CN101631870B - 多不饱和脂肪酸及含有其的脂质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

提供多不饱和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂质的制造方法、含有PUFA的微生物菌体及所述微生物菌体的利用方法。提供PUFA或含有其的脂质的制造方法，其为在培养具有花生四烯酸(ARA)及/或二高-γ-亚麻酸(DGLA)生产能力的微生物的同时制造多不饱和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂质的方法，包括以下(a)～(c)工序中的1个以上，(a)在主培养开始后，在培养基中添加有机酸0.01～5w/v％的工序；(b)在主培养开始后，控制培养基的pH使其在培养有效范围内提高的工序；及(c)在主培养培养基中添加金属离子的硫酸盐0.01～0.5w/w％的工序。

Description

多不饱和脂肪酸及含有其的脂质的制造方法
技术领域
本发明涉及多不饱和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂质的制造方法、含有PUFA的微生物菌体及其利用。本发明特别涉及二高-γ-亚麻酸(DGLA)、花生四烯酸(ARA)的含量高的脂质及含有该脂质的微生物菌体的制造方法、以及其代表性的利用。
背景技术
多不饱和脂肪酸(以下称为PUFA)具有各种有用的生理功能。在此，PUFA是指碳原子数为20以上的具有2个以上双键的脂肪酸。在PUFA中、特别是在二高-γ-亚麻酸(以下称为DGLA)、花生四烯酸(以下称为ARA)中，近年来发现了各种有用性(非专利文献1)。例如在DGLA中发现了特应性皮炎抑制效果、抗变应性作用等，在ARA中发现了以脑功能改善作用、婴儿营养效果为代表的多种有用性。此外，在成人病患者、其亚健康人群、婴儿、高龄者、宠物(特别是猫科动物)中DGLA、ARA的不足引人担心。
在这种情况下，对PUFA、特别是DGLA、ARA的供给方法进行了各种探讨，作为实用的制造方法，探讨了通过培养具有上述脂肪酸的生产能力的微生物而制造的方法。在对培养方法进行各种探讨的基础上，发现了可工业生产的方法(非专利文献1)。在PUFA中、特别是对于DGLA，发现了通过大规模培养，每1kg干燥菌体中的DGLA量最高达到167g的培养方法(专利文献1、非专利文献2)。但是在这些方法中，在培养初期葡萄糖的消耗量多，另一方面为了避免由高葡萄糖浓度引起的增殖阻碍所导致的生产率降低的障碍，需要从培养初期开始最少在数天内分期频繁地添加葡萄糖。
另一方面，对于特定的物质，也探讨了用于使其产量提高的微生物的培养方法。专利文献2公开了在含有乳清的培养基中培养乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)发酵生产脑苷脂时，在培养基中添加各种钠源的方法、控制培养基pH的方法。
此外，对于被孢霉属丝状菌的培养方法，非专利文献3公开了将NH4OH兼作氮源并控制pH的方法，专利文献3公开了在培养的后半期控制pH为7～7.5的方法。非专利文献4公开了通过在培养基中添加KH2PO4和0.05％CaCl2·2H2O、0.05％MgCl2·6H2O、0.1％Na2SO4，菌形态变为最适形态，且PUFA生产性提高。
专利文献1日本专利第3354581号
专利文献2日本特开2006-55070
专利文献3 US 5,658,767
非专利文献1河岛洋、Foods Food Ingredients J Jpn，210，106-114(2005)
非专利文献2 H Kawashima et al.，J Am Oil Chem Soc，77，1135-1138(2000)
非专利文献3 Byung-Hae Hwang et al.，Biotechnol Lett，27，731-5(2005)
非专利文献4藤川茂昭等、生物科学与工业、57、818-821(1999)
发明内容
如上所述，对于通过培养具有脂肪酸生产能力的微生物来制造PUFA、特别是DGLA、ARA的方法进行了各种探讨。但是，利用上述以往技术得到的微生物菌体存在微生物菌体中的PUFA含量低的问题。含有PUFA的微生物菌体，虽然可将干燥后的干燥菌体直接配合在饮食品、营养组合物、饲料、宠物食品等中，但在微生物菌体中PUFA占有的含量低时，为了充分发挥PUFA的效果，需要配合大量的微生物菌体，因此其他成分的配合量受到显著限制。此外，含有PUFA的微生物菌体也可作为用于提取含有PUFA的脂质的原料使用，但是微生物菌体中的PUFA含量低时，必须处理大量的微生物菌体，因此需要大规模的提取装置、大量的提取溶剂。因为这会引起成本大幅上涨，而且处理时需要的能量也大，所以对地球环境的负荷加大。
此外，在以往技术中也尝试了对微生物菌体进行的各种培养控制，但是因为培养操作变得复杂化时，会引起杂菌污染、操作失误的危险及成本上涨，所以包括在培养基中添加添加物的操作，采用尽量少的操作进行高效培养非常重 要。
本发明是鉴于上述课题而进行的发明，其目的在于：提供PUFA或含有其的脂质的低成本、操作简便、适合大量生产的制造方法、以及PUFA或含有其的脂质的含量高的微生物菌体及其利用方法。
到目前为止，对于使被孢霉属丝状菌的PUFA生产提高的培养方法，已探讨了在基本培养基中添加油脂、盐类的方法，但是对于有机酸的添加，即使有在其他微生物中添加的例子，但也还未有使PUFA含量增加的见解。此外，对于培养过程中的pH控制，也未有关于最适pH的控制的详细分析报告。而且，通过添加有机酸当然可以降低pH，但是未着眼于对于有机酸添加和pH控制的组合对PUFA生产所产生的影响。
对于培养基中的微量金属盐的量，例如非专利文献4中虽着眼于使用CaCl2和MgCl2、主要是Ca2+和Mg2+的效果，但未考虑与金属离子成对的阴离子的影响，未着眼于与金属离子成对的阴离子对微生物的PUFA生产率所产生的影响。
关于在基本培养基中添加添加物的操作，对培养前的培养基通常进行加热灭菌，但因为将葡萄糖和其他化合物混合进行灭菌诱发化学反应的可能性高，所以通常不这样进行。因此，在培养初期在培养基中添加葡萄糖以外的添加物会使操作变得烦杂、困难。从避免将葡萄糖和其他化合物(容易发生化学反应)同时进行灭菌的方面出发，必须尽量减少上述添加操作。
本发明者为了解决上述课题进行精心研究的结果，首次发现：在液体培养基中进行通气搅拌培养高山被孢霉的同时制造PUFA及含有其的脂质的方法中，通过(a)在培养基中添加有机酸及/或有机酸盐进行培养；(b)在培养开始后，在规定时期提高培养基的pH并控制在一定范围内；(c)在培养基中添加金属离子的硫酸盐；及将所述操作组合，微生物菌体内生产的脂质、以及该脂质中的PUFA、特别是DGLA、ARA的量飞跃提高。并且对于能够同时进行(a)有机酸等的添加和(b)培养基pH的控制等进行上述(a)～(c)的时期进行了进一步的探讨，完成了本发明。
即：本发明提供PUFA、优选ARA及/或DGLA、更优选DGLA或含有其的脂质、优选甘油三酯的制造方法，其为将具有花生四烯酸(ARA)及/或二高-γ-亚麻酸(DGLA)生产能力的微生物、优选属于被孢霉属的微生物、更优选高山被孢 霉进行培养，优选在液体培养基中进行通气搅拌培养的同时制造多不饱和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂质的方法，包括以下(a)～(c)工序中的1种以上：
(a)在主培养开始后，优选在脂肪酸积累期、更优选在主培养开始后24小时之后、进一步优选在主培养开始后第3天之后、特别优选在主培养开始后第4天之后，在培养基中添加有机酸、优选选自糖酵解途径和其分支途径、或TCA循环中含有的有机酸中的1种以上的有机酸、更优选选自琥珀酸、富马酸、丙酮酸、乳酸及苹果酸中的1种以上的有机酸、进一步优选琥珀酸0.01～5w/v％、优选0.2～5w/v％、更优选0.22～5w/v％、进一步优选0.3～5w/v％、特别优选0.44～5w/v％的工序；
(b)在主培养开始后，优选在脂肪酸积累期、更优选在主培养开始后24小时后、进一步优选在主培养开始后第3天之后、特别优选在主培养开始后第4天之后，控制培养基的pH使其在培养有效范围内、优选在pH6～8范围内、更优选在pH6.3～7.5范围内、进一步优选在pH6.6～7.5范围内、特别优选在pH6.9～7.2范围内提高的工序；及
