JP2622253B2 - リボフラビンの有効な生産方法 - Google Patents
リボフラビンの有効な生産方法Info
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 発明の分野 本発明は、リボフラビン生産のためのカンジダ・フラ
レリ（Candida flareri）のフラビン生産株の創製およ
び単離に関する。
レリ（Candida flareri）のフラビン生産株の創製およ
び単離に関する。
最も通常には酵素補因子であるビタミンB2として知ら
れているリボフラビンはある程度までほとんどすべての
天然に存在する食物中に見い出されている。リボフラビ
ンは広く薬、食品強化および飼料補強に用いられてい
る。
れているリボフラビンはある程度までほとんどすべての
天然に存在する食物中に見い出されている。リボフラビ
ンは広く薬、食品強化および飼料補強に用いられてい
る。
リボフラビンは醗酵によって商業的に生産されてき
た。最も商業的に生産されるリボフラビンは動物飼料を
強化するための粗製濃厚物として消費される。リボフラ
ビンはヒトによる消費に対してもその用途を見い出して
いる。本発明は有効かつ経済的なリボフラビンの生産に
対するカンジダ・フラレリ株の開発に関するものであ
る。
た。最も商業的に生産されるリボフラビンは動物飼料を
強化するための粗製濃厚物として消費される。リボフラ
ビンはヒトによる消費に対してもその用途を見い出して
いる。本発明は有効かつ経済的なリボフラビンの生産に
対するカンジダ・フラレリ株の開発に関するものであ
る。
関連文献の記載 カンジダ酵母の変種はフラビン生産性生物として魅力
的である。なぜならば、これら変種はよく知られている
単純培地上で迅速に増殖するからである。ピー．アー
ル．バークホルダー（P.R.Burkholder）、プロク．ナ
ト．アカド．サイ．、ユー．エス．エー（Proc.Nat.Aca
d.Sci.,U.S.A.）（1943年）29:166。
的である。なぜならば、これら変種はよく知られている
単純培地上で迅速に増殖するからである。ピー．アー
ル．バークホルダー（P.R.Burkholder）、プロク．ナ
ト．アカド．サイ．、ユー．エス．エー（Proc.Nat.Aca
d.Sci.,U.S.A.）（1943年）29:166。
カンジダ・フラレリは多くの年月にわたってそのフラ
ビン生産能について研究されてきた。例えば、エナリ
（Enari）およびカウピネン（Kauppinen）、アクタ．ケ
ム．スカンド．（Acta.Chem.Scand）（1961年）15:1513
を参照されたい。とりわけ、リボフラビン生産への鉄お
よび微量元素の阻害作用が研究されてきた。タナー（Ta
nner）等、サイエンス（Science）（1945年）101:180。
これまで、カンジダ・フラレリによるリボフラビン生産
は極めて変化しやすいということが証明された。非滅菌
単純培養基を用いた初期のパイロットプラント醗酵は32
5mg/のリボフラビン収率を与えた。レヴィン，エイ
チ．（Levine,H.）等、インダストリアル・アンド・エ
ンジニアリング・ケミストリー（Industrial and Engin
eering Chemistry）（1949年）41:1665。
ビン生産能について研究されてきた。例えば、エナリ
（Enari）およびカウピネン（Kauppinen）、アクタ．ケ
ム．スカンド．（Acta.Chem.Scand）（1961年）15:1513
を参照されたい。とりわけ、リボフラビン生産への鉄お
よび微量元素の阻害作用が研究されてきた。タナー（Ta
nner）等、サイエンス（Science）（1945年）101:180。
これまで、カンジダ・フラレリによるリボフラビン生産
は極めて変化しやすいということが証明された。非滅菌
単純培養基を用いた初期のパイロットプラント醗酵は32
5mg/のリボフラビン収率を与えた。レヴィン，エイ
チ．（Levine,H.）等、インダストリアル・アンド・エ
ンジニアリング・ケミストリー（Industrial and Engin
eering Chemistry）（1949年）41:1665。
ある種のカンジダ酵母の変種は実質量のリボフラビン
を生産することが知られている。例えば、新たに単離さ
れたラクトースおよびエタノール同化性微生物であるカ
ンジダ・インターメディア・ヴァラエティー・エー（Ca
ndida intermedia var A）を用いた変法が特公昭第48−
19,958号明細書に開示されており、49.2mgリボフラビン
／の収率が報告されている。カンジダＴ−３もメタノ
ールからリボフラビンを生産する。これは特開昭第51−
19,187号明細書に開示されている。リボフラビン生産に
対してカンジダ・ロブスタ（Candida robusta）を開示
しているEPA 0137226も参照されたい。
を生産することが知られている。例えば、新たに単離さ
れたラクトースおよびエタノール同化性微生物であるカ
ンジダ・インターメディア・ヴァラエティー・エー（Ca
ndida intermedia var A）を用いた変法が特公昭第48−
19,958号明細書に開示されており、49.2mgリボフラビン
／の収率が報告されている。カンジダＴ−３もメタノ
ールからリボフラビンを生産する。これは特開昭第51−
19,187号明細書に開示されている。リボフラビン生産に
対してカンジダ・ロブスタ（Candida robusta）を開示
しているEPA 0137226も参照されたい。
増大したリボフラビン生産は突然変異したカンジダ株
を用いて達成される。リボフラビン生産性カンジダ株を
用いて出発し、この株を化学的および／または物理的突
然変異誘発処理および突然変異誘発処理株のプロトプラ
スト融合に付して、リボフラビンの有効な生産性を有し
かつプリンおよびリボフラビン生合成の阻害剤および鉄
に対して低減された感受性を有する株をつくり出す。突
然変異体dgrも単離され、増大したフラビン生産活性を
示した。
を用いて達成される。リボフラビン生産性カンジダ株を
用いて出発し、この株を化学的および／または物理的突
然変異誘発処理および突然変異誘発処理株のプロトプラ
スト融合に付して、リボフラビンの有効な生産性を有し
