KR101290937B1 - 스핑고신을 생산하는 미생물 균주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 외인성 파이토스핑고신을 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 미생물을 동정하는 방법을 제공한다. 상기 미생물은 탈수효소 활성을 보유한다. 상기 방법은 일련의 후보 미생물을 제공하는 단계, 적정량의 파이토스핑고신의 존재 하에 상기 일련의 후보 미생물을 항온처리하는 단계, 각각의 항온처리된 미생물로부터 얻은 스핑고이드 염기의 조성을 분석하는 단계, 및 파이토스핑고신의 적어도 일부를 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 미생물을 동정하는 단계를 포함한다. 상기 미생물은 스핑고신의 제조에 사용될 수 있다.
스핑고신, 파이토스핑고신

Description

스핑고신을 생산하는 미생물 균주{MICROBIAL STRAINS PRODUCING SPHINGOSINE}
도 1. 탈수효소에 의한 파이토스핑고신(I)의 스핑고신(II)으로의 전환.
도 2. 탈수효소 양성 유기체의 개요.
도 3. 아세트산 무수물(AA)을 사용한 스핑고이드 염기 분석.
도 4. 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca)에 의한 탈수효소 활성(Nakhimovskaya 1948, VKM B-1524). 파이토스핑고신으로부터 생산된 스핑고신의 TFAA계 HPLC 분석. A. 직접적 샘플 분석; B. 스핑고신의 형성을 확인하기 위하여 샘플에 스파이킹된 스핑고신.
본 발명은 스핑고이드 염기 스핑고신(sphingoid base sphingosine)을 생산할 수 있는 미생물 균주에 관한 것이다.
용어 "스핑고지질(sphingolipid)"은 스핑고신 염기 유사 스핑고신에서 유래하는 지질 군을 말한다. 스핑고지질은 주로 동물, 식물 및 미생물의 세포막에 존재한다.
세라마이드는, 지방산과의 아미드 결합으로 염기(스핑고이드 염기)로서 스핑고신, 파이토스핑고신 또는 디히드로스핑고신(스핑가닌(sphinganine))을 포함하는 스핑고지질의 특정 군이다. 세라마이드는 피부의 상부층인 각질층의 주요 지질 성분이다. 세라마이드와 같은 스핑고지질을 포함하는 조성물의 국소 적용은 피부의 배리어 기능 및 보습성을 개선시킨다(Curratolo, 1987, Pharm. Res. 4, 271-277; Kerscher et al., 1991, Eur. J. Dermatol. 1, 39-43). 또한, 그와 같은 스핑고이드 염기는 단백질 키나제 C의 활성을 억제하는 것과 같은 몇몇 생리학적 효과를 매개하는 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 소염 활성 및 항균 활성을 위해 화장용 또는 피부과용 조성물에 포함된다.
스핑고신은 인간에게 있어서 스핑고지질의 주요한 스핑고이드 염기 성분이기 때문에, 식품, 약학적 적용 및 화장용 적용을 위해 스핑고신 및 스핑고신 포함 스핑고지질을 제조하는 것에 상당한 상업적 관심이 있다.
현재, 스핑고신 (및 스핑가닌)의 몇몇 화학적 합성 경로가 개발되어 있다. 그러나, 그들 분자에는 2개 입체 중심이 존재하기 때문에, 화학적 합성은, 천연적으로 발생하는 입체화학적 배열을 오직 25%만 나타내는 라세미체 혼합물을 생성시킨다. 더욱이, 이들 분자 내에는 3개의 작용기가 존재하기 때문에, 광범위한 보호 화학이 적용되어야 한다. 결과적으로, 화학적 합성을 통해 제조되는 스핑고신 및 스핑가닌은 지나치게 고가이고, 따라서 식품 및 화장료에 혼입될 수가 없다. 이는, 뇌 또는 달걀과 같은 천연 공급원으로부터 단리된 순수한 스핑고신 및 스핑가닌에서도 그러하다. 동물 공급원에서 추출한 불균질성(heterogeneous) 스핑고지질 제제도 또한 이용가능하다. 이는 순수 화합물보다 저렴하지만, 조성적 불균질성의 문제가 있고, 이는 병원체를 포함할 수가 있기 때문에 잠재적으로 안전하지가 못하다.
효모 피치아 시페리(Pichia ciferrii)와 같은 미생물(Wickerham and Stodola, 1960, J. Bacteriol. 80, 484-491)이 스핑고이드 염기 및 이의 유도체를 생산하는 것으로 밝혀졌으나, 주로 C18-파이토스핑고신 및 이의 아세틸화된 유도체를 생산한다. 이를 추출하여, 다른 스핑고이드 염기 및/또는 세라마이드로 화학적 전환함으로써, 순수한 미용 성분들을 얻을 수 있다(예를 들어, WO 93/20038 참조).
그러나, 스핑고신 및 스핑가닌의 자연 발생 입체 이성질체를 순수 화합물로서 생산할 수 있는 경제적인 방법은 유효하지 않으나 매우 요망된다.
