KR19980038342A - 사이클로스포린 a 생성 변이균주, 이의 분별방법 및 사이클로스포린 a의 제조방법 - Google Patents

사이클로스포린 a 생성 변이균주, 이의 분별방법 및 사이클로스포린 a의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사이클로스포린 A를 세포내에 고농도로 생성축적 하는 톨리포클라디움 인플라툼 (Tolypocladium inflatum A2)의 변이미생물, 사이클로스포린 A를 고농도로 생성하는 특성을 갖는 변이균주를 분별하는 개선된 방법 및 그러한 변이균주를 이용하여 사이클로스포린 A를 고수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
사이클로스포린 A 생성 변이균주, 이의 분별방법 및 사이클로스포린 A의 제조방법
[발명의 상세한 설명]
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 사이클로스포린 A의 생산균주를 간편하게 개량하는 방법 및 사이클로스포린을 세포내에 고농도로 축적 생산하는 능력을 가진 균주를 개발하고 그러한 균주로부터 사이클로스포린 A를 고수율로 제조하는 개선된 방법을 제공하는데 있다.
[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]
사이클로스포린 A는 항진균, 항기생충, 항염증 및 면역억제 활성을 갖는 물질로 11개의 아미노산으로 구성된 환상의 폴리펩타이드이다. 사이클로스포린 A는 면역억제능으로 인해 인간의 장기이식 수술 및 자가면역증의 치료에 널리 사용되고 있다. 톨리포클라디움 인플라툼(Tolypocladium inflatum)은 배양액 중에 적어도 사이클로스포린 A, B, C, D종의 사이클로스포린 유도체를 생산하는 것으로 알려져 있다. 이들은 모두 사이클로스포린 합성효소에 의해 생산되며 사이클로스포린 A가 주요산물이다.
종래의 사이클로스포린 A 생산균주 개량 방법은 돌연변이원을 처리한 후 얻어진 여러 가지 변이주를 생산용 배지를 함유하는 삼각 플라스크에 접종한 후 약 10일간 배양한 후 고속액체 크로마토그라피법을 사용하여 사이클로스포린 A 농도를 분석하여 그중 가장 높은 농도를 나타내는 변이주를 선별하였다. 이 경우 균주를 배양·추추루·분석하는 과정이 매우 복잡하고, 많은 시간과 장비가 요구되므로, 처리할 수 있는 시료의 숫자가 매우 한정되어지는 문제점이 있다. 한편 종래 미생물에 의한 발효법으로 사이클로스포린 A를 공업적으로 생산하는 경우 균체량을 증가시키고 세포 내에 사이클로스포린 A를 고농도로 축적시키는 것이 바람직하나, 기존의 생산균주는 생성된 사이클로스포린 A의 약 10% 이상이 세포 밖으로 분비됨으로서 균체만을 회수·추출·정제하는 일반적인 정제공정에서는 상당량의 사이클로 스포린 A를 회수할 수 없는 단점이 있다.
[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]
종래의 사이클로스포린 A 생성균주의 배양, 추출, 분석과정을 간편화하고 사이클로스포린 A를 고농도로 세포내에 생성 축적하는 새로운 변이균주를 개발할 필요가 있다.
[발명의 구성 및 작용]
본 발명은 사이클로스포린 A 생성균주, 예를들면 톨리포클라디움 인플라툼의 포자현탁액을 돌연변이 처리하고, 변이균체를 S-아데노실-L-메치오닌 또는 L-발린의 방사성 동위원소 물질로 처리한 후 에틸아세테이트를 첨가하여 사이클로스포린A를 추출한 다음 액체섬광계수기로 방사능량을 측정함을 특징으로하여 개량된 사이클로스포린 A 생성 변이균주를 분별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기한 본 발명의 방법에 의해 분별된 사이클로스포린 A를 고농도로 세포내에 생성하고 축적하는 신규한 톨리포클라디움 인플라툼 변이주를 제공한다. 이 균주는 톨리포클라디움 인플라툼 A2로 명명되어 한국 종균협회에 1996년 11월 19일에 수탁번호 KFCC-10932로 기탁되었다.
