DE3688245T2

DE3688245T2 - Herstellung von Riboflavin mit Hefe.

Info

Publication number: DE3688245T2
Application number: DE86309249T
Authority: DE
Inventors: Annette Boyts; Linda Burdzinski; Donald L Heefner; Michael Yarus
Original assignee: Zeagen Inc
Current assignee: Archer Daniels Midland Co
Priority date: 1985-12-20
Filing date: 1986-11-27
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2006-11-28
Also published as: JPH0464673B2; CN86108637A; EP0231605B1; JP2622253B2; CA1305679C; JPH0216968A; CN1033172C; JPS62228297A; EP0231605A2; EP0231605A3; DE3688245D1; ATE87978T1; ES2054619T3

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung und Isolierung flavinogener Stämme von Candida flareri zur Produktion von Riboflavin.
Während des Verfahrensverlauf dieser Anmeldung wurde die taxonomische Bezeichnung dieses Organismus in C. famata geändert, jedoch wurde hier die frühere Terminologie beibehalten.
Riboflavin, üblicherweise als Vitamin B&sub2; bekannt, ein Enzymcofaktor wird in gewissem Ausmaß in nahezu allen natürlich vorkommenden Lebensmitteln gefunden. Es wird weitverbreitet in Pharmazeutika, Lebensmittelanreicherungen und Lebensmittelzusätzen verwendet.
Riboflavin wurde gewerblich durch Fermentation hergestellt. Der Großteil des gewerblich hergestellten Riboflavins wird als Rohkonzentrat zur Anreicherung von Tierfutter verbraucht. Riboflavin findet auch bei menschlichen Bedarf Verwendung. Die Erfindung betrifft die Entwicklung von Candida flareri-Stämmen zur wirksamen und wirtschaftlichen Produktion von Riboflavin.
Candida-Hefearten sind als flavinogene Organismen begehrt, da sie auf einem einfachen, gut bekannten Medium schnell wachsen. P.R. Burkholder, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., (1943) 29 : 166.
Candida flareri wurde viele Jahre auf seine flavinogenen Fähigkeiten hin untersucht. Siehe z. B. Enari und Kauppinen, Acta Chem. Scand., (1961) 15 : 1513. Insbesonders wurde die Hemmwirkung von Eisen und Spurenelementen auf die Riboflavinproduktion untersucht. Tanner et al., Science, (1945) 101 : 180. Bisher wurde nachgewiesen, daß die Riboflavinproduktion von Candida flareri hochvariabel ist. Frühe Versuchsanlagen zur Fermentation unter Verwendung einfacher, nichtsterilisierter Kulturmedien ergaben Riboflavinausbeuten von 325 mg/l. Levine, H., et al., Industrial and Engineering Chemistry, (1949) 41 : 1665.
Die Produktion bedeutender Riboflavinmengen gewisser Candida-Hefearten war bekannt. Z.B. wurde eine Modifikation unter Verwendung von Candida intermedia var A, ein neu isolierter Mikroorganismus, der Lactose und Ethanol assimiliert, in dem japanischen Patent Nr. 73/19,958 offenbart und Ausbeuten von 49,2 mg Riboflavin pro Liter wurden berichtet. Candida T-3 produziert auch Riboflavin aus Methanol, wie in dem japanischen Patent Nr. 76/19,187 offenbart wurde. Siehe auch Offenbarung von Candida robusta zur Riboflavinproduktion in EPA 0 137 226.
Gemäß der Erfindung wird erhöhte Riboflavinproduktion durch Verwendung eines mutierten Candida-Stammes erreicht. Ausgehend von einem riboflavinproduzierenden Candida-Stamm wird der Stamm einem Schema von chemischer und/oder physikalischer Mutagenese und der Protoplastenfusion mutierter Stämme unterworfen, um einen Stamm mit wirksamer Riboflavinproduktion und verringerter Empfindlichkeit gegenüber Eisen und Inhibitoren der Purin- und Riboflavinbiosynthese herzustellen. Es wurde auch eine Mutante dgr isoliert, die erhöhte flavinogene Aktivität zeigte.