かつプリンおよびリボフラビン生合成の阻害剤および鉄
に対して低減された感受性を有する株をつくり出す。突
然変異体dgrも単離され、増大したフラビン生産活性を
示した。
増大したリボフラビン生産に対する方法および生物を
提供する。リボフラビン生産性カンジダ株を選択し、こ
れを突然変異誘発処理の過程に付し、この突然変異誘発
処理された株をフラビン生産に関連する特性をもつ変種
についてスクリーニングし、所望の突然変異体を融合
し、この融合子孫をスクリーニングして一層の突然変異
誘発処理に付して、安定でかつ再現性のあるレベルにお
いて高い効率でリボフラビンを生産する株を提供する。
この株は、グルコースによるカタボライトリプレッショ
ンに対する耐性、およびアデニン代謝拮抗物質である４
−アミノピラゾロ（3,4−ｄ）ピリミジン（APP）および
アデノシン一リン酸によるプリン経路の阻害に対する耐
性によりB2経路の低減された抑制を有している。
提供する。リボフラビン生産性カンジダ株を選択し、こ
れを突然変異誘発処理の過程に付し、この突然変異誘発
処理された株をフラビン生産に関連する特性をもつ変種
についてスクリーニングし、所望の突然変異体を融合
し、この融合子孫をスクリーニングして一層の突然変異
誘発処理に付して、安定でかつ再現性のあるレベルにお
いて高い効率でリボフラビンを生産する株を提供する。
この株は、グルコースによるカタボライトリプレッショ
ンに対する耐性、およびアデニン代謝拮抗物質である４
−アミノピラゾロ（3,4−ｄ）ピリミジン（APP）および
アデノシン一リン酸によるプリン経路の阻害に対する耐
性によりB2経路の低減された抑制を有している。
リボフラビン合成がフラビンアデニンジヌクレオチド
および／またはアデノシン一リン酸調節に対してもはや
感受性でないかまたは非感受性であり、ホスホリボシル
ピロリン酸アミドトランスフェラーゼがアデニンおよび
アデノシンによる調節に対して低減された感受性を有
し、およびAPPに対して実質的に非感受性である複数種
類の突然変異体が選ばれる。非感受性または抑制解除と
は、突然変異体の生産率が、少なくとも50％まで生産率
を低下させるであろう普通培地（nutrient medium）中
の濃度において影響を受けないことを意味するものであ
る。さらに、突然変異体は、野生型のカンジダ・フラレ
リにおいて呼吸を抑制するレベルのデオキシグルコース
に対する応答の欠如によって証明されるように、カタボ
ライトリプレッションに対して実質的に耐性である。
および／またはアデノシン一リン酸調節に対してもはや
感受性でないかまたは非感受性であり、ホスホリボシル
ピロリン酸アミドトランスフェラーゼがアデニンおよび
アデノシンによる調節に対して低減された感受性を有
し、およびAPPに対して実質的に非感受性である複数種
類の突然変異体が選ばれる。非感受性または抑制解除と
は、突然変異体の生産率が、少なくとも50％まで生産率
を低下させるであろう普通培地（nutrient medium）中
の濃度において影響を受けないことを意味するものであ
る。さらに、突然変異体は、野生型のカンジダ・フラレ
リにおいて呼吸を抑制するレベルのデオキシグルコース
に対する応答の欠如によって証明されるように、カタボ
ライトリプレッションに対して実質的に耐性である。
本方法は突然変異誘発および融合の過程を含んでお
り、各段階で、プリンおよびリボフラビン代謝経路に関
する特性と組み合わせたリボフラビン生産の増大につい
てのスクリーニングを行なう。望ましくは、突然変異体
は普通培地中でアミノ酸源の存在において高いリボフラ
ビン収率を提供する。
り、各段階で、プリンおよびリボフラビン代謝経路に関
する特性と組み合わせたリボフラビン生産の増大につい
てのスクリーニングを行なう。望ましくは、突然変異体
は普通培地中でアミノ酸源の存在において高いリボフラ
ビン収率を提供する。
突然変異誘発処理は物理的または化学的突然変異誘発
物質を用いて実施しフラビン生産刺激培地中で生物を増
殖させる。フラビン生産を維持する添加剤は約0.1〜0.3
％、とりわけ約0.2〜0.25％のレベルのグリシンを含ん
でいる。さらに、痕跡量のコバルト（III）イオンおよ
び亜鉛イオンが望ましい。コバルト濃度は一般に約0.5
〜２μg/ml、好ましくは約１μg/mlの範囲にあり、亜鉛
濃度は一般に約５〜25μg/ml、通常は約５〜15μg/mlで
ある。必要により、Fe+3が約0.1〜0.3μg/mlで存在して
いてもよい。さらに、炭素源を使用し、大部分の糖質、
例えば、グルコース、スクロース、Ｄ−フルクトースお
よびガラクトース等が許容され得る。スクロースの場
合、その濃度は一般に約１〜８％、好ましくは約６％で
ある。他の糖質について同等の濃度を使用することがで
きる。
物質を用いて実施しフラビン生産刺激培地中で生物を増
殖させる。フラビン生産を維持する添加剤は約0.1〜0.3
％、とりわけ約0.2〜0.25％のレベルのグリシンを含ん
でいる。さらに、痕跡量のコバルト（III）イオンおよ
び亜鉛イオンが望ましい。コバルト濃度は一般に約0.5
〜２μg/ml、好ましくは約１μg/mlの範囲にあり、亜鉛
濃度は一般に約５〜25μg/ml、通常は約５〜15μg/mlで
ある。必要により、Fe+3が約0.1〜0.3μg/mlで存在して
いてもよい。さらに、炭素源を使用し、大部分の糖質、
例えば、グルコース、スクロース、Ｄ−フルクトースお
よびガラクトース等が許容され得る。スクロースの場
合、その濃度は一般に約１〜８％、好ましくは約６％で
ある。他の糖質について同等の濃度を使用することがで
きる。
突然変異誘発および融合処理の種々の段階において、
プリン性合成経路中の１種またはそれ以上の酵素を阻害
する１種またはそれ以上の有機化合物を含んでいてもよ
い定義された培地（フラビン生産刺激性であり、グリシ
ン以外のアミノ酸を欠いている）または複合培地（アミ
ノ酸を含有する富栄養培地）上で突然変異体をスクリー
ニングする。AMPおよびAPPに対する耐性がとりわけ注目
される。さらに、プリン性合成経路の抑制解除、とりわ
け経路の前半における、さらにとりわけ最初の３段階ま
たは４段階における抑制解除に基づいて中間の突然変異
体を選択することができる。