놀랍게도, 본 발명은 파이토스핑고신을 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 미생물의 동정 방법을 제시한다. 이러한 전환을 수행할 수 있는 능력은 적합한 효소 활성, 예컨대 탈수효소(dehydratase)(도 1 참조)의 활성을 갖는 미생물의 존재에 기인한다. 이러한 탈수효소의 동정은 간단한 일이 아닌데, 그 이유는 이러한 효소는 종종 정반응과 역반응 둘 다를 촉진시키고 수중(또는 산성 조건)에서는 일반적으로 수화가 촉진되기 때문이다; 그러므로 효소 반응의 평형은 알코올(파이토스핑고신) 쪽으로 치우치게 된다. 알켄(스핑고신)이, 예를 들면 페닐 또는 다른 접합기에 의해 매우 안정화되거나 효소의 반응속도가 한 방향의 반응을 촉진하는 경우에만, 평행이 한쪽 방향으로 극도로 치우치는 경향이 적을 수 있다. 화학적으로, 물의 제거 반응은 H3PO4 또는 AL2O3 상의 기상 가열, 진한 H2SO4와 같은 극한 조건 하에서만 일어난다.
놀랍게도, 본 발명은 파이토스핑고신을 탈수시킬 수 있는 미생물 균주 및 및 효소를 제공한다.
제1 측면에서, 본 발명은 외인성 파이토스핑고신을 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 능력에 대해 일련의 후보 미생물을 스크리닝하는 방법 및 파이토스핑고신의 적어도 일부를 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 미생물을 동정하는 방법을 제공한다.
바람직하게는 이 방법은
일련의 후보 미생물을 제공하는 단계,
상기 일련의 후보 미생물을 적정량의 파이토스핑고신 존재 하에 항온처리하는 단계,
각각의 항온처리된 미생물로부터 얻어진 스핑고이드 염기의 조성을 분석하는 단계, 및
파이토스핑고신의 적어도 일부를 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 미생물을 동정하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 방법에 이용되는 미생물은 임의의 미생물, 즉, 박테리아, 효모 또 는 진균류일 수 있다. 진핵 미생물 또는 방선균류 박테리아를 상기 스크리닝에 사용하는 것이 바람직하다. 후보 미생물은, 원하는 세포 밀도에 도달할 때까지 배양하고 그 후 당업자에게 공지된 방법에 따라 각 미생물에 대해 세포를 회수한다.
관련된 미생물 효소(들)가 세포 내에 축척된다면, 관련된 미생물 효소들이 외인적으로 첨가된 소수성 기질 파이토스핑고신과 접촉할 수 있도록 파이토스핑고신과 함께 항온처리하기 전에 미생물 세포들을 투과화시키는 것이 바람직하다. 투과화(permeabilisation)는 세포벽/세포막 투과성을 유도하는 어떠한 적절한 처리에 의해서도 수행될 수 있다. 예를 들면, 적절한 양의 미생물 세포를 격렬한 교반 하에서 톨루엔과 같은 물과 혼화되지 않는 유기 용매로 처리할 수 있다. 전형적으로 처리는 중성 부근의 pH, 예를 들면 6∼8의 pH와, 미생물을 배양하는 데 이용되는 온도와 유사한 온도에서 수행될 수 있다. 투과화는 또한 세포막에 구멍을 도입할 수 있는 물질을 사용함으로써 수행될 수 있다. 그러한 물질의 예는 니스타틴(nystatin)이다(Averet N, Fitton V, Bunoust O, Rigoulet M, Guein B. 1998. Yeast mitochondrial metabolism: from in vitro to in situ quantitative study. Mol Cell Biochem 184: 67-79). 투과화는 또한 어떠한 특정 화학물질도 첨가하지 않고 격렬한 볼텍스(vortexing)에 의해 수행될 수 있다. 투과화 처리는 세포의 투과성이 충분한 수준에 이를 때까지 이루어진다. 세포 용해를 초래하는 과도한 세포 투과화가 일어나지 않도록 주의해야 한다. 투과성 정도는 적절한 세포내 지시 효소(indicator enzyme), 예를 들어 이소시트레이트 탈수효소(isocitrate dehydrogenase)의 활성을 측정하거나, 적절한 염료, 예를 들면 형광염료가 세포로 들어갈 수 있는지 여부를 조사함으로써 측정될 수 있다.
그 후, 투과화된 세포를 적절한 양의 파이토스핑고신과 함께 항온처리하는데, 이에 의해 파이토스핑고신이 바람직하게는 수용액 중에서 가용화된다. 수용액 중에서 파이토스핑고신을 가용화하기 위해, 적절한 양의 알코올, 예를 들면 에탄올 및/또는 계면활성제, 예를 들면 트윈-80(Tween-80)이 파이토스핑고신 용액 중에 포함된다. 에탄올과 트윈-80은 20% 이하의 농도로 사용될 수 있다. 항온처리는 10∼40℃에서, 전형적으로는 미생물의 배양 온도와 유사한 온도에서 수행될 수 있다. 항온처리는 10분∼24시간, 전형적으로는 2시간 동안 중성 부근의 pH에서 이루어질 수 있다. 항온처리 혼합물 중의 파이토스핑고신 농도는 0.1∼100 mM, 바람직하게는 1∼20 mM일 수 있다. 항온처리 후, 얻어진 반응 생성물을 건조시키는데, 동결건조에 의하는 것이 바람직하고, 경우에 따라, 액체 반응 생성물의 -70℃에서의 보존이 선행될 수 있다.
