KR20010071721A

KR20010071721A - 스핑고이드 염기를 생산하는 개선된 미생물 균주

Info

Publication number: KR20010071721A
Application number: KR1020017000063A
Authority: KR
Inventors: 휴고 스트리크스트라
Original assignee: 비이체 코이닝; 코스모페름 베.파우
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2001-07-31
Also published as: BR9911674A; WO2000001839A1; EP1093525A1; CN1309718A; JP2002519070A

Abstract

본 발명은Pichia ciferriiY-1031 F-60-10 에 비하여 실질적으로 향상된 스핑고이드 염기의 생산성을 가진Pichia균주를 개시한다. 본 발명은 더욱이 스핑고이드 염기의 항균작용에 기초한 초기의 스크리닝 단계를 포함하는 스핑고이드 염기의 향상된 생산성을 가진 미생물 균주를 얻는 방법을 개시한다.

Description

스핑고이드 염기를 생산하는 개선된 미생물 균주{IMPROVED MICROBIAL STRAINS PRODUCING SPHINGOID BASES}

용어 "스핑고리피드"는 스핑고신과 같은 스핑고이드 염기로부터 유래된 지질군을 나타낸다. 스핑고리피드는 종종 동물, 식물과 미생물의 세포막에서 나타난다. 인간의 경우 스핑고리피드의 정확한 기능은 밝혀지지 않았지만, 이 화합물군이 신경계에 있어서 전기 신호의 전달과 세포막의 안정화에 관련이 있다는 것은 분명하다. 글리코스핑고신이 면역계에서 작용을 한다는 것이 또한 제시되어 왔었다. 특정 글리코스핑고신은 세균독소의 수용체로서 작용하고 아마도 또한 세균과 바이러스의 수용체로서 작용한다.

세라미드는 염기가 지방산과 아미드 결합으로 된 스핑고신,디히드로스핑고신 또는 피토스핑고신을 포함하는 특정 스핑고리피드군이다. 세라미드는 피부의 상피층인 각질층의 주요 지질 성분이다. 각질층은 중요한 간벽기능을 하는데, 외부 화합물은 통상적으로 그 간벽의 외부에 위치하여 수분의 유출이 제한된다. 세라미드와 같은 스핑고리피드를 포함하는 성분의 국소처리법은 예를 들어 간벽 기능과 피부의 수분 보유 특성을 개선한다.

(Curatolo,1987,Pharm. Res. 4,271-277;Kerscher et al. ,1991,Eur. J. Dermatol. 1,39-43)

스핑고이드 염기는 그 자체로 신호 전달 경로의 주요 효소인 단백질 키나아제 C 의 활성을 막는 것에 의해서 몇몇의 생리적인 작용을 매개하는 것으로 알려졌다. 더욱이 스핑고이드 염기는 화장품용 또는 피부용 조성물에 포함되어 그들의 항염증작용과 항균 작용을 한다.

통상적으로, 화장품용 이종성 스핑고리피드 제제는 주로 동물원으로부터 추출된다. 분명하게, 이것은 산업적인 규모에서 볼때 다소 비용이 많이 드는 과정이다. 더욱이, 이러한 물질들은 예를 들어, 소 조직의 소 해면양 뇌병증(bovine spongiform encephalopathy:BSE) 의 가능한 존재로 인해 잠재적으로 불안정한 것으로 밝혀져 왔다. 따라서, 화장품 산업은 동물 조직을 제외한 공급원으로부터 얻어진 순수하고 잘 규정된 새로운 공급원에 대한 증가하는 관심을 나타내왔다.

효모pichia ciferrii(Wickerham and Stodola,1960, J. Bacteriol. 80,484-491)와 같은 미생물은 그 자체로 스핑고리피드 뿐만 아니라 스핑고신, 피토스핑고신 및/또는 이의 유도체를 생성하는 것으로 밝혀져왔다. 이 발견은 스핑고리피드 자체에 대한 공급원을 제공하며 이러한 화합물의 동물원의 사용에 대해 가능한 대안을 제공할 수 있는 공업적으로 가치있는 화합물의 생산을 위한 출발 물질에 대한 공급원을 제공한다.

예를 들어,pichia ciferrii에 의해 생산된 스핑고신, 디히드로스핑고신 및피토스핑고신의 아세틸화된 유도체는 탈아세틸화될 수 있고 이렇게 획득된 스핑고신, 디히드로스핑고신 또는 피토스핑고신은 세라미드, 슈도세라미드 및/또는 글리코세라미드와 같은 관련 화합물로 화학적으로 전환될 수 있고 이것들은 차례로 화장품과 피부용제품(국제특허출원 WO 93/20038)에 이용될 수 있다.

