BE890917A - Procede microbiologique d'obtention de la riboflavine et riboflavine ainsi obtenue - Google Patents

Description

  "Procédé microbiologique d'obtention de la riboflavine et riboflavine ainsi obtenue"  <EMI ID=1.1> 

  
gie, et, plus précisément , elle se rapporte à un procédé micro-biologique d'obtention de la riboflavine.

  
 <EMI ID=2.1> 

  
dans l'agriculture, les industries pharmaceutique et alimentaire . Dans l'agriculture, la riboflavine est utilisée essentiellement

  
à titre d'additif au fourrage des animaux d'élevage.

  
Actuellement, on connaît bien dans la pratique mondiale un procédé de production de riboflavine, fondé sur la culture immergée du champignon Eremothecium ashbyii. Ainsi, les certificats d'auteur de l'URSS No. 389132 et No. 368302 préconisent L'utilisation de la culture du champignon E.ashbyii, qui à l'échéance d'une croissance de 95 heures dans un milieu nutritif de soja, contenant de l'hydrol et de l'extrait de mars, accumule près de 2000 mg/1 de riboflavine .

  
Il est connu que la productivité des souches mycétiques augmente dans les milieux nutritifs, enrichis par de l'huile végétale, des acides gras, du glycérol et de la lécithine. Le brevet d'invention de la RFA No. 1767260 précise que la culture

  
de E . ashbyii dans des milieux nutritifs, contenant plus de 3 %

  
de gl cose, de l'acide butyrique ou du glycérol, du glutamate d'ammonium et des vitamines, accumule 3800 mg/1 de riboflavine. Le brevet d'invention de la RFA No. 2028355 se rapporte à la culture du champignon E . ashbyii dans un milieu, qui contient

  
de 1 à 5 % de glucose, de L'huile végétale, 5 % de collagène, de 0,5 à 5 % de lécithine, de l'extrait de mais et des oligo-éléments Dans le milieu nutritif mentionné, l'accumulation de riboflavine constitue de 4500 à 5000 mg/1.

  
Le principal avantage du procédé microbiologique de production de la riboflavine par la culture de E.ashbyii consiste en la hauta activité biosynthétique. Cependant, les souches mycétiques productrices de riboflavine présentent des particularités peu souhaitables, parmi lesquelles on peut citer leur longue période de croissance, dont résulte l'accroissement de la durée de fermentation, ainsi que leur sensibilité à l'égard de contamination par une microflore étrangère et leur exigence envers la composition des milieux nutritifs, qui doivent contenir dans certains cas des constituants coûteux et déficitaires. Dans le but d'inhiber la croissance de la microflore étrangère au cours de la culture de E .ashbyii, on ajoute dans le milieu de ferment.avion des antibiotiques, ce qui élève nettement le coût du processus de fermentation.

   Un certain nombre d'autres constituants des milieux de fermentation pour la culture du champignon E.ashbyii, telles que diverses graisses, glycérol, acides gras, lécithine et autres, sont difficilement accessibles et également coûteux .

  
Un autre procédé d' obtention de la riboflavine, connu d'après les publications de brevets d'invention, consiste en la culture immergée de bactéries de type Bacillus subtilis (Brevet d'invention des USA, N[deg.] 3900368). Ce procédé utilise les mutants induits de B.subtilis - FERM-P1657 et FERM-P2292, en particulier des mutants résistant aux hautes concentrations de purines, d'analogues de purines, et auxotropbes par rapport aux purines. Les mutants mentionnés sont cultivés dans un milieu nutritif, contenant 8 %de glucose, des sels minéraux et, à titre de facteurs de croissance, de l'extrait de levure, de la peptone, de l'acide glutamique, des produits d'ARN (acide ribonucléique), des purines ou analogues de purines. A la suite d'une fermentation de 44 heures, le liquide de culture accumule 560 mg/1 de riboflavine.