プリン性合成経路中の１種またはそれ以上の酵素を阻害
する１種またはそれ以上の有機化合物を含んでいてもよ
い定義された培地（フラビン生産刺激性であり、グリシ
ン以外のアミノ酸を欠いている）または複合培地（アミ
ノ酸を含有する富栄養培地）上で突然変異体をスクリー
ニングする。AMPおよびAPPに対する耐性がとりわけ注目
される。さらに、プリン性合成経路の抑制解除、とりわ
け経路の前半における、さらにとりわけ最初の３段階ま
たは４段階における抑制解除に基づいて中間の突然変異
体を選択することができる。
得られた突然変異誘発処理物は、直前の親株より少な
くとも20％増加のリボフラビン生産量を有しており、そ
して最終の突然変異体はもとの親株より少なくとも約５
倍、好ましくは少なくとも約10倍増加のリボフラビン生
産量を有しかつ鉄に対する低減した感受性を有してい
る。
くとも20％増加のリボフラビン生産量を有しており、そ
して最終の突然変異体はもとの親株より少なくとも約５
倍、好ましくは少なくとも約10倍増加のリボフラビン生
産量を有しかつ鉄に対する低減した感受性を有してい
る。
突然変異誘発は、物理的または化学的手段、例えば、
紫外線またはＸ線を用いた照射によって、または化学的
な突然変異誘発物質、例えば、ニトロソ化合物、例えば
ニトロソグアニジン、アルキル化化合物、例えばエチル
メタンスルホネート、カラシ（mustard）化合物、ヒド
ラジンまたは亜硝酸等によって実施することができる。
突然変異誘発に対する特定の技法は臨界的なものでな
く、通常の技法を用いることもできる。これらの突然変
異誘発の条件は一般的に生存性の低下をもたらす。
紫外線またはＸ線を用いた照射によって、または化学的
な突然変異誘発物質、例えば、ニトロソ化合物、例えば
ニトロソグアニジン、アルキル化化合物、例えばエチル
メタンスルホネート、カラシ（mustard）化合物、ヒド
ラジンまたは亜硝酸等によって実施することができる。
突然変異誘発に対する特定の技法は臨界的なものでな
く、通常の技法を用いることもできる。これらの突然変
異誘発の条件は一般的に生存性の低下をもたらす。
次いで、得られた突然変異株を、APPまたはデオキシ
グルコースに対する耐性、プリン経路における抑制の喪
失、または鉄、AMPおよび／または複合培地（アミノ酸
を個々にまたはペプチドとして含んでいる）によるB2合
成の阻害の喪失についてスクリーニングすることができ
る。
グルコースに対する耐性、プリン経路における抑制の喪
失、または鉄、AMPおよび／または複合培地（アミノ酸
を個々にまたはペプチドとして含んでいる）によるB2合
成の阻害の喪失についてスクリーニングすることができ
る。
融合に対して、細胞壁を除去したプロトプラストを用
いる。チモラーゼ（zymolase）、とりわけアルスロバク
ター・ルテウス（Arthrobacter luteus）からのもの、
およびβ−グルクロニダーゼ、とりわけヘリックス・ポ
マチア（Helix pomatia）からのもの、の混合物は効果
的であることが見い出された。望ましくは、突然変異株
を栄養要求株として選択する。ここで、使用される各株
は１種またはそれ以上のアミノ酸の生産のための１種ま
たはこれ以上の代謝経路を欠いている。次いで、形成さ
れたヘテロカリオンを原栄養株として選択し、増大した
リボフラビン生産についてスクリーニングすることがで
きる。
いる。チモラーゼ（zymolase）、とりわけアルスロバク
ター・ルテウス（Arthrobacter luteus）からのもの、
およびβ−グルクロニダーゼ、とりわけヘリックス・ポ
マチア（Helix pomatia）からのもの、の混合物は効果
的であることが見い出された。望ましくは、突然変異株
を栄養要求株として選択する。ここで、使用される各株
は１種またはそれ以上のアミノ酸の生産のための１種ま
たはこれ以上の代謝経路を欠いている。次いで、形成さ
れたヘテロカリオンを原栄養株として選択し、増大した
リボフラビン生産についてスクリーニングすることがで
きる。
突然変異誘発または融合の各段階において、もとの親
株より少なくとも20％、好ましくは少なくとも約50％増
加のリボフラビン生産が観察される。突然変異誘発およ
び融合の組み合わせを含む株変形の段階数は、少なくと
も３回で、好ましくは10回より多くなく、好ましくは約
８回より多くない。
株より少なくとも20％、好ましくは少なくとも約50％増
加のリボフラビン生産が観察される。突然変異誘発およ
び融合の組み合わせを含む株変形の段階数は、少なくと
も３回で、好ましくは10回より多くなく、好ましくは約
８回より多くない。
突然変異誘発は任意の培地、例えば、フラビン生産刺
激培地中で行なうことができ、そして得られた生存して
いる突然変異誘発処理物をフラビン生産刺激培地中でス
クリーニングすることができる。本発明に従い、異なる
突然変異誘発剤を用いて突然変異体を得る。ある株につ
いてはアデノシン一リン酸の存在下での増大したリボフ
ラビン生産を基準にし、他の株については増大したリボ
フラビン生産およびプリン生合成経路の初期段階におけ
る抑制の欠如を基準にして、各突然変異誘発から株を選
択する。
激培地中で行なうことができ、そして得られた生存して
いる突然変異誘発処理物をフラビン生産刺激培地中でス
クリーニングすることができる。本発明に従い、異なる
突然変異誘発剤を用いて突然変異体を得る。ある株につ
いてはアデノシン一リン酸の存在下での増大したリボフ
ラビン生産を基準にし、他の株については増大したリボ
フラビン生産およびプリン生合成経路の初期段階におけ
る抑制の欠如を基準にして、各突然変異誘発から株を選
択する。
次いで、各株を、特定のアミノ酸は欠く培地で増殖せ
ずかつその特定のアミノ酸を含有する培地で増殖するで
あろうコロニーを決定することによってアミノ酸栄養要
求性について標識付けする。本発明において、選択され
るアミノ酸はヒスチジンおよびメチオニンである。栄養
要求性の２つの株の各々をサッカリダーゼ、とりわけチ
モラーゼおよびβ−グルクロニダーゼの混合物を用いて
処理してプロトプラストをつくり、これらを非イオン性
界面活性剤の存在下に融合させ引き続いてアミノ酸源を
欠く普通培地に移す。得られる原栄養株をリボフラビン