Es werden Verfahren und Organismen zur erhöhten Riboflavinproduktion zur Verfügung gestellt. Es wird ein riboflavinproduzierender Candida-Stamm ausgewählt, einem Mutageneseschema unterworfen, die mutierten Stämme werden auf verschiedene, mit der Flavinogenese verbundene Eigenschaften gescreent, gewünschte Mutanten fusioniert, die folgende Fusionstochtergeneration gescreent und weiterer Mutagenese unterworfen, um Stämme zur Verfügung zu stellen, die Riboflavin hochwirksam in beständigen und reproduzierbaren Mengen produzieren mit verringerter Resistenz gegenüber der Repression des B&sub2;-Syntheseweges durch Resistenz gegenüber Glucosekatabolitrepression, Resistenz gegenüber Hemmung des Purinsyntheseweges durch Adenosinmonophosphat und den Adenin-Antimetaboliten 4-Aminopyrazolo(3,4-d)pyrimidin (APP).
Es werden Mutanten ausgewählt, in denen die Riboflavinsynthese nicht mehr so empfindlich oder unempfindlich gegenüber der Flavinadenindinucleotidund/oder Adenosinmonophosphatregulierung ist, wobei Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase verringerte Empfindlichkeit gegenüber der Regulierung durch Adenin und Adenosin besitzt und wobei die Mutante im wesentlichen unempfindlich gegenüber APP ist. Durch Unempfindlichkeit oder Deregulierung wird beabsichtigt, daß die Produktionsmengen der Mutante in einem Nährmedium bei Konzentrationen nicht beeinträchtigt werden, die die Produktionsmengen um mindestens 50% verringern würden. Zusätzlich ist die Mutante gegenüber Katabolitrepression im wesentlichen resistent, wie bewiesen wird durch Fehlen einer Reaktion auf Desoxyglucose in Mengen, die die Atmung im Candida flareri-Wildtyp reprimieren.
Das Verfahren beinhaltet ein Mutagenese- und Fusionsschema, wobei nach jedem Schritt die Steigerung der Riboflavinproduktion gescreent wird, die mit besonderen Eigenschaften bezüglich des Purin- und Riboflavinmetabolismus verbunden ist. Es ist wünschenswert, daß die Mutanten hohe Riboflavinausbeuten in Gegenwart einer Aminosäurequelle im Nährmedium zur Verfügung stellen.
Die Mutagenese wird ausgeführt, indem man entweder physikalische oder chemische Mutagene mit den in einem flavinogenesestimulierenden Medium gezüchteten Organismen verwendet. Zusätze, die die Flavinogenese unterstützen beinhalten Glycin in Mengen von ungefähr 0,1 bis 0,3%, vorzugsweise ungefähr 0,2 bis 0,25%. Zusätzlich sind Spurenmengen an Kobalt- und Zinkionen wünschenswert. Die Kobaltkonzentration liegt im allgemeinen im Bereich von ungefähr 0,5 bis 2 ug/ml, vorzugsweise ungefähr 1 ug/ml, während die Zinkkonzentration im allgemeinen ungefähr 5 bis 25 ug/ml, gewöhnlich ungefähr 5 bis 15 ug/ml beträgt. Gegebenenfalls kann Fe³&spplus; in Konzentrationen von ungefähr 0,1 bis 0,3 g/ml vorhanden sein. Zusätzlich wird eine Kohlenstoffquelle verwendet, wobei die meisten Zucker zufriedenstellend sind, z. B. Glucose, Saccharose, Fructose, Galactose, etc. Bei Verwendung von Saccharose liegt die Konzentration im allgemeinen im Bereich von ungefähr 1 bis 8%, vorzugsweise ungefähr 6%. Vergleichbare Konzentrationen der anderen Zucker können verwendet werden.
In verschiedenen Schritten des Mutagenese- und Fusionsschemas werden die Mutanten entweder in definiertem Medium (flavinogenesestimulierend und ohne Aminosäuren außer Glycin) oder komplexem Medium (reiches Nährmedium mit Aminosäuren) gescreent, wobei das Medium eine oder mehrere organische Verbindungen enthalten kann, die ein oder mehrere Enzyme des Purinbiosyntheseweges hemmen. Besonders interessant ist die Resistenz gegenüber AMP und APP. Zusätzlich können intermediäre Mutanten aufgrund der Deregulierung des Purinbiosyntheseweges, insbesonders in der ersten Hälfte des Syntheseweges, am besten in den ersten drei oder vier Schritten ausgewählt werden.
Die entstehende Mutante besitzt mindestens um 20% erhöhte Riboflavinproduktion gegenüber dem unmittelbar vorhergehenden Elternstamm und die endgültige Mutante besitzt eine um mindestens ungefähr fünffach, vorzugsweise mindestens ungefähr zehnfach erhöhte Riboflavinproduktion gegenüber dem Ausgangselternstamm und besitzt eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber Eisen.
