CN1033172C - 用酵母高效生产核黄素 - Google Patents

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Abstract

一种系统产生和分离闪耀假丝酵母Candidaflareri的高产黄素菌株的方法。已研究及到Candidaflareri GA 18Y8-6#2 dgr菌株及Candida flareriGA18Y8-6#2#11菌株，而且其产量每6天每升大约7.0-7.5克。本方法包括在亲代菌株和后代菌株里完成反复进行诱变步骤和原生质体融合相结合。所指的后代菌株是按筛选方案一步接一步选出的。

Description

用酵母高效生产核黄素
本发明涉及用来生产核黄素的Candida flareri闪耀假丝酵母产黄素品系的产生和分离。
称作维生素B2，一种酶的辅助因子的核黄素事实上常见于所有的天然食物里。它广泛用于药物，补品及饲料添加剂上。
核黄素已用发酵进行商业生产，大多数商业性生产的核黄素是按自然浓度用以丰富动物饲料的。核黄素亦为人所用。本发明与一些高效而经济地生产核黄素的Candida flareri闪耀假丝酵母菌株的研制有关。
作为产生核黄素的有机体，Candida假丝酵母的各种变种，由于它们在简单而又为人熟知的培养基上生长迅速而受到重视。P.R.Burkholder，Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A(1943)29：l66。
对闪耀假丝酵母Candida flareri产黄素的能力已研究多年。见例如Enari and Kauppinen斯堪的纳维亚化学学报(1961)15：1513。尤其是铁和微量元素对核黄素生产的抑制作用已作过研究。Tanner等人.，科学(1945)101：180。迄今为止，已证明用闪耀假丝酵母C.flareri生产核黄素是多式多样的。早期试验性工厂用简单而未经灭菌培养基发酵使核黄素的产量达到325mg/升。Levine，H.，等人.，工业和化学工程(1949)41：1665。
已知某些Candida假丝酵母的变种产生大量的核黄素。例如，日本专利73/19,958号已公开了使用新分离得的可同化乳糖和乙醇的微生物居间假丝酵母Candida中间体的变种A的改进方法，并报导核黄素产量达49.2mg/升。日本专利76/19,187亦公开了假丝酵母Candida T-3亦可用甲醇生产核黄素。欧洲专利局EPA0137226号公开了用Candidarobusta茁状假丝酵母进行核黄素生产。
使用Candida假丝酵母的突变菌株已使核黄素的产量提高。从产核黄素的Candida假丝酵母菌株开始，该菌株经受化学的和/或物理的诱变方式以及突变品系的原生质体融合，以产生一种具有高效生产核黄素的和对铁以及对嘌呤和核黄素生物合成抑制物的敏感性下降的菌株。一种dgr突变株亦已分离到，而且它显示增强产黄素的活性。
提供了用来提高核黄素产量的方法及生物体。一种产核黄素的Candida假丝酵母菌株已被选出并经受一种诱变过程，诱变处理的菌株经过筛选以便成为与产黄素特性有关的变种。将理想的突变株融合，筛选其融合子代并进一步经受诱变以提供一些稳定而可重视地高效地产核黄素的，对由葡萄糖引起的代谢降解物抑制有抗性而造成的B2途径的抑制的抗性下降的菌株，并提供具有对由腺苷一磷酸及腺嘌呤抗代谢产物4氨基吡唑(3，4-d)嘧啶(APP)引起的抑制嘌呤途径有抗性的菌株。
