KR101072121B1 - 톨리포클라디움 니베움에서 사이클로스포린 대량 생산 방법 - Google Patents

톨리포클라디움 니베움에서 사이클로스포린 대량 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 최적화된 배양방법에 따른 톨리포클라디움 니베움(Tolypocladium niveum)에서 사이클로스포린 A를 대량 생산하기 위한 방법에 관한 것으로, 구체적으로 포자 형성, 균사체 성장 및 사이클로스포린 생산 단계별 최적화된 배양액을 사용하고, 균사체 성장 배양 시 포자 접종량을 조절함으로써 사이클로스포린 A를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하여 면역억제제 및 항진균제로 사용되는 사이클로스포린 A를 대량생산할 수 있다.
사이클로스포린 A, 톨리포클라디움 니베움, 배양조건, 접종방법

Description

톨리포클라디움 니베움에서 사이클로스포린 대량 생산 방법{Method for mass culture of cyclosporine at Tolypocladium niveum}
본 발명은 최적화된 배양방법에 따른 톨리포클라디움 니베움(Tolypocladium niveum)에서 사이클로스포린을 대량 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.
사이클로스포린(Cyclosporine)은 균사 형성 곰팡이인 톨리포클라디움 니베움(Tolypocladium niveum)에 의해 호기적 조건에서 생산되는 이차 대사 산물로, 장기이식뿐 아니라 에이즈와 같은 자가면역질환에 이용되는 면역억제제로 알려져 있다. 1970년대 초 스위스 제약회사인 산도즈(Sandoz)사에 의해 최초로 항진균제로 개발되었으나, 최근에는 사이클로스포린이 T 세포에 대항하여 매우 선택적인 면역억제 효과를 가질 뿐만 아니라 낮은 세포독성을 나타내어 산업적 관심의 초점이 되고 있다.
사이클로스포린 A(Cyclosporine A; CyA)는 11개 아미노산이 화학적으로 이루어진 고리모양의 펩타이드로 α-아미노부티르산(α-aminobutyric acid)이나 MeBmt(N-methyl (4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonine)와 같은 특수한 아미노산들을 포함하고 있으며, 다기능효소복합체(multifunctional enzyme complex)에 의한 비리보좀적 생합성 경로(nonribosomal biosynthetic pathway)에 의해서 생합성된다(Kobel H & R Traber, Eur J App Microbiol Biotechnol 14:237-240, 1982).
일반적으로 톨리포클라디움 니베움과 같은 균사형성 곰팡이에 의한 2차 대사 산물의 생산은 포자형성과정을 통해 형성된 포자를 성장 배지에 접종하여 성장 배양 동안 균사형 배양형태를 형성하고 다음 생산 배양을 통해 치밀한 펠렛형 배양형태를 이루어 생산 균주가 원활한 2차 대사를 수행함으로써 이루어지는데 생산 균주의 형태학적 특성과 2차 대사의 까다로운 생리적 특성으로 인해 배양에 많은 어려움이 있다. 즉 박테리아나 효모와 달리 균사형성 곰팡이의 액상 배양시에는 그 독특한 3차원적 균사체 구조로 인해 배양액의 점도가 상당히 증가함으로써 배양액 내에서의 물질전달, 특히 산소전달 능력이 급속히 감소하는 특성이 있다. 그러므로 사이클로스포린의 생산 균주인 톨리포클라디움 니베움과 같은 호기성 균사형성 곰팡이의 경우, 1차 대사과정에서 충분한 양의 포자로부터의 균사형성이 다음 2차 대사에 영향을 주어 사이클로스포린 생산에 결정적이라고 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 톨리포클라디움 니베움 균주가 최대로 사이클로스포린을 생산하기 위한 최적 배지 선정 및 포자 접종량에 따른 생산성 조사를 수행하여 사이클로스포린 생산성을 더욱 향상시킴으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 톨리포클라디움 니베움(Tolypocladium niveum)에서 사이클로스포린 A를 대량 생산할 수 있는 최적화된 배양방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 톨리포클라디움 니베움(Tolypocladium niveum) 균주를 SSMA 포자 형성 배지(sterile semisynthetic medium agar)에서 8 내지 12일 동안 배양하여 포자를 형성하는 단계;
2) 상기 포자를 여과함으로써 지역 균사체(areal mycelia)를 제거하는 단계;