生産について試験し、増大したリボフラビン生産を有す
るものを選択する。
ずかつその特定のアミノ酸を含有する培地で増殖するで
あろうコロニーを決定することによってアミノ酸栄養要
求性について標識付けする。本発明において、選択され
るアミノ酸はヒスチジンおよびメチオニンである。栄養
要求性の２つの株の各々をサッカリダーゼ、とりわけチ
モラーゼおよびβ−グルクロニダーゼの混合物を用いて
処理してプロトプラストをつくり、これらを非イオン性
界面活性剤の存在下に融合させ引き続いてアミノ酸源を
欠く普通培地に移す。得られる原栄養株をリボフラビン
生産について試験し、増大したリボフラビン生産を有す
るものを選択する。
次いで、融合した細胞を一層の突然変異誘発処理、こ
の場合には化学的突然変異誘発処理に付し、そして増大
したリボフラビン生産について株を選択する。
の場合には化学的突然変異誘発処理に付し、そして増大
したリボフラビン生産について株を選択する。
特に注目される２株を単離した。これらをGA18Y8−６
＃2 dgr（ATCC寄託番号20756）およびGA18Y8−６＃２＃
11（ATCC寄託番号20755）と名付けた（これらの株のATC
Cへの寄託日は1985年５月23日である）。定義された培
地において、これらの株は６日間で約5gリボフラビン／
より多い量、通常は６日間で約7gリボフラビン／よ
り多い量のリボフラビンを、5mlの指数増殖培養物を50m
lの定義された培地に接種することによって生産する
〔この培地は4B＋0.2％グリシン＋Co＋Zn＋Fe＋10％YMG
（２％グルコース、酵母抽出物、ペプトンおよび麦芽抽
出物）である。24時間毎、2mlの10×4B＋グリシン＋Co
＋Znを培養物に供給する〕。
＃2 dgr（ATCC寄託番号20756）およびGA18Y8−６＃２＃
11（ATCC寄託番号20755）と名付けた（これらの株のATC
Cへの寄託日は1985年５月23日である）。定義された培
地において、これらの株は６日間で約5gリボフラビン／
より多い量、通常は６日間で約7gリボフラビン／よ
り多い量のリボフラビンを、5mlの指数増殖培養物を50m
lの定義された培地に接種することによって生産する
〔この培地は4B＋0.2％グリシン＋Co＋Zn＋Fe＋10％YMG
（２％グルコース、酵母抽出物、ペプトンおよび麦芽抽
出物）である。24時間毎、2mlの10×4B＋グリシン＋Co
＋Znを培養物に供給する〕。
突然変異誘発 メチルＮ′−ニトロソグアニジン（NTG）または紫外
線を用いた突然変異誘発によって突然変異体を得た。カ
ンジダ・フラレリの最初の親株をNTGを用いて突然変異
誘発処理した。この方法を用いて最初の親株であるカン
ジダ・フラレリNRRL Y245の第１の培養で突然変異体GR3
を得た。親株の一夜間培養物20mlを洗浄し、0.2％グリ
シンを添加した4B培地（4B培地；「定義された培地」）
20ml中に懸濁した〔バークホルダー（Burkholder）、プ
ロク・ナトル・アカド．サイ．ユーエスエー（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA）（1943年）29:166〕。（グリシンを加
えた4B培地は、１の水に0.5gのKH2PO4、0.2gのMgSO4
・7H2O、1.84gの尿素、60gのスクロース、１μｇのＤ−
ビオチン、20μｇのH3PO4、20μｇのMnSO4、140μｇのZ
nSO4、20μｇのCuSO4、20μｇのNa2M0O4および2.3gのグ
リシンを溶解することによって調製される。コバルトお
よび亜鉛が必要な場合には１μgCoCl2および10mgのZnCl
2を添加する。）DMSO中NTG（10mg/ml）を100μg/mlの最
終濃度まで培養基に添加した。この培養物を30℃で１時
間撹拌した後、集菌し洗浄した。
線を用いた突然変異誘発によって突然変異体を得た。カ
ンジダ・フラレリの最初の親株をNTGを用いて突然変異
誘発処理した。この方法を用いて最初の親株であるカン
ジダ・フラレリNRRL Y245の第１の培養で突然変異体GR3
を得た。親株の一夜間培養物20mlを洗浄し、0.2％グリ
シンを添加した4B培地（4B培地；「定義された培地」）
20ml中に懸濁した〔バークホルダー（Burkholder）、プ
ロク・ナトル・アカド．サイ．ユーエスエー（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA）（1943年）29:166〕。（グリシンを加
えた4B培地は、１の水に0.5gのKH2PO4、0.2gのMgSO4
・7H2O、1.84gの尿素、60gのスクロース、１μｇのＤ−
ビオチン、20μｇのH3PO4、20μｇのMnSO4、140μｇのZ
nSO4、20μｇのCuSO4、20μｇのNa2M0O4および2.3gのグ
リシンを溶解することによって調製される。コバルトお
よび亜鉛が必要な場合には１μgCoCl2および10mgのZnCl
2を添加する。）DMSO中NTG（10mg/ml）を100μg/mlの最
終濃度まで培養基に添加した。この培養物を30℃で１時
間撹拌した後、集菌し洗浄した。
この処理によって生存細胞は対数的に減少した。
紫外線を用いた突然変異誘発も実施した。この方法を
用いて突然変異体A22を得た。0.2％グリシンを有する4B
培地〔レヴィン，エイチ．（Levine,H.）等、インダス
トリアル・アンド・ケミカル・エンジニアリング（Indu
strial and Chemical Engineering）（1949年）41:1666
を参照されたい〕中で増殖させた親株の第２の一夜間培
養物を洗浄しそしてプラスチック製ペトリ皿中の等容量
（35ml）の同じ培地中に懸濁した。次いで、この培地を
撹拌し200〜290nmの紫外線に暴露した。この照射のレベ
ルは生存している細胞数を出発の培養物の10％まで低下
させた。次いで、この細胞を、25mMの５′−AMPを含有
する定義された培地上にプレートした。突然変異誘発処
理、プレート処理およびインキュベーションは暗中で行
なった。紫外線照射後に生存していた細胞約104個から
１株得られた突然変異株A22はフラビン生産の阻害剤で
ある５′−AMPの存在下でリボフラビンを生産すること
が見い出された。