외인성 첨가 파이토스핑고신의 적어도 일부를 스핑고신으로 전환할 수 있는 미생물을 동정하기 위해, 파이토스핑고신과 (투과화된) 세포의 항온처리의 반응 생성물에 대해 스핑고이드 염기 조성을 분석한다. 이를 위해, 반응 생성물에 존재하는 미생물 세포 잔류물로부터 스핑고이드 염기를 추출하고, 이 스핑고이드 염기를 유도체화되도록 처리한다.
스핑고이드 염기의 추출에 앞서, 반응 생성물을 분쇄 또는 밀링할 수 있는데, 그 이유는 스핑고이드 염기 및 유도체화에 이용되는 샘플은 바람직하게는 미세 분할 고체로 이루어져야 하기 때문이다.
스핑고이드 염기의 추출은 반응 생성물을 적절한 유기 용매, 예컨대 클로로포름, 메탄올 및/또는 에탄올과 격렬히 혼합함으로써 행한다. 존재하는 임의의 결정은, 예컨대 초음파 처리로 제거할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 유도체화는 추출된 스핑고이드 염기의 분리를 먼저 수행함이 없이, 반응 혼합물 중에 존재하는 대로의 스핑고이드 염기에 대해 이루어진다. 보다 바람직하게는, 유도체화 시약은 추출하는 동안에 이미 존재한다.
유도체화는 스핑고이드 염기를, 적절한 용매 중에서, 예컨대 아세트산 무수물, 트리플루오로아세트산 무수물 또는 o-프탈알데히드로 처리함으로써 수행할 수 있다. 이 처리는 35℃에서 30분간 이루어질 수 있다. 기질(matrix)(예컨대, 미생물) 및 구체적 조건에 따라, 처리의 최적화가 필요할 수 있다. 이것에 의해 1∼240분 범위의 항온처리 시간 및 20∼50℃ 범위의 온도가 될 수 있다.
추출된 스핑고이드 염기의 스핑고신 함량은 예컨대 HPLC 또는 NMR 분석으로 결정한다. 추출된 스핑고이드 염기는 미생물 세포에 자연적으로 존재하는 스핑고이드 염기는 물론, 경우에 따라서는 외인성 첨가 파이토스핑고신으로부터 생성된 스핑고신도 포함한다.
본 발명에 따르면, 10 mM 농도로 파이토스핑고신을 이용할 경우, 추출된 스핑고이드 염기의 스핑고신 함량이 5% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 20%(w/w) 이상이 되도록 외인성 첨가 파이토스핑고신의 적어도 일부를 스핑고신으로 전환할 수 있는 미생물이 동정된다. 동정된 미생물의 예는 다음 속(종)의 미생물들이다: 슈도모나스 아우란티아카[Pseudomonas (aurantiaca)], 그리폴라 프론도사[Grifola (frondosa)], 스트렙토마이세스(Streptomyces), 이노노터스 드라이오필러스[Inonotus (dryophilus)], 헤리시움 코랄로이데스[Hericium (coralloides)], 파이토프토라 캅시시[Phytophthora (capsici)], 트리셀룰라 아우란티아카[Tricellula (aurantiaca)], 피티움 아드하에렌스[Pythium (adhaerens)].
도 2에는, 동정된 미생물의 개요가 제공된다.
제2 측면에서, 본 발명은, 제1 측면의 방법에 의해 얻을 수 있는 미생물을 배양하고, 파이토스핑고신의 존재 하에 미생물을 항온처리하여 파이토스핑고신의 적어도 일부를 스핑고신으로 전환시키며, 그리고 스핑고신을 회수함으로써, 스핑고신을 제조하는 방법을 제공한다.
파이토스핑고신의 존재 하에서의 미생물의 항온처리는, 파이토스핑고신을 스핑고신으로 전환할 수 있는 미생물의 동정과 관련하여 언급된 것과 유사한 조건을 사용하여, 편리하게 수행될 수 있다.
바람직하게는, 사용되는 파이토스핑고신은 피치아 시페리(Pichia ciferrii)로부터 얻을 수 있다.
파이토스핑고신과 미생물의 항온처리 후에 얻어지는 스핑고신은, 전체 브로쓰(broth)로부터, 또는 더욱 바람직하게는 스핑고지질 회수에 있어서 당업계에 공지된 방법에 따른 아실화 후에, 직접 회수할 수 있다. 상기 아실화는 스핑고신의 모노아실화 형태에서 트리아실화 형태에 이를 수 있다. 바람직하게는, 상기 아실화는 아세틸화이다.
파이토스핑고신을 스핑고신으로 전환시키는 미생물의 변이체, 예를 들어, 더 높은 농도의 파이토스핑고신을 견딜 수 있고/있거나 고속으로 전환을 수행할 수 있는 변이체를 단리하기 위해 전통적인 돌연변이 유발 방법을 이용할 수 있다.