突变株选自核黄素合成不再对黄腺嘌呤二核苷酸和/或腺苷-磷酸调节敏感或不敏感，选自磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶对由嘌呤或腺苷酸所行的调节的敏感性下降，以及选自突变株已对APP基本上不敏感。选不敏感或失去调节是希望即使营养培养基所处的浓度会使产率下降至少50％时，突变株的产率仍不受影响。此外，该突变株在脱氧葡萄糖达到抑制野生型闪耀假丝酵母Candida flareri呼吸水平时缺乏反应这一事实，它实际上是有抗代谢降解物抑制力的。
本方法包括一个诱变和融合的过程，在其整个过程的每一阶段里，筛选是用来实现提高核黄素产量的，它是与涉及嘌呤和核黄素代谢途径的特点相联系的。最好的是在营养基有一种氨基酸源时，这些突变株就使核黄素高产。诱变是用化学的或物理的诱变剂处理生长在刺激产黄素的培养基的生物体而实现的。支持产黄素的附加物包括从大约0.1-0.3％的水平特别是大约0.2-0.25％的甘氨酸。此外，微量的钴和锌离子是理想的。钴的浓度一般介乎于大约0.5-2微克/毫升之间，最好是大约1微克/毫升。而锌的浓度一般是大约5-25微克/毫升，通常是大约5-15微克/毫升非必需的Fe+++可以有大约0.1-0.3微克/毫升。此外，应用了碳源，大多数糖类，例如葡萄糖，蔗糖，果糖，半乳糖等是合用的。就蔗糖而言，其浓度一般是从大约1-8％，最好是大约6％。其它糖可用相似的浓度。
在诱变和融合的各个阶段里，这些突变株将会受到特定培养基(刺激产黄素和除含有甘氨酸之外不含其它氨基酸)或复合培养基(含有多种氨基酸的丰富培养基)的筛选。这些培养基可含有1种或多种可在嘌呤生物合成途径中抑制1种或多种酶的有机化合物。特别有趣的是具有对AMP和APP的抗性。此外，中间类型的突变株可以根据嘌呤生物合成途径的失去调节而选得。尤其在这一途径的前半段选更好，在开始的第三或第四阶段选则最好。
所得的诱变剂将会比上一亲代菌株至少增产核黄素20％，而最终的突变株将比起始的亲代菌株至少增产5倍，较好的至少约增10倍。而且对铁的敏感性下降。
实现诱变可以用物理或化学方法，例如用紫外线或X射线照射，也可用化学诱变剂，例如亚硝基化合物，像亚硝酸胍；烷基化化合物，像甲磺酸乙酯；氮芥化合物，肼，亚硝酸，等等。诱变所用的专门技术是不严格的，常规技术都适用。诱变所用的条件一般会导致生活力下降。
产生的突变品系可筛选抗APP的或抗脱氧葡萄糖的，筛选在嘌呤途径上失去调节作用的，或者失去由铁，AMP和/或复合培养基(包含各种氨基酸的，个别用或以肽用)引起的对B2合成的抑制作用。
为了融合使用去除细胞壁的原生质体。一种混合物，特别是从藤黄节杆菌Arthrobacte luteus而得的酶酶(zymolase)和从法国大蜗牛Helix pomatia而得的β-葡萄糖苷酸酶的混合物对融合是有效的。最理想的是把这些突变株品系都选成营养缺陷型，其中所使用的每一菌株都缺乏产生一种或多种氨基酸的一种或多种代谢途径。融合得的异核体随后可选作原养型，并且为提高核黄素产量进行筛选。
在每个阶段诱变或融合里，发现核黄素的产量至少比起始亲代增加20％，较好的至少增加了50％，包含诱变和融合的复合在内的菌株修饰至少要3个阶段，最好不超过10个阶段，不超过大约8就更好。
诱变可在任何培养基里例如在刺激产黄素的培养基里实现。而所得的有活力的诱变剂在刺激产黄素的培养基里进行筛选。依据本主题发明，各诱变株是用不同的突变剂获得的。每次诱变选出一种菌株。其中之一是根据它在腺苷磷酸存在时提高了核黄素产量选出的，另一种则是根据提高了核黄素产量以及在嘌呤生物合成途径早期阶段缺乏调节作用为依据选出的。