用いて突然変異体A22を得た。0.2％グリシンを有する4B
培地〔レヴィン，エイチ．（Levine,H.）等、インダス
トリアル・アンド・ケミカル・エンジニアリング（Indu
strial and Chemical Engineering）（1949年）41:1666
を参照されたい〕中で増殖させた親株の第２の一夜間培
養物を洗浄しそしてプラスチック製ペトリ皿中の等容量
（35ml）の同じ培地中に懸濁した。次いで、この培地を
撹拌し200〜290nmの紫外線に暴露した。この照射のレベ
ルは生存している細胞数を出発の培養物の10％まで低下
させた。次いで、この細胞を、25mMの５′−AMPを含有
する定義された培地上にプレートした。突然変異誘発処
理、プレート処理およびインキュベーションは暗中で行
なった。紫外線照射後に生存していた細胞約104個から
１株得られた突然変異株A22はフラビン生産の阻害剤で
ある５′−AMPの存在下でリボフラビンを生産すること
が見い出された。
GR3株のスクリーニング方法 前述したNTG突然変異誘発処理された培養物を生理的
食塩水20ml中で２回洗浄し同容量のYMG培地（複合培
地）中に懸濁した。YMG培地の成分は、１当り、3gの
酵母抽出物、3gの麦芽抽出物、5gのペプトンおよび使用
直前の炭素源例えばグルコース（２％）100mlである。
次いで、この培養物を30℃で48時間震盪培養した。次い
で、細胞を集菌し、生理的食塩水20ml中で３回洗浄しそ
して尿素またはグリシンを含まない4B培地中に再懸濁し
た。一夜間の窒素飢餓後、細胞を集菌し、アミノ酸を含
まず２％グルコースを含有するイーストナイトロジェン
ベース培地中に懸濁した。次いで、この培養物を６時間
インキュベーションした。
食塩水20ml中で２回洗浄し同容量のYMG培地（複合培
地）中に懸濁した。YMG培地の成分は、１当り、3gの
酵母抽出物、3gの麦芽抽出物、5gのペプトンおよび使用
直前の炭素源例えばグルコース（２％）100mlである。
次いで、この培養物を30℃で48時間震盪培養した。次い
で、細胞を集菌し、生理的食塩水20ml中で３回洗浄しそ
して尿素またはグリシンを含まない4B培地中に再懸濁し
た。一夜間の窒素飢餓後、細胞を集菌し、アミノ酸を含
まず２％グルコースを含有するイーストナイトロジェン
ベース培地中に懸濁した。次いで、この培養物を６時間
インキュベーションした。
1mgのナイスタチンを1mlのエタノール中に溶解し、引
き続いてこれを蒸留水で10mlまで稀釈することによって
新鮮なナイスタチン溶液を調製した。次いで、このナイ
スタチン溶液を20μg/mlの最終濃度まで添加して栄養細
胞を殺した。
き続いてこれを蒸留水で10mlまで稀釈することによって
新鮮なナイスタチン溶液を調製した。次いで、このナイ
スタチン溶液を20μg/mlの最終濃度まで添加して栄養細
胞を殺した。
このナイスタチン処理の後、生存している細胞を生理
的食塩水中10-4〜10-5まで稀釈し、0.1mlサンプルをYMG
プレート（20g寒天／のYMG培地）上にプレートした。
インキュベーションの２日後、YMGプレート上のコロニ
ーを定義された培地上にレプリカ培養した。
的食塩水中10-4〜10-5まで稀釈し、0.1mlサンプルをYMG
プレート（20g寒天／のYMG培地）上にプレートした。
インキュベーションの２日後、YMGプレート上のコロニ
ーを定義された培地上にレプリカ培養した。
次いで、複合培地上では増殖したが定義された培地上
では増殖しなかったコロニーを、アデニンを30μg/mlで
含有する定義された培地上にストリークした。最少培地
上で白色コロニーとして増殖し、そしてアデニンを有す
る最少培地上でピンク色がかった赤色のコロニーとして
増殖する１つのコロニーが、ナイスタチン処理後生存し
ていた約５×103個の細胞から得られた。このGR3と名付
けられた分離物は20〜50μg/mlのアデニンの存在下で赤
色のコロニーをつくりそして０または100μg/mlアデニ
ンの存在下で白色のコロニーをつくることが見い出され
た。コロニーの赤色はＰ−リボシルアミノイミダゾール
カルボキシレート（CAIR）および／またはＰ−リボシル
アミノイミダゾール（AIR）の蓄積によるものであっ
た。GR3はプリン経路における第１段階の調節が欠損し
ている突然変異体であると結論された。このGR3突然変
異体において、第１段階の調節は明らかに欠損してい
る。なぜならば、20〜50μg/mlのアデニンの存在下でさ
え、たとえその突然変異体がプリンに対して栄養要求性
でないとしてもプリン中間体が蓄積したからである。
では増殖しなかったコロニーを、アデニンを30μg/mlで
含有する定義された培地上にストリークした。最少培地
上で白色コロニーとして増殖し、そしてアデニンを有す
る最少培地上でピンク色がかった赤色のコロニーとして
増殖する１つのコロニーが、ナイスタチン処理後生存し
ていた約５×103個の細胞から得られた。このGR3と名付
けられた分離物は20〜50μg/mlのアデニンの存在下で赤
色のコロニーをつくりそして０または100μg/mlアデニ
ンの存在下で白色のコロニーをつくることが見い出され
た。コロニーの赤色はＰ−リボシルアミノイミダゾール
カルボキシレート（CAIR）および／またはＰ−リボシル
アミノイミダゾール（AIR）の蓄積によるものであっ
た。GR3はプリン経路における第１段階の調節が欠損し
ている突然変異体であると結論された。このGR3突然変
異体において、第１段階の調節は明らかに欠損してい
る。なぜならば、20〜50μg/mlのアデニンの存在下でさ
え、たとえその突然変異体がプリンに対して栄養要求性
でないとしてもプリン中間体が蓄積したからである。
融合 突然変異株A22およびGR3のプロトプラスト融合によっ
てGA18株を得た。前述したナイスタチン処理の後、生理
的食塩水中に稀釈した（10-4〜10-5）各株を複合培地上
にプレートした。２日間のインキュベーションの後、細
胞を4B培地上にレプリカ培養した。次いで、4B上で増殖
しなかったコロニーを、30μg/mlのヒスチジンまたはメ
チオンニンを補充した4B上にストリークした。定義され
た培地上では増殖しなかったがいずれかのアミノ酸を補