제3 측면에서, 본 발명은, 파이토스핑고신을 스핑고신으로 전환시키는 효소 활성을 단리하기 위한 제1 측면의 방법에 의해 얻을 수 있는 미생물의 용도를 제공한다. 상기 효소 활성은 바람직하게는 탈수효소 활성이다. 또한, 본 발명은, 특정 효소(탈수효소) 활성을 코딩하는 유전자를 단리하고, 상기 유전자(들)로 적절한 파이토스핑고신 생산 미생물, 바람직하게는 피치아 시페리로 형질전환시키며, 그리고 스핑고신을 생산하는 형질전환된 미생물을 단리함으로써, 스핑고신을 생산하는 미생물을 얻기 위한, 제1 측면의 방법에 의해 얻을 수 있는 미생물의 용도를 제공한다.
실시예 1
아세트산 무수물을 이용한 유도체화를 통한 스핑고이드 염기 분석
유도체화 시약으로서 아세트산 무수물 600 ㎕를 4-(디메틸아미노)피리딘 40 ㎎ 및 트리에틸아민 200 ㎕와 혼합하였다. 클로로포름을 10 ㎖까지 첨가하고, 이 용액을 자기 교반기에서 혼합하였다. 파이토스핑고신 또는 스핑고신 2 ㎎을 유도체화 시약 250 ㎕와 혼합하고, 결정이 용해될 때까지 초음파 처리하였다. 용액을 35℃의 수조에 30분 동안 정치시킨 후, 아세토니트릴을 5 ㎖까지 첨가하며, 볼텍스로 혼합하였다. 하기 조건을 이용하여, HPLC에 의해 10 ㎕를 분석하였다.
HPLC 조건
이동상 아세토니트릴 1000 ㎖ 중 트리플루오로아세트산 0.5 ㎖
칼럼 GL 사이언스사 제품, Inertsil ODS 80-A, 4.6 x 250 mm
유량 1 ㎖/200분
UV 검출기 파장 200 nm
아세트산 무수물 유도체의 분석에 UV 검출기를 사용하였다. 파이토스핑고신(PS) 및 스핑고신(So)은 각각 7.5분 및 7.1분의 체류 시간에서 분리되었다(도 3 참고). 검출 한계는 20 μM PS에서 측정되었다.
실시예 2
트리플루오로아세트산 무수물을 이용한 유도체화를 통한 스핑고이드 염기의 분석
유도체화 시약으로서 600 ㎕의 트리플루오로아세트산 무수물을 40 mg의 4-(디메틸아미노)피리딘 및 200 ㎕의 트리에틸아민과 혼합하였다. 클로로포름을 10 ml까지 첨가하고, 이 용액을 자기 교반기에서 혼합하였다. 2 mg의 파이토스핑고신 또는 스핑고신을 250 ㎕의 유도체화 시약과 혼합하여, 결정이 용해될 때까지 초음파 처리하였다. 용액을 35℃의 수조에 30분간 정치한 후, 아세토니트릴을 5 ml까지 첨가하고 볼텍스로 혼합하였다. 10 ㎕를 실시예 1의 조건을 이용한 HPLC로 분석하였다.
아세트산 무수물 유도체의 분석에 UV 검출기를 사용하였다. PS 및 So는 각각 10.1분과 8.9분의 체류 시간에서 잘 분리되었다. 검출 한계는 10 μM PS에서 측정되었다.
실시예 3
o-프탈알데히드를 이용한 유도체화를 통한 스핑고이드 염기의 분석
유도체화 시약으로서 50 mg의 OPA(o-프탈알데히드)를 1 ml의 에탄올 및 50 ㎕의 2-머캅토에탄올에 용해시켰다. 이어서, 99 ml의 3% 붕산 수용액(pH 10.5, KOH로 조절)을 첨가하였다. 2 mg의 파이토스핑고신 또는 스핑고신을 2.5 ml의 MeOH과 혼합하여, 결정이 용해될 때까지 초음파 처리하였다. 그 후, 2.5 ml의 OPA 유도체화 시약을 첨가하고, 혼합한 후 샘플을 실온에서 15분간 항온처리하였다. HPLC로 분석하기 전에, 샘플을 원심분리를 통해 맑게 하였다. HPLC 조건은 하기와 같았다.
HPLC 조건
이동상 0.5 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 중 90%(v/v) 메탄올
칼럼 Radial Pak C18 칼럼 Waters (8 x 100 mm)
유량 2 ml/min
형광 검출기
여기 파장 340 nm
방출 파장 455 nm
검출을 위해 주사 형광 검출기(scanning fluorescence detector)를 사용하였다. PS 및 So의 OPA 유도체는 5.1분 및 8.0분의 체류 시간에서 잘 분리되었다. 검출 한계는 2 μM PS에서 측정되었다.
