｃ）で得た乾燥顆粒からその化合物または各化合物を精製、抽出または単離する。
2. （ｂ）において造粒がバイオマスの押出によってなされる請求項１または２の方法。
3. 造粒前にバイオマスが破砕または混練される請求項２の方法。
4. （ａ）のバイオマスが発酵液に対して行われる固／液分離によって得られる先の請求項のいずれかの方法。
5. 固／液分離が機械的脱水と併用される請求項４の方法。
6. （ａ）において２５〜８０％の乾物含量を持つバイオマスが、
   ｉ）バイオマスへの固形物質の添加、または
   ｉｉ）バイオマスの脱水
   によって得られる先の請求項のいずれかの方法。
7. （ｃ）の顆粒状バイオマスを少なくとも８０％の乾物含量にする乾燥が流動床もしくはサブ流動床乾燥または真空乾燥によって行われる先の請求項のいずれかの方法。
8. バイオマスが菌類を含むまたは菌類に由来する先の請求項のいずれかの方法。
9. その菌類がケカビ目（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）に属する請求項８の方法。
10. その菌類がクサレケカビ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）に属する請求項９の方法。
11. その菌類がモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）である請求項８〜１０のいずれかの方法。
12. バイオマスが藻類を含むまたは藻類に由来する請求項１〜６のいずれかの方法。
13. その藻類が渦鞭毛藻類であり、かつ／または、クリプセコジニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）に属する請求項１２の方法。
14. その藻類がクリプセコジニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ）である請求項１２または１３の方法。
15. その化合物が、脂質に含まれていてもよい多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）である先の請求項の方法。
16. その多価不飽和脂肪酸がＣ１８、Ｃ２０もしくはＣ２２ω−３またはＣ１８、Ｃ２０もしくはＣ２２ω−６多価不飽和脂肪酸である請求項１５の方法。
17. その化合物がＣ２０もしくはＣ２２ω−３またはＣ２０もしくはＣ２２ω−６多価不飽和脂肪酸である請求項１６の方法。
18. その化合物がアラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）である先の請求項のいずれかの方法。
19. その菌類がヒゲカビ属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）またはコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）に属する請求項８の方法。
20. その化合物がカロチノイドまたはＨＧＭ−ＣｏＡレダクターゼ阻害因子（例：ロバスタチン、プラバスタチンまたはコンパクチン）である請求項１〜１３のいずれかまたは請求項１９の方法。
21. その微生物が酵母である先の請求項のいずれかの方法。
22. その化合物がテトラアセチルフィトスフィンゴシン（ＴＡＰＳ）である請求項２１の方法。
23. その微生物が細菌である先の請求項のいずれかの方法。
24. その化合物がビタミンである請求項２３の方法。
25. バイオマスが酸性化（例えばｐＨ＜５への酸性化）の後に発酵液から得られる先の請求項のいずれかの方法。
26. 酸性化（例えば約２のｐＨへの酸性化）によって化合物の沈殿が起こる請求項２５の方法。
27. 菌類を含むまたは菌類に由来する微生物押出物。
28. その菌類がクサレケカビ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）に属する請求項２７の押出物。
29. バイオマスの顆粒状粒子を含む組成物であって、その粒子が少なくとも３０％でしかも７０％未満の平均乾物含量を持ちかつバイオマスを顆粒化することによって得られたもの。
30. 乾燥顆粒を含む組成物であって、その顆粒が微生物バイオマスに由来し、乾燥され、少なくとも８０％の平均乾物含量を持つもの。
31. その顆粒状粒子または乾燥顆粒が押出によって形成される請求項３０または３１の組成物。
32. そのバイオマスが菌類を含む請求項２９〜３０のいずれかの組成物。
33. その顆粒状粒子が０．３〜１０ｍｍの直径を持ち、その長さが平均でその顆粒の直径の２〜６倍である請求項２９〜３２のいずれかの組成物。
34. 食品組成物、栄養補助品、化粧用および／または医薬用組成物を製造するための、請求項１〜２６のいずれかの方法によって単離、抽出または精製された化合物の使用。
35. その食品組成物が乳児用調製粉乳を含む請求項３４の使用。
36. バイオマスの顆粒から１種類またはそれ以上の化合物を単離する方法であって、次の段階を含む方法：
    ａ）少なくとも８０％の乾物含量を持つ乾燥顆粒であって、そのような化合物を産生した微生物を含む微生物バイオマスから得られたものを用意する；
    ｂ）その乾燥顆粒から溶媒抽出によってその化合物または各化合物を抽出もしくは単離する。

Images