(c)在主培养培养基中，添加金属离子的硫酸盐、优选选自MgSO4、CaSO4、Na2SO4、K2SO4、FeSO4、及MnSO4等中的1个以上、更优选MgSO4及/或CaSO4 0.01～0.5w/w％、优选0.01～0.25w/w％、更优选0.05～0.2w/w％、特别优选0.06～0.1w/w％的工序，并且最好是代替培养基中的金属氯化物，添加相应的上述硫酸盐的工序。
本发明还提供上述的制造方法，其包括上述工序(a)及工序(b)，工序(a)及工序(b)优选在同日、更优选在同时、且在与向培养基中添加碳源例如葡萄糖不同的时间、优选在不同的日子进行。
本发明还提供上述的制造方法，其包括上述工序(c)，工序(c)在主培养开始前进行。
本发明还提供上述的制造方法，其中，在上述PUFA或含有其的脂质中，上述总脂肪酸中的DGLA为35w/w％以上、优选37w/w％以上、特别优选40w/w％以上。
本发明还提供高山被孢霉的干燥菌体，其中，每1g干燥菌体中的DGLA为190mg以上、优选195mg以上、更优选200mg以上、特别优选220mg以上。
本发明还提供上述干燥菌体，其为将利用包括以下(a)～(c)工序中的1个 以上的方法，在液体培养基中进行通气搅拌培养后的高山被孢霉菌体，进一步供给干燥工序所得到的干燥菌体，所述(a)～(c)工序为，
(a)在主培养开始后第3天之后、优选在主培养开始后第4天之后，在培养基中添加选自琥珀酸、富马酸、丙酮酸、乳酸及苹果酸中的1种以上的有机酸、优选琥珀酸0.2～5w/v％、优选0.22～5w/v％、更优选0.3～5w/v％、进一步优选0.44～5w/v％的工序；
(b)在主培养开始后第3天之后、优选在主培养开始后第4天之后，控制培养基的pH使其在pH6.6～7.5范围内、优选在pH6.9～7.2范围内提高的工序；及
(c)在主培养培养基中，添加选自MgSO4、CaSO4、Na2SO4、K2SO4、FeSO4、及MnSO4等中的1种以上、优选MgSO4及/或CaSO4 0.05～0.2w/w％、优选0.06～0.1w/w％的工序，并且最好是代替培养基中的金属氯化物，添加相应的上述硫酸盐的工序。
本发明还提供包含上述干燥菌体或来自上述干燥菌体的ARA及/或DGLA的饮食品，优选营养补助品、饮料、动物用饲料，更优选动物用饲料(特别是宠物食品)。
进而本发明提供利用上述制造方法获得的PUFA、优选ARA及/或DGLA或含有其的脂质、优选甘油三酯。
进而本发明提供上述制造方法，其中，与不包括工序(a)～(c)的制造方法相比，获得的每1g微生物干燥菌体中的DGLA增加3％以上、优选5％以上、更优选10％以上。
进而本发明提供上述制造方法，其中，与不包括工序(a)～(c)的制造方法相比，获得的每1g微生物干燥菌体中的ARA增加。
进而本发明提供上述制造方法，其中，培养结束后的每1ml培养基中的DGLA量为5.5mg以上、优选6.5mg以上、更优选7.0mg以上、进一步优选7.5mg以上。
进而本发明提供上述制造方法，其中，与不包括工序(a)～(c)的制造方法相比，培养结束后的每1ml培养基中的DGLA量增加5％以上、优选10％以上、更优选15％以上。
进而本发明提供上述制造方法，其中，与不包括工序(a)～(c)的制造方法相比，培养结束后的每1ml培养基中的ARA量增加。
根据本发明的制造方法，微生物菌体中的PUFA、含有其的脂质的含量飞跃提高，因此，可有效利用含有PUFA的微生物菌体、以及PUFA及含有其的脂质。并且在本发明中，因为在主培养开始前进行(c)金属离子的硫酸盐的添加，渡过主培养初期的葡萄糖添加的必要时期之后，进行(a)有机酸的添加、(b)培养基pH的控制即可，所以可以避免在同日进行这些操作和葡萄糖的添加操作这一烦杂问题。其结果，可以提供PUFA或含有其的脂质的低成本、操作简便的适合大量生产的制造方法、以及PUFA或含有其的脂质的含量高的微生物菌体及其利用方法。
附图说明
图1表示在实施例4中，从高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株的主培养开始第5天控制pH(pH 5.0、5.8、7.2)时对DGLA量的影响。
图2表示在实施例5中，从高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株的主培养开始第3天控制pH(pH6.6、6.9、7.2、7.5)时对DGLA量的影响。
具体实施方式
[微生物]
作为可在本发明的制造方法中使用的微生物，可例举具有ARA及/或DGLA生产能力的微生物，优选为被孢霉属丝状菌，更优选为被孢霉亚属丝状菌，进而优选为高山被孢霉。例如作为具有含有花生四烯酸作为构成脂肪酸而形成的脂质(甘油三酯)的生产能力的微生物，可例举属于被孢霉(Mortierella)、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、青霉属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉属(Mucor)、镰刀菌属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属(Entomophthora)、 Echinosporangium属、水霉属(Saprolegnia)的微生物。
属于被孢霉(Mortierella)属被孢霉(Mortierella)亚属的微生物，例如可例举长孢被孢霉(Mortierella elongata)、Mortierella exigua、Mortierella hygrophila、高山被孢霉(Mortierella alpina)等。具体可例举长孢被孢霉(Mortierella elongata)IF08570、Mortierella exigua IF08571、Mortierellahygrophila IF05941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IF08568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等菌株。
这些菌株均可从大阪市的财团法人发酵研究所(IFO)、及美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)以及Centrral Bureau voorSchimmelcultures(CBS)等中无任何限制地获得。此外也可使用本发明研究组从土壤中分离的菌株高山被孢霉1S-4株、菌株长孢被孢霉SAM0219(微工研菌寄第8703号)(微工研条寄第1239号)、采用常法亚硝基胍诱变法从1S-4株中诱导获得的高山被孢霉S14株、高山被孢霉Iz3株等。
此外，作为可在本发明的制造方法中使用的微生物，还包含上述微生物的突变株。例如可使用对属于被孢霉亚属的微生物进行突变操作，使去饱和酶、碳链增长酶的活性降低或缺损或提高的突变株。突变操作可采用同领域技术人员公知的方法进行。突变株是否具有所期望的PUFA生产能力，只要是同领域技术人员即可容易地判断。
[基本培养操作]
本发明提供在培养上述微生物的同时制造多不饱和脂肪酸(PUFA)及含有其的脂质的方法。
在上述微生物的培养中向培养基内接种菌体的方法，根据培养方法同领域技术人员可适当选择。具体为：将微生物菌株的营养细胞、孢子及/或菌丝、或者经预培养获得的种子培养液或通过种子培养回收的营养细胞、孢子及/或菌丝接种在液体培养基或固体培养基中并进行培养。
本发明的制造方法使用的培养基中，作为碳源，可以单独或组合使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、山梨糖醇、半乳糖、糖化淀粉等，进而还可以使用含有上述物质的柑橘糖蜜、甜菜糖蜜、甜菜榨汁、甘蔗榨汁等，只要是同领域技术人员通常使用的碳源，可使用任意的碳源。
作为氮源，可以使用同领域技术人员通常使用的氮源，例如除蛋白胨、酵母浸膏、麦芽浸膏、肉浸膏、酪蛋白水解物、玉米浆、大豆蛋白、脱脂大豆、棉籽粕等天然氮源之外，还有尿素等有机氮源、以及硝酸钠、硝酸铵等硝酸盐、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐等无机氮源。特别是可以使用从大豆中获得的氮源，具体为大豆、脱脂大豆、大豆片、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆奶、熟黄豆面等。例如可单独或组合使用对脱脂大豆实施热改性后的产物，更优选在约70～90℃对脱脂大豆进行热处理，进而除去乙醇可溶性成分后的产物，或者可与上述氮源组合使用。
