CZ20012761A3 - Mikrobiální způsob výroby pravastatinu - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu výroby pravastatinu, konkrétně mikrobiologického způsobu výroby pravastatinu v průmyslovém měřítku.

Dosavadní stav techniky

Nejvíce rizikovým faktorem atherosklerosy a stenosy koronárních arterií je vysoká plasmatická koncentrace cholesterolu. V posledních dvou dekádách byla důkladně studována 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzym A reduktasa (EC.1.1.1.34), která je klíčovým enzyme regulujícím rychlost syntézy cholesterolu. Pravastatin, sloučenina vzorce I,

a jiné příbuzné sloučeniny (compactin, mevinolin, simvastatin) jsou kompetitivní inhibitory HMG-CoA reduktasy (A. Endo et al., J. Antibiot. 29: 1346-1348 (1976); A. Endo et al., FEBS Lett. 72: 323-326 (1976); C.H. Kuo et al., J. Org. Chem. 48: 1991 (1983)) .

Pravastatin poprvé izoloval M. Tanaka et al. (nepublikované výsledky) z moči psů během vyšetřování metabolismu compactinu (Arai, M. et al., Sankyo Kenkyusyo Nenpo, 40: 1-38, 1988). V současnosti je pravastatin činidlem snižujícím hladinu ···· · · · · ·· · · • · · · ··· · ·· · cholesterolu s nejvýhodnějším mechanismem účinku. Jeho významnou vlastností je tkáňová selektivita, tj. inhibice syntézy cholesterolu ve dvou hlavních místech cholesterolgenese, v játrech a v tenkém střevu, zatímco v jiných orgánech je jeho účinek na intracelulární enzym stěží detekovatelný. Limitující účinek mevinolinu a simvastatinu na biosyntézu cholesterolu je významný ve většině orgánů (T- Koga et al., Biochim. Biophys Acta 1045: 115-120, 1990).

Pravastatin se významně liší ve své chemické struktuře od mevinolinu a simvastatinu, které mají více lipofilní charakter. V případě posledních dvou sloučenin je substituent navázaný na C-l atom uhlíku hexahydronaftalenového skeletu zakončen 6-členným laktonovým kruhem, zatímco v případě pravastatinu je místo laktonového kruhu přítomna biologicky aktivní, otevřená sodná sůl dihydroxy kyseliny. Jiným významným strukturálním rozdílem je to, že místo methylové skupiny přítomné v C-6 pozici hexahydronaftalenového kruhu mevinolinu a simvastatinu je v pravastatinu přítomna hydroxylová skupina, což vede k dalšímu zvýšení jeho hydrofilního charakteru.

V důsledku výše uvedených strukturálních odlišností může pravastatin pronikat skrz lipofilní membrány periferních buněk v pouze minimální míře (A.T.M. Serajuddin et al., J. Pharm. Sci. 80: 830-834, 1991).

Průmyslová výroba pravastatinu může být provedena dvěma fermentačními procesy. V prvním způsobu je mikrobiálně připraven compactin, který je potom během druhé fermentace za použití sodné soli kyseliny compactinové jako substrátu přeměněn na pravastatin mikrobiální hydroxylací v 6β-ροζίοί.

···· · ·· · ·· ·· ··· · · · ♦ · · · ·

Podle publikovaných patentů může být mikrobiální hydroxylace compactinu provedena v různém rozsahu za použití plísní různých rodů a za použití filamentosních bakterií náležících do rodu Nocardia, Actinomadura a Streptomyces (Belgická patentová přihláška č. 895090. Japonská patentová přihláška č. 5810572, US patenty č. 4537859 a 4346227, a publikovaná Evropská patentová přihláška č. 0605230). Biokonverze compactinového substrátu byla publikována v koncentraci 500 gg/ml za použití filamentosních plísní, jako je Mucor hiemalis, Syncephalastrum nigricans, Cunninghamella echinulata, a v koncentraci 2000-4000 pg/ml pro kmeny Nocardia, Actinomodura a Streptomyces náležících k prokaryotickým organismům.

Obecným problémem v případě výroby pravastatinu při použití filamentosních plísní je, že v důsledku antimykotického účinku compactinu netolerují mikroorganismy compactinový substrát v kultuře ani při nízkých koncentracích (Serizawa et al., J. Antibiotics, 36: 887-891, 1983). Buněčná toxicita tohoto substrátu byla také pozorována při hydroxylaci se Streptomyces carbophilus, která byla intenzivně studována japonskými výzkumníky M. Hosobuchi et al., Biotechnology and Bioingineering, 42: 815-820, 1993).