充した培地上で増殖した細胞は栄養要求株であると考え
られた。この方法において、A22のヒスチジン栄養要求
株（A22 His-）およびGR3のメチオニン栄養要求株（GR3
Met-）が得られた。
てGA18株を得た。前述したナイスタチン処理の後、生理
的食塩水中に稀釈した（10-4〜10-5）各株を複合培地上
にプレートした。２日間のインキュベーションの後、細
胞を4B培地上にレプリカ培養した。次いで、4B上で増殖
しなかったコロニーを、30μg/mlのヒスチジンまたはメ
チオンニンを補充した4B上にストリークした。定義され
た培地上では増殖しなかったがいずれかのアミノ酸を補
充した培地上で増殖した細胞は栄養要求株であると考え
られた。この方法において、A22のヒスチジン栄養要求
株（A22 His-）およびGR3のメチオニン栄養要求株（GR3
Met-）が得られた。
融合を実施するために、A22 His-およびGR3 Met-の48
時間培養物を、グリシンを加えた4B培地上で増殖させ、
集菌し、20mlの蒸留水中で１回洗浄しそして1Mソルビト
ール、25mM EDTAおよび50mMジチオトレイトールの溶液2
0ml中に懸濁させた。この懸濁液を、時折穏やかに震盪
しながら30℃で20分間インキュベーションした。次い
で、細胞を集菌し、2Mソルビトール20mlで１回洗浄し、
そして各栄養要求株を、1.5Mソルビトール、0.1Mクエン
酸ナトリウム、pH5.8および0.01M EDTAの溶液20ml中に
懸濁した。次いで、各懸濁液に対して、0.2mlのβ−グ
ルクロニダーゼ〔タイプＨ−２、ヘリックス・ポマチア
（Helix pomatia）由来、100,000単位/ml、シグマ（Sig
ma）〕および20mgのチモラーゼ100T〔マイルス・ラボラ
トリー（Miles Laboratory）〕を添加した。この懸濁
液を室温で45分間インキュベーションした。この間、正
常には細長い細胞が丸い球形を帯びた。このことは、細
胞壁の消化を示す。
時間培養物を、グリシンを加えた4B培地上で増殖させ、
集菌し、20mlの蒸留水中で１回洗浄しそして1Mソルビト
ール、25mM EDTAおよび50mMジチオトレイトールの溶液2
0ml中に懸濁させた。この懸濁液を、時折穏やかに震盪
しながら30℃で20分間インキュベーションした。次い
で、細胞を集菌し、2Mソルビトール20mlで１回洗浄し、
そして各栄養要求株を、1.5Mソルビトール、0.1Mクエン
酸ナトリウム、pH5.8および0.01M EDTAの溶液20ml中に
懸濁した。次いで、各懸濁液に対して、0.2mlのβ−グ
ルクロニダーゼ〔タイプＨ−２、ヘリックス・ポマチア
（Helix pomatia）由来、100,000単位/ml、シグマ（Sig
ma）〕および20mgのチモラーゼ100T〔マイルス・ラボラ
トリー（Miles Laboratory）〕を添加した。この懸濁
液を室温で45分間インキュベーションした。この間、正
常には細長い細胞が丸い球形を帯びた。このことは、細
胞壁の消化を示す。
酵素処理後、低速度の遠心分離（5000×ｇ）によって
各栄養要求株のプロトプラストを集菌し、これを10mlの
2Mソルビトール中で２回、10mlの1.5Mソルビトール、10
mM CaCl2および10mM Tris HCl pH7.5中で１回洗浄し、
次いで後者の溶液0.5ml中に懸濁した。プロトプラスト
を融合するために、各栄養要求株の0.1ml試料を混合
し、20％PEG〔シグマ（Sigma）、分子量約6000〕、10mM
CaCl2および10mM Tris HCl pH7.4の溶液0.1mlを添加し
た。
各栄養要求株のプロトプラストを集菌し、これを10mlの
2Mソルビトール中で２回、10mlの1.5Mソルビトール、10
mM CaCl2および10mM Tris HCl pH7.5中で１回洗浄し、
次いで後者の溶液0.5ml中に懸濁した。プロトプラスト
を融合するために、各栄養要求株の0.1ml試料を混合
し、20％PEG〔シグマ（Sigma）、分子量約6000〕、10mM
CaCl2および10mM Tris HCl pH7.4の溶液0.1mlを添加し
た。
この混合物を時折震盪させながら室温で20分間インキ
ュベーションした。次いで、細胞を遠心分離し、アミノ
酸を含まず２％のグルコースおよび1.5Mソルビトールを
有するイーストナイトロジェンベース培地10mlで１回洗
浄し、そして同じ培地0.5ml中に懸濁した。次いで、約
0.1mlの試料を2.0％の寒天を含有する同じ培地7ml（約5
5℃）に添加しそして同じ培地上に重層した。この手順
中に使用する溶液の大部分は、メソッド・イン・イース
ト・ジェネティクス（Method in Yeast Genetics）、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Harbor Laboratory）、コールド・スプリング・
ハーバー（Cold Spring Harbor）、シューヨーク、1981
年、115頁に見い出すことができる。アミノ酸が存在し
ない場合には、いずれの栄養要求株も増殖しないであろ
う（極めて低い頻度で復帰がある）。30℃における６〜
９日間のインキュベーションの後形成されたコロニー
は、遺伝的交換の結果として生じた原栄養株を含んでい
た。融合手順から得られた原栄養株は、ポリエチレング
リコール処理で生存した103個中約１個の頻度で生じ
た。低倍率でコロニーを調べ、リボフラビンの結晶を含
んでいるコロニーを再ストリークし定義された培地中で
のリボフラビン生産について調べた。１つのコロニーを
GA18を呼んだ。
ュベーションした。次いで、細胞を遠心分離し、アミノ
酸を含まず２％のグルコースおよび1.5Mソルビトールを
有するイーストナイトロジェンベース培地10mlで１回洗
浄し、そして同じ培地0.5ml中に懸濁した。次いで、約
0.1mlの試料を2.0％の寒天を含有する同じ培地7ml（約5
5℃）に添加しそして同じ培地上に重層した。この手順
中に使用する溶液の大部分は、メソッド・イン・イース
ト・ジェネティクス（Method in Yeast Genetics）、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold S