불행하게도, 현재까지 연구된 효모 균주의 어느것도 ,Pichia ciferriiNRRL Y-1031 F-60-10 조차도, 그러한 화합물의 효율적이고 경제적인 매력적인 공급원인 스핑고신,피토스핑고신 또는 이의 유도체와 같은 스핑고리피드 염기의 충분한 양을 효율적으로 생산하지 못했다.

국제 특허 출원 WO 95/12683 은 모균주인 NRRL Y-1031 F-60-10에 비하여 향상된 TAPS의 생산성을 가지는pichia ciferrii균주를 개시한다. 그러나, 이러한 "개선된" 균주의 생산성은 많아야 1. 6배 증가된다.

실질적으로 더 높은 생산성을 가진 균주를 얻는 것이 매우 바람직하지만 그것은 미생물 세포에 대한 스핑고이드 염기의 독성 때문에 더 이상의 생산성의 개선을 이룰수 있는지는 불확실하다. (Pinto et al. ,1992,J. Bacteriol. 174,2565-2574;Bibel et al. ,1992,J. Invest. Dermatol. 98,269-273)

본 발명은 스핑고이드 염기의 생산성이 개선된 미생물 균주와 이의 생산방법에 관한것이다.

본 발명은 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 실질적으로 향상된 생산성을 나타내는 Pichia 균주를 개시한다. 본 발명의 명세서에서,스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 실질적으로 향상된 생산성은 동일 조건하에서 측정될 때 CBS 408. 94(WO 95/12683참조)로서 기탁된Pichia ciferriiY -1031 F-60-10 의 생산성보다적어도 두 배 이상의 생산성에 관련됨을 의미한다. 바람직하게는, 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 실질적으로 향상된 생산성은 CBS 408. 94에 로서 기탁된Pichia ciferriiY -1031 F-60-10 의 생산성보다 적어도 4배,더욱 바람직하게는 적어도 6배,한층 더 바람직하게는 적어도 8배, 가장 바람직하게는 적어도 10배의 생산성에 관련됨을 의미한다.

본 발명은 더욱이 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 향상된 생산성을 보여주는 미생물 균주를 분리하는 새로운 방법을 개시한다.

본 발명의 새로운 방법은 균주군의 스핑고이드 염기의 생산성을, 상기 균주군내에 존재하는 각 개개의 균주에 의해 생산된 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 항균 작용을 결정하는 것에 의해서 측정하는 초기 스크리닝단계를 포함한다. 이 초기 스크리닝 단계는 유리하게도 스핑고이드 염기의 생산성을 위한 실질적인 양의 개개의 균주의 스크리닝과 기준균주에 비하여 향상된 생산성을 보이는 균주가 풍부한 소단위 균주의 선택을 허용한다.

특히, 본 발명 방법은 기준균주에 비하여 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 향상된 생산성을 나타내는 미생물 세포 또는 그로부터 유도된 균주의 스크리닝 또는 분리에 관련된다. 바람직한 상기 기준균주는Pichia ciferriiY-1031 F-60-10 또는 이의 유도체이다.

본 발명의 방법은 본질적으로 다음 단계들을 포함한다.

균주군내에 존재하는 각 개개의 균주에 의해 생산된 스핑고이드 염기의 항균작용을 측정하는 것에 의해 상기 균주군의 스핑고이드 염기의 생산성을 스크리닝하는 단계,

적어도 한 번 이상의 세포의 계대를 위해 소단위 균주를 선택하는 단계,

상기 선택된 소단위내의 각 개개의 균주로부터 많은 세포를 다음 배지로 옮기는 것에 의해 세포를 더욱 계대시키고 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 생산성에 기여하는 조건하에서 상기 다음 배지내에서 상기양의 세포를 배양하는 단계,

동일 조건하에서 배양될 때 기준균주의 생산성에 비하여 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 향상된 생산성을 가진 균주를 선택하는 단계

본 발명에서 사용되는 용어, 스핑고이드 염기에는 용어, 유도체가 항상 구체적으로 언급되는 것은 아니지만 하기에 특정된 대로의 스핑고이드 염기 유도체를 포함하는 것으로 본다.

상기에 기술된 본 발명의 방법은 더욱이 한 번의 스크리닝과 선택을 나타낸다. 그러나, 반복된 스크리닝과 선택 과정은 또한 향상된 스핑고이드 염기의 생산성을 보이는 미생물 균주의 획득에 적용될 수 있다.