실시예 4
스핑고신을 생산할 수 있는 유기체를 찾기 위해, 소수성이 매우 큰 화합물인 스핑고이드 염기 기질을 적당한 환경에서 필요한 효소와 접촉시킬 필요가 있다. 따라서, 상이한 종(표 1 참조)의 세포를 중간 대수기(mid-exponetial phase)까지 증식시키고, 세척한 후, 전체 항온처리 시간 동안 약하게 진탕하면서(10 rpm∼100 rpm) 0.5% 톨루엔과 함께 30분 동안 항온처리하였다. 세포를 다시 세척하고, 당업자에게 일반적으로 알려진 방법에 따라 내부 효소 분석을 수행함으로써 투과성을 테스트하였다. 적합한 효소는 이소시트레이트 탈수효소이다. 투과화된 세포의 일부는 필요한 기질 및 보조인자와 함께 적당한 온도에서 항온처리하고, 그 후 보조인자/생성물 형성을 분석한다.
실시예 5
세포 기질로부터의 소핑고이드 염기 회수율을 평가하기 위해서, 투과화된 세포를 파이토스핑고신 300 μM과 함께 2시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 샘플을 스핀 다운하여 과량의 파이토스핑고신을 제거하였다. 이어서, 세포를 50 mM TRIS-HCl(pH 7.4) 중에 재현탁시키고, 냉동시키고, 밤새 동결건조시켰다. 동결건조 후, 순수 메탄올을 첨가하여 스핑고이드 염기를 추출하고, 주기적으로 30분 동안 볼텍싱하였다. 원심분리 후 얻은 상청액을 o-프탈알데히드법(표 3 참조)에 따라 유도체화하였는데, 평균 회수율은 높은 재현율로 71% 이상이었다(표 1 참조).
파이토스핑고신 회수율로부터 얻어지는 결과
미생물 파이토스핑고신 회수율(%)
아시네토박터 칼코아세티쿠스
(Acinetobacter calcoaceticus)		 82 4
에스케리키아 콜라이
(Escherichia coli)		 75 8
마이코박테리움 네오아우럼
(Mycobacterium neoaurum)		 90 1
오크로박트룸 안트로피
(Ochrobactrum anthropi)		 71 1
슈도모나스 푸티다
(Pseudomonas putida)		 82 4
로도코쿠스 에리트로폴리스
(Rhodococcus erythropolis)		 87 7
사카로마이세스 세레비시아
(Sacchromyces cerevisiae)		 75 1
실시예 6
파이토스핑고신과 생물학적 샘플의 항온처리를 위한 프로토콜
1. 50 ㎖ 진탕 플라스크 중 10 ㎖ 배지에서 유기체를 예비 배양한다.
박테리아에 대해서는 약 24시간∼36시간; 진균류에 대해서는 약 72시간∼96시간.
2. 미리 배양한 배양물 200 ㎕를 100 ㎖ 진탕 플라스크 중 20 ㎖ 새로운 배지로 옮겨서 100배 희석시키고(진균류의 경우, 이들이 펠릿으로 증식하거나 천천히 증식한다면, 옮기는 양을 조절할 수 있음), 대수기까지 증식시킨다(흡광도를 측정하는 경우, OD600nm 약 4∼5까지 증식시킴).
박테리아에 대해서는 약 6시간∼8시간; 진균류에 대해서는 약 24시간∼72시간(진균류의 증식 속도에 따라 달라짐).
3. 원심분리에 의해 세포를 수거한다.
4. 12 ㎖ 테스트 튜브(유리 또는 플라스틱) 중 Tris/HCl(50 mM; pH 7.4) 2.5 ㎖에 펠릿을 재현탁시킨다.
5. Tris/HCl(50 mM; pH 7.4)에서 1% 톨루엔 2.5 ㎖를 첨가한다.
1% 톨루엔은 완충액에 용해되지 않는다; 따라서, 혼합물을 격렬히 교반해야 한다.
6. 단계 1 및 단계 2에서 이용된 배양 온도와 동일한 온도에서, 1,200 rpm의 자기 교반기 상에서 10분 동안 항온처리한다.
7. 원심분리에 의해 세포를 수거한다.
8. 펠릿을 10 ㎖ Tris/HCl(50 mM; pH 7.4)에 재현탁시킨다.
9. 원심분리에 의해 세포를 수거한다.
10. 펠릿을 2 ㎖ Tris/HCl(50 mM; pH 7.4)에 재현탁시킨다.
투과화된 세포는 즉시 사용하거나, 또는 -70℃에 보존할 수 있다.
11. 투과화된 세포 1 ㎖에 파이토스핑고신 저장 용액(stock solution) 71 ㎕를 첨가한다.
파이토스핑고신 저장 용액 :
파이토스핑고신(유리 염기) 440 mg
milliQ(= 탈이온수) 중 20%(v/v) Tween-80 8 ㎖
96% 에탄올 2 ㎖
파이토스핑고신이 용해될 때까지, HCl로 pH를 조정한다(pH ∼5.8).
저장 용액의 최종 농도는 140 mM이다.
12. 2시간 동안 진탕(100 rpm)하면서 항온처리하고, 단계 1 및 단계 2에서의 배양을 위해 이용된 온도와 동일한 온도를 가한다.
13. 동결건조하기에 충분한 샘플을 얻을 때까지 샘플을 -70℃에서 저장한다.