Japonští autoři se pokusili zlepšit hydroxylační schopnost kmene Streptomyces carbophilus pomocí rekombinantních DNA technik. Systém cytochrom P-450 monooxygenasy je nutný pro hydroxylaci compactinu (Matsuoka et al., Eur. J. Biochem. 184, 707-713) . Nicméně, podle autorů není bakteriální systém cytochrom P-450 monooxygenasy jeden protein, ale jedná se o více proteinů účastnících se na transportu elektronů, což ztěžuje použití technik rekombinantní DNA. Vývoj cenově ·· · · · ·· · ·· • · · · · · · ♦ · · výhodných mikrobiálních metod hydroxylace pro výrobu pravastatinu je extrémně složitý, komplexní problém.

Cílem předkládaného vynálezu je nový mikrobiální proces přípravy pravastatinu z compactinu v průmyslovém rozsahu, kterým by mohl být pravastatin vyráběn výhodněji než dříve. Během výzkumu jsme se pokusili najít mikrobiální kmen s hydroxylasou, který by mohl být použit pro mikrobiální transformaci compactinu na pravastatin ve vysokých koncentracích.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká mikrobiálního způsobu přípravy sloučeniny vzorce (I)

(I) ze substrátu vzorce (II)

·«·· · ·· « ·· ·· • ·· · · ·· · · · · kde R znamená alkalický kov nebo ammoniový iont;

kde uvedený způsob zahrnuje stupně (a) kultivace filamentosni plísně kmene Mortierella maculata schopné ββ-hydroxylace sloučeniny vzorce (II) v živném mediu obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku a anorganické soli; (b) přidávání substrátu, který má být transformován, do kultury Mortierella maculata; (c) fermentováni substrátu do konce biokonverze; (d) separování sloučeniny vzorce (I) z kultivačního media; a (e) izolaci sloučeniny vzorce (I) .

Předkládaný vynález se také týká biologicky čisté kultury Mortierella maculata n. sp. E-97 uložené v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, pod přírůstkovým č. NCAIM(P)F 001266 a biologicky čisté kultury mutantu tohoto organismu, Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13, uložené v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, pod přírůstkovým č. NCAIM(P)F 001267.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je ilustrací fyzikálních charakteristik Mortierella maculata č. E-97.

Podrobný popis vynálezu

Během vyhledávacího programu jsme testovaly přibližně 5500 prokaryotických a eukaryotických kmenů.Vybráno bylo 23 kmenů, které byly schopny hydrolyzovat compactin. Z těchto kmenů byly filamentosni plísně nejvhodnější pro produkci pravastatin z důvodu nejvyšší resistence vůči compactinu ve srovnání s kmeny známými z publikovaných patentů. Podle taxonomických ··«· » ·· · ·· ·♦ • ·· · · ♦· · · · ♦ • 9 «·· 9 w · • 9 « ♦ 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 ·· ·«·· studii bylo zjištěno, že tento kmen je novým představitelem druhu náležícím do rodu Mortierella (Mortierella maculata nsp.). Z vybraných plísní byl nový kmen selektován jednak pomocí metody mutace-selekce a jednak pomocí indukce hydroxylasy kmene,- který byl schopen hydroxylovat compactinový substrát na pravastatin ve vyšších koncentracích, než bylo doposud popsáno. Jako mutagenních činidel bylo použito fyzikálních a chemických mutagenů (UV záření, methylmethansulfonat, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) . Po mutagenesi byla pro přípravu haploidních buněk suspenze spor nanesena na agarové plotny obsahující benomyl a potom byly vzniklé kolonie za účelem indukce hydroxylasy naočkovány na agarové plotny obsahující 100 gg/ml 8-de-(2-methylbutyryl)compactin nebo compactin. Pomocí těchto metod byl z nového kmene připraven mutantní kmen, který byl schopen přeměňovat compactin na pravastatin ve významně vyšší míře než původní kmen.

Během optimalizačních pokusů jsme určili složení nejvýhodnějšího inokula a nejvýhodnějšího biokonverzního media pro hydroxylaci compactinu, stejně jako optimální způsob pro opakované přidávání compactinu ve vysokých koncentracích.