根据其它需要，可将磷酸离子、钾离子、钠离子、镁离子、钙离子、铁、铜、锌、锰、镍、钴等金属离子、维生素等作为微量营养源使用。根据需要，也可添加ADEKA NATE等消泡剂。
这些成分在培养基中的浓度，只要不阻碍微生物的生长发育，无特别限制。实际使用中期望：碳源的总添加量相对于培养基为0.1～40w/w％、优选为1～25w/w％，氮源的总添加量相对于培养基为2～15w/w％、优选为2～10w/w％。此外，已知在主培养中初始氮源浓度及/或碳源浓度过高时阻碍微生物的成长。作为适当的方式，使初始碳源添加量为1～8w/w％、优选1～5w/w％，初始氮源添加量为0.1～8w/w％、优选1～6w/w％，在培养过程中添加微生物消耗的碳源及氮源进行培养。将葡萄糖和其他化合物混合进行灭菌，诱发化学反应的可能性高，并且因为已知碳/氮比高时微生物的脂质生产率高，所以作为特别适当的方式，仅将碳源通过流加等添加在培养基中进行培养。
此外，为了提高微生物菌体中的含PUFA脂质的含量，作为不饱和脂肪酸的前体，例如可将十六烷或十八烷等烃；油酸或亚油酸等脂肪酸或其盐、或脂肪酸酯(例如乙酯、甘油脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯等)；或橄榄油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油等油脂类单独或组合添加在培养基中。这些物质的添加量相对于培养基为0.001～10w/w％、优选为0.05～10w/w％。此外，也可将这些物质作为培养基中的唯一碳源进行培养。
培养可使用以往的培养微生物的方法，具体可使用静置培养、振荡培养、通气搅拌培养等。作为培养操作法，可使用所谓的分批发酵法、批式流加发酵法、反复分批发酵法及连续发酵法等中的任一种。此外，作为搅拌方式，例如可使用叶轮(搅拌叶轮)、气升发酵槽、发酵液的泵驱动循环、及这些方式的组合等。
本发明的制造方法可利用上述培养方法来实施，其中，采用在液体培养基中的通气搅拌培养来进行主培养在工业上有利。作为用于进行通气搅拌培养的槽，例如可使用发酵罐及槽等的搅拌槽，但并不限于这些。
在通气搅拌培养中，例如可通入空气等含氧气体、氩及氮等不含氧的气体中的任一种，这种气体可由同领域技术人员结合培养体系的条件来适当选择。例如在下述实施例记载的方法(作为本发明的一种方式的高山被孢霉(Mortierella alpina)时)中，向培养基中通入空气等含氧气体。
微生物的培养温度因使用的微生物不同而不同，通常为5～40℃、优选20～30℃。作为另一方式，在20～30℃进行培养使菌体增殖后，在5～20℃继续培养可生产含PUFA的脂质。采用这样的温度管理，也可提高含PUFA的脂质中的PUFA含量。
在试管、烧瓶中培养上述微生物时(预培养阶段)的培养时间通常为1～10天、优选1～5天、更优选1～3天。后续的主培养的培养时间通常为2～30天、优选5～20天、更优选5～15天。可将所期望的PUFA含量、脂肪酸组成作为判断主培养结束时的基准。主培养大致可分为微生物的对数增殖期、即从微生物的干燥菌体重量中减去菌体内总脂肪酸重量后的无脂质菌体量增加的时期、和其后续的PUFA等的脂肪酸积累期、即无脂质菌体量变化小的时期。非专利文献4中记载：在10kL培养箱内培养高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4时，具有从培养开始到第2天的增殖期(无脂质菌体量增加)、和其后续的脂肪酸积累期(无脂质菌体量几乎无变化)。对数增殖期及脂肪酸积累期的判断方法，可参照非专利文献4记载的方法进行。
此外，在微生物主培养开始时(添加种子培养液时)，调节培养基的pH为5～7、优选为5.5～6.5。
[有机酸]
本发明提供上述制造方法，其为在培养上述微生物的同时制造PUFA及含有其的脂质的方法，包括(a)在主培养开始后，在培养基中添加有机酸0.01～5w/v％的工序。向培养基中添加有机酸，例如可参照下述实施例进行。
在该工序(a)中，所述有机酸包含有机酸及其盐、以及其水合物，以下有时将这些总称为“有机酸等”。在本说明书中，有机酸是指在具有-COOH基的有机化合物中，在培养基中添加量为0.01～5w/v％时不阻碍上述微生物增殖的有机酸，其中特别优选糖酵解途径和其分支途径、或TCA循环中包含的有机酸。糖酵解途径及TCA循环是与以葡萄糖为初始物质获取能量、合成脂肪酸相关的中心途径，其中大多数由有机酸构成。这些有机酸通过糖酵解途径、TCA循环、进而通过其分支途径、旁路途径进行相互变化。通常情况下，作为PUFA合成的最初阶段的脂肪酸合成，需要上述途径中生成的乙酰CoA、NADPH，与上述途径密切相关。因此，期待通过改变培养基中有机酸的量、平衡来改变上述微生物的PUFA生产能力。特别优选添加在培养基中培养上述微生物时，每单位重量微生物干燥菌体中的PUFA量增加的有机酸及/或每单位体积培养基中的PUFA量增加的有机酸。例如可使用琥珀酸、富马酸、丙酮酸、乳酸、苹果酸(这些为碳原子数为3～4的单或二羧酸，具有1个以下-OH基)、所述酸的盐或其水合物中的至少1种，可优选使用琥珀酸、苹果酸、乳酸、所述酸的盐或其水合物中的至少1种。作为有机酸的盐，可使用钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐中的至少1种。是否为添加时的优选有机酸等，例如可根据下述实施例中记载的方法来判断。
在培养基中添加上述有机酸等，换算为游离有机酸，可添加0.01～5w/v％、优选0.2w/v％以上、更优选0.22w/v％以上、进一步优选0.3w/v％以上、特别为0.44w/v％以上。为0.01w/v％以下时，无法获得提高上述微生物中的PUFA或含有其脂质的含量的所期望效果，为5w/v％以上时，有可能阻碍上述微生物的增殖。此外，认为在一定量以上时伴随有机酸添加量的增加，上述微生物中的PUFA或含有其的脂质的含量并不会增高，所以在该一定量以上的范围可任意选择有机酸添加量。作为优选的一种方式，在培养基中可添加琥珀酸二钠盐·六水合物1w/v％、即可添加琥珀酸0.44w/v％。上述有机酸等，例如可作为水溶液添加在培养基中。可将有机酸水溶液调节至与有机酸添加前的培养基相同程度的pH后添加，也可调节为不同的pH可使培养基的pH变化。
上述有机酸等在微生物的主培养中添加，优选不是在主培养开始前，而是在主培养开始后添加。因为考虑到有机酸等的添加效果表现在脂肪酸积累期，所以在上述微生物的主培养开始后、适合在对数增殖期结束转移至脂肪酸积累 期后、例如在主培养开始后24小时之后、优选在主培养开始后第3天之后、更优选在主培养开始后第4天之后在培养基中添加上述有机酸。特别是可在主培养开始后第3～5天之间、例如在主培养开始后第4天添加有机酸。此外，有机酸可以1次添加，也可以分为数次添加，从操作简便性的观点来看，优选1次添加。
[pH]
本发明提供上述制造方法，其为在培养上述微生物的同时，制造PUFA及含有其的脂质的方法，包括(b)在主培养开始后，控制培养基的pH使其在培养有效范围内提高的工序。培养基pH的控制，例如可参照下述实施例进行。认为培养中的培养基pH对微生物代谢产生影响，特别会对参与电子传递系统的脂肪酸合成、去饱和反应产生大的影响。
培养基的pH的控制，可参照同领域技术人员公知的方法进行控制，使其比控制前的培养基的pH高、且为不阻碍微生物增殖的范围内(培养有效范围内)。例如在考虑控制前的培养基pH的情况下，可进行控制使培养基的pH提高到6～8的范围内，该范围优选pH6.3～7.5、更优选pH6.6～7.5、进一步优选pH6.9～7.2。
pH的控制，优选用NaOH、KOH、NaHCO3、氨等碱性水溶液进行，特别是可使用廉价、容易获得且对上述微生物不良影响小的NaOH水溶液进行。
已知在上述微生物的主培养开始时被调节至pH5～7、优选pH5.5～6.5的培养基的pH，通常在微生物的对数增殖期降低一次后，再逐渐恢复到原来的pH，在脂肪酸积累期变化小。培养基的pH控制，在上述微生物的主培养中进行，优选不在主培养开始前，而是在主培养开始后进行。因为认为pH控制的效果表现在脂肪酸积累期，所以在上述微生物的主培养开始后、适合在对数增殖期结束转移至脂肪酸积累期后、例如在主培养开始后24小时之后、优选在主培养开始后第3天之后、更优选在主培养开始后第4天之后进行上述pH的控制。特别是可在主培养开始后第3～5天之间、例如在主培养开始后第4天进行。此外，pH的控制可在控制开始后至培养结束时连续进行，考虑到在脂肪酸积累期的pH变化小及操作简便性，可优选在脂肪酸积累期进行1次。