상기 균주군의 초기 스크리닝의 제 1단계로서, 상기 균주군안에 존재하는 각 개개의 균주로부터 얻어진 세포들은 다른 개개의 균주에서 기원된 세포들과 섞이지 않도록 주의하면서 적당한 배양 배지에 접종한다.

다음 단계로, 세포들은 스핑고이드 염기 화합물의 생산에 기여하는 조건하에서 배양된다. 충분한 성장이 이루어졌을 때, 각 개개의 배양에서의 스핑고이드 염기 생산성은 스핑고이드 염기를 포함하는 배양 상청액의 항균 작용을 결정하는 것에 의해 측정된다.

항균 작용을 결정하기 위한 배양 상청액을 얻기 위해 세포를 배양하는 것은 편리하게도 어떠한 적당한 시스템에서도 수행될 수 있다.

예를 들어, 배양은 진탕 플라스크 또는 마이크로타이터 평판에서 수행될 수 있다.

스핑고이드 염기를 포함하는 배양 상청액의 항균 작용은 상기 배양 상청액의 존재하에 상기 지표 균주의 인큐베이션에 의해 생산된 적당한 지표 균주의 성장 저해의 정도를 측정하는 것에 의해서 편리하게 결정된다. 적당한 지표 균주는 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 항균작용에 영향받기 쉬운 어떠한 미생물 균주일 수 있다. 바람직하게는 지표 균주는 세균 균주이고, 더욱 바람직하게는 그람-양성 세균 균주이다.

간단히는, 적당히 희석된 지표 균주를 스핑고이드 염기의 생산성을 알기 위해 스크리닝되어질 개개의 균주로부터 얻어진 배양 상청액과 함께 인큐베이션한다.

적당한 희석은 지표 균주의 예를 들어 하룻밤 동안의 배양과 같은 정지 배양을 희석하여 얻어질 수 있다.

하룻 밤동안 배양한것의 적당한 희석은 통상적으로 약 100 에서 약 500배이다.

스핑고이드 염기를 포함하는 배양 상청액에 의해 생산된 것의 성장 저해 정도는 인큐베이션된 표본의 광학밀도를 측정하는 것에 의해서 결정된다. 인큐베이션 조건은 사용된 지표 균주와 스핑고이드 염기의 생산성에 따라 다를 수 있다.

예를 들어, 인큐베이션 시간은 얻어진 성장 저해의 정도에 따라서 아마도 4-8 시간에서부터 하룻밤동안의 배양에 이르기까지 다양할 수 있다.

인큐베이션 온도는 지표 균주의 성장을 위한 최적의 조건에 따를 수 있다.

통상적으로, 인큐베이션 온도는 37℃이다. 인큐베이션이 계속되는 동안, 온도는 약 25℃까지 낮아질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서,지표 균주는 세균 균주인Staphylococcus aureus또는Streptococcus pyogenes종 이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 초기의 스크리닝 단계는 인큐베이션과 분석 단계를 위해서 마이크로타이터평판 시스템을 사용하여 수행된다. 마이크로타이터평판 시스템사용의 잇점은 많은 양의 개개의 균주가 실질적으로 자동화된 조건하에서 스크리닝될 수 있다.

항균 작용 분석(assay)의 결과에 기초하여, 소단위 균주가 적어도 한 번 이상의 더 이상의 세포 계대를 위해 선택된다.

상기의 더이상의 세포 계대는 상기 선택된 소단위 균주내에 존재하는 각 개개의 균주로부터 다음 배지로의 세포의 이동과 스핑고이드 염기 화합물의 생산에 기여하는 조건하에서 각 개개의 균주의 후속 배양을 포함한다. 그다음 배양 배지 또는 그것의 적절한 희석을 적절한 분석을 사용하여 스핑고이드 염기의 생산성에 대해 분석한다.

예를 들어, 스크리닝된 소단위내에 존재하는 각 개개의 균주로부터 얻은 세포들을 진탕 플라스크 또는 튜브 배양에서 배양하다. 각 배양마다의 스핑고이드 염기의 생산성은 배양 배지 또는 이의 적합한 희석의 분석, 바람직하게는 정량 분석에 의하여 결정된다. 그다음 기준균주와 비교하여 생산성에서 일정 증가를 이루는 균주를 확인한다.

본 발명의 스크리닝과 선택의 방법의 대상이 되는 상기 균주군은 몇가지 방법들에 의해 얻어질 수 있는데, 이 방법들은 본 발명에 중요하지 않다.