   L'avantage de ce procédé de production de la riboflavine réside dans la rapidité de croissance des bactéries et, par conséquent, dans la réduction du délai de fermentation. Toutefois, les mutants de B.subtilis, utilisés dans ledit procédé, présentent une basse activité biosynthétique. Par ailleurs, il convient de noter que les milieux nutritifs utilisés comportent des constituants déficitaires, tels que, par exemple, les produits d'ARN, les purines et analogues de purines, et pour cette raison, le procédé susmentionné est difficilement réalisable dans des conditions industrielles.

  
Le but de la présente invention consiste à mettre au point un procédé microbiologique d'obtention de la riboflavine, permettant de réduire la durée du processus de fermentation et

  
de réduire son coût, sans diminuer le rendement en produit fini.

  
Le problème, posé dans la présente invention, consiste à élaborer de nouvelles souches productrices de riboflavine chez les bactéries de l'espèce B.subtilis, qui présenteraient une haute activité flavinogène.

  
Ce problème est résolu par un procédé d'obtention

  
de riboflavine, basé sur la culture immergée des microorganismes producteurs, appartenant à l'espèce B.subtilis, sous des conditions d'aération dans un milieu de culture comportant des source:
de carbone et d'azote, des sels minéraux requis, en présence de facteurs de croissance, dans lequel on utilise à titre de micro-organismes producteurs de riboflavine les souches de <EMI ID=3.1> 

  
Les souches susmentionnées ont été déposées le 22 juillet 1980 au Musée Central des micro-organismes industriels

  
 <EMI ID=4.1> 

  
souches signifie l'abréviation du nom de l'Institut : Institut national de recherches de génétique et de sélection des micro-

  
 <EMI ID=5.1> 

  
organismes industriels.

  
La culture initiale, servant à l'obtention des souches productrices susmentionnées, est la souche bien connue B.subtilis SHgw, dans laquelle on a obtenu, indépendamment l'une de l'autre, des mutations, entraînant la super-synthèse de riboflavine :

  
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de régulation, AGR - résistance à la 8-azaguanine. Ensuite, par des procédés génétiques on a réalisé un triple mutant

  
 <EMI ID=7.1> 

  
nisine, nitrosométhyl-urée, et à une irradiation UV avec une sélection ultérieure des variantes actives . On a .obtenu de cette façon Les deux nouvelles souches.

  
 <EMI ID=8.1> 

  
non identifié. Les deux souches sont oligosporogènes, et par rapport à la culture initiale la quantité de spores est réduite d'un ordre de grandeur de 3 à 4. Les données, concernant les caractéristiques culturales et morphologiques des souches pro-ductrices de riboflavine VNIIgénétika-304 et VNIIgénétika-304a, sont représentées dans le tableau qui suit .

TABLEAU

  

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 <EMI ID=10.1> 

  
(AVP) 28-37[deg.]C se forment des colonies avec un

  
bord irrégulier, en forme d'étoiles,

  
de 3-4 mm de diamètre, avec une surface lisse, brillante, de couleur jaunâtre. La croissance sur la ponction est modérée, principalement sur la surface du milieu.

  
Bouillon viande-pep- Croissance sans balancement à la surface tone (BVP) du bouillon, sous forme de pellicule. Milieu minimal de Au 2-ième jour de Pas de croissance Speedeizen avec croissance se for- dans le milieu minima glucose ment des colonies

  
d'un diamètre de

  
2-3 mm, de couleur

  
jaune-vive, fluorescence de couleur jaune dans les rayons UV,

  
colonies rondes avec

  
des bords réguliers,

  
brillantes. 

  
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 <EMI ID=12.1> 

  
carbures : utilisent bien le glucose, le 'saccharose, l' amidon. Alcools : utilisent l'éthanol, le sorbitol. Sources d'azote :
assimilent bien l' ammonium, l'urée, les nitrates. Liquéfie la gélatine .