[硫酸盐]
本发明提供上述制造方法，其为在培养上述微生物的同时，制造PUFA及含有其的脂质的方法，包括(c)在主培养培养基中添加金属离子的硫酸盐0.01～0.5w/w％的工序。在培养基中添加金属离子的硫酸盐，例如可参照下述实施例进行。
作为上述金属离子的硫酸盐，例如可单独或组合添加MgSO4、CaSO4、Na2SO4、K2SO4、FeSO4、MnSO4等，优选MgSO4及CaSO4。更优选代替培养基中的金属氯化物、例如MgCl2、CaCl2，添加相应的上述硫酸盐、例如MgSO4、CaSO4。在添加时可使用这些化合物的水合物。这些金属离子的硫酸盐是水合物时，用除去水分子的重量换算，在培养基中可添加合计为0.01～0.5w/w％、优选0.01～0.25w/w％、更优选0.05～0.2w/w％、特别优选0.06～0.1w/w％。
添加MgSO4及/或CaSO4时，可同时添加Na2SO4，但优选Na2SO4相对于培养基为0.1w/w％以下，更优选不添加Na2SO4。此外，作为金属离子的硫酸盐使用MgSO4及CaSO4时，例如相对于培养基，可以为0.05w/w％ MgSO4·7H2O+0.05w/w％CaSO4·2H2O、0.06w/w％ MgSO4·7H2O+0.06w/w％ CaSO4·2H2O等的添加量。
上述金属离子的硫酸盐可在主培养开始前添加到培养基中，也可在主培养过程中添加。与有机酸等不同，在对培养基灭菌时可与葡萄糖等碳源进行反应的可能性低，而且从操作简便性的观点来考虑，优选在主培养开始前的培养基中1次添加上述金属离子的硫酸盐。
上述工序(a)～(c)可分别进行，也可多数组合进行。例如使工序(a)及(b)组合进行时，通过工序(a)也可引起pH变化，并且从操作简便性的观点来看，优选所述工序在同日、更优选在同时进行。从更进一步的操作简便性的观点来看，使所述工序避开碳源、例如葡萄糖的添加时机，优选在与添加碳源不同的日子进行。
进而例如可使工序(a)及(c)、工序(b)及(c)、工序(a)、(b)及(c)组合进行，此时从操作简便性的观点来看，优选使工序(c)在主培养开始前进行，使工序(a)及/或(b)在主培养开始后、与碳源添加不同的日子进行。
从本发明的目的在于提供PUFA或含有其的脂质的含量高的微生物菌体的观点来看，特别优选使上述工序(a)、(b)及(c)全部组合进行。
通过上述培养，在微生物菌体内生产并积累含有PUFA的脂质。
在此，作为本发明的制造方法中使用的微生物菌体中含有的脂质，可例举甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂质、溶血磷脂质、糖脂质、游离脂肪酸，特别是上述微生物菌体生产甘油三酯作为主要的脂质。
作为构成上述脂质的脂肪酸可例举PUFA。作为PUFA，只要是上述微生物菌体内含有、生产·蓄积的脂肪酸，无特别限制，例如可例举二十碳二烯酸、二十碳三烯酸、二高-γ-亚麻酸(DGLA)、Mead酸、二十碳四烯酸、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸、二十二碳二烯酸、二十二碳三烯酸、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳二烯酸、二十四碳三烯酸、二十四碳四烯酸、二十四碳五烯酸、及二十四碳六烯酸等。在本发明的制造方法中，因为使用特别是具有ARA、DGLA生产能力的微生物，所以PUFA中特别优选ARA及DGLA，最优选DGLA。通过对作为上述微生物的一例的被孢霉属微生物的培养进行研究钻研，可生产的DGLA、Mead酸、ARA、二十碳五烯酸也是优选的PUFA(参照非专利文献1)。
本发明的课题之一是提供PUFA或含有其的脂质的含量高的微生物菌体，从这一观点来看，期望构成上述微生物菌体中含有的脂质的PUFA的含量高。该PUFA为DGLA时，在培养基中不添加DGLA的情况下培养上述微生物后，DGLA或DGLA残基以游离脂肪酸换算，例如用下述实施例记载的方法测定时每1g干燥菌体中大于164mg，例如为190mg以上、优选195mg以上、更优选200mg以上、进一步优选220mg以上。此外，在一种方式中，与以往的方法(不包括工序(a)～(c))相比较，根据本发明的方法得到的每1g干燥菌体中的DGLA增加，以游离脂肪酸换算，例如增加3％以上、优选5％以上、更优选10％以上。此外，在一种方式中，与以往的方法(不包括工序(a)～(c))相比较，根据本发明的方法得到的每1g干燥菌体中的ARA增加。
同样，期望构成上述微生物菌体中含有的脂质的PUFA在每单位培养基中的收量高。该PUFA为DGLA时，在培养基中不添加DGLA的情况下培养上述微生物后，每1ml培养基中的DGLA或DGLA残基的收量以游离脂肪酸换算，例如用下述实施例记载的方法测定时为5.5mg以上、优选6.5mg以上、更优选7.0mg以上、进一步优选7.5mg以上。此外，在一种方式中，与以往的方法(不包括工序(a)～(c))相比较，在本发明的制造方法中培养结束后的每1ml培养基中的 DGLA量增加，例如增加5％以上、优选10％以上、更优选15％以上。此外，在一种方式中，与以往的方法(不包括工序(a)～(c))相比较，在本发明的制造方法中培养结束后的每1ml培养基中的ARA量增加。
在一种方式中，优选用本发明的制造方法得到的PUFA或含有其的脂质中的上述总脂肪酸中的DGLA多，以游离脂肪酸换算，例如用下述实施例中记载的方法测定时，例如为35w/w％以上、优选37w/w％以上、特别优选40w/w％以上。
培养结束后，采用同领域技术人员所公知的方法例如日本特开2000-69987、或参照下述实施例中记载的方法，可从培养基中获得PUFA、含有PUFA的脂质、含有所述物质的微生物菌体。对于获得的PUFA、含有PUFA的脂质，已在上述例举。
根据需要对菌体杀菌后，优选进行干燥。用于获得微生物干燥菌体的干燥工序，可通过烤箱加热、冷冻干燥、热风干燥等进行。从培养结束后的培养基中获得的微生物菌体，期望每单位培养基中的干燥菌体的重量多，例如优选每1ml培养基中的干燥菌体重量约为34mg以上。
使用同领域技术人员所公知的方法，可以从干燥菌体或湿菌体中获得含有PUFA的脂质。例如用己烷等有机溶剂对干燥菌体提取处理后，通过在减压条件下从提取物中蒸馏除去有机溶剂，获得以甘油三酯为主的高浓度的含有PUFA的脂质。并且通过对得到的以甘油三酯为主的脂质进行脱胶、脱酸、脱色、脱臭等通常对食用油脂实施的精制处理，可获得高纯度的精制食用油脂(甘油三酯)。
脂质中的PUFA可直接分离，但通过形成低级醇酯例如甲酯，可容易地从其它脂质成分中分离出来。此外，可容易地仅将所需的PUFA从其它PUFA中分离出来。这种分离方法是同领域技术人员所公知的。
本发明的微生物菌体，可直接或使其干燥利用。此外，用本发明的制造方法获得的PUFA及含有其的脂质，也可用各种方法利用。可使用同领域技术人员所公知的方法，例如如下述实施例所记载，将上述物质配合到例如包括营养补助品、营养组合物、动物用饲料(特别是宠物食品)、鱼贝类养殖用饲料、奶粉等的饮食品中进行利用。关于PUFA、特别是ARA、DGLA的优选摄取量，例如可参照非专利文献1的记载。
这样，通过使用本发明涉及的微生物菌体，即使微生物菌体的配合量少，也可简便地获得PUFA、特别是DGLA含量高的上述饮食品，例如配合微生物干燥菌体0.5w/w％，可获得100g中含有DGLA约100mg以上的宠物食品。此外，从上述微生物菌体中提取、精制的甘油三酯，在总脂肪酸中占有的DGLA非常高，适合作为食用油脂。
对于上述微生物(干燥)菌体、PUFA或含有其的脂质、或配合了这些物质的饮食品，可将其具体用途(例如用于营养补助、成长促进、体质改善、供给特定的脂肪酸(例如DGLA、ARA)、脑功能改善等)及/或其具体使用方法(例如用量、次数、时间等)表示出来。
实施例