Die Mutagenese kann entweder mit physikalischen oder chemischen Mitteln ausgeführt werden wie Bestrahlung mit ultraviolettem Licht oder Röntgenstrahlen oder durch chemische Mutagene wie Nitrosoverbindungen, z. B. Nitrosoguanidin, alkylierende Verbindungen, z. B. Ethylmethansulfonat, Senfverbindungen, Hydrazin, salpetrige Säure o. dgl. Das Verfahren der Mutagenese im besonderen ist nicht kritisch und es können herkömmliche Verfahren verwendet werden. Die Mutagenesebedingungen ergeben im allgemeinen eine Verringerung der Lebensfähigkeit.
Die entstehenden Mutantenstämme können dann gescreent werden auf Resistenz gegenüber APP oder Desoxyglucose, Verlust der Regulierung des Purinsyntheseweges oder Verlust der B&sub2;-Synthesehemmung durch Eisen, AMP und/oder ein komplexes Medium (einschließlich einzelner Aminosäuren oder in Form von Peptiden).
Zur Fusion werden Protoplasten verwendet, deren Zellwand entfernt wurde. Es wurde festgestellt, daß eine Mischung aus Zymolase, insbesonders aus Arthrobacter luteus und β-Glucuronidase, insbesonders aus Helix pomatia wirksam ist. Es ist erwünscht, daß die mutierten Stämme als Auxotrophe ausgewählt werden, wobei jedem verwendeten Stamm ein oder mehrere Stoffwechselwege zur Produktion einer oder mehrerer Aminosäuren fehlen. Die gebildeten Heterokaryonten können dann als prototroph ausgewählt werden und auf erhöhte Riboflavinproduktion gescreent werden.
Nach jedem Schritt der Mutagenese oder Fusion wird eine um mindestens 20%, vorzugsweise um mindestens ungefähr 50% erhöhte Riboflavinproduktion gegenüber der Ausgangselterngeneration beobachtet. Die Anzahl der Schritte zur Stammodifizierung, einschließlich Kombinationen aus Mutagenese und Fusion ist mindestens drei und vorzugsweise nicht mehr als zehn, vorzugsweise nicht mehr als ungefähr acht.
Die Mutagenese kann in jedem Medium ausgeführt werden, z. B. einem flavinogenesestimulierenden Medium und die entstehenden, lebensfähigen Mutanten werden in einem flavinogenesestimulierenden Medium gescreent. Gemäß der Erfindung werden Mutanten durch Verwendung unterschiedlicher Mutagene gewonnen. Ein Stamm wird aus jeder Mutagenese ausgewählt, einer aufgrund der erhöhten Riboflavinproduktion in Gegenwart von Adenosinmonophosphat und der andere Stamm wird ausgewählt aufgrund der erhöhten Riboflavinproduktion und des Fehlens der Regulierung in einem frühen Schritt des Purinbiosyntheseweges.
Die Aminosäureauxotrophie jedes Stammes wird dann gekennzeichnet durch Bestimmung der Kolonien, die auf einem Medium ohne eine bestimmte Aminosäure nicht wachsen und auf einem Medium mit der bestimmten Aminosäure wachsen. Gemäß der Erfindung waren Histidin und Methionin die Aminosäuren, nach denen ausgewählt wurde. Auxotrophe der beiden Stämme werden mit Saccharidasen, insbesonders einer Mischung aus Zymolase und β-Glucuronidase behandelt, um Protoplasten herzustellen, die in Gegenwart eines nichtionischen Detergens fusioniert werden, gefolgt von Überführung in ein Nährmedium ohne jede Aminosäurequelle. Die entstehenden Prototrophen werden auf Riboflavinproduktion untersucht und es wurden diejenigen mit erhöhter Riboflavinproduktion ausgewählt.
Die fusionierten Zellen wurden dann einem weiteren Mutageneseschema unterworfen, in diesem Fall chemischer Mutagenese und es wurden Stämme mit erhöhter Riboflavinproduktion ausgewählt.
Zwei Stämme von besonderem Interesse wurden isoliert, bezeichnet mit GA18Y8-6#2 dgr, ATCC-Zugangsnummer 20756 und GA18Y8-6#2#11, ATCC-Zugangsnummer 20755. In definiertem Medium produzieren diese Stämme unter Verwendung von 5 ml einer exponentiell wachsenden Kultur zum Animpfen von 50 ml des definierten Mediums mehr als ungefähr 5 g Riboflavin pro Liter in 6 Tagen, gewöhnlich mehr als ungefähr 7 g pro Liter in 6 Tagen. (Das Medium ist 4B + 0,2% Glycin + Co + Zn + Fe + 10% YMG (2% Glucose, Hefeextrakt, Pepton und Malzextrakt.) Alle 24 h wurden der Kultur 2 ml 10·4B + Glycin + Co + Zn zugeführt.)