  
D'une façon générale le procédé suivant l'invention est réalisé de la&#65533;açon suivante. On cultive les souches VNIIgénéti. ka-304 ou VNIIgénétika 304a pour l'obtention du matériel d'ensemencement dans le milieu nutritif agarisé de Hottinger ou dans

  
le milieu d' agar-viande-peptone (AVP) pendant 1 à 2 jours à la

  
 <EMI ID=13.1> 

  
laire dans des fioles contenant le milieu d'ensemencement avec de la mélasse, de la biomasse séchée de levure alimentaire et des sels minéraux, ou un milieu d'ensemencement contenant des parcelles de pommes de terre pelées ou du bouillon à base de viandepeptone. On cultive la matière d'ensemencement pendant 17 à 24 heures sur une secoueuse à 200 tours/min. Puis on transfère la matière d'ensemencement à raison de 5-10 % dans le milieu essentiel de fermentation. On réalise le processus de fermentation dans des fioles d'Erlenmeyer sur une secoueuse ou dans un fermenteur avec brassage vigoureux et aération au cours de 46-50 heures, à la température de 37 [deg.]C, au pH de 6,5 à 7,5 (au début de la fermentation), dans un milieu nutritif contenant des sources  <EMI ID=14.1> 

  
amidon, des sources d'azote minéral, telles que sels d'ammonium, urée, nitrates, des sels de phosphore, tels que phosphates de potassium, d'ammonium et d'autres sels, des sels de manganèse

  
 <EMI ID=15.1> 

  
par exemple, biomasse de levures alimentaires, hydrolysats et autolysats de levures alimentaires, levures alimentaires, extrait de levure, farine de mars et de soja, extrait de maïs, hydrolysat

  
 <EMI ID=16.1> 

  
fermentation, le liquide de culture accumule de 700 à 1000 mq/l de riboflavine. 

  
Le procédé d ' obtention de la riboflavine, suivant l'intention, utilisant les souches susmentionnées, assure après une croissance de 46 à 50 heures dans des milieux synthétiques

  
ou complexes dans des fioles, l'accumulation dans le liquide de cu:
ture d'une quantité allant jusqu'à 1000 mg/1 de riboflavine,

  
ce qui dépasse de 40 % l'activité de la culture de B.subtilis, recommandé dans le Brevet des Etats-Unis d'Amérique No .
3.900.368. D'autre part, les souches proposées dans la présente invention se cultivent bien dans des milieux nutritifs ordinaires, et ne comportant pas de constituants coûteux.

  
Par rapport aux procédés d'obtention de la riboflavine, oÙ l'on utilise à titre de producteur le champignon E.ashbyii, le procédé, suivant l'invention, est plus économique grâce à l'accélération de la fermentation de 1,5-2 fois, compte tenu de ce que les cultures bactériennes croissent plus vite que

  
les cultures mycétiques. Un facteur qui n'est pas de moindre

  
. 

  
importance consiste en la sensibilité réduite de la culture de B.subtilis, par rapport à celle du champignon, à l'égard de microflore étrangère, et, en particulier, on n'ajoute pas <EMI ID=17.1> 

  
lement le processus moins coûteux dans les conditions industrielles.

  
Le procédé, suivant l'invention, sera mieux compris à l'aide des exemples de réalisation non limitatifs suivants.

Exemple 1.

  
Une culture d'un jour de B.subtilis VNIIgénétika-304, réalisée sur des milieux en pente d' agar-viande-peptone (AVP) est ensemencée dans un milieu d'ensemencement liquide contenant

  
6 % de mélasse, 1% de biomasse sèche de levure fourragère et

  
des sels minéraux. On prépare le milieu d'ensemencement en diluant à raison de 1/1 le milieu de fermentation, dont la composition est rapportée ci-dessous, avec de l'eau stérile . On effectue la culture de la matière d'ensemencement dans des fioles d'Erlenmeyer d'une capacité de 750 ml (le volume du milieu est

  
 <EMI ID=18.1> 

  
coueuse à 200 tours/min, pendant 17 heures . La matière d'ensemencement obtenue est transférée à raison de 5 % dans le milieu de fermentation de composition suivante, en % en poids :

  