以下根据实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限于这些实施例。此外，在实施例中高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株产生含ARA脂质。高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株是本发明者从高山被孢霉(Mortierellaalpina)1S-4株中获得的突变株，是几乎完全丧失了使作为ARA的直接前体的DGLA转化为ARA的Δ5去饱和酶的活性的菌株。即：几乎不产生ARA，而产生含有显著量的DGLA的脂质(参照非专利文献1)。高山被孢霉(Mortierellaalpina)Iz3株与S14株同样几乎不产生ARA，而产生显著量的含有DGLA的脂质。
[实施例1试管培养中有机酸的添加效果]
在已装入试管内的10ml大豆粉液体培养基(3w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.3w/w％ K2HPO4、0.1w/w％ Na2SO4、0.05w/w％ MgCl2·6H2O、0.05w/w％ CaCl2·2H2O、pH6.3)中，接种约1白金耳的高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株，在28℃振荡培养3天。在培养开始第4天，将灭菌后的50w/w％葡萄糖溶液添加到0.6ml培养基中，同时添加用NaOH调节pH为6.0的5w/v％浓度的各种有机酸水溶液0.6ml，进一步继续培养(振荡培养)。有机酸相对于全体培养基的浓度相当于0.3w/v％。在此，作为有机酸，使用琥珀酸、富马酸、丙酮酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸及乙酸。此外，作为对照，除不添加有机酸水溶液之外，进行同样培养。
在接种第10天结束培养，用日本特开2000-69987号记载的方法进行干燥菌体的甲酯化，将获得的脂肪酸甲酯用气相色谱法分析。即：在培养结束后，通过过滤从培养液中获得培养菌体，将其充分洗涤后，用烤箱加热(100℃)进行干燥，获得干燥菌体。将获得的干燥菌体加入螺口试管(16.5mmφ)内，加入二氯甲烷1ml、无水甲醇-盐酸(10％)2ml，通过在50℃处理3小时，使菌体内的脂肪酸残基甲酯化，加入正己烷4ml、水1ml，提取2次，提取液的溶剂用离心蒸发器(40℃、1小时)蒸发除去获得脂肪酸甲酯。用毛细管气相色谱法分析获得的脂肪酸甲酯，求出DGLA的量。结果如表1所示。
表1
  有机酸  (0.3w/v％)   干燥菌体重量  (mg/ml培养基)   每单位重量干燥菌体中  DGLA量(mg/g干燥菌体)  每单位体积培养基中 DGLA量(mg/ml培养基)
  无   32.9   164   5.39
  琥珀酸   33.7   187   6.28
  富马酸   33.0   182   6.01
  丙酮酸   33.4   179   5.97
  乳酸   34.8   166   5.77
  柠檬酸   31.6   162   5.12
  酒石酸   28.9   139   4.03
  乙酸   12.1   81   0.98
添加琥珀酸、富马酸、丙酮酸或乳酸时，每单位培养基中的干燥菌体重量、每单位重量干燥菌体中的DGLA量、每单位体积培养基中的DGLA量均增加，但添加柠檬酸、酒石酸、乙酸时未观察到这样的效果。
[实施例2烧瓶培养中有机酸的添加效果]
在已装入烧瓶内的100ml的含有酵母浸膏的液体培养基(8w/w％葡萄糖、1.5w/w％酵母浸膏、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、pH6.3)中，接种约1白金耳高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株，在28℃振荡培养5天。在培养开始第6天，添加2ml的用NaOH调节pH为6.0的10w/v％乳酸水溶液，进一步继续培养(振荡培养)。乳酸相对于全体培养基的浓度相当于0.2w/v％。在接种第10天结束培养，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如表2所示。
表2
  有无添加乳酸   无乳酸   有乳酸
  干燥菌体重量(mg/ml培养基)   13.8   14.9
  每单位重量干燥菌体中的DGLA量(mg/g干燥菌体)   75.3   98.4
  每单位体积培养基中的DGLA量(mg/ml培养基)   1.04   1.47
  总脂肪酸中的DGLA的比例(％)   33.5   34.7
通过添加乳酸，每单位培养基中的干燥菌体重量、每单位重量干燥菌体中的DGLA量、每单位体积培养基中的DGLA量均增加。并且，获得的脂质中含有的总脂肪酸中的DGLA比例也增加。
[实施例3发酵罐培养中有机酸的添加效果]
将1白金耳高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株接种于种子培养基100ml(2w/w％葡萄糖、1w/w％酵母浸膏、pH6.3)中，在往复振荡100rpm、28℃的条件下进行3天预培养，制备种子培养液。接着在容积10L的通气搅拌培养槽中加入5L主培养基(2w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.1w/w％甘油、0.2w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、pH6.3)并进行灭菌，将上述种子培养液全部添加到其中。然后在26℃、通气量1vvm(空气、以下实施例中也相同)、搅拌转速300rpm的条件下，通气搅拌培养(主培养)7天。根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。考虑经过对数增殖期进入脂肪酸积累期的时间，在主培养开始第4天，添加用NaOH调节至pH6.3的有机酸水溶液(琥珀酸、富马酸、乳酸)，使其终浓度为0.3w/v％，然后进行通气搅拌培养。在主培养开始第7天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如表3所示。
表3
  有机酸(0.3W/V％)   无   琥珀酸   富马酸   乳酸
  干燥菌体重量(mg/ml培养基)   29.6   29.4   29.6   30.5
  每单位重量干燥菌体中的DGLA量(mg/g干燥菌体)   199   222   223   203
  每单位体积培养基中的DGLA量(mg/ml培养基)   5.88   6.54   6.58   6.21
  总脂肪酸中的DGLA的比例(％)   37.2   40.1   38.2   37.8
添加琥珀酸、富马酸、乳酸时，每单位重量干燥菌体中的DGLA量、每单位体积培养基中的DGLA量均增加。并且获得的脂质中含有的总脂肪酸中的DGLA 的比例也增加。特别是使用琥珀酸及富马酸时，增加更加显著。
[实施例4接种后的pH控制的影响1]
将约1白金耳高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株接种于种子培养基100ml(2％葡萄糖、1％酵母浸膏、pH6.3)中，在往复振荡100rpm、28℃的条件下进行3天预培养，制备种子培养液。接着，在容积10L的通气搅拌培养槽中加入5L主培养基(2w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.2w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、pH6.3)并进行灭菌，将上述种子培养液全部添加到其中。然后，在26℃、通气量1vvm、搅拌转速300rpm的条件下，进行通气搅拌培养13天(主培养)。根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。考虑经过对数增殖期进入脂肪酸积累期的时间，在主培养开始第5天到结束培养为止，使用经过灭菌的NaOH溶液或硫酸，调节pH为5.0、5.8、7.2。此外，未调节的对照组在主培养开始第5天的pH约为6.3。在主培养开始第13天，采用与实施例1同样的方法获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如图1A～1C所示。图中横轴表示培养第5天的pH值。