3) 단계 2)의 여과된 포자를 2.8 내지 3.2%(v/v)의 농도로 SSM 성장 배지(sterile semisynthetic medium)에 접종하여 3 내지 7일 동안 배양함으로써 상기 포자로부터 균사체를 발아하는 단계; 및,
4) 상기 균사체를 L-발린이 포함되고 탄소원으로써 과당을 사용한 SM 배지(synthetic medium)에서 13 내지 17일 동안 배양하여 사이클로스포린 A를 생산하는 단계를 포함하는 사이클로스포린 A 대량생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 SM 배지(synthetic medium)에 L-발린이 포함되고 탄소원으로써 과당을 사용한 사이클로스포린 A 생산 배지를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 톨리포클라디움 니베움(Tolypocladium niveum) 균주를 SSMA 포자 형성 배지(sterile semisynthetic medium agar)에서 8 내지 12일 동안 배양하여 포자를 형성하는 단계;
2) 상기 포자를 여과함으로써 지역 균사체(areal mycelia)를 제거하는 단계;
3) 단계 2)의 여과된 포자를 2.8 내지 3.2%(v/v)의 농도로 SSM 성장 배지(sterile semisynthetic medium)에 접종하여 3 내지 7일 동안 배양함으로써 상기 포자로부터 균사체를 발아하는 단계; 및,
4) 상기 균사체를 L-발린이 포함되고 탄소원으로써 과당을 사용한 SM 배지(synthetic medium)에서 13 내지 17일 동안 배양하여 사이클로스포린 A를 생산하는 단계를 포함하는 사이클로스포린 A 대량생산 방법을 제공한다.
톨리포클라디움 니베움 균주는 단계 1)에서 SSMA 배지(sterile semisynthetic medium agar)에서 배양하여 포자를 최대한으로 형성할 수 있고, 상기 배양은 8 내지 12일 동안, 바람직하게는 10일 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 톨리포클라디움 니베움 균주를 PDA 배지(potato dextrose agar), MYA 배지(Malt Yeast Agar; Chahal PS, PhD Thesis. London, Ontario:Faculty of Graduate studies, The University of Western Ontario, 1992) 및 SSMA 배지(Chun G-T & Agathos SN, Biotechnol Bioeng 37:256-265, 1991)에서 배양한 결과, SSMA 배지에서 가장 많은 수(약 109 포자/㎖)의 포자를 형성하였다(도 1 참조).
또한, 단계 2)의 포자는 20 내지 30 ㎛ 여과기, 바람직하게는 25 ㎛ 여과기를 이용하여 여과됨으로써 지역 균사체(areal mycelia)가 제거될 수 있다. 일반적으로 포자형성시 지역 균사체가 함께 생성되고, 상기 포자 전체를 회수하였을 때, 상기 지역 균사체가 뭉쳐서 충분한 산소전달이 어려운 경우가 생길 수 있으며 이는 균사형성을 방해할 수 있기 때문에, 상기 지역 균사체를 제거해 줌으로써 균사체 형성을 도울 수 있다.
또한, 단계 2)의 포자는 SSM 배지(sterile semisynthetic medium)에서 배양하여 포자로부터 균사체를 최대한으로 형성될 수 있고, 상기 배양은 3 내지 7일 동안, 바람직하게는 5일 동안 수행될 수 있다. 이때, 단계 3)에서 단계 2)의 포자는 2.8 내지 3.2%(v/v)의 농도, 바람직하게는 3%(v/v)의 농도로 접종될 수 있다. 3%이하로 접종할 경우 적응기(lag phase)가 길어져 균사형성을 지연시킴으로써 사이클로스포린 생산성이 낮아지고 3% 이상의 농도로 포자를 접종할 경우 균사형성이 너무 많이 이루어져 한정된 배양액 내에서 산소와 양분이 제한된다. 따라서 증가한 사이클로스포린 생산성을 얻기 위한 가장 이상적인 펠렛의 형태는 성장 배지에서 이미 결정되기 때문에 성장 배지에서 적절한 세포농도에 의한 배양형태를 얻는 것이 사이클로스포린 생산성 향상에 중요한 단계일 것이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 SSM 배지(Chun G-T & Agathos SN, Biotechnol Bioeng 37:256-265, 1991), FC1 배지, YM 배지(yeast malt) 및 MGP 배지(malt glucose peptone)에서 배양한 결과, SSM 배지에서 가장 활발하게 균사체를 형성하였다(도 2 참조). 다른 본 발명의 구체적인 실시예에서 SSM 배지에 상기 포자를 여러 농도로 접종한 결과, 3% 농도로 접종했을 경우 안정적인 배양형태를 보이며(도 4a 참조) 동시에 가장 높은 사이클로스포린 생산성(10 ㎎/ℓ이상; 도 4b 참조)을 나타내는 것을 확인하였다.