Proto je předkládaný vynález založen na zjištění, že kmeny E-97 a E-97/15/13 izolované plísně Mortierella maculata, které byly uloženy pod přírůstkovými čísly NCAIM(P)F 001266 a NCAIM(P)F 001267, v příslušném pořadí, v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (Department of Microbiology and Biotechnology, University of Agriculture and the Food Industry, Budapest), jsou za vhodných podmínek schopny vyrábět pravastatin ve vysokém rozsahu, zatímco nežádoucí příbuzné sloučeniny, jako jsou kyseliny 6a-hydroxycompactinu, 2a-hydroxy-compactinu, 8-de-(2-methyl-butyryl)-

99 ♦·	*					Λ9
·'	• ·	«	•	• <	•		•	♦ ·
•		«	4		»			♦
• *	•	»	•	•	•		•	•
• r	• ··		·«	λ··		*9		·44·

compactinu, 3a, 5P-dihydroxy-5, 6-dihydro-isocompactinu, 8α, βhydroxy-compactinu a hydroxylované deriváty v pozicích 2 a 3

2-methyl-butyrylového vedlejšího řetězce compactinu jsou získány během biokonverze pouze v malých nebo stopových množstvích. Proto jsou tyto kmeny zejména vhodné pro výrobu pravastatinu v průmyslovém měřítku.

Když se bere v úvahu to, že ekonomická výroba aktivní složky je funkcí koncentrace compactinového substrátu, tak je významné mít kmen, který bude tolerovat vysoké koncentrace compactin a pravastatinu. Proto je další významnou částí vynálezu zjištění, že hydroxylační schopnost původní izolované plísně může být zlepšena technikami mutace-selekce a indukcí enzymu, a dále zjištění toho, že vývoj vhodné metody pro přidávání substrátu hydroxylace velkých množství compactinu na pravastatin může být proveden v jednom postupu. Nový mutantní kmen označený Mortierella maculata n.sp. E-97/15/13 je zejména vhodný pro výrobu pravastatinu.

Taxonomické rysy nových izolovaných druhů plísní ve srovnání s nejvýznamnějšími diagnostickými znaky jiných druhů Mortierella jsou shrnuty dále.

Taxonomický popis holotypního kmene Mortierella maculata nov. sp. E-97

Na mediu škrob-kasein-sladový extrakt-agar se aerální mycelium dobře vyvíjí (více než 10 μιη silná vrstva mycelia pokrývající substrát). Na počátku se jeví jako lehce zvlněná bílá síť hyf, ve kterých se později objeví nažloutlé sporulující skvrny o průměru několika mm (výraz maculatus znamená skvrnitý) . Toto nažloutlé zabarvení se může rozšířit na větší povrch aerální sítě. Barva myceliového substrátu je • · · · · ·· · ·· ·· • · · · ··· · * · · na Czapek-, krevní-Czapek-, tyrosin-, škrob-kasein-, sladový extrakt- atd. agaru obvykle bezbarvá nebo světle žlutá, barva myceliového substrátu na kvasinkový extrakt-glukosa-pepton mediu načervenalá. Produkce difundovatelných a solubilních pigmentů ve výše uvedených mediích není pravidlem a pouze občas se na těchto mediích vyskytuje nevýznamné nažloutlé zabarvení. Kolonie kmene E-97 mohou mít, v důsledku produkce těkavého oleje, podobně jako mnoho jiných kmenů Mortierella (kromě kmene Isabellina), velmi charakteristický zápach.

Sporangiofory, označené čísly 1 až 7 na obr. 1, často vznikají lokálně na aerálních hyfách (ale méně na substrátových) ve velkém počtu ve velmi různých vzdálenostech od sebe. Nejsou rozvětvené, ale jsou nejčastěji přímé nebo zahnuté. Jejich délka je obvykle 60-80 pm. Výchozím místem je ve valné většině případů.kratší či delší, ale výrazně zbytnělá hyfální část aerální sítě, od které jsou odděleny stěnou. Sporangiofory mohou být sami o sobě zbobtnalé (někdy významně), jak je uvedeno pod číslem 6 na obr. 1, ale ve směru sporangia se postupně zužují, od 5,0-9,0 μπι na 1,0-2,0 μιη. Významným taxonomickým rysem je to, že pod sporangiofory se nikdy nerozšiřují (viz č. 8).

Sporangia jsou sférická; v některých případech se jedná o lehce zploštěné sféry. Jejich průměr je přibližně 6017,0 μιη, což znamená, že jsou relativně malé ve srovnání se sporangiemi jiných druhů Mortierella. Sporangia mohou obsahovat mnoho spor, ale mohou také existovat sporangia obsahující pouze jednu sporu. Spory 9 jsou cylindrické nebo oválné. Jejich velikost je 3,0-5,0 x 1,5-2,0 μπι. V jednotlivých sporách mohou být přítomny jedna nebo dvě malé tmavé sférické olejové kapky