从第5天开始控制pH低(低于对照pH6.3的pH)时的微生物的DGLA生产能力低，但控制pH高(高于对照pH6.3的pH)时的微生物的DGLA生产能力提高。
[实施例5接种后的pH控制的影响2]
采用与实施例4同样的方法，培养高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株(预培养：3天、主培养：11天)。根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。考虑经过对数增殖期进入脂肪酸积累期的时间，从主培养开始第3天至培养结束，使用经过灭菌的NaOH溶液或硫酸，调节pH为6.6、6.9、7.2、7.5。在主培养开始第11天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如图2A～2C所示。图中横轴表示培养第3天的pH值。
从第3天开始控制pH，与控制pH为6.6、7.5时相比，控制pH为6.9或7.2时微生物的DGLA生产能力提高。此外，在主培养开始后第5天及第3天控制pH，发现DGLA生产能力均提高，所以认为可在主培养开始后的该前后的时期、在适合培养操作的时期进行pH控制。
[实施例6接种后的pH控制的影响3] 采用与实施例4同样的方法，培养高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株(预培养：3天、主培养：7天)。根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培养开始第4天，在pH为6.6的培养基中加入经过灭菌的NaOH溶液，调节pH为6.8。然后未进行特别的pH调节。在主培养开始第7天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出ARA的量。结果如表4所示。
表4
  pH调节   无   6.6→6.8
  干燥菌体重量(mg/ml培养基)   40.0   34.3
  每单位重量干燥菌体中的ARA量(mg/g干燥菌体)   140   206
  每单位体积培养基中的ARA量(mg/ml培养基)   5.30   7.07
  总脂肪酸中的ARA的比例(％)   31.1   37.9
从第4天开始调节pH，但与无调节时相比，微生物的ARA生产能力提高。
[实施例7有机酸的添加方法]
采用与实施例4同样的方法，培养高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株(预培养：3天、主培养：10天)。根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。仅在主培养开始第4天、或在第4天和第7天添加琥珀酸或乳酸的钠盐水溶液，使最终浓度为表5所示量的琥珀酸或乳酸。此外，表5的A～D中的任一种均是在第4天使用NaOH水溶液调节培养基的pH为约6.9。在主培养开始第10天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如表5所示。
表5
此外，在第4天或第7天添加琥珀酸或乳酸，使其浓度为0.22w/v％或0.44w/v％时，均具有增加每单位重量干燥菌体中的DGLA量、每单位体积培养基中的DGLA量等的效果。此外，将琥珀酸和乳酸组合添加也有效。
[实施例8琥珀酸の添加量]
将约1白金耳高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株接种于种子培养基100ml(2w/w％葡萄糖、1w/w％酵母浸膏、pH6.3)中，在往复振荡100rpm、28℃的条件下进行3天预培养，制备种子培养液。接着在容积10L的通气搅拌培养槽中加入5L主培养基(2w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.1w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、pH6.3)并进行灭菌，将上述种子培养液全部加入其中。然后在26℃、通气量1vvm、搅拌转速300rpm的条件下，通气搅拌培养11天(主培养)。根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培养开始第4天，添加琥珀酸钠盐水溶液使琥珀酸水溶液的最终浓度为0.44、0.87、1.3w/v％。此外，任一种均是在主培养开始第4天使用NaOH水溶液将培养基的pH调节至约为6.9。在主培养开始第11天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如表6所示。
表6
  琥珀酸添加量   0.44w/v％   0.87w/v％   1.3w/v％
  干燥菌体重量(mg/ml培养基)   37.3   37.6   37.2
  每单位重量干燥菌体中的DGLA量(mg/g干燥菌体)   225   228   211
  每单位体积培养基中的DGLA量(mg/ml培养基)   8.39   8.57   7.87
  总脂肪酸中的DGLA的比例(％)   40.0   40.4   39.2
以各种浓度添加琥珀酸时，发现添加0.87w/v％或1.3w/v％时可获得与添加0.44w/v％时几乎同等的生产能力。由此认为，在一定量以上，伴随有机酸的添加量的增加，DGLA量并不会增加，因此可选择一定量以上的任意的有机酸添加量。
[实施例9苹果酸的效果]
采用与实施例8同样的方法，培养高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株(预培养：3天、主培养：8天)。根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培养开始第4天，添加苹果酸钠盐水溶液使苹果酸水溶 液的最终浓度为0.71w/v％。此外，任一种均是在主培养开始第4天使用NaOH水溶液将培养基的pH调节至约为6.9。在主培养开始第8天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如表7所示。
表7
  苹果酸添加量   无   0.71w/v％
  干燥菌体重量(mg/ml培养基)   34.0   36.3
  每单位重量干燥菌体中的DGLA量(mg/g干燥菌体)   197   207
  每单位体积培养基中的DGLA量(mg/ml培养基)   6.71   7.53
  总脂肪酸中的DGLA的比例(％)   39.4   38.7
通过添加苹果酸，可获得DGLA含量高的菌体。
[实施例10其他菌株在生产DGLA时的琥珀酸的效果]
将约1白金耳高山被孢霉(Mortierella alpina)Iz3株，接种于种子培养基100ml(2w/w％葡萄糖、1w/w％酵母浸膏、pH6.3)中，在往复振荡100rpm、28℃的条件下进行3天预培养，制备种子培养液。Iz3株与S14株相同，是对ARA生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株进行亚硝基胍的常法诱变处理而获得的DGLA生产菌。接着，在容积10L的通气搅拌培养槽内加入5L主培养基(2w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.2w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、pH6.3)并进行灭菌，将上述种子培养液全部加入其中。然后在26℃、通气量1vvm、搅拌转速300rpm的条件下，通气搅拌培养9天(主培养)。根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培养开始第4天，添加琥珀酸钠盐水溶液以使琥珀酸水溶液的最终浓度为0.44w/v％。此外，任一种均是在主培养开始第4天使用NaOH水溶液将培养基的pH调节至约6.9。在主培养开始第9天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如表8所示。
表8
  琥珀酸添加量   无   0.44w/v％
  干燥菌体重量(mg/ml培养基)   31.8   34.7
  每单位重量干燥菌体中的DGLA量(mg/g干燥菌体)   160   186