VERSUCHE

Mutagenese

Durch Mutagenese unter Verwendung entweder von Methyl- N'-nitrosoguanidin (NTG) oder von ultraviolettem Licht wurden Mutanten gewonnen. Der Ausgangselternstamm von C. flareri wurde durch Verwendung von NTG mutiert. Die Mutante GR3 wurde unter Anwendung dieses Verfahren auf die erste Kultur des Ausgangselternstammes von C. flareri NRRL Y245 gewonnen. 20 ml einer Übernachtkultur des Elternstammes wurden gewaschen und in 20 ml 4B-Medium ("definiertes Medium") unter Zugabe von 0,2% Glycin suspendiert. (Burkholder, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1943) 29 : 166). (4B-Medium plus Glycin wird hergestellt durch Lösen von 0,5 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,2 g MgSO&sub4; 7 H&sub2;O, 1,84 g Harnstoff, 60 g Saccharose, 1 ug D-Biotin, 20 ug H&sub3;BO&sub4;, 20 ug MnSO&sub4;, 140 ug ZnSO&sub4;, 20 ug CuSO&sub4;, 20 ug Na&sub2;MoO&sub4; und 2,3 g Glycin in 1 l Wasser. Wenn Kobalt und Zink angegeben sind, werden 1 ug CoCl&sub2; und 10 mg ZnCl&sub2; zugegeben). NTG (10 mg/ml) in DMSO wurde dem Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 100 ug/ml zugegeben. Die Kultur wurde bei 30ºC 1 Stunde lang gerührt, bevor sie geerntet und gewaschen wurde.
Diese Behandlung ergab eine logarithmische Abnahme von lebensfähigen Zellen.
Mutagenese wurde auch durch Verwendung von ultravioletter Strahlung induziert. Die Mutante A22 wurde unter Anwendung dieses Verfahrens gewonnen. Eine zweite Übernachtkultur des Elternstammes, gezüchtet in 4B-Medium (s. Levine, H., et al., Industrial and Chemical Engineering, (1949) 41:1666) mit 0,2% Glycin wurde gewaschen und im gleichen Volumen (35 ml) des gleichen Mediums in einer Kunststoff-Petrischale suspendiert. Das Medium wurde dann gerührt und ultravioletter Strahlung von 200 bis 290 nm ausgesetzt. Diese Strahlungsmenge verringerte die Zahl der lebensfähigen Zellen auf 10% der Ausgangskultur. Die Zellen wurden dann auf definiertem Medium ausgestrichen, das 25 mM 5'-AMP enthielt. Mutagenese, Ausstrich und Inkubation wurden im Dunkeln ausgeführt. Es wurde festgestellt, daß Mutante A22 Riboflavin in Gegenwart von 5'-AMP produziert, einem Inhibitor der Flavinogenese.