샘플은 12 ㎖ 플라스틱 테스트 튜브에서 밤새 동결건조시킨다.
14. 어떠한 것도 첨가하지 않고, 볼텍스 진탕기를 사용하여 잔류물을 분쇄한다.
15. 트리플루오로아세트산 무수물 유도체화 시약 2.5 ㎖를 첨가한다.
트리플루오로아세트산 무수물 유도체화 시약 (100회 반응용):
4-(디메틸아미노)피리딘 2.0 g
트리플루오로아세트산 무수물 30 ㎖
트리에틸아민 10 ㎖
클로로포름으로 500 ㎖까지 채우고, 자기 교반기로 이 용액을 혼합한다.
이 용액은 1개월 동안 안정하며, 4℃에서 보존한다.
16. 격렬히 교반하여 균질한 혼합물을 얻는다.
17. 초음파 처리하여 임의의 결정을 제거한다.
18. 혼합물을 35℃의 수조에서 30분 동안 항온처리한다.
19. 혼합물을 원심분리한다.
20. 상청액을 새로운 튜브에 옮긴다.
21. 8℃ 미만에서 상청액을 저장하며, 유도체화된 물질의 안정성으로 인하여 48시간 이내에 분석한다.
22. 매번 새로이 파이토스핑고신 및 스핑고신의 유도체화된 표준물질을 제조한다.
23. 파이토스핑고신 표준물질:
파이토스핑고신 2 mg
250 ㎕의 트리플루오로아세트산 무수물 유도체화 시약을 첨가한다.
초음파 처리하여 임의의 결정을 제거한다.
트리플루오로아세트산 무수물 유도체화 시약 (40개 표준 용액용):
4-(디메틸아미노)피리딘 40 mg
트리플루오로아세트산 무수물 600 ㎕
트리에틸아민 200 ㎕
클로로포름을 10 ml까지 채우고, 이 용액을 자기 교반기로 혼합한다.
유도체화 용액은 1개월 동안 안정하며, 4℃에서 보존한다.
24. 스핑고신 표준물질:
스핑고신 1 mg
트리플루오로아세트산 무수물 유도체화 시약 250 ㎕를 첨가한다.
초음파 처리하여 임의의 결정을 제거한다.
25. 35℃ 수조에서 30분 동안 두 혼합물을 항온처리한다.
26. 1,750 ㎕의 아세토니트릴을 첨가한다.
27. 볼텍싱에 의해 혼합한다.
28. 원심분리한다.
29. 10 ㎕의 상청액을 HPLC 분석에 사용한다.
30. 단계 20으로부터의 샘플을 볼텍싱 및 원심분리한다.
31. 10 ㎕의 상청액을 HPLC 분석에 사용한다.
32. HPLC 조건:
이동상 1,000 ml의 아세토니트릴 중 0.5 ml의 트리플루오로아세트산
컬럼 GL Science, Inertsil ODS 80-A, 4.6 x 250 mm
유량 1 ml/분
UV 검출 200 nm에서
체류 시간 파이토스핑고신: 10.1 분
체류 시간 스핑고신: 8.9 분
33. 각 샘플의 분석에 15분이 소요된다. 샘플을 통과시키면서(파이토스핑고신 및 스핑고신은 10.1분 및 8.9분 후에 나옴) 동시에 컬럼을 세정하므로, 추가의 세정은 필요하지 않다.
실시예 7
슈도모나스에 의한 스핑고신 생산
슈도모나스 아우란티아카(VKM B-1524)를 PDA 한천 플레이트(리터당: 감자 추출물 230 ml; 글루코스 20.0 g; 한천, 20.0 g; pH 6.0) 상에서 25℃로 4일 동안 예비 배양하였다. 이것을 사용하여, 25℃에서 2일 동안 P-M 배지(리터당: 고기 추출물 5.0 g; 펩톤 10.0 g; 효모 추출물 3.0 g; NaCl 3.0 g; 글루코스 10.0 g; KH2PO4 3.0 g; MgSO4ㆍ7H2O 5.0 g; pH 7.2)를 함유한 진탕 플라스크에 접종하였다. 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같이 처리하였으며, 추출된 스핑고지질 염기 중 10∼28%가 스핑고신이었는데(도 4 참조), 이에 반해 대조군 샘플에서는 스핑고신이 검출되지 않았다. 형성된 생성물을 확인하기 위해, 스핑고신을 샘플에 스파이킹하여, 재차 분석하였다. 명백히 4.85분/4.86분에서의 피크가 증가하였는데, 이는 스핑고신의 형성을 확인시켜 주었다(도 4a 및 4b 비교).
실시예 8
그리폴라에 의한 스핑고신 생산
그리폴라 프론도사(VKM F-3125)를 유리 비드(리터당: 맥아 추출물 300 ml; pH 6.0)를 갖는 액상 맥아 상에서 25℃로 10일 동안 예비 배양하였다. 이것을 사용하여, 한천 배지(리터당: 펩톤 2.0 g; 효모 추출물 2.0 g; 글루코스 20.0 g; K2HPO4 1.0 g; KH2PO4 0.5 g; MgSO4ㆍ7H2O 0.2 g; pH 6.3∼6.4)를 함유한 진탕 플라스크에 접종(예비 배양물의 5% 이용)하였다. 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같이 처리하였으며, 추출된 스핑고지질 염기 중 13%가 스핑고신이었는데, 이에 반해 대조군 샘플에서는 스핑고신을 검출할 수 없었다.