随后每一菌株根据测定其菌落在缺乏特定氨基酸的培养基上不能生长以及含有特定氨基酸的培养基上能生长而标记出其氨基酸营养缺陷型。在本主题发明里，要筛选的氨基酸是组氨基和蛋白基。这两种品种酸各自的营养缺陷型用糖酶，特别是由酶酶和β葡萄糖苷酸酶混合物处理制成原生质体。这些原生质体在有非离子去污剂存在时会相互融合，融合后转移至缺乏任一种氨基酸源的营养基里。产生的原养型经过核黄素产量的测试，那些具有提高了核黄素产量的就选用。
这些融合了的细胞随后进一步经受诱变，本例是化学诱变并将菌株作提高核黄素产量的筛选。
分离得到两种特别有兴趣的菌株，分别命名为GA18Y8-6#2 dgr，ATCC注册号为20756和GA18Y8-6#2#11，ATCC注册号为20755。用5ml这些菌株的指数生长培养物接种到50ml特定培养基里的，它们在6天内每升培养基可生产多于5克核黄素，通常每升会生产多于大约7克。(特定培养基是4B＋0.2％甘氨酸＋Co＋Zn＋Fe＋10％YMG(2％葡萄糖，酵母提取液，胨及麦芽提取液)每24小时，向培养物内补加2ml 10×4B＋甘氨酸＋Co＋Zn的母液)。
用甲基N′-亚硝基胍(NTG)或紫外线诱变获得突变株。闪耀假丝酵母C.flareri的起始亲本菌株是用NTG诱变的。突变株GR3是用这种方法在第一次培养的闪耀假丝酵母C.flareri NRR LY245的起始亲本菌株上获得的。将20ml培养过夜的亲本菌株培养物洗涤并悬浮在加有0.2％甘氨酸的20ml4B培养基(“特定培养基”)中。(Bunkholder，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1943)29：166.)(加甘氨酸的4B培养基是在1升水里溶入0.5gKH2PO4；0.2g MgSO4·TH2O，1.84g尿素，60g蔗糖，1μgD-生物素20μgH3BO4，20μgMnSO4，140μgZnSO4，20μgCuSO4，20μgNa2MoO4及2.3g甘氨酸而配得，如果需要钴和锌时就加入1微克COCl2和10mgZnCl2)。将溶在二甲基亚砜(DMSO)里的NTG(10mg/ml)加到培养基部里的使其最终浓度达到100微克/毫升。在收集和洗涤之前将培养物在30℃下搅拌1小时。
这一处理导致活细胞数对数下降。
诱变亦使用紫外线辐射诱导进行。突变株A22就是用本方法获得的。将在加有0.2％甘氨酸的4B培养基里生长(见，Levine，H，etal.，工业和化学工程(1949)41：1666)过2夜的亲本菌株的培养物洗涤，并把它放在塑料平板里悬浮在等体积(35ml)的同一培养基里。该培养基随后搅拌并曝置于200-290nm的紫外线下。这样的照射强度将活细胞数减少至开始培养时的10％。这些细胞随后接种在含有25mM5′-AMP的特定培养基里的，诱变，接种和孵育都在无光下进行。突变株A22被发现可在有产黄素抑制物5′-AMP存在时仍生产核黄素。
将按前面所述NTG诱变的培养物用20ml生理盐水洗涤2次，并将它悬浮在同样体积的YNG培养基(复合培养基)里。YMG培养基的成分是每升有3g酵母提取液，3g麦芽提取液，5g胨及100ml碳源例如2％葡萄糖，糖是用前加入。这些培养物随后在30℃下摇动培养48小时。接着收集细胞，在20ml生理盐水里将它们洗涤3次，并再悬浮在没有尿素或甘氨酸的4B培养基里。在缺氮过夜之后，收集细胞并将它们悬浮在以酵母作氮源的没有氨基酸而含有2％葡萄糖的基本培养基里。培养物随后孵育6小时。
新鲜的制霉菌素溶液是将1mg制霉菌素溶液在1ml乙醇里，接着用蒸馏水稀释成10ml而制得。随后将制霉菌素溶液加到最终浓度为20微克/毫升以杀死营养细胞。