Screenprotokoll für den GR3-Stamm

Die vorstehend beschriebene, mit NTG mutierte Kultur wurde zweimal in 20 ml Salinelösung gewaschen und im gleichen Volumen YMG-Medium (komplexes Medium) suspendiert. Die Komponenten des YMG-Mediums sind pro Liter: 3 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt, 5 g Pepton und 100 ml einer Kohlenstoffquelle, z. B. Glucose, (2%) unmittelbar vor Verwendung. Die Kultur wurde dann unter Schütteln bei 30ºC 48 Stunden lang inkubiert. Dann wurden die Zellen geerntet, dreimal in 20 ml Salinelösung gewaschen und in 4B-Medium ohne Harnstoff oder Glycin resuspendiert. Nach Stickstoffmangel über Nacht wurden die Zellen geerntet und in Hefe-Stickstoff-Basismedium ohne Aminosäuren und mit 2% Glucose suspendiert. Die Kultur wurde dann 6 Stunden lang inkubiert.
Es wurde eine frische Nystatin-Lösung hergestellt durch Lösen von 1 mg Nystatin in 1 ml Ethanol, gefolgt von Verdünnung auf 10 ml mit destilliertem Wasser. Die Nystatin-Lösung wurde dann mit einer Endkonzentration von 20 ug/ml zur Abtötung vegetativer Zellen zugegeben.
Nach erfolgter Nystatinbehandlung wurden die lebensfähigen Zellen auf 103w4 bis 10&supmin;&sup5; in Saline verdünnt und 0,1 ml-Proben wurden auf YMG-Platten (20 g Agar/l YMG- Medium) ausgestrichen. Nach 2 Tagen Inkubation wurden die Kolonien auf den YMG-Platten auf das definierte Medium durch Abdruck übergeführt.
Kolonien, die auf dem komplexen Medium, aber nicht auf dem definierten Medium wuchsen, wurden dann auf dem definierten Medium ausgestrichen, das 30 ug/ml Adenin enthielt. Es wurde eine Kolonie entdeckt, die auf Minimalmedium als weiße Kolonie und auf dem Minimalmedium mit Adenin als rosarote Kolonie wuchs. Es wurde festgestellt, daß dieses Isolat, GR3 genannt, in Gegenwart von 20 bis 50 ug/ml Adenin rote Kolonien und in Gegenwart von 0 oder 100 ug/ml Adenin weiße Kolonien produziert. Die rote Farbe der Kolonien wurde der Ansammlung von p-Ribosylaminoimidazolcarboxylat (CAIR) und/oder p-Ribosylaminoimidazol (AIR) zugeschrieben. Es wurde gefolgert, daß in der GR3-Mutante die Regulierung des ersten Schrittes des Purinsyntheseweges gestört war. In dieser GR3-Mutante ist offensichtlich die Regulierung des ersten Schrittes gestört, da sich selbst bei Gegenwart von 20 bis 50 ug/ml Adenin Purinintermediate ansammelten, obwohl die Mutante nicht purinauxotroph ist.