실시예 9
스트렙토마이세스에 의한 스핑고신 생산
스트렙토마이세스 종(Ac-109)를 P-Y 배지(리터당: 펩톤 5.0 g; 효모 추출물 3.0 g; 글루코스 5.0 g; KH2PO4 0.2 g; pH 7.0∼7.2) 상에서 26℃로 3일 동안 예비 배양하였다. 이것을, 26℃에서 3일 동안, 접종원으로서 예비 배양물의 5%를 이용하여 P-Y 배지를 함유한 제2 진탕 플라스크에 접종하는 데 사용하였다. 세포를 실시예 6에 기재된 바와 같이 처리하였으며, 추출된 스핑고지질 염기 중 19%가 스핑고신이었는데, 이에 반해 대조군 샘플에서는 스핑고신을 검출할 수 없었다.
실시예 10
이노노터스에 의한 스핑고신 생산
이노노터스 드라이오필러스(VKM F-434)를, 유리 비드가 있는 액상 맥아(1ℓ당: 맥아 추출물 300 ㎖; pH 6.0)에서 25℃로 6일간 예비 배양하였다. 이것을 사용하여, 25℃에서 3일 동안, 한천 배지(1ℓ당: 펩톤 2.0 g; 효모 추출물 2.0 g; 글루코스 20.0 g; K2HPO4 1.0 g; KH2PO4 0.5 g; MgSO4ㆍ7H2O 0.2 g; pH 6.3∼6.4)를 포함하는 진탕 플라스크에 (예비 배양물의 5%를 사용하여) 접종하였다. 실시예 6에 기재된 바와 같이 세포를 처리하였으며, 추출된 스핑고이드 염기 중 7%가 스핑고신이었다.
실시예 11
헤리시움에 의한 스핑고신 생산
헤리시움 코랄로이데스(VKM F-3128)를, 유리 비드가 있는 액상 맥아(리터당: 맥아 추출물 300 ㎖; pH 6.0)에서 25℃로 10일 동안 예비 배양하였다. 이것을 사용하여, 25℃에서 3일 동안, 한천 배지(리터당: 펩톤 2.0 g; 효모 추출물 2.0 g; 글루코스 20.0 g; K2HPO4 1.0 g; KH2PO4 0.5 g; MgSO4ㆍ7H2O 0.2 g; pH 6.3∼6.4)를 포함하는 진탕 플라스크에 (예비 배양물의 5%를 사용하여) 접종하였다. 실시예 6에 기재된 바와 같이 세포를 처리하였고, 추출된 스핑고이드 염기 중 18%가 스핑고신이었으며, 이에 반해 대조군 샘플에서는 스핑고신을 검출할 수 없었다.
실시예 12
파이토프토라의 배양
파이토프토라 캡시시(VKM F-2062)를 V8 한천 플레이트(리터당: V8 식물즙액 125 ㎖; CaCO3 2.5 g; 한천 20 g)에서 예비 배양하였다. 1 cm2 블록을 절단하고, 진탕하지 않으면서 플라스틱 페트리 디쉬 중의 15 ㎖ 액상 배지에 접종하였다. 몇몇 배지를 사용하였다: Ph (리터당: 효모 추출물 5.0 g; 글루코스 5.0 g; L-아스파라긴 1.0 g; KH2PO4 0.5 g; MgSO4ㆍ7H2O 1.0 g; 티아민 0.001; pH 6.0), V8 및 HV8(V8 식물즙액과 CaCO3를 혼합한 후에 잔해를 제거한 것을 제외하고는 V8과 동일함). 모든 배지에는 피마리신(100 mg/ℓ), 리팜피신(10 mg/ℓ), 반코마이신(10 mg/㎖) 및 앰피실린(100 mg/ℓ)을 보충하였다. 64시간 후에 증식이 분명하게 육안으로 확인 가능하였다.
실시예 13
파이토프토라에 의한 스핑고신 생산
파이토프토라 캡시시(VKM F-2062)는 25℃에서 14일 동안 PDA 한천 플레이트(리터당 감자 추출물 230 ml; 글루코스 20.0 g; 한천 20.0 g; pH 6.0) 상에서 예비 배양하였다. 이것을, 25℃에서 3일 동안, 액상 Ph 배지(리터당 효모 추출물 5.0 g; 글루코스 5.0 g; L-아스파라긴 1.0 g; KH2PO4 0.5 g; MgSO4ㆍ7H2O 1.0 g; 티아민 0.001; pH 6.0)에 접종하는 데 사용하였다. 세포는 실시예 6에 기재한 바와 같이 처리하였으며, 추출된 스핑고이드 염기의 29%가 스핑고신이었는데, 이에 반해 대조군 샘플에서는 스핑고신을 검출할 수 없었다.