10. Z důvodu velmi snadného rozpadu stěny sporangia se ve vlhku spory rychle rozptýlí. Po rozpadu sporangia, někdy na • · · · · · · · ·· ·· ··· · · · · · · · · konci sporangiospor, může být pozorován jemná vidlicovítá kolumela a velmi krátká rudimentární (a ne typická) kolumela. Rozmnožovací pupeny 15-28, které jsou sférické nebo cylindrické, se mohou vyskytovat na většině diagnostických medií. Jejich obvyklá velikost je 10-25 μπι. V kulturách se mohou také vyskytovat řetězce sférických rozmnožovacích pupenů 13, pučících buněk, interkalované rozmnožovací pupeny 15-23, asociace hyf, konkrétně spirální růst jednoho vlákna okolo jiného (11), struktury podobné anastomozám a obrovské buňky atd. V aerálním myceliu mohou být také pozorovány velké (50— 250 pm v průměru) velmi husté sítě vláken, ve kterých nejsou přítomny detekovatelné zygoty.

Kultury kmene E-97 jsou schopné redukovat dusičnany na dusitany, nehydrolyzují škrob, esculin, arginin nebo želatinu, ale hydrolyzují Tween polysorbáty a nerozkládají parafinové uhlovodíky. Kultury kmene E-97 mají ureasovou aktivitu vykazující dobrý růst při pH mezi 7,0 a 9,0 a tolerují maximálně 2% NaCl. Účinky xantinu, hypoxantinu, lecitinu, tyrosinu a adeninu jsou negativní. Silná produkce kyselin kulturami byla pozorována z glukosy, fruktosy, glycerinu a galaktosy, ale slabá nebo žádná produkce byla pozorována z xylosy, arabinosy, raffinosy, sorbitolu, inositolu, inulinu atd. Slabý růst je byl detekován na pyruvátu a acetátu, ale žádný růst nebyl detekován na benzoátu, salicylátu, citrátu, laktátu, jantaranu, vinanu a jablečnanu. Dobrý růst byl pozorován při použití glukosy a fruktosy jako jediného zdroje uhlíku v mediu. Testy využívání xylosy, arabinosy, rhamnosy, sacharosy, arffinosy, mannitolu a inositolu byly negativní. Kultury nerozkládaly celulosu.

Systematická pozice: Kmen E-97 patří do čeledi Mortierellaceae a je typickým představitelem rodu Mortierella:

···· · ·« * ·· ·· • · · · · · * » · · · sporangia obsahuji obvykle mnoho spor, kolumela je obvykle extrémně redukována, rozmnožovací pupeny jsou často přítomné, výskyt zygot nebyl detekován a kolonie mají velmi charakteristický zápach. V rodu Mortierella je kmen E-97 typickým představitelem skupiny Alpina. Tato je charakterizována velmi krátkými nerozvětvenými sporangiofory (maximální délka 200 pm) a malými sporangiemi (Zycha, H., und Siepmann, R., Mucorales. Eine Beschreibung aller Gattungen und Artendieser Pilzgruppe, D-3301 Lehre, Verl. von J. Cramer, 1969). Mezi ostatními členy skupiny Alpina vykazuje kmen E-97 největší podobnost s kmenem M. thaxteri Bjorling 1936 a M. renispora Dixon-Stewart 1932. Nicméně, data v tabulce 1 jasně ukazují rozdíly v diagnostických charakteristikách kmene E-97 a těmito dvěma kmeny. Proto se jedná o nový kmen označený Mortierella maculata nov. sp. E-97.

Tabulka 1: Srovnání holotypního kmene Mortierella maculata

n.sp. s kmeny M. renispora a M. thaxteri podle klíčových diagnostických charakteristik

	Mortierella renispora	Mortierella kmen E-97	Mortierella thaxteri
Odstup sporangioforů	Pravidelně, nicméně hyfyjsou širší než normálně, laterálně z rozšířených hyf	Laterálně z rozšířených nebo normálních hyf nebo neseparovaných částí substrátových hyf	laterálně z rozšířených separovaných segmentů aerálních hyf nebo neseparovaných částí substrátových hyfu
Tvar a velikost sporangioforů	Postupně se zmenšující od vrcholu 10 pm do 3 μηι. Délka přibližně 200 μηι.	Většinou přímé nebo zakřivené, bez větvení. Šířka se postupně zmenšuje od konce: od 5-9 pm do 1,5-2,5 pm. Délka přibližně 60-80 pm. Na konci se nikdy nerozšiřují.	Délka přibližně 60-90 pm. Šířka na začátku přibližně 5-7 pm, na konci 1,5-2 pm. Ihned pod sporangiem rozšíření.