Fusionen

Der GA18-Stamm wurde durch Protoplastenfusion der Mutantenstämme A22 und GR3 gewonnen. Nach erfolgter, vorstehend beschriebener Nystatinbehandlung wurde jeder in Saline verdünnte Stamm (10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup5;) auf Komplexmedium ausgestrichen. Nach 2 Tagen Inkubation wurden die Zellen auf 4B-Medium durch Abdruck übergeführt. Kolonien, die nicht auf 4B wuchsen, wurden dann auf 4B ausgestrichen, das entweder mit Histidin oder mit Methionin in einer Konzentration von 30 ug/ml ergänzt worden war. Zellen, die auf dem definierten Medium nicht wuchsen, aber auf dem mit einer der Aminosäuren ergänzten Medium wuchsen, wurden als Auxotrophe betrachtet. Auf diese Weise wurde eine Histidin-Auxotrophe von A22 (A22 His-) und eine Methionin-Auxotrophe von GR3 (GR3 Met-) gewonnen.
Zur Ausführung der Fusionen wurden 48 h-Kulturen von A22 His- und GR3 Met- auf 4B-Medium plus Glycin gezüchtet, geerntet, einmal in 20 ml destilliertem Wasser gewaschen und in 20 ml einer Lösung aus 1 M Sorbitol, 25 mM EDTA und 50 mM Dithiothreitol suspendiert. Die Suspensionen wurden 20 Minuten lang bei 30ºC unter gelegentlichem, leichtem Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden dann geerntet, einmal in 20 ml 2 M Sorbitol gewaschen und jede Auxotrophe wurde in 20 ml einer Lösung aus 1,5 M Sorbitol, 0,1 M Natriumcitrat (pH 5,8) und 0,01 M EDTA suspendiert. Zu jeder Suspension wurden dann 0,2 ml β-Glucuronidase (Typ H-2 aus Helix pomatia, 100000 Einheiten/ml, Sigma) und 20 mg Zymolase 100T (Miles Laboratory) zugegeben. Die Suspensionen wurden 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit nahmen die normalerweise länglichen Zellen eine runde, kugelförmige Form an, was den Verdau der Zellwand anzeigte.
Nach der Enzymbehandlung wurden die Protoplasten jeder Auxotrophen durch Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit (5000·g) geerntet, zweimal in 10 ml 2 M Sorbitol gewaschen, einmal in 10 ml aus 1,5 M Sorbitol, 10 mM CaCI&sub2; und 10 mM Tris HCI (pH 7,5) gewaschen und dann in 0,5 ml der gleichen Lösung suspendiert. Zur Fusion der Protoplasten wurden 0,1 ml-Proben jeder Auxotrophen vermischt und 0,1 ml einer Lösung aus 20% PEG (Sigma, ungefähres Molekulargewicht: 6000), 10 mM CaCI&sub2; und 10 mM Tris HCI (pH 7,4) zugegeben.
Die Mischung wurde unter gelegentlichem Schütteln 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden dann zentrifugiert, einmal gewaschen in 10 ml Hefe-Stickstoff-Basismedium ohne Aminosäuren, mit 2% Glucose und 1,5 M Sorbitol und in 0,5 ml der gleichen Lösung suspendiert. Proben von ungefähr 0,1 ml wurden dann zu 7 ml des gleichen Mediums zugegeben, das 2,0% Agar (bei ungefähr 55ºC) enthielt und damit wurde das gleiche Medium überschichtet. Die meisten der nach diesem Verfahren verwendeten Lösungen können gefunden werden in: Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1981, S. 115. In Abwesenheit von Aminosäuren wächst keine Auxotrophe (da eine sehr geringe Revertierungshäufigkeit besteht). Kolonien, die sich nach 6 bis 9 Stunden Inkubation bei 30ºC gebildet hatten, enthielten Prototrophe als Ergebnis genetischen Austausches. Prototrophe, die sich aus dem Fusionsverfahren ergaben, traten mit einer Häufigkeit von ungefähr 1 in 10³ Überlebenden der Polyethylenglykolbehandlung auf. Die Kolonien wurden bei geringer Vergrößerung untersucht und Kolonien mit Riboflavinkristallen wurden wiederausgestrichen und auf Riboflavinproduktion in dem definierten Medium untersucht. Eine Kolonie wurde mit GA18 bezeichnet.

Zweite Mutation und Screenausbeuten GA18Y8-6#2

Der Stamm GA18Y8-6#2 wurde durch Mutagenese einer 48 h-Kultur der Elterngeneration von GA18 mit dem vorstehend beschriebenen NTG-Verfahren gewonnen. Nach erfolgter Mutagenese wurden die Zellen gewaschen, auf 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup5; verdünnt und 0,1 ml wurden auf YMG ausgestrichen. GA18 bildete auf dem YMG-Medium keine gelben Kolonien, d. h. Kolonien mit einem hohen Riboflavingehalt. Dies wurde der Repression der Flavinogenese durch Eisen oder einen organischen Bestandteil im Medium zugeschrieben. Nach einer Woche Inkubation wurden ein paar gelbe Kolonien bemerkt, aufgenommen und mehrmalig auf YMG wiederausgestrichen, um den Stamm zu reinigen. Der gereinigte Stamm wurde als GA18Y8-6#2 bezeichnet.