실시예 14
슈도모나스 및 트리셀룰라 스핑고이드 염기의 o-프탈알데히드 분석
트리셀룰라 아우란티아카(VKM F-2456) 및 슈도모나스 아우란티아카(VKM B-1524)를 실시예 8에 기재한 바와 같이 배양하였다. 동결건조 후, 샘플을 실시예 3에 기재한 바와 같이 o-프탈알데히드를 이용하여 유도체화하였다. 상기 균주 둘 다는 파이토스핑고신과의 항온처리 후에 스핑고신을 생산하였다.
실시예 15
피티움에 의한 스핑고신 생산 및 NMR 분석
피티움 아드하에렌스(VKM F-1921)를 맥아 한천 페트리 디쉬(리터당 맥아 추출물 300 ml; 한천 20.0 g; pH 6.0) 상에서 25℃로 20일 동안 예비 배양하였다. 이들 한천 플레이트로부터 진균류를 갖는 블록을 절단하여, (20개의 예비 배양물 블록을 사용하여) 25℃에서 3일 동안 액상 한천 배지(리터당 펩톤 2.0 g; 효모 추출물 2.0 g; 글루코스 20.0 g; K2HPO4 1.0 g; KH2PO4 0.5 g; MgSO4ㆍ7H2O 0.2 g; pH 6.3∼6.4)에 접종하였다. 세포는 실시예 6에 기재된 바와 같이 처리하였으나, 핵 자기 공명(NMR)으로 분석하였고, 스핑고신이 관찰되었다.
본 발명의 방법에 의하면 외인성 파이토스핑고신의 적어도 일부를 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 미생물을 경제적인 방식으로 동정할 수 있다.

Claims (14)

  1. 일련의 후보 미생물을 제공하는 단계,
    상기 일련의 후보 미생물을 파이토스핑고신 존재 하에 항온처리하는 단계,
    각각의 항온처리된 미생물로부터 얻어진 스핑고이드 염기의 조성을 분석하는 단계, 및
    파이토스핑고신의 일부 또는 전부를 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 미생물을 동정하는 단계
    를 포함하는, 외인적으로 첨가된 파이토스핑고신의 일부 또는 전부를 스핑고신으로 전환시킬 수 있는 미생물을 동정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 후보 미생물을 파이토스핑고신과의 항온처리 전에 투과화하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 파이토스핑고신을 수용액 중에서 가용화하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 스핑고이드 염기는, 각각의 항온처리된 미생물로부터 스핑고이드 염기를 추출하고, 이 스핑고이드 염기를 아세트산 무수물, 트리플루오로아세트산 무수물 또는 o-프탈알데히드로 처리함으로써 유도체화하여 얻는 것인 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 파이토스핑고신의 함량이 0.1∼100 mM인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 파이토스핑고신을 10 mM의 양으로 사용할 경우, 얻어지는 스핑고이드 염기의 스핑고신 함량이 5%(w/w) 이상인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 동정된 미생물이 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 그리폴라(Grifola) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 이노노터스(Inonotus) 속, 헤리시움(Hericium) 속, 파이토프토라(Phytophthora) 속, 트리셀룰라(Tricellula) 속 및 피티움(Pythium) 속 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 동정된 미생물이 슈도모나스 아우란티아카(Pseudomonas aurantiaca) 종, 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa) 종, 이노노터스 드라이오필러스(Inonotus dryophilus) 종, 헤리시움 코랄로이데스(Hericium coralloides) 종, 파이토프토라 캅시시(Phytophthora capsici) 종, 트리셀룰라 아우란티아카(Tricellula aurantiaca) 종 및 피티움 아드하에렌스(Pythium adhaerens) 종 미생물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 방법.
  10. 스트렙토마이세스 종, 슈도모나스 아우란티아카 종, 그리폴라 프론도사 종, 이노노터스 드라이오필러스 종, 헤리시움 코랄로이데스 종, 파이토프토라 캅시시 종, 트리셀룰라 아우란티아카 종 및 피티움 아드하에렌스 종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물을 배양하는 단계,
    파이토스핑고신 존재 하에 상기 미생물을 항온처리하여 파이토스핑고신의 일부 또는 전부를 스핑고신으로 전환시키는 단계, 및
    스핑고신을 회수하는 단계
    를 포함하는, 스핑고신의 제조 방법.
  11. 스트렙토마이세스 종, 슈도모나스 아우란티아카 종, 그리폴라 프론도사 종, 이노노터스 드라이오필러스 종, 헤리시움 코랄로이데스 종, 파이토프토라 캅시시 종, 트리셀룰라 아우란티아카 종 및 피티움 아드하에렌스 종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 미생물로부터 파이토스핑고신을 스핑고신으로 전환시키는 효소 활성을 코딩하는 유전자(들)를 단리하는 단계,
    상기 유전자(들)을 파이토스핑고신 생산 미생물로 형질전환시키는 단계, 및
    스핑고신을 생산하는 형질전환된 미생물을 단리하는 단계
    에 의해 스핑고신을 생산하는 미생물을 얻는 방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 파이토스핑고신 생산 미생물이 피치아 시페리(Pichia ciferrii)인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 효소가 탈수효소인 방법.
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