또한, 본 발명은 상기한 본 발명의 신규한 균주를 배양하고 균체를 분쇄한 다음 사이클로스포린 A를 분리함을 특징으로하여 순수한 사이클로스포린 A를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 짧은 시간에 많은 시료의 사이클로스포린 A 생성 역가를 동시에 측정하기 위해, 돌연변이 처리후 얻어지는 변이주들의 소량의 균체를 이용해 사이클로스포린 A의 전구물질인 S-아데노실-L-메치오닌 및 L-발린과 같은 아미노산의 방사성 동위원소 물질을 첨가하여 반응시킨 후 생성되는 소량의 사이클로스포린 A를 측정함으로서 사이클로스포린 A 합성효소의 역가가 높은 변이주들을 선별하는 새로운 사이클로스포린 A 생산균주 개량 방법을 확립하였고, 사이클로스포린 A를 고농도로 생산할 수 있고 동시에 세포내 축적되는 사이클로스포린 A의 비율이 95%이상되는 변이 미생물을 얻었다. 또한, 본 발명에서 얻어진 균주를 이용하여 사이클로스포린 A 발효 생산성을 획기적으로 향상시켰다.
본 발명자들은 대표적으로 한국종균협회에 1996년 1월 8일에 기탁된 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC-10889의 포자현탁액(106∼107포자/㎖)에 자외선이나 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 돌연변이원이를 공지의 방법으로 처리하여 효모엑기스 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%, 한천 2%를 함유하는 고체 배지에 도말하고, 30℃에서 10일간 배양한 후 완전한 콜로니가 형성되면, 각각의 콜로니로부터 포자현탁액(106∼107포자/㎖)를 조제하여 시험관에 적당랑씩 분주한 후, 사이클로스포린 A의 전구물질인 S-아데노실-L-[메틸-14C]-메치오닌 및 L-[U-14C]발린과 같은 방사성 동위원소 물질을 소량 첨가한다. 이를 30℃, 30분간 반응시킨 후, 포자 현탁액과 동량의 에틸아세테이트 분주하고, 수 초간 흔들어 섞어준 다음 원심분리하여 상층부의 에틸아세테이트 층을 분리시킨다. 이 에틸아세테이트 층으로부터 소량의 취하여 적정량의 칵테일 용액에 섞은 후 액체섬광 계수기를 사용하여 유리되는 방사능량을 측정한다. 이때 가장 큰 값을 나타내는 콜로니를 선별하여 글리세린 12%, L-발린 1%, 인산암모늄 1%, 황산마그네슘 0.05%, 염화포타슘 0.05%, 질산나트륨 0.3%, 인산칼륨 0.2%, 황화철 0.0001%, 탄산칼슘 0.3%를 함유하는 삼각플라스크 생산용 배지에 접종하여 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 사이클로스포린 A를 다랑 생산하는 변이주를 선별하였다.
본 발명에 따른 신규한 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC-10932와 이의 친주인 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC-10889의 균주 특성 차이는 표 2에 나타낸 바와 같다.
본 발명에 따라 사이클로스포린 A가 고농도로 축적되는 미생물의 발효액은 하기 표 3의 배지에서 1차 종배양하고, 이 배양액을 하기 표 4의 배지에서 2차 종배양하고, 필요한 경우 동일 배지에서 3차 종배양 한 후, 이 배양액을 하기 표 5에서 본 배양하여 얻는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC-10932는 상기한 표 5의 발효배지에서 배양시, 친주인 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC-10889에 비해, 고농도의 사이클로스포린 A를 생성함과 동시에 세포내 축적되는 사이클로스포린 A의 비율이 95% 이상되는 것을 특징으로 하는 신규한 변이주이다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 구체화한다. 그러나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 실시예에서 사용된 배지는 1차 종배양시 상기 표 3의 종배양 배지를, 2차 종배양시는 상기 표 4의 종배양 배지를, 발효 배양시에는 하기 표 6에 나타낸 배지를 사용하였다.
[실시예 1]
톨리포클라디움 인플라툼 KFCC-10889의 포자현탁액(106∼107포자/㎖) 10㎖를 페트리디쉬에 분주한 후 자외선 램프(20Watts) 아래 30cm 떨어진 지점에 놓고 서서히 교반하면서 약 100초간 조사한다. 이 자외선 처리된 포자현탁액은 4℃ 암실에서 1시간 정도 방치시킨 후, 효모엑기스 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%, 한천 2%를 함유하는 고체배지에 도말하고, 30℃에서 10일간 배양한다. 완전한 콜로니가 형성되면, 각각의 콜로니로부터 포자현탁액(106∼107포자/㎖)을 조제하여 에펜도르프 시험관에 0.6㎖씩 분주한 후, 방사선 동위원소 물질인 S-아데노실-L-[메틸-14C]-메치오닌 또는 L-[U-14C]발린을 0.1μCi씩 첨가한다. 이를 30℃, 30분간 반응시킨 후, 에칠아세테이트 0.6㎖ 분주하고, 약 15초간 흔들어 섞어준 다음 1200rpm에서 2분간 원심분리하여 상층부의 에틸아세테이트층을 분리시킨다. 이 에틸아세테이트층으로부터 200μ1를 취하여 3㎖의 칵테일 용액에 섞은 후 액체 섬광 계수기를 사용하여 각 시료의 유리되는 방사능량을 분석한 결과 표 8과 같았다.