예를 들어, 상기 균주군은 다른 종, 다른 속, 다른 과 등으로부터의 균주와 같은 스핑고이드 염기의 생산성 분석과 관련없는 균주군을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 스크리닝과 선택 방법의 대상이 될 수 있는 균주는 스핑고이드 염기 및/또는 이의 유도체를 자연히 생산할 수 있는 효모, 세균과 균류 균주를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 선택된 균주는 원하는 생산물의 가장 높은 고유의 생산 수준을 나타내는 균주이다.

본 발명에 사용된 효모 균주는Saccharomyces, Kluveromyces, Debaromyces, Pichia, Hansenula, Lipomyces, Sporobolomyces, Cryptococcus, Torulopsis, Endomycopsis, Candida, Trichosporon, Hanseniaspora 및 Rhocotorula속의 종으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 효모 균주는Pichia, Hansenula, Endomycopsis, Candida, Saccharomyces 및 Hanseniaspora속과 특히Pichia ciferrii, Candida utilis 및 Sacchromyces cerevisae속에 속한다. 가장 바람직한 것은Pichia속에 속하는 효모 균주이고 가장 바람직하게Pichia ciferrii종(특히Pichia ciferriiNRRL Y -1031 F -60-10) 에 속하는 효모 균주이다.

바람직한 균류는Aspergillus와Penicillium 속이며 더욱 바람직하게는Aspergillus sydowi및Penicillum notatum종이다.

바람직한 세균은Sphingobacterium속(특히S. Versatilis, S. multivorum및S. mizutae),Acetobacter속(특히A. xylinum),Baeteroides속(특히B. melaninogenicus, B. fragilis, B. ruminicola및B. thetaiotaomicron), Bdellovibrio(특히Bdellovibrio bacteriovus), Xanthomnas(특히 Xanthomonas campestris) 및Flavobacterium속 (특히Flabacterium devorans) 이다.

발명의 바람직한 구체예에서, 상기 균주군은 적절한 모균의 돌연변이유발에 의해서 얻어진다.

발명의 이 구체예에 따르면, 세포의 모 개체군은 상기 개체군에 유전적 다양성을 도입시킬 목적으로 돌연변이를 유발하는 처리를 받게 된다. 적용되어지는 돌연변이 유발 처리의 형태는 본 발명에 중요하지 않다. 돌연변이유발 처리는 전형적으로 소위 고전적인 처리를 포함하나, 또한 DNA가 매개된 형질전환을 포함할 수 있다.

고전적인 돌연변이유발 처리는 N-메틸, N'-니트로, N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 에틸 메탄 술폰에이트(EMS) 와 같은 알킬화제와 같은 화학적 돌연변이제로의 처리 또는 UV 조사와 같은 물리적 처리 또는 양 처리의 조합을 포함한다.

처리는 바람직하게는 상당한 양의 세포가 단일의 돌연변이를 일으킨 돌연변이유발된 세포의 개체군이 얻어지거나 그리고 동일 조건하에서 배양될 때 모균주와 비교하여 향상된 수준의 원하는 생산물을 생산할 수 있는 돌연변이체 균주가 제공되도록 하는 방법으로 수행된다.

DNA가 매개된 형질전환에는 무작위로 선택된 동종 또는 이종의 핵산 조각에 의한 형질전환 및/또는 특이적으로 선택된 DNA 조각, 예를 들어 스핑고이드 염기또는 이의 유도체의 생합성에 관여하는 하나 또는 그 이상의 유전자들을 포함하는 DNA 조각에 의한 형질전환을 포함한다.

예를 들어, 제 1의 생합성 단계에 관여하는 유전자들인 LCB1과 LCB2(세린 팔미토일 트랜스퍼아제의 소단위를 암호화함)가 클론되었다(Nagiec et al. (1994),Proc . Natl. Acad. Sci. USA 91, 7899-7902).

예를 들어 그 유전자 투여량을 증가시키는 것에 의한 이들 유전자의 발현의 증가는 더 높은 비율로 탄소를 중추 물질대사 경로로부터 스핑고이드 염기 생합성 순서로 포획할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

유사하게, SUR2(피토스핑고신의 4-OH 기를 도입하는 히드록실아제를 암호화함:Haak et al. (1997),J. Biol. Chem. 272,29704-29710) 과 LCB3(스핑고이드 염기의 운반에 관여함;Qie et al. (1997),J. Biol. Chem. 272,16110-16117)의 과발현은 스핑고이드 염기의 생산성을 더욱 높일 수 있다.