 <EMI ID=19.1> 
 

  

 <EMI ID=20.1> 


  
On réalise la fermentation dans des fioles d'Erlenineyer d'une capacité de 750 ml (volume; de milieu - 2 5 ml) sur une secoueuse à 200 tours/min à 37 [deg.]C . Après 48 heures de fermentation dans les conditions mentionnées, le liquide de culture

  
 <EMI ID=21.1> 

Exemple 2

  
La fermentation est réalisée de la même façon que celle décrite dans l'exemple 1, mais en utilisant la souche R.subtilis VNIIgénétila-304a. Après 48 heures, le liquide de culture de fermentation contient 1000 mg/1 de riboflavine.

Exemple 3

  
Le milieu de fermentation et les conditions de la fermentation sont les mêmes que ceux décrits dans l'exemple 1, et on utilise à titre de producteur la souche VNIIgénétika-304. La différence réside dans la composition du milieu d'ensemencement que l'on prépare comme suit. On épluche des pommes de terre, on les découpe en morceaux que l'on recouvre d'une petite quantité d'eau, puis on stérilise sous 0,8-1,0 atm. On ensemence le milieu d'ensemencement à partir de pentes de AVP. La culture croît dans des fioles de 750 ml (le volume du milieu étant de
50 à 100 ml), sur une secoueuse à la température de 37 [deg.]C pendant  <EMI ID=22.1> 

  
 <EMI ID=23.1> 

  
comme dans l'exemple 1.

  
Après 48 heures de la fermentation le liquide de fermentation contient 900 mg/1 de riboflavine .

Exemple 4

  
 <EMI ID=24.1> 

  
que dans l'exemple 3, à l'exception que l'on utilise la souche B.subtilis VNIIgénétika-304a.

  
Après 48 heures de fermentation, le liquide de culture

  
 <EMI ID=25.1> 

Exemple 5

  
La culture, le milieu d'ensemencement et. les conditions de fermentation sont les mêmes que dans les exemples 1, 2, 3 ou 4. La différence réside dans la composition du milieu de fermentation, en % en poids :

  

 <EMI ID=26.1> 


  
Après 48 heures de fermentation, le liquide de culture contient 700 mg/1 de riboflavine .

Exemple 6

  
La culture d'un jour de la souche VNIIgénétika-304 est transportée des pentes de AVP dans le milieu d'ensemencement

Claims (4)

à base de bouillon de viande et de peptone, dans lequel on prépare la matière d'ensemencement pendant 10 heures, sur une secoueuse à la température de 37 [deg.]C. On transfère à raison de 10 % la matière d'ensemencement dans le milieu de fermentation de composition suivante, en % en poids : <EMI ID=27.1> On réalise la fermentation pendant 48-50 heures à la température de 37 [deg.]C dans des fioles sur une secoueuse à 200 <EMI ID=28.1> ture contient 1000 mg/1 de riboflavine. REVENDICATIONS

1. Procédé microbiologique d'obtention de la riboflavine par culture immergée de micro-organismes producteurs de l'espèce Bacillus subtilis, dans des conditions d'aération dans un milieu nutritif, comportant une source de carbone, d'azote, <EMI ID=29.1>

des sels minéraux requis, en présence de sources de facteurs

de croissance, caractérisé en ce que, à titre de micro-organismes producteurs de riboflavine, appartenant à l'espèce Bacillus

<EMI ID=30.1>

le numéro d'enregistrement CMPM B-2116, ou VNIIgénétika-304a, déposée sous le numéro CMPM B-2117.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'on réalise la culture dans un milieu nutritif contenant à titre de source de carbone du sucre, du glucose ou de la mélasse, et à titre de sources de facteurs de croissance une biomasse séchée de levures fourragères ou de levures alimentaires, ou de l'extrait de levure.

3 . Procédé microbiologique d'obtention de la riboflavine, tel que décrit ci-dessus, notamment dans les exemples donnés.

4. Riboflavine telle qu'obtenue par le procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3.