상기 표 3의 1차 종배양 배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고, 살균시킨 후 KFCC-10889 및 각각의 콜로니로부터 얻어진 포자현탁액(106∼107포자/㎖)을 1㎖씩 식균하여 30℃에서 280rpm으로 68 내지 74시간 1차 종배양하였다.
상기 표 4의 2차 종배양 배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고, 살균시킨 후 2차 종배양액 10%를 식균하여 30℃에서 220rpm으로 40 내지 48시간 2차 종배양하였다.
상기 표 5의 발효배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고, 살균시킨 후 2차 종배양액 10%를 식균하여 30℃에서 220rpm으로 240시간 발효배양하였다. 발효 완료 후 배지중의 사이클로스포린 A 농도는 표 7과 같다. 이대 사이클로스포린 A 농도는 USP 표준품을 표준 물질로 사용하여 HPLC 방법으로 정량하였다.
[실시예 2]
상기 표 3의 1차 종배양 배지를 50㎖씩 500㎖ 용량의 진탕용 삼각 플라스크에 넣고, 살균시킨 후 KFCC-10889 및 KFCC-10932 포자현탁액(10 ∼10 포자/㎖)을 1㎖씩 식균하여 30℃에서 280rpm으로 68 내지 74시간 1차 종배양하였다.
상기 표 4와 2차 종배지를 20ℓ씩 30ℓ 용량의 발효조에 넣고 121℃에서 30분간 살균시킨 후 1차 종배양액 50㎖을 식균하여 30℃에서 300 내지 350rpm으로 40내지 48시간 2차 종배양하였다.
상기 표 4의 2차 종배지를 18ℓ씩 30ℓ 용량의 발효조에 넣고 12℃에서 30분간 살균시킨 후 2차 종배양액 2ℓ를 식균하여 30℃에서 300 내지 350rpm으로 20내지 24시간 3차 종배양하였다.
상기 표 5의 발효배지를 18ℓ씩 30ℓ 용량의 발효조에 넣고 살균시킨 후 3차 종배양액 2ℓ를 식균하여 30℃에서 200 내지 400rpm으로 240시간 발효배양하였다. 통기량은 0.3 내지 0.5vvm으로 하였고 내압은 0.3 내지 0.5kg/cm 로 조정하였다. 발효 완료 후 배지중의 사이클로스포린 A 농도는 표 7과 같다.
[발명의 효과]
본 발명의 신규한 변이 균주 톨리포클라디움 인플라툼 KFCC-10932로부터 사이클로스포린 A를 대량생산할 수 있음은 자명하며 본 발명에 따른 분별방법을 이용했을때 고농도의 사이클로스포린 A를 생성하는 변이주를 간편하게 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (6)

  1. 미생물 배양시 사이클로스포린 A 고농도로 생성하고, 생성된 사이클로스포린 A중 95% 이상을 세포내에 축적함을 특징으로 하는 톨리포클라디움 인플라툼 A2(KFCC-10932).
  2. 사이클로스포린 A 생성균주의 포자 현탁액을 돌연변이 처리한 다음 S-아데노실-L-[메틸-14C]-메치오닌 또는 L-[U-14C] 발린을 첨가하고, 에틸아세테이트로 사이클로스포린 A를 추출한 후 액체 섬광 계수기로 방사능량을 측정함을 특징으로 하여 고농도의 사이클로스포린 A를 생성하는 변이균주를 선별하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 균주가 톨리포클라디움 인플라툼인 방법.
  4. 제 2 항 또는 3 항에 있어서, 돌연변이를 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘의 화학적 처리로 유도하는 방법.
  5. 제1항의 미생물을 하기 조성의 배양배지에서 배양하여 사이클로스포린 A를 제조하는 방법
  6. 제 5 항에 있어서, 배양하기전에 하기 표 1의 조성을 갖는 배지에서 미생물을 일차 종배양하고 하기 표 2의 조성을 갖는 배지에서 미생물을 이차 종배양하는 방법
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