经制霉菌素处理后，活细胞用生理盐水稀释至10～10并将0.1ml样品接种到YMG平板上(20g琼脂/升YMG培养基)，孵育两天之后，将在YMG平板上的菌落影印培养在特定培养基上。
在复合培养基而不是在特定培养基上生长的菌落，随后划线培养在含有30微克/毫升腺嘌呤的特定培养基上。检出一个菌落，当它生长在基本培养基上时是白色菌落，而长在含腺嘌呤的基本培养基上时为粉红色菌落。发现这个名为GR3的分离菌在有20-25微克/毫升腺嘌呤时产红色菌落，而在有0或100微克/毫升腺嘌呤时产白色菌落。菌落为红色表明有P-核糖氨基咪唑羧酸盐(CAIP)和/或P-核糖氨基咪唑(AIR)的积累。结论GR3是一个突变株，它在嘌呤途径第一阶段的调节作用受损。在这种GR3突变株上，第一阶段的调节作用显然是损伤的，因为这一突变株即使不是嘌呤营养缺陷型，但在有20-25μg/ml腺嘌呤时嘌呤的中间代谢物就积存。
GA18菌株是通过突变株A22菌株和GR3菌株的原生质体融合而得的。如前所述，经制霉菌处理后，用生理盐水稀释成(10-4～l0-5)的每一菌种都各接种在其复合培养基上。经两天孵育后，其细胞影印培养在4B培养基里。不在4B培养基上生长的菌落，随后划线培养在补充有30微克/毫升组氨酸或蛋氨酸的4B培养基上。不在特定培养基上生长但在补充有任一种氨基酸的特定培养基上生长的细胞都假定为营养缺陷型。用这种方式就获得A22组氨酸营养缺陷型(A22 His-)和GR3蛋氨酸营养缺陷型(GR3 Met-)。
为了实现融合，A22 His-及GR3 Met-的48小时培养物在加有甘氨酸的4B培养基上生长，收集后，在20毫升蒸馏水里洗涤1次，并将它们悬浮在20毫升1摩尔山梨醇，25毫摩尔EDTA及50毫摩尔二硫苏糖醇(DTT)溶液里。将悬浮物在30℃下偶尔轻轻摇动孵育20分钟。随后收集细胞，在20毫升2摩尔的山梨醇里洗涤1次，并将各营养缺陷型悬浮在20毫升1.5摩尔山梨醇，0.1摩尔柠檬酸钠，pH5.8及0.01摩尔EDTA溶液里。随后向各悬浮加入0.2毫升β-葡萄糖苷酸酶(H-2型采自法国大蜗牛Helix pomatia，100,000单位/毫升，SigmaT)和20毫克酶酶100T(Miles实验室)。悬浮液在室温下孵育45分钟。在此期间，正常的长形细胞显现成表明细胞壁消解的圆球形。
经酶处理后，每种营养缺陷型的原生质体以低速离心(5000×克)收集，用10毫升2摩尔山梨醇洗涤2次。用10毫升1.5摩尔山梨醇，10毫克分子CaCl2及10毫克分子Tris。HCl缓冲液pH7.5洗涤1次，然后将它们悬浮在0.5毫升同样的溶液里。为了融合原生质体，混合每种0.1毫升营养缺陷型样品，并加入0.1毫升20％的聚乙二醇PEG(Sigma 厂，分子量6000左右)溶液，10毫克分子CaCl2及10毫克分子Tris.HCl，pH7.4缓冲液。
这种混合液在室温下偶尔摇动孵育20分钟，然后将细胞离心，用10毫升无氨基酸而有2％葡萄糖的以酵母为氮源的基本培养基及1.5摩尔山梨醇洗涤1次，并悬浮在0.5毫升同样溶液里。(随后把大约0.1毫升样品加到7毫升含有2.0％琼脂的同样培养基里(大约55℃)，并把它涂布在同样培养基上。在这一步所用的大部分溶液可见于Methods inYeast Gentics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，1981，p.115.在缺氨基酸时，没有一种营养缺陷型会生长(有极低的回复突变频率)。孵育在30℃6-9天后形成的菌落会有由于遗传的交换而产生的原养型。从这一融合过程而获得的原养型出现的频率大约是经聚乙二醇处理的残存者103之一。这些菌落在低倍镜下检查，那些含有核黄素结晶的菌落重行在特定培养基上划线培养并检查核黄素生产的情况。一个菌落已被命名为GA18。