Die mutierten Stämme

Die Stämme, die zur Zeit am wirksamsten Riboflavin produzieren wurden als Candida flareri GA18Y8-6#2 dgr mit der ATCC-Zugangsnummer 20756 und Candida flareri GA18Y8- 6#2#11 mit der ATCC-Zugangsnummer 20755 identifiziert. Diese Stämme wurden gemäß des vorstehend beschriebenen, experimentellen Verfahrens abgeleitet.
GA18Y8-6#2 dgr erzeugt 7,0 bis 7,5 Gramm Riboflavin pro Liter in 6 Tagen unter Verwendung von 5 ml einer exponentiell wachsenden Kultur zum Animpfen von 50 ml des vorstehend beschriebenen, definierten Mediums, das mit 0,2 ug FeCI&sub3; und 10% YMG ergänzt wurde. Dieser Stamm wurde durch NTG-Mutagenese des Elternstammes GA18Y8-6#2 gewonnen. Desoxyglucose ist ein Glucoseanalogon und hemmt bei Verwendung von Saccharose als Kohlenstoffquelle das Zellwachstum stark. Es wurden gelbe, gegen Desoxyglucose resistente Kolonien aufgenommen, durch Wiederausstreichen auf 4B plus Glycin und Desoxyglucose gereinigt und auf Flavinogenese überprüft. Die mutierten Zellen wurden auf 4B-Medium plus Glycin ausgestrichen, das 750 ug/ml 2-Desoxyglucose enthielt. Candida flareri GA18Y8-6#2 dgr wurde aus den gereinigten Kolonien ausgewählt.
GA18Y8-6#2#11 erzeugt auch 7,0 bis 7,5 Gramm Riboflavin pro Liter in 6 Tagen bei den gleichen, vorstehend für GA18Y8-6#2 dgr beschriebenen Bedingungen. Dieser Stamm wurde auch durch NTG-Mutagenese des Elternstammes GA18Y8-6#2 gewonnen. Nach erfolgter Mutagenese wurden 20 ml der mutierten Kultur zweimal in 20 ml destilliertem Wasser gewaschen und dann in 20 ml aus YMG + FeCI&sub3; (2 ug/ml) + AMP (40 mM) + Aminopyrazolopyrimidin, APP (500 ug/ml) suspendiert. Durch dieses Medium ergab sich die Auswahl von APP-resistenten Kolonien. Diese Kultur wurde über Nacht unter zeitweiligem Schütteln bei 30ºC inkubiert. Dann wurden die Zellen geerntet, zweimal in 20 ml destilliertem Wasser gewaschen und auf YMG + FeCI&sub3; (2 4g/ml) + APP (1 mg/ml) + AMP (40 mM) ausgestrichen und 1 Woche lang bei 30ºC inkubiert. Nach dieser Zeit wurden die Platten untersucht, die gelb-orangen Kolonien wurden aufgenommen und auf Flavinogenese untersucht. GA18Y8-6#2#11 wurde aus den gereinigten Kolonien gewonnen.
Mit den vorstehenden Stämmen wurden hohe Riboflavinausbeuten in 50 ml eines Anzuchtsmedium in einer mit Staukörpern versehenen 500 ml-Anzuchtsflasche gewonnen. Das Anzuchtsmedium bestand aus 10% YMG + 90% 4B + Glycin + Co + Zn + FeCI&sub3; (0,2 ug/ml). Optimale Riboflavinproduktion mit GA18-Derivaten erhält man in Gegenwart von 0,2 ug/ml FeCI&sub3;. Im C. flareri-Wildtyp reprimieren 0,2 ug/ml FeCI&sub3; die Riboflavinsynthese. Den Kulturen wurden alle 24 Stunden 2 ml einer 10·4B-Lösung + Glycin zugeführt.
Weitere Erhöhung der Riboflavinproduktion und Eisenunempfindlichkeit kann durch Wiederholung der vorstehend beschriebenen Mutagenese-, Auswahl- und Fusionsverfahren erreicht werden.
Gemäß der Erfindung können Candida-Stämme mit unergiebiger Riboflavinproduktion mutiert werden, so daß sie große Mengen Riboflavin unter wirksamer Ausnutzung von Nährstoffen beständig produzieren und verbesserte Resistenz gegenüber Eisenhemmung der Flavinogenese zeigen.
Hiermit wurde die Erfindung vollständig beschrieben ohne den Umfang der Erfindung zu beschränken.