pring Harbor Laboratory）、コールド・スプリング・
ハーバー（Cold Spring Harbor）、シューヨーク、1981
年、115頁に見い出すことができる。アミノ酸が存在し
ない場合には、いずれの栄養要求株も増殖しないであろ
う（極めて低い頻度で復帰がある）。30℃における６〜
９日間のインキュベーションの後形成されたコロニー
は、遺伝的交換の結果として生じた原栄養株を含んでい
た。融合手順から得られた原栄養株は、ポリエチレング
リコール処理で生存した103個中約１個の頻度で生じ
た。低倍率でコロニーを調べ、リボフラビンの結晶を含
んでいるコロニーを再ストリークし定義された培地中で
のリボフラビン生産について調べた。１つのコロニーを
GA18を呼んだ。
GA18Y8−６＃２を生ずる第２の突然変異およびスクリー
ニング GA18の48時間親培養物を前述のNTG法を用いて突然変
異誘発処理することによって株GA18Y8−６＃２を得た。
突然変異誘発処理の後、細胞を洗浄し、10-4〜10-5まで
稀釈し、そして0.1mlをYMG上にプレートした。GA18は、
黄色のコロニー、すなわち、YMG培地上で高いリボフラ
ビン含量を有するコロニーを形成しなかった。このこと
は、培地中の鉄または少量の有機成分によるフラビン生
産の抑制に原因していた。１週間のインキュベーション
期間の後、いくつかの黄色のコロニーが認められた。こ
れを取り出しYMG上に数回再ストリークして株を純化
し、前記突然変異処理の後に生存していた細胞約104個
から１本の変異株を得た。この精製した株をGA18Y8−６
＃２と名付けた。
ニング GA18の48時間親培養物を前述のNTG法を用いて突然変
異誘発処理することによって株GA18Y8−６＃２を得た。
突然変異誘発処理の後、細胞を洗浄し、10-4〜10-5まで
稀釈し、そして0.1mlをYMG上にプレートした。GA18は、
黄色のコロニー、すなわち、YMG培地上で高いリボフラ
ビン含量を有するコロニーを形成しなかった。このこと
は、培地中の鉄または少量の有機成分によるフラビン生
産の抑制に原因していた。１週間のインキュベーション
期間の後、いくつかの黄色のコロニーが認められた。こ
れを取り出しYMG上に数回再ストリークして株を純化
し、前記突然変異処理の後に生存していた細胞約104個
から１本の変異株を得た。この精製した株をGA18Y8−６
＃２と名付けた。
突然変異株 現在最も有効なリボフラビン生産者である株は、カン
ジダ・フラレリGA18Y8−６＃2 dgr（ATCC寄託番号20756
を有する）およびカンジダ・フラレリGA18Y8−６＃２＃
11（ATCC寄託番号20755を有する）として特定される。
これらの株は、前述した実験方法によって得られた。
ジダ・フラレリGA18Y8−６＃2 dgr（ATCC寄託番号20756
を有する）およびカンジダ・フラレリGA18Y8−６＃２＃
11（ATCC寄託番号20755を有する）として特定される。
これらの株は、前述した実験方法によって得られた。
GA18Y8−６＃2 dgrは、前述の定義された培地であっ
て0.2μｇのFeCl3および10％のYMGが補充された培地50m
l中に5mlの指数増殖培養物を接種することによって、６
日間当りで１当り7.0〜7.5gのリボフラビンを生産す
る。この株は親株GA18Y8−６＃２のNTG突然変異誘発処
理によって得られた。デオキシグルコースはグルコース
のアナローグでありスクロースが炭素源として使用され
る場合に細胞の増殖を阻害する。デオキシグルコースに
対して耐性である黄色のコロニーを取り出し、グリシン
およびデオキシグルコースを加えた4B上へ再ストリーク
することによって精製し、そしてフラビン生産について
試験した。突然変異誘発処理された細胞を、750μg/ml
の２−デオキシグルコースを含有するグリシン添加4B培
地上にプレートした。カンジダ・フラレリGA18Y8−６＃
2 dgrを、前記突然変異誘発処理の後に生存していた細
胞約５×103個から純化されたコロニーから選んだ。
て0.2μｇのFeCl3および10％のYMGが補充された培地50m
l中に5mlの指数増殖培養物を接種することによって、６
日間当りで１当り7.0〜7.5gのリボフラビンを生産す
る。この株は親株GA18Y8−６＃２のNTG突然変異誘発処
理によって得られた。デオキシグルコースはグルコース
のアナローグでありスクロースが炭素源として使用され
る場合に細胞の増殖を阻害する。デオキシグルコースに
対して耐性である黄色のコロニーを取り出し、グリシン
およびデオキシグルコースを加えた4B上へ再ストリーク
することによって精製し、そしてフラビン生産について
試験した。突然変異誘発処理された細胞を、750μg/ml
の２−デオキシグルコースを含有するグリシン添加4B培
地上にプレートした。カンジダ・フラレリGA18Y8−６＃
2 dgrを、前記突然変異誘発処理の後に生存していた細
胞約５×103個から純化されたコロニーから選んだ。
GA18Y8−６＃２＃11も、GA18Y8−６＃2 dgrについて
前述したと同じ条件を用いて、６日間当りで１当り7.
0〜7.5gのリボフラビンを生産する。この株も親株GA18Y
8−６＃２のNTG突然変異誘発処理によって得られた。突
然変異誘発処理の後、突然変異誘発処理された培養物20
mlを蒸留水20ml中で２回洗浄し、次いで、20mlのYMG＋F
eCl3（２μg/ml）＋AMP（40mM）＋アミノピラゾロピリ
ミジン＋APP（500μg/ml）中に懸濁した。この培地によ
って、APP耐性コロニーが選択された。この培養物を周
期的に震盪させながら30℃で一夜間インキュベーション
した。次いで、細胞を集菌し、20mlの蒸留水中で２回洗
浄し、そして、YMG＋FeCl3（２μg/ml）＋APP（1mg/m
l）＋AMP（40mM）上にプレートし30℃で１週間インキュ
ベーションした。この終了時に、プレートを調べ、黄色
〜オレンジ色のコロニーを取り出しフラビン生産につい
て試験した。上記突然変異誘発処理の後に生存していた
細胞約104個から純化したコロニーからGA18Y8−６＃２
＃11を得た。
前述したと同じ条件を用いて、６日間当りで１当り7.