GA18Y8-6#2菌株是通过用前面所说的NTG方法诱变处理GA18亲代培养物48小时而获得。在诱变之后，洗涤其细胞，把它们稀释至10-4和10-5将0.1ml接种在YMG里，GA18不形成黄色菌落即是那些在YMG培养基里具有高的核黄素含量的菌落。这是由于培养基里有铁或某些有机物抑制产黄素的结果。在一星期孵育期之后，发现有一些黄色菌落，挑出它并在YMG培养基上划线培养数次以纯化该菌株。这种纯化了的菌株被命名为GA18Y8-6#2。
目前最有效的核黄素生产者被认为是具有ATCC注册号20756的闪耀假丝酵母Candida flareri GA18Y8-6#2dgr菌株及具有ATCC注册号20755的Candida flareri GA18Y8-6#2#11菌株。它们都是前面所说的实验方法产生的。
用5ml指数生长培养物作为一次接种量接种到50ml前面所说的并且补充有0.2μgFecl3和10％YMG的特定培养基里，每6天每升培养基里GA18Y8-6#2dgr产生7.0～7.5克核黄素。这一菌株是由NTG诱变处理亲代菌株GA18Y8-6#2而得的。脱氧葡萄糖是葡萄糖的类似物，当用蔗糖作碳源时，强力抑制细胞生长。挑出有抗脱氧葡萄糖力的黄色菌落，划线培养在加有甘氨酸和脱氧葡萄糖的4B培养基上纯化和试验其产黄素情况。把这些诱变处理的细胞接种在含有750μg/ml 2-脱氧葡萄糖的加有甘氨酸的4B培养基上。Candida flareri闪耀假丝酵母GA18Y8-6#2 dgr就是从纯化了的菌落选出的。
用前面所说的处理GA18Y8-6#2 dgr相同的条件，GA18Y8-6#2#11菌株亦能每6天每升培养基产7.0～7.5克核黄素。这一菌株亦是通过NTG诱变亲代菌株GA18Y8-6#2而获得的。在诱变之后，20ml诱变处理的培养物用20ml蒸馏水洗涤2次，然后将它悬浮在20ml YMG＋FeCl3(2μg/ml)＋AMP(40mM)＋氨基吡唑嘧啶APP(500μg/ml)里。这一培养基导致选出有抗APP力的菌株。将这培养物在30℃下定期摇动孵育通过。然后收集其细胞，用20ml蒸馏水洗涤2次，并接种在YMG＋FeCl3(2微克/毫升＋APP(1微克/毫升＋AMP(40毫克分子)上，并在30℃下孵一周。在这期间之末，检验平板，挑出橙黄色菌落并检验其产黄素情况。GA18Y8-6#2#11就是从这些纯化了的菌落获得的。
在500毫升隔板培养瓶里用50毫升生长培养基从上述菌株获得高产量核黄素。这种生长培养基是由10％YMG＋90％4B＋甘氨酸＋Co＋Zn＋FeCl3(0.2微克/毫升)组成的。从GA18衍生物而得的最优的核黄素生产是在有0.2微克/毫升FeCl3存在时出现的。对野生型闪耀假丝酵母Candida flareri 0.2微克/毫升就会抑制其核黄素合成。每24小时向这些培养物补加2毫升10倍的4B＋甘氨酸溶液的母液。
进一步提高核黄素产量和对铁的不敏感性可以通过上述的重复诱变、筛选及融合而完成。
根据本主题发明，原来核黄素无效的假丝酵母Candida某些菌株，可以通过诱变而成为有效地利用营养物稳定而又高水平方生产核黄素和改善对铁抑制产黄素的抗性。
上述内容完满地描述了本发明，但它只作为后面权利要求书的说明，而无意约束本发明的范围。

Claims (11)

1.一种生产核黄素的方法，其特征在于该方法包括：
在刺激产核黄素培养基中培养无名假丝酵母(Candida famata)突变株；