아울러, 단계 3)의 균사체는 단계 4)에서 L-발린이 포함되고 탄소원으로써 과당을 사용한 SM 배지(synthetic medium)에서 사이클로스로린 A를 최대한으로 생산될 수 다. 상기 L-발린은 5 내지 7 g/ℓ 및 과당은 28 내지 32 g/ℓ을 포함하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 L-발린은 6 g/ℓ 및 과당은 30 g/ℓ을 포함할 것이다. 또한 상기 배양은 13 내지 17일 동안, 바람직하게는 15일 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 SM - 포도당 배지(Chun G-T & Agathos SN, Biotechnol Bioeng 37:256-265, 1991: 탄소원이 포도당) 및 SM - 과당 배지(Chun G-T & Agathos SN, Biotechnol Bioeng 37:256-265, 1991: 탄소원이 과당)에서 배양한 결과, SM - 과당 배지에서 배양 형태가 사이클로스포린 생산에 적절한 배양형태인 치밀한 펠렛형을 이루는 것을 관찰할 수 있었다. 즉, 치밀한 펠렛형을 이룸으로써 배양액 내 점도가 감소하여 산소나 배양액의 세포 내 확산이 증가할 수 있었고, 결과적으로 사이클로스포린 A의 생산량을 증가시키는 것을 확인하였고, 이는 탄소원을 포도당에서 과당으로 교체함에 따른 이화 생성물 억제를 최소화하였기 때문일 수 있다. 또한, 다른 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 SM - 과당 배지에 L-발린을 첨가한 결과, 대조군(L-발린 무첨가 SM - 과당 생산 배지)에 비해 더욱 작고 치밀한 펠렛형 배양형태를 형성한 것과(도 3a 참조), 사이클로스포린 A 생산성이 두 배 이상 증가한 8 ㎎/ℓ의 생산성을 보이는 것을 확인하였다(도 3b 참조).
또한, 본 발명은 SM 배지(synthetic medium)에 L-발린이 포함되고 탄소원으로써 과당을 사용한 사이클로스포린 A 생산 배지를 제공한다.
상기 L-발린은 5 내지 7 g/ℓ 및 과당은 28 내지 32 g/ℓ을 포함되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 L-발린은 6 g/ℓ 및 과당은 30 g/ℓ을 포함될 것이다. 본 발명의 배지는 톨리포클라디움 니베움 균사체로부터 사이클로스포린 A 생산량을 최대화하기에 적합하다.
본 발명의 방법을 이용하여 면역억제제 및 항진균제로 사용되는 사이클로스포린 A를 대량생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 균주 계대 배양
PDA 배지에 톨리포클라디움 니베움 균주(ATCC 34921) 0.1 ㎖을 접종하여 28℃에서 10일간 배양하였다.
< 실시예 2> 최적 포자생성 배지 선정
곰팡이 배양에 가장 기본적으로 이용되는 3가지 포자 형성 배지인 PDA(감자 덱스트로스 아가 39 g/L), MYA(탈이온수 1 ℓ에 20 g 맥아, 4 g 효모 추출물 및 20 g 아가) 및 SSMA(탈이온수 1 ℓ에 포도당 50 g, 박토 펩톤 10 g, KH2PO4 5 g, KCl 2.5 g)를 대상으로 톨리포클라디움 니베움 균주가 포자를 최대로 형성할 수 있는 배지를 조사하였다.
구체적으로, 상기 3가지 포자 형성 배지 각각 30 ㎖에 실시예 1의 방법으로 수득한 배양액 동량(0.1 ㎖)을 접종하였다. 28℃에서 10 일간 배양한 후 20% 글리세롤 5 ㎖을 이용하여 스패츄라로 포자를 회수하였다. 상기 방법으로 회수한 포자를 계수기 챔버(counting chamber, Hemacytometer; Marienfeld, 독일)를 이용하여 계수하였다.