게다가 ELO2 와 ELO3( 매우 긴 사슬 지방산의 생합성에 관여함; Oh et al. (1997),J. Biol. Chem. 272,17376-17384)그리고 AUR1(세라미드와 이노시톨 부분을 연결시키는데 관여함;Nagiec et al. (1997),J. Biol. Chem. 272,9809-9817)와 같은 많은 유전자들이 스핑고이드 염기로부터 세라미드의 생합성에 관여하는 것으로 공지되어 있다.

이 유전자들의 발현을 조절하는 효과를 예견하는 것은 어려울지 모르나, 이 발현의 저하는 아세틸화되고 회수가능한 형태로 분비된 스핑고이드 염기의 더 큰 부분을 얻을 수 있는 것은 분명하다.

발명의 바람직한 구체예에서, 돌연변이유발 처리를 받는 적당한 모균주는Pichia속 균주이고, 더욱 바람직하게는Pichia ciferrii종 균주이고, 가장 바람직하게는pichia ciferriiY-1031 F-60-10종 또는 이의 유도체이다.

따라서 본 발명은 기준균주와 비교하여 향상된 정도로 스핑고이드 염기 또는 그의 유도체를 생산할 수 있는 미생물의 균주를 분리하는 방법을 제공한다.

특히, 향상된 수준의 스핑고노신 및/또는 3-케토스핑고신,트리아세틸스핑고신,디아세틸스핑고신 및 N-아세틸스핑고신을 포함하는 이의 케토,글리코실화 또는 아세틸화된 유도체; 디히드로스핑고신 및/또는 3-케토디히드로스핑고신, 트리아세틸디히드로스핑고신, 디아세틸디히드로스핑고신 및 N-아세틸디히드로스핑고신을 포함하는 케토, 글리코실화 또는 아세틸화된 이의 유도체; 그리고/또는 피토스핑고신 및/또는 테트라아세틸피토스핑고신,트리아세틸피토스핑고신,디아세틸피토스핑고신과 N-아세틸피토스핑고신을 포함하는 케토,글리코실화 또는 아세틸화된 이의 유도체를 생산할 수 있는 미생물 균주들이 제공된다.

바람직한 균주는 향상된 수준의 피토스핑고신과 트리아세틸피토스핑고신(TriAPS)과 테트라아세틸피토스핑고신(TAPS)와 같은 부분적으로 또는 전체적으로 아세틸화된 이의 유도체를 생산할 수 있는 균주이다.

실시예에서 구체화된 대로, 성장 조건의 기술은 본 발명의 균주로부터 얻어진 원하는 생산물의 생산 수준을 결정하기 위한 기준으로서 제공된다.

그러나, 원하는 생산물의 생산에 도움이 되는 다른 배양 조건들은 ,당업자에게 공지된 바에 따라, 본 발명의 취지에 벗어나지 않게 또한 이용될 수 있다.

예를 들어, 진탕 플라스크 배양에서 분석할 때 기준균주와 비교하여 스핑고이드 염기의 생산성에서 어떤 향상을 보이는 균주는 통상적으로 대규모로 측정될 때 실질적으로 유사한 향상을 보인다.

정량 분석은 당업계에서 공지된 다양한 방법들에 의해 수행될 수 있다.

예를 들어, TAPS 생산 수준에 기초한 정량 분석은 CDCl₃같은 적절한 용매에서 추출된 상기 배양 상청액인 진탕 플라스크 배양 상청액에서 수행될 수 있고, NMR에 의해 분석될 수 있다. TAPS 는 NMR 분석의 표준으로서 바람직하게 사용된다.

스핑고신, 피토스핑고신 및 디히드로스핑고신; 스핑고신, 피토스핑고신 및 디히드로스핑고신의 트리아세틸, 디아세틸 및 N-아세틸 유도체; 스핑고신, 피토스핑고신 및 디히드로스핑고신의 글리코실화된 유도체; 3-케토 디히드로스핑고신 및/또는 3-케토스핑고신과 같은 다른 원하는 생산물은 정량으로 같은 방법으로 결정될 수 있고 TAPS 표준은 기준으로서 사용될 수 있다.

발명의 한 구체예에서, 기준균주인 Y-1031 F-60-10 과 비교하여 향상된 양의 TriAPS 를 생산하는Pichia균주, 바람직하게는Pichia ciferrii균주가 분리된다. 발명의 바람직한 구체예에서, 주요 스핑고이드 염기로서 TriAPS 를 생산하는, 즉 형성된 TAPS가 낮거나 0인 수준을 갖는 Pichia 균주가 분리된다.