其中所述无名假丝酵母突变株是无名假丝酵母GA18Y8-6#2 der(CCTCC No.86-176)或由其制备的突变株，任何这类突变株能在6天内每升发酵培养液至少产生大约5克核黄素。
2.一种有效地生产核黄素的方法，其特征在于该方法包括：
在刺激核黄素培养基中培养无名假丝酵母(Candida famata)突变株；
其中所述无名假丝酵母突变株是无名假丝酵母GA18Y8-6#2-11(CCTCC No.86-175)或由其制备的突变株，任何这类突变株能在6天内每升发酵培养液至少产生大约5克核黄素。
3.根据权利要求1或2的方法，其中制备核黄素高产无名假丝酵母株的方法包括：
(a)用两种不同的诱变剂诱变无名假丝酵母亲代菌株，得到突变菌株的第一和第二菌群；
(b)在增加核黄素生产和改变嘌呤生物合成途径的调节或改变对嘌呤生物合成途径的抑制剂的反应的刺激产核黄素培养基中，第一次筛选所述第一菌群，得到从所述第一菌群中产生的菌株1a和从所述第二菌群中产生的菌株1b；
(c)从菌株1a和1b制备原生质体，并将该原生质体融合，得到融合菌株；
(d)在刺激产核黄素培养基中，第二次筛选所述融合菌株，筛选出至少能增加核黄素生产的菌株2a。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于所述菌株1a是通过用亚硝基胍诱变所述亲代菌株和筛选红色菌落得到的；
所述菌株1b是通过用紫外线照射诱变所述亲代菌株和筛选抗腺苷一磷酸抑制B合成得到的。
5.根据权利要求1或2的方法，其中制备核黄素高产无名假丝酵母株的方法包括：
(a)诱变无名假丝酵母菌群，得到突变菌株；
(b)在能改变嘌呤生物合成途径或抗嘌呤生物合成途径的抑制剂的刺激核黄素培养基中，筛选所述突变菌株，得到第一无名假丝酵母菌株；
(c)在所述第一无名假丝酵母株和第二无名假丝酵母株之间进行原生质体融合，得到第三无名假丝酵母株，其中所述第三无名假丝酵母株是所述第一和第二无名假丝酵母株的融合产物。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述抗性是对腺苷一磷酸和/或APP的抗性。
7.根据权利要求1，2或5的方法，其特征在于所述刺激产核黄素培养基包括刺激甘氨酸、钴和锌的量。
8.根据权利要求3的方法，其进一步的特征在于该方法包括：
(a)诱变所述菌株2a，得到突变菌株的第三菌群；
(b)在刺激产核黄素的培养基中，第三次筛选所述第三菌群，筛选得到至少能增加核黄素生产的菌株3a；
(c)按需要重复所述诱变和筛选，得到核黄素产量至少比所述亲代菌株增加五倍的菌株。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于所述筛选包括至少筛选一次具有对腺苷一磷酸、4-氨基吡唑(3，4-d)嘧啶和铁的抗性。
10.根据权利要求8的方法，其特征在于，
(a)所述菌株1a是通过用亚硝基胍诱变所述亲代菌株和筛选红色菌落得到的；
(b)所述菌株1b是通过用紫外线照射诱变所述亲代菌株和筛选抗腺苷一磷酸抑制B2合成得到的；
(c)所述菌株3a是通过用亚硝基胍诱变所述菌株2a和在复合培养基中筛选产生核黄素得到的；
(d)所述重复步骤包括用亚硝基胍诱变所述菌株3a和筛选抗4-氨基吡唑-(3，4-d)嘧啶抑制生长，得到至少6天内每升产生5g核黄素的菌株。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于所述重复步骤进一步包括用亚硝基胍诱变所述菌株3a和筛选抗脱氧葡萄糖抑制生长。
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