그 결과, SSMA에서 가장 많은 수의 포자(약 109 포자/㎖)를 형성하였고, 이는 MYA(5.5×107 포자/㎖) 배지나 PDA(3.2×107 포자/㎖)배지에 비해 약 100 배 많은 수의 포자를 형성하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
< 실시예 3> 최적 균사체 성장 배지 선정
곰팡이 성장 배양에 가장 기본적으로 이용되는 4가지 성장 배지인 SSM(탈이온수 1 ℓ에 포도당 50 g, 박토 펩톤 10 g, KH2PO4 5 g, KCl 2.5 g), FC1[탈이온수 1 ℓ에 포도당 80 g, 트립톤 40 g, 우레아 2 g, NaNO3 3 g, KH2PO4 2 g, KCl 0.5 g, MgSO4 0.5 g, FeSO4·7H2O 용액(10 g/L)], YM(맥아 추출물 20 g, 효모 추출물 4 g) 및 MGP(맥아 추출물 20 g, 포도당 20 g, 펩톤 1 g)를 대상으로 실시예 2의 방법으로 생성된 포자를 균사체로 발아시킬 수 있는 최적 배지를 선정하였다.
구체적으로, 실시예 2의 방법으로 수득한 포자 배양액을 20% 글리세롤 5 ㎖을 이용하여 회수한 후, 상기 4가지 성장 배지 50 ㎖에 접종하였고, 28℃에서 5일간 200 rpm으로 진탕배양 하였다. 이후, 상기 배양액을 광학현미경(성원과학)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 배지마다 다른 배양형태를 확인할 수 있었는데, SSM 배지(도 2a)의 경우 포자로부터 균사가 완전히 발아하여 가장 활발한 균사체를 형성하고 있는 것을 확인할 수 있었고, FC1 배지(도 2b)의 경우는 이와 달리 5 일간의 성장 배양을 거쳤는데도 균사형성이 이루어지지 않고 포자상태를 유지하고 있는 것을 확인하였다. 또한 YM 배지(도 2c)의 경우도 이와 마찬가지로 균사형성을 활발히 하지 못하는 것을 볼 수 있었으며, MGP 배지(도 2d)의 경우는 포자로부터 발아하여 균사가 형성되기는 했지만 아직 충분히 균사형성이 이루어지지 못하고 포자상태를 어느 정도는 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이로부터 생산균주의 2차 대사를 준비하기 위한 성장 배지로는 SSM 배지가 가장 적당한 것으로 판단되었다.
< 실시예 4> 최적 사이클로스포린 생산 배지 선정
<4-1> SM -포도당 생산 배지와 SM -과당 생산 배지에서의 생산성 비교
사이클로스포린 생산 배양에 가장 기본적으로 이용되는 3가지 생산 배지인 SM - 포도당 생산 배지[포도당 30 g/ℓ, (NH4)2SO4 10 g/ℓ, KH2PO4 0.75 g/ℓ, MgSO4 0.5 g/ℓ, CaCl2 0.1 g/ℓ, 미량원소용액 1 ㎖/ℓ(탈이온수 1ℓ당 ZnSO4·7H2O 4400 ㎎, MnCl2·4H2O 180 ㎎, NaMoO4 25 ㎎, CuSO4·5H2O 80 ㎎, FeSO4·7H2O 5000 ㎎ 및 H2SO4 2 ㎖)] 및 SM - 과당 생산 배지(SM - 포도당 배지의 포도당 대신 과당 30 g/ℓ를 사용)를 대상으로 실시예 3의 방법으로 생성된 균사체를 사이클로스포린 생성을 최적화시킬 수 있는 최적 생산 배지를 선정하였다.
구체적으로, 실시예 3의 방법으로 수득한 균사체 배양액을 20% 글리세롤 5 ㎖을 이용하여 회수한 후, 상기 3가지 생산 배지 50 ㎖에 접종하였다. 28℃에서 15일간 200 rpm으로 진탕배양 하였다. 이후, 상기 배양액을 동량의 에틸 아세테이트로 밤새 추출한 후, 상등액을 회수하여 증발건조하였고, 이를 1 ㎖의 메탄올에 재현탁한 후, 0.2 ㎛ 여과기에 통과시켜 HPLC 분석을 위한 시료를 준비하였다. 상기 두 가지 배양액으로부터 수득한 HPLC 분석을 위한 시료를 사이클로스포린 표준물질(Sigma, USA)을 이용하여 C18 컬럼(3.9×150 mm, Waters, USA)으로 완충액 1 (25% 메탄올)과 완충액 2(100% 아세토나이트릴)이 4 분까지 60 대 40, 그 후 20 분까지 39 대 61, 그 후 40분까지 0 대 100, 45분까지 60 대 40의 비율을 갖도록 하는 조건에서 210 ㎚파장에서 탐지하여 정량분석을 수행하였다.