  每单位体积培养基中的DGLA量(mg/ml培养基)   5.08   6.46
  总脂肪酸中的DGLA的比例(％)   34.1   36.6
由此可知，与S14株相同，通过添加琥珀酸，Iz3株的DGLA的生产能力也提高。
[比较例1使用10kL培养槽的DGLA培养法]
使用高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株，将约1白金耳的保存菌株接种到酵母浸膏1w/w％、葡萄糖2w/w％、pH6.3的培养基中，在往复振荡100rpm、温度28℃的条件下开始预培养(第一阶段)，培养3天。接着，在50L容积的培养槽内制备30L酵母浸膏1w/w％、葡萄糖2w/w％、大豆油0.1w/w％、pH6.3的培养基，在其中接种种子培养液(第一阶段)，开始预培养(第二阶段)，培养2天。接着，在主培养培养基(2w/w％葡萄糖、3.1w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、0.1w/w％大豆油、0.01w/w％ADEKA NATE、pH6.3)中接种种子培养液(第二阶段)，配成合计6000L的初始培养液量(培养槽容积10kL)。在温度26℃、内压200kPa下开始培养。在培养第1～5天流加葡萄糖，在不使培养基中的葡萄糖消耗用完的同时培养12天。未进行主培养中的pH控制时，发现pH在6.0～6.5之间推移，在对数增殖期降低一次后，再逐渐恢复到原来的pH，在脂肪酸积累期变化小的趋势。
培养结束后，在121℃、20分钟的条件下对培养液7.9kL进行杀菌后，利用附带空气压缩结构的卧式压滤机回收湿菌体，用100℃热风干燥，获得干燥菌体(水分含量：2％)。获得的干燥菌体量为47.2kg/kL培养基、每单位重量干燥菌体中的DGLA量为174g/kg干燥菌体、每单位体积培养基中的DGLA量为8.18kg/kL培养基、总脂肪酸中DGLA的比例为39.1％。此外，在干燥菌体中加入己烷，在室温下轻轻振荡的同时实施提取。将获得的己烷溶液用滤纸过滤除去含固体成分后，通过在减压下加热至约30～40℃来除去己烷，获得以DGLA为 构成脂肪酸而形成的甘油三酯。在甘油三酯中的总脂肪酸中DGLA所占比例为38.5％。
[实施例11使用10kL培养槽的DGLA培养]
采用与比较例1同样的方法，用合计6000L的初始主培养液量开始高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株的培养。在主培养第1～3、及第6天流加葡萄糖，在不使培养基中的葡萄糖消耗用完的同时培养12天。在主培养第4天添加1w/v％琥珀酸二钠六水合物水溶液(60kg、相当于琥珀酸0.44w/v％)和NaOH(1.26kg)，使pH为6.9。然后直至培养结束培养基的pH为6.9～7。
培养结束后，采用与比较例1同样的方法，获得干燥菌体及以DGLA为构成脂肪酸形成的甘油三酯。获得的干燥菌体重量为51.8kg/kL培养基、每单位重量干燥菌体中的DGLA量为240g/kg干燥菌体、每单位体积培养基中的DGLA量为12.43kg/kL培养基。此外，获得的甘油三酯中的总脂肪酸中DGLA所占比例为45.8％。
对于比较例1及实施例11中获得的干燥菌体及DGLA的量，结果如表9所示。
表9
    比较例1   实施例11
  干燥菌体重量(kg/kL培养基)   47.2   51.8
  每单位重量干燥菌体中的DGLA量(g/kg干燥菌体)   174   240
  每单位体积培养基中的DGLA量(kg/kL培养基)   8.18   12.43
  总脂肪酸中的DGLA的比例(％)   38.5   45.8
[实施例12发酵罐培养中硫酸盐的效果]
将约1白金耳高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株接种于种子培养基100ml(2w/w％葡萄糖、1w/w％酵母浸膏、pH6.3)中，在往复振荡100rpm、28℃的条件下进行3天预培养。接着，在容积10L的通气搅拌培养槽中加入5L主培养基并进行灭菌，将上述种子培养液全部接种于其中，在26℃、通气量1vvm、搅拌转速300rpm的条件下培养11天。主培养基的组成为以下3种：
(i)氯盐+硫酸钠(对照)：
2w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.2w/w％大豆油、 0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、pH6.3
(ii)硫酸盐+硫酸钠：
2w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.2w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgSO4·7H2O、0.05w/w％CaSO4·2H2O、pH6.3
(iii)硫酸盐-硫酸钠：
2w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.2w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.05w/w％MgSO4·7H2O、0.05w/w％CaSO4·2H2O、pH6.3
根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完。在主培养开始第4天，添加琥珀酸钠盐水溶液使琥珀酸水溶液的最终浓度为0.44w/v％。此外，任一种均是在主培养开始第4天使用NaOH水溶液调节培养基的pH为约6.9。在主培养开始第11天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。结果如表10所示。
表10
  培养基   (i)氯盐  (对照)   (ii)硫酸盐  +硫酸钠   (iii)硫酸盐  -硫酸钠
  干燥菌体重量(mg/ml培养基)   36.7   37.7   37.0
  每单位重量干燥菌体中的DGLA量(mg/g干燥菌体)   206   232   267
  每单位体积培养基中的DGLA量(mg/ml培养基)   7.6   8.7   9.9
  总脂肪酸中的DGLA的比例(％)   37.5   38.2   44.0
由此可见，使用“硫酸盐+硫酸钠”培养基时，每单位重量干燥菌体中的DGLA量、每单位体积培养基中的DGLA量均比对照增加。并且获得的脂质中含有的总脂肪酸中的DGLA的比例也增加。使用“硫酸盐-硫酸钠”培养基时，每一项均提高。
[实施例13发酵罐培养中硫酸盐的量]
除主培养基的组成为2w/w％葡萄糖、1.5w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.2w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.01w/w％MgSO4·7H2O、0.01w/w％CaSO4·2H2O、pH6.3之外，采用与实施例12同样的方法，培养高山被孢霉(Mortierellaalpina)S14株(预培养：3天、主培养：11天)。在主培养开始第11天，采用 与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出DGLA量。获得的干燥菌体重量为33.7mg/mL培养基、每单位重量干燥菌体中的DGLA量为209mg/g干燥菌体、每单位体积培养基中的DGLA量为7.03g/L培养基。
[实施例14硫酸盐对花生四烯酸生产的效果]
将约1白金耳高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株接种于种子培养基100ml(2w/w％葡萄糖、1w/w％酵母浸膏、pH6.3)中，在往复振荡100rpm、28℃的条件下进行3天预培养。接着，在容积50L的通气搅拌培养槽中加入25L主培养基并进行灭菌，将上述种子培养液全部接种于其中，在26℃、通气量1vvm、搅拌转速300rpm的条件下培养8天。主培养基的组成为以下2种：
(i)氯盐(对照)：
2w/w％葡萄糖、3.1w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.1w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、pH6.3。