본 발명의 더나아간 측면은, 상기 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 생산에 기여하는 조건하에서 본 발명의 방법에 의해 얻어질 수 있는 균주의 발효를 포함하는 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 생산 방법에 관한 것이다. 따라서 생성된 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체는 통상적인 추출과 회수 기법을 사용하여 발효 육즙, 바람직하게는 발효 상청액으로부터 회수될 수 있다.

일단 원하는 생산물이 얻어지면, 직접적으로 사용되거나 또는 사용 목적에 따라 또다른 과정을 거칠 수 있다. 예를 들어, 스핑고신, 디히드로스핑고신 및/또는 피토스핑고신의 아세틸화 유도체는 효소적으로 또는 화학적으로 탈아세틸화될 수 있다.

탈아세틸화된 스핑고이드 염기 유도체 ,예를 들어 스핑고신, 디히드로스핑고신 및/또는 피토스핑고신은 직접적으로 사용되거나 또는 세라미드(WO93/20038참조), 글리코세라미드 및 슈도세라미드와 같은 상업적으로 가치있는 스핑고리피드 생산물의 합성에서 출발 물질로서 연속적으로 이용될 수 있다.

본 발명에 따라 얻어진 스핑고이드 염기 화합물의 직접적인 사용은 화장품 및 피부용 조성물에서 상기 화합물의 사용을 포함한다.

하기의 실시예는 당업계에서 통상의 기술을 가진 자에게 본 발명의 완전한 개시와 설명을 주기 위해 제공된 것이며 발명자가 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

TAPS 생산의 생물학적 검정(bioassay)을 위한 지표 균주의 실험

하기의 지표 균주들은 TAPS 표준에 대한 민감도를 알기 위해 한천 평판에서시험하었다.

Staphylococcus aureusATCC 14458

Streptococcus pyogenesATCC 12344

Micrococcus luteusATCC 10204

Serratia marcescensATCC 14041

네가지 세균 균주를 37℃에서 500 ml 진탕 플라스크의 100ml 브레인 하트 인퓨젼(BHI) 육즙에서 정지기에 이를 때까지 성장시켰다. 이어서, 정지기 배양에서 0. 5 ml 를 1 mM CaCl₂를 포함하는 100ml 용해된 BHI 한천(45℃)과 혼합한다. 이 혼합물을 페트리 디쉬에 붓고, 고형화시킨다.

그때 무균의 메탈 링들은 ( 내부 지름은 6mm ) 한천 표면에 놓고 50 % 에탄올내의 50mg/ml 의 TAPS 스톡 용액 50㎕을 링내에 도입한다. 이어서, 한천 평판을 37℃에서 인큐베이션하고,금속 링으로부터 연장되는 성장 저해 범위가 측정되었다.

분명한 성장 저해는S. aureus와 S. pyogenes에서 발견되었고, 더 적은 정도로는M. leteus에서 발견되었다.

대조적으로 S. marcescens의 성장은 이들 조건하에서 TAPS 용액에 의해 저해되지 않았다.

실시예 2

마이크로타이터 평판상에서의 TAPS 생산의 생물학적 검정:일차선택

지표균주인Staphylococcus aureusATCC 14458 은 저온 냉동 상태에서 저장되었다.

하나의 언 튜브를 25ml BHI 배지를 포함하는 100ml 진탕 플라스크를 인큐베이션하는데 사용하였다. 배양은 37℃에서 하루밤동안(16-17시간)동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 그 하룻밤 동안의 배양을 1 mM CaCl₂를 포함하는 신선한 BHI 배지에서 250-500배 희석하였다.

생산 균주를 한천 표면으로부터 33 g/l dextrose, 1g/l 효모 추출물, 4.83 g/l NH₄Cl, 1.0g/l KH₂PO_4,0.88 g/l MgSO₄. 7aq, 0.06g/l NaCl, 0.2 g/l CaCl₂. 2aq, 20 g/l KH-프탈레이트, 농축된 미량원소용액 0.3ml/l, 농축 비타민 용액 1.5ml/l과 Structol 소포제 0.16ml/l가 포함된 25ml 의 배지를 포함하는 100ml 진탕 플라스크에 접종하였다.

회전식 진탕기에서 72시간동안 성장시킨 후에(25℃) 플라스크를 표본화되었고, 표본은 4000rpm으로 10분동안 원심분리하였다.

상청액 부분의 10㎕가 96-웰 평평 바닥 마이크로타이터 평판에 이식되었다. 이 과정은 하나의 표본의 8 복제를 가진 한 배열의 마이크로타이터 평판을 채우기 위해 7번 반복된다. 매 마이크로타이터 평판마다 TAPS표준 용액의 8번의 복제뿐만 아니라 2*8 배지 블랭크를 포함시켰다.