그 결과, SM - 과당 생산 배지에서 배양형태와 사이클로스포린 생산성 모두 안정적인 것을 확인하였다. 특히, 사이클로스포린 생산에 적절한 배양형태인 치밀한 펠렛형을 이루는 것을 관찰할 수 있었다. 이에, 사이클로스포린 생산에 효과적인 배지로 과당을 탄소원으로 사용하는 SM - 과당 생산 배지를 선정하였다.
<4-2> L-발린 첨가의 영향
실시예 4-1의 방법으로 선정된 SM - 과당 생산 배지에 L-발린(Sigma, USA) 첨가시 사이클로스포린 생산성에 미치는 영향을 조사하였다.
구체적으로, 실시예 3의 방법으로 수득한 균사체 배양액을 20% 글리세롤 5 ㎖을 이용하여 회수한 후, SM - 과당 생산 배지에 L-발린을 6 g/ℓ의 농도로 첨가한 배지 50 ㎖에 접종하였다. 28℃에서 15일간 200 rpm으로 진탕배양 하였다. 이후, 상기 배양액을 실시예 4-2의 방법으로 HPLC 분석용 시료로 만든 후, HPLC를 이용하여 정량분석하였다.
그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이 대조군(L-발린 무첨가 SM - 과당 생산 배지)에 비해 생산성이 두 배 이상 증가한 8 ㎎/ℓ의 생산성을 보이는 것을 확인하였다. 또한, L-발린을 첨가한 경우 대조군에 비해 더욱 작고 치밀한 펠렛형 배양형태를 형성한 것을 확인할 수 있었다(도 3a).
< 실시예 5> 접종량의 최적화
사이클로스포린 생산성의 최적화를 위한 곰팡이 성장 배양 시 접종량을 결정하였다.
구체적으로, 실시예 2의 방법으로 수득한 포자를 여과하여 지역 균사체(areal mycelia)를 제외한 포자만을 회수한 뒤, 약 109 포자/㎖의 포자를 실시예 3의 방법으로 선정한 SSM 성장 배지에 1, 3, 5, 7 및 10% 농도(v/v)로 접종하였다. 28℃에서 5일간 200 rpm으로 진탕배양 한 후, 상기 배양액을 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이 3% 농도로 접종했을 경우 안정적인 배양형태를 보이며 동시에 가장 높은 사이클로스포린 생산성(10 ㎎/ℓ이상; 도 4b)을 나타내는 것을 확인하였다.
도 1은 최적 포자생성 배지 선정 결과를 나타낸 도이다:
a: PDA;
b: MYA; 및,
c: SSMA.
도 2는 최적 균사체 성장 배지 선정 결과를 나타낸 도이다:
a: SSM;
b: FC1; 및,
c: YM;
d: MGP.
도 3은 최적 사이클로스포린 생산 배지 선정 결과를 나타낸 도이다:
a: 배양형태; 및,
b: 사이클로스포린 생산성.
도 4는 사이클로스포린 생산성의 최적화를 위한 곰팡이 성장 배양 시 접종량 결정을 나타낸 도이다:
a: 배양형태; 및,
b: 사이클로스포린 생산성.

Claims (5)

1) 톨리포클라디움 니베움(Tolypocladium niveum) 균주를 SSMA 포자 형성 배지(sterile semisynthetic medium agar)에서 8 내지 12일 동안 배양하여 포자를 형성하는 단계;
2) 상기 포자를 여과함으로써 지역 균사체(areal mycelia)를 제거하는 단계;
3) 단계 2)의 여과된 포자를 2.8 내지 3.2%(v/v)의 농도로 SSM 성장 배지(sterile semisynthetic medium)에 접종하여 3 내지 7일 동안 배양함으로써 상기 포자로부터 균사체를 발아하는 단계; 및,
4) 상기 균사체를 L-발린이 포함되고 탄소원으로써 과당을 사용한 SM 배지(synthetic medium)에서 13 내지 17일 동안 배양하여 사이클로스포린 A를 생산하는 단계를 포함하는 사이클로스포린 A 대량생산 방법.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 여과는 20 내지 30 ㎛ 여과기를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 4)의 SM 생산 배지는 5 내지 7 g/ℓ의 L-발린 및 28 내지 32 g/ℓ의 과당을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
SM 배지(synthetic medium)에 L-발린이 포함되고 탄소원으로써 과당을 사용한 사이클로스포린 A 생산 배지.
제 4항에 있어서, 상기 L-발린은 5 내지 7 g/ℓ을 포함하고 상기 과당은 28 내지 32 g/ℓ를 포함하는 것을 특징으로 하는 사이클로스포린 A 생산 배지.
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