0〜7.5gのリボフラビンを生産する。この株も親株GA18Y
8−６＃２のNTG突然変異誘発処理によって得られた。突
然変異誘発処理の後、突然変異誘発処理された培養物20
mlを蒸留水20ml中で２回洗浄し、次いで、20mlのYMG＋F
eCl3（２μg/ml）＋AMP（40mM）＋アミノピラゾロピリ
ミジン＋APP（500μg/ml）中に懸濁した。この培地によ
って、APP耐性コロニーが選択された。この培養物を周
期的に震盪させながら30℃で一夜間インキュベーション
した。次いで、細胞を集菌し、20mlの蒸留水中で２回洗
浄し、そして、YMG＋FeCl3（２μg/ml）＋APP（1mg/m
l）＋AMP（40mM）上にプレートし30℃で１週間インキュ
ベーションした。この終了時に、プレートを調べ、黄色
〜オレンジ色のコロニーを取り出しフラビン生産につい
て試験した。上記突然変異誘発処理の後に生存していた
細胞約104個から純化したコロニーからGA18Y8−６＃２
＃11を得た。
500mlバッフル付増殖フラスコ中50ml増殖培地を用い
て上記株から高いリボフラビン収率を得た。この増殖培
地は、10％YMG＋90％4B＋グリシン＋Co＋Zn＋FeCl3（0.
2μg/ml）からなっていた。GA18由来のものによる最適
のリボフラビン生産は0.2μg/mlのFeCl3の存在下で起こ
る。野生型のカンジダ・フラレリの場合、0.2μg/mlのF
eCl3はリボフラビン合成を抑制する。24時間毎に、培養
物に2mlの10×4B＋グリシン溶液を供給した。
て上記株から高いリボフラビン収率を得た。この増殖培
地は、10％YMG＋90％4B＋グリシン＋Co＋Zn＋FeCl3（0.
2μg/ml）からなっていた。GA18由来のものによる最適
のリボフラビン生産は0.2μg/mlのFeCl3の存在下で起こ
る。野生型のカンジダ・フラレリの場合、0.2μg/mlのF
eCl3はリボフラビン合成を抑制する。24時間毎に、培養
物に2mlの10×4B＋グリシン溶液を供給した。
リボフラビン生産の一層の増大および鉄に対する非感
受性は、上述した突然変異誘発処理、選択および融合操
作を繰り返すことによって達成することができる。
受性は、上述した突然変異誘発処理、選択および融合操
作を繰り返すことによって達成することができる。
本発明に従って、非能率的なリボフラビン生産性のカ
ンジダの株を、栄養素を有効に利用しかつフラビン生産
の鉄抑制に対して改善された耐性を有して多量のリボフ
ラビンを安定に生産するように突然変異させることがで
きる。
ンジダの株を、栄養素を有効に利用しかつフラビン生産
の鉄抑制に対して改善された耐性を有して多量のリボフ
ラビンを安定に生産するように突然変異させることがで
きる。
前述した内容は本発明の完全な記載であるが、特許請
求の範囲の記載を除いては本発明の範囲を限定しようと
するものではない。
求の範囲の記載を除いては本発明の範囲を限定しようと
するものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:72） (72)発明者 リンダ ブルジンスキイ アメリカ合衆国，コロラド 80027，ル イスビレ，コットンウッド ドライブ 1615 (72)発明者 マイケル ヤルス アメリカ合衆国，コロラド 80302，ボ ウルダー，シックスティーンス ストリ ート 2231
Claims (5)
- 【請求項１】カンジダ・フラレリ（Candida flareri）
突然変異株をフラビン生産刺激培地中で増殖させること
によってリボフラビンを増大した量で生産することを含
んで成る、リボフラビンの生産方法において、 前記カンジダ・フラレリ突然変異株は物理的又は化学的
手段による突然変異誘発及びプロトプラスト融合の処理
の結果物であり、その際、各突然変異誘発又は融合の
後、株をフラビン生産刺激培地中でプリン生合成経路の
阻害剤に対する耐性又はプリン生合成経路の抑制解除に
ついてスクリーニングし、そして前記変異体が６日間で
発酵培地１当たり少なくとも約5gのリボフラビンを生
成することを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記耐性がアデノシン一リン酸および／ま
たは４−アミノピラゾロ（3,4−ｄ）ピリミジン（APP）
に対するものである、特許請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】前記フラビン生産刺激培地が刺激量のグリ
シン、コバルトおよび亜鉛を含んでいる、特許請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】カンジダ・フラレリ（Candida flareri）
突然変異株をフラビン生産刺激培地中で増殖させること
によってリボフラビンをもとの親株より最低５倍の増大
した量で生産することを含む、リボフラビンの効率的な
生産方法において、 前記カンジダ・フラレリ突然変異株は、突然変異株を与
える２つの異なる突然変異誘発剤を用いて前記親株を別
受に突然変異誘発処理して得られたものであり、 フラビン生産刺激培地中で増大したリボフラビン生産お
よびプリン生合成経路の抑制における変化またはプリン
生合成経路の阻害剤に対する応答における変化について
第１のスクリーニングを行なって、異なる突然変異誘発
剤によって生じた第１及び第２の誘導された株を得、 前記第１及び第２の誘導された株からプロトプラストを
つくりそして前記プロトプラストを融合して融合株を
得、 フラビン生産刺激培地中で少なくとも増大したリボフラ
ビン生産について前記融合株を第２のスクリーニングに
かけて第３の誘導された株を得、 前記第３の誘導された株と突然変異誘発処理して第２代
目の突然変異誘発処理細胞を得、 フラビン生産刺激培地中で少なくとも増大したリボフラ
ビン生産について前記第２代目の突然変異誘発処理細胞
を第３のスクリーニングにかけて第４の誘導された株を
与え、そして必要な場合には前記の突然変異誘発処理お
よびスクリーニングを繰り返してリボフラビン生産にお
いて最低５倍の増大量を有する株を得ることを含む方
法。 - 【請求項５】前記スクリーニングが少なくとも１回の、
アデノシン一リン酸に対する耐性、４−アミノピラゾロ
（3,4−ｄ）ピリミジンに対する耐性および鉄に対する
耐性についての選択を含んでいる、特許請求の範囲第４
項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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