Claims

1. Verfahren zur Erzeugung von Riboflavin, welches umfaßt:

das Züchten eines mutierten Candida flareri-Stamms in einem Flavinogenese stimulierenden Medium, wodurch Riboflavin in erhöhten Mengen erzeugt wird,

worin der genannte mutierte C.flareri-Stamm ein Ergebnis eines Mutageneseschemas durch physikalische oder chemische Mittel und Protoplastfusion ist, worin nach jeder Mutagenese oder Fusion Stämme in einem Flavinogenese stimulierenden Medium auf Resistenz gegen einen Inhibitor des Purinbiosynthesewegs oder Deregulierung des Purinbiosynthesewegs gescreent werden, und worin die genannten Stämme und Mutanten davon in sechs Tagen zumindest etwa 5 g Riboflavin pro Liter Fermentationsmedium erzeugen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die genannte Resistenz eine gegen Adenosinmonophosphat und/oder APP ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das genannte Flavinogenese stimulierende Medium stimulierende Mengen Glycin, Kobalt und Zink einschließt.

4. Verfahren zur wirksamen Erzeugung von Riboflavin, welches umfaßt:

das Züchten eines mutierten Candida flareri-Stammes in einem Flavinogenese stimulierenden Medium, wodurch Riboflavin mit zumindest 5-facher Steigerung gegenüber dem ursprünglichen Elternstamm erzeugt wird;

worin der genannte mutierte C.flareri-Stamm ein Ergebnis des getrennten Mutierens des genannten Elternstamms mit zwei verschiedenen Mutagenen ist, um mutierte Stämme zu erzeugen;

erstes Screenen in einem Flavinogenese stimulierenden Medium für verstärkte Riboflavinproduktion und eine Veränderung der Regulierung des Purinbiosynthesewegs oder Reaktion auf Inhibitoren des Purinbiosynthesewegs, um erste und zweite abgeleitete Stämme zu schaffen, die aus verschiedenen mutagenen Mitteln resultieren;

Herstellen von Protoplasten aus den ersten und zweiten abgeleiteten Stämmen und Fusion der genannten Protoplasten, um Fusionsstämme zu schaffen;

zweites Screenen der genannten Fusionsstämme in einem Flavinogenese stimulierenden Medium, für zumindest verstärkte Riboflavinproduktion, um einen dritten abgeleiteten Stamm zu schaffen;

Mutieren des dritten abgeleiteten Stamms, um zweite Mutagene zu schaffen;

drittes Screenen der genannten zweiten Mutagene in einem Flavinogenese stimulierenden Medium für zumindest verstärkte Riboflavinproduktion, um einen vierten abgeleiteten Stamm zu schaffen; und

Wiederholen des genannten Mutierens und Screenens wie erforderlich, um einen Stamm zu erhalten, der zumindest eine 5-fache Steigerung der Riboflavinproduktion aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die genannten Screeningvorgänge das zumindest einmalige Auswählen für: Resistenz gegen Adenosinmonophosphat; Resistenz gegen 4-Aminopyrazol(3,4-d)pyrimidin; und Resistenz gegen Eisen einschließen.

6. Verfahren zur Erzeugung von Riboflavin, welches umfaßt:

das Züchten eines mutierten Candida flareri-Stamms in einem Flavinogenese stimulierenden Medium, wobei der genannte Stamm fähig ist, in sechs Tagen zumindest etwa 5 g Riboflavin pro Liter Fermentationsmedium zu erzeugen, worin der genannte Stamm gegen die Hemmung von B&sub2;-Synthese durch Adenosinmonophosphat resistent ist, gegen die Hemmung von Wachstum durch 4-Aminopyrazol-(3,4-d)pyrimidin resistent ist und gegen Katabolitrepression in der Gegenwart von Desoxyglukose resistent ist, wenn Saccharose die Kohlenstoffquelle ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der genannte Stamm gegen die Hemmung von B&sub2;-Synthese durch Eisen- oder Komplexmedium resistent ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin der genannte Stamm in sechs Tagen zumindest etwa 5 g Riboflavin pro Liter erzeugt.

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin der genannte Stamm GA18Y8-6#2 dgr, ATCC-Zugangsnummer 20756, oder GA18Y8-6#2#11, ATCC-Zugangsnummer 20755, oder davon abgeleitete Stämme ist.