(ii)硫酸盐：
2w/w％葡萄糖、3.1w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.1w/w％大豆油、0.3w/w％K2HPO4、0.06w/w％MgSO4·7H2O、0.06w/w％CaSO4·2H2O、pH6.3。
根据葡萄糖的消耗适当流加葡萄糖，以不使葡萄糖消耗用完，在主培养开始第4天，添加琥珀酸钠盐水溶液以使琥珀酸水溶液的最终浓度为0.44w/v％。此外，任一种均是在主培养开始第4天使用NaOH水溶液调节培养基pH为约6.9。在主培养开始第8天，采用与实施例1同样的方法，获得干燥菌体，求出ARA量。结果如表11所示。
表11
  培养基   (i)氯盐  (对照)  (ii)硫酸盐
  干燥菌体重量(mg/ml培养基)   36.5   39.3
  每单位重量干燥菌体中的ARA量(mg/g干燥菌体)   159   182
  每单位体积培养基中的ARA量(mg/ml培养基)   5.80   7.17
  总脂肪酸中的ARA的比例(％)   47.0   45.8
[比较例2使用氯盐在10kL培养槽中的DGLA培养法]
除了使用2w/w％葡萄糖、4w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.3w/w％K2HPO4、0.1w/w％Na2SO4、0.05w/w％MgCl2·6H2O、0.05w/w％CaCl2·2H2O、0.1w/w％大豆油、 0.01w/w％ADEKA NATE、pH6.3作为主培养培养基之外，采用与比较例1同样的方法，用合计6000L的初始培养液量开始高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株的培养。在培养第1、2、3、6天流加葡萄糖，在不使培养基中的葡萄糖消耗用完的同时培养10天。在主培养第4天添加1w/v％琥珀酸二钠六水合物水溶液(60kg、相当于琥珀酸0.44w/v％)和NaOH(1.26kg)，使pH为6.9。
在培养结束后，采用与比较例1同样的方法，获得干燥菌体及以DGLA为构成脂肪酸而形成的甘油三酯。获得的干燥菌体重量为57.3kg/kL培养基、每单位重量干燥菌体中的DGLA量为168g/kg干燥菌体、每单位体积培养基中的DGLA量为9.31kg/kL培养基。并且获得的甘油三酯中的总脂肪酸中DGLA所占比例为41.8％。
[实施例15使用硫酸盐在10kL培养槽中的DGLA培养法]
除了使用2w/w％葡萄糖、4w/w％大豆粉、0.02w/w％甘油、0.3w/w％K2HPO4、0.06w/w％MgSO4·7H2O、0.06w/w％CaSO4·2H2O、0.1w/w％大豆油、0.01w/w％ADEKANATE、pH6.3作为主培养培养基之外，采用与比较例2同样的方法，培养高山被孢霉(Mortierella alpina)S14株。
10天的主培养结束后，采用与比较例1同样的方法，获得干燥菌体及以DGLA为构成脂肪酸而形成的甘油三酯。获得的干燥菌体重量为60.5kg/kL培养基、每单位重量干燥菌体中的DGLA量为193g/kg干燥菌体、每单位体积培养基中的DGLA量为11.70kg/kL培养基。并且获得的甘油三酯中的总脂肪酸中DGLA所占比例为42.3％。
对于比较例2及实施例15中获得的干燥菌体及DGLA的量，结果如表12所示。
表12
    比较例2   实施例15
  干燥菌体重量(kg/kL培养基)   57.3   60.5
  每单位重量干燥菌体中的DGLA量(g/kg干燥菌体))   168   193
  每单位体积培养基中的DGLA量(kg/kL培养基)   9.31   11.70
  总脂肪酸中的DGLA的比例(％)   41.8   42.3
[实施例16-1宠物食品1]
利用磨粉机将实施例11中获得的干燥菌体制成粉末，在由肉末、鸡肉浸膏、玉米、大米、大豆、植物油脂、维生素混合物组成的原料中，添加制成粉末的干燥菌体0.5％重量，制作宠物食品。获得的宠物食品100g中含有DGLA约120mg，适合使用。
[实施例16-2宠物食品2]
使用实施例15中获得的干燥菌体，采用与实施例16-1同样的方法，制作宠物食品。获得的宠物食品100g中含有DGLA约97mg，适合使用。
[实施例17幼鱼养殖用的微小生物饵料]
使用实施例16-1中得到的制成粉末的干燥菌体，培养用作幼鱼养殖时的饵料的轮虫、及卤虫。培养方法为：在300ml水槽内加入海水200ml，在通气条件下，在23℃下放养轮虫每1ml 100个、卤虫每1ml 20个，分别供给干燥菌体使其生长发育，1天1g/106个轮虫、1天1g/105个卤虫。轮虫、卤虫均摄取干燥菌体并生长发育，成为含有DGLA的饵料。均适合作为养殖用饵料。
[实施例18-1食用精制甘油三酯的制造1]
对于实施例11中获得的干燥菌体，实施己烷提取、脱胶、脱酸、脱色、脱臭等提取精制处理，制造食用精制甘油三酯。在总脂肪酸中DGLA所占的比例为45.4％。此外，未检出己烷、重金属类，适合作为食用油脂。
[实施例18-2食用精制甘油三酯的制造2]
使用实施例15中获得的干燥菌体，采用与实施例18-1同样的方法，制造食用精制甘油三酯。在总脂肪酸中DGLA所占的比例为42.0％。此外，未检出己烷、重金属类，适合作为食用油脂。
[实施例19配合从干燥菌体中提取的油脂的胶囊的制备]
将明胶(新田明胶株式会社制)和食品添加用甘油(花王株式会社制)以重量比100∶35混合并加入水，在50～60℃的温度范围溶解，制备粘度2000cp的明胶被膜。接着将实施例18-1或18-2中获得的食用精制甘油三酯和维生素E油(卫材(Eisai)株式会社制)以重量比100∶0.05混合，制备内容物。使用上述物质，根据常法进行胶囊成型及干燥，制造每1粒含有180mg内容物的软胶囊。该软胶囊均适合口服摄取。
[实施例20配合从干燥菌体中提取的油脂的饮料的制备]
将实施例18-1中获得的食用精制甘油三酯和大豆卵磷脂(Tsuji制油株式会社)以重量比9∶1混合，在水中均匀分散获得微脂粒分散液。通过在橙汁、汽水、咖啡饮料、牛奶、豆奶、或浓汤饮料中分别添加1/100容量的该微脂粒分散液，制备(制造)作为本发明涉及的食品的上述各饮料。这些饮料均适合口服摄取。

Claims (6)

1.多不饱和脂肪酸或含有其的脂质的制造方法，其为在培养具有花生四烯酸及/或二高-γ-亚麻酸生产能力的被孢霉属微生物的同时，制造多不饱和脂肪酸及含有其的脂质的方法，该方法包括：
(a)在主培养开始后，在培养基中添加选自琥珀酸、富马酸、丙酮酸、苹果酸、所述酸的盐及其水合物中的1种以上的有机酸0.01～5w/v％的工序；以及
(c)在主培养培养基中添加选自MgSO4、CaSO4、K2SO4、FeSO4、及MnSO4中的1种以上的金属离子的硫酸盐0.01～0.5w/w％的工序。
2.如权利要求1所述的制造方法，其中还包括(b)在主培养开始后，控制培养基的pH使其在培养有效范围内提高的工序。
3.如权利要求2所述的制造方法，其中工序(a)及工序(b)在与向培养基中添加碳源不同的时间进行。
4.如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中工序(c)在主培养开始前进行。
5.如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，在所述多不饱和脂肪酸或含有其的脂质中所述总脂肪酸中的二高-γ-亚麻酸为35％以上。
6.制造每1g干燥菌体中的二高-γ-亚麻酸为220mg以上的高山被孢霉的干燥菌体的方法，其中包括在液体培养基中进行通气搅拌培养高山被孢霉菌体，接着进行干燥，还包括以下(a)～(c)工序中的1个以上工序：
(a)在主培养开始后的第3天之后，在培养基中添加选自琥珀酸、富马酸、丙酮酸、苹果酸、所述酸的盐及其水合物中的1种以上的有机酸0.2～5w/v％的工序；
(b)在主培养开始后的第3天之后，控制培养基的pH使其在pH6.6～7.5的范围内提高的工序；及
(c)在主培养的培养基中，添加0.01～0.25w/w％的选自MgSO4、CaSO4、K2SO4、FeSO4、及MnSO4等中的1种以上的工序。
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