이어서, 지표 균주의 희석된 현탁액 150 내지 200㎕를 웰에 첨가하였다.

마이크로타이터 평판은 Flow Laboratories "Titertek"진탕 인큐베이터상(속도4)에서 37℃로 5-6시간 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후에 Anthos Htlll 마이크로타이터 평판 리더를 사용하여 웰의 광학밀도를 620㎚에서 측정하였고,한 균주의 8 복제의 평균값을 TAPS생산의 척도로서 취하였다.

성장 저해가 너무 심했다면, 인큐베이션은 26℃에서 하룻밤동안 연장시켰다.

실험예 3

2차 선택에서의 생물학적 검정의 이용

1차 선택에서의 생물학적 검정 방법에 의해서 선택된 균주가 정말로 높은 생산자인지를 확인하기 위해서 세벌로하여 2차 선택을 하였다.

각 선택된 균주를 저온 냉동된 글리세롤 현탁액으로부터 실시예 2에 기술된 100ml의 배지를 포함하는 500ml 배플된 진탕 플라스크에 접종하였다.

25℃ 에서 회전식 진탕기상에서 40시간의 성장을 거친 후에 , 이 종자 배양을 사용하여 5부피% 수준에서 100ml의 같은 배지를 함유하는 세개의 500ml 배플된 진탕 플라스크에 접종하였다.

이어서, 이들 생산 배양을 진탕기에서 또 48시간동안 인큐베이션하였고 표본화하였다.

이 표본들을 실시예 2에서 기술된 대로 처리하였다.

상청액 부분은 실시예 2에서 기술된 대로 생물학적 검정을 받게 했지만, 이번에는 TAPS 농도는 또한 NMR 분광학을 사용하여 직접 측정하였다.

균주를 또한 생물학적 검정이 더 높은 생산 수준별로 구별될 수 있는지를 산정하기 위해 사용된 NMR 결과에 기초하여 선택하였다.

표본 상청액을 TAPS 농도에 비례하여 희석하면, 항상 그러함을 발견하였다. 생물학적 검정이 더욱 향상된 균주의 배양에서 관찰된 더 높은 TAPS-농도와 일치시키기 위해 5-배까지의 희석을 사용하였다.

생물학적 검정이 서로 다른 생산 수준을 나타내는 균주를 구별하는 능력의 한 예로서, 공지된 생산 수준을 가진 많은 균주의 결과를 하기의 표에 나타내었다.

균주	생물학적 검증 OD	상대적인 TAPS 생산도
blank	649
COS 1A	567	100%
COS 6	465	152%
COS 10	361	182%
COS 17	344	242%

실시예 4

COS 1A 균주와 COS 10 균주의 직접적 비교

반수체 야생형 균주Pichia cifettiF-60-10 의 가동중인 세포 은행인 COS 1A와, 화학적 돌연변이유발에 의해 얻어지고 실험예2에서 기술된 1차 선택에 의해 선택된 균주의 하나인 COS 106의 가동중인 세포 은행인 두 균주를 비교하였다.

COS 10 은 CBS 101070으로서 1998년 7월 23일 "Centraal Bureau voor Schimmelcultures"에 기탁되었다.

비교는 실시예 3에서 기술된 대로 수행하였다. 하기의 표는 결과를 제시한다.

균주	생물학적 검정OD(620)	NMR에 의한 TAPS(g/l)
COS1A(F-60-10의 가동중인 세포 은행	0.2420.3690.160	0.350.310.41
COS10(COS106의 가동중인 세포 은행	0.1180.1290.119	0.750.740.79

생물학적 검정에서 성장 저해와 NMR에 의해 측정된 TAPS 생산간에 좋은 상관관계가 있었다는 것은 분명하다. 결과적으로, 같은 조건하에서 야생형 균주보다 두 배 더 많은 TAPS를 생산하는 균주를 선택하였다.

실시예 5

COS 17과 COS 144의 비교

연속된 균주 개선의 주기 동안(돌연변이유발과 선택) 지금까지 얻어진 가장 좋은 균주인 COS 17을 대조 표준으로 사용하였다. 본 실험에서, 실시예 3에 기술된 과정을 이용하나 표본 상청액을 4배 희석하여 선택된 균주 COS 144의 결과를 대조 표준과 비교하였다.

균주	생물학적 검정 OD(620)	NMR에 의한 TAPS
COS17	204159327	0.90.90.6
COS144	11010394	1.11.21.1

균주 COS 144는 COS 17에 비하여 약 25%정도 증가된 TAPS 생산을 보인 것이 분명하고 이것도 COS 144에 COS1A에 비하여 302% 생산 수준의 증가를 부여한다. 그러므로 COS 144와 마찬가지로 같은 TAPS 생산을 가진 것으로 보여진 COS 19A로 명명된 이 균주의 가동중인 세포 은행를 제조하였다.

실시예 6

생물학적 검정이 TriAPS 생산균주를 선택하는 능력

생물학적 검정은 또한 TriAPS 생산자를 선택하기 위해 사용될 수 있는데, 왜냐하면 이 화합물에 의한 성장 저해는 TAPS에 대한 것과 같은 수준이기 때문이다.

실시예 2에서 기술된 과정을 사용하여, 하기의 표에서 보여지는 바와 같이 주로TAPS를 생산하는 두 균주,TAPS 와 TriAPS를 모두 생산하는 두 균주와 단지 TriAPS를 생산하는 두 균주가 선택되었음이 밝혀졌다.

균주	COS17에 대한 %로서 NMR에 의해서 전부 아세틸화된 PS	총 APS에 대한 %로서 TAPS	총 APS 에 대한 %로서의 TriAPS
COS17	100	90	10
COS141	60	0	100
COS19A	133	80	20
COS154	213	53	47
COS159	173	85	15

전부 아세틸화된 피토스핑고신의 생산성은 COS 154에서 가장 높았던 것이 분명하고, 이것은 이 균주에 야생형 균주 COS1A에 비하여 515%의 생산 수준을 부여한다.

Claims

동일 조건하에서 배양될 때 CBS 408. 94로서 기탁된Pichia ciferriiY-1031 F-60-10의 생산성보다 적어도 두 배 이상 높은 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 생산성을 보이는Pichia속의 균주.
제 1 항에 있어서, 동일 조건하에서 배양될 때, CBS 408. 94로서 기탁된Pichia ciferriiY-1031 F-60-10의 생산성보다 적어도 4배, 바람직하게는 적어도 6배, 더욱 바람직하게는 적어도 8 배, 가장 바람직하게는 적어도 10배 이상 높은 생산성을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,Pichia ciferrii종에 속하는 것을 특징으로 하는 균주.
제 3 항에 있어서,Pichia ciferriiY-1031 F-60-10 종의 유도체인 것을 특징으로 하는 균주.
스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 향상된 생산성을 가진 미생물 세포 또는 이로부터 유도된 균주를 분리하는 방법에 있어서,

균주군내에 존재하는 각 개개의 균주에 의해 생산된 스핑고이드 염기의 항균작용을 측정하는 것에 의해 상기 균주군의 스핑고이드 염기의 생산성을 스크리닝하는 단계,

적어도 한 번 이상의 세포의 계대를 위해 소단위 균주를 선택하는 단계,

상기 선택된 소단위내의 각 개개의 균주로부터 많은 세포를 다음 배지로 옮기는 것에 의해 세포를 더욱 계대시키고 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 생산성에 기여하는 조건하에서 상기 다음 배지내에서 상기양의 세포를 배양하는 단계,

동일 조건하에서 배양될 때 기준균주의 생산성에 비하여 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 향상된 생산성을 가진 균주를 선택하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 모균주의 돌연변이를 일으키는 처리에 의해서 상기 균주군을 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항 또는 제 6 항에 있어서 기준균주는Pichia ciferriiY -1031 F-60-10 인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항 내지 제 7 항중 어느 한항에 있어서, 상기 균주군은 Pichia속, 바람직하게는 Pichia ciferrii종, 더욱 바람직하게는 Pichia ciferrii 1031 F-60-10 종 또는 이의 유도체에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 제조방법으로서, 상기 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 생산에 기여하는 조건하에서 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한항에 따른 균주를 발효시키는 단계와, 선택적으로, 발효 육즙으로부터 상기 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 제조방법으로서, 상기 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 생산에 기여하는 조건하에서 제 5 항 내지 제 8 항중 어느 한항에 따른 방법에 의해 얻어진 균주를 발효시키는 단계와, 선택적으로, 발효 육즙으로부터 상기 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체를 회수단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서 ,스핑고이드 염기 또는 이의 유도체가 아세틸화된 피토스핑고신인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 피토스핑고신을 얻기 위해 아세틸화된 피토스핑고신의 탈아세틸화를 추가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항내지 제 12 항중 어느 한항에 따른 방법에 의해서 생산된 스핑고이드 염기 또는 이의 유도체의 N-아실화를 포함하는 세라미드의 제조방법.