···· ♦ · · · ·· ·· • · · .· · · · · · · · ·· ··· ·· ··· ·♦ ····

Tvar a velikost sporangií	Bezbarvé, průměr je 25 pm.	Většinou sférické (průměr 6-17 pm), ale méně často zploštělé. Obvykle obsahují mnoho spor, výjimečně jednu sporu.	Sférické (12-20 pm v průměru). Obsahují mnoho spor, ale na některých mediích obsahují pouze jednu sporu.
Stěna (membrána) sporangií	Rozšířená membrána. Po rozpadu zůstává límcovitá struktura.	Rozpadající se. Zůstává vidlicovitý límec.	Rozpadající se. Zůstává zpětně stočený malý límec.
Tvar a velikost spor	Ledvinovitého tvaru, hyaliní struktura, velikost 2x4 pm.	Cylindrické. Délka (3-5 pm)je zhruba dvojnásobkem šířky (1,5-2 pm).	Elipsoidní hyaliní spory 3,5-4 pm x 1,5x2 pm.
Rozmnožovací pupeny	Vyskytují se na většině medií.	Časté na většině medií, nejčastěji na aerálním myceliu. Sférické nebo protáhlé (10-25 pm).	Interkalámí, oválné (ΙΟΙ 4 pm) v substrátovém myceliu.
Zygoty	Časté na všech diagnostických mediích. Průměr společně s překrývajícím vláknem je přibližně 500 pm, bez něj přibližně 30 pm.	Nezjištěny	Nepozorovány
Husté lokality sítě vláken.		Velké hustě propletené regiony hyf (50-250 pm) jsou časté, ale bez zygot.	Ve starých kulturách velké (průměr 100-125 pm) žluto-zelené husté sítě hyf, bez zygot.
Barva a charakteristický růst aerálního mycelia	Volné, téměř bílé hyfy	Bílé s nažloutlými skvrnami	Nejprve jako pavučina, potom hustší

Ve způsobech přípravy pravastatinu podle předkládaného vynálezu je výhodně použita kultura plísně Mortierella maculata n.sp. E-97 nebo její mutant označený jako E-97/15/13.

• · · · · ·* · ·· ·· ··· · ··· · ·· · · · · · ·· · vybraný kmen je výhodný z důvodu rychlého růstu. Jako zdroj uhlíku snadno využívá glukosu, glycerin, fruktosu nebo galaktosu. Jako zdroj dusíku může být použit kvasinkový extrakt, pepton, kasein, masový extrakt, sojová moučka, výluh z kukuřice, dusičnan sodný nebo síran amonný.

V kultivačním mediu použitém pro výrobu pravastatinu mohou být kromě zdroje uhlíku a dusíku přítomny anorganické soli, například dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid hořečnatý, síran hořečnatý, stopové prvky (železnaté, manganové soli), aminokyseliny a protipěnivá činidla.

Ve výhodném provedení vynálezu se suspenze spor připravená z kultury Mortierella maculata n.sp. E-97 nebo jejího mutantu (NCAIM(P)F 001267) označeného E-97/15/13 na šikmém agaru naočkuje do očkovacího media; potom se 10% očkovací kultury, která se kultivuje po dobu 3 dnů při teplotě přibližně 25-30 °C, výhodně přibližně 24-28 °C, nejlépe při přibližně 28 °C, přenese do biokonverzního media. Toto medium' se potom inkubuje po dobu 4 dnů při teplotě přibližně 25-28 β, lépe přibližně 28 °C, a potom se do kultury přidá glukosa a sodná sůl kyseliny compactinové. V závislosti na koncentraci compactinového substrátu pokračuje kultivace po dobu 2-12 dnů za aerobních podmínek za udržování pH mezi 5,5 a 7,5, výhodně 7,0. Biokonverze se provede za míšení a provzdušňování, kde průtok vzduchu je 0,2 vvm a rychlost míšení je 400/minutu.

Během fermentace následuje po biokonverzi compactinového substrátu vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC). V tomto způsobu se vzorek media naředí na dvojnásobek methanolem a odstředí se a supernatant se použije pro HPLC analýzu za následujících podmínek: Waters vybavení pro analytickou HPLC; kolona - Nucleosil Cis 10 μιη; detekční vlnová ···· 4 · · · ΦΦ Φ Φ • · · · · Φ Φ Φ · φ · ·· ··» ΦΦ ·ΦΦ φ» ·ΦΦ· délka: 238 nm; injekční objem 20 μΐ; průtok 1 ml/minutu; gradientově eluce, eluens: A = 0,05% vodný roztok kyseliny fosforečné, B = acetonitril.

Gradient eluce

Čas (minuty)	Eluens A (%)	Eluens B (%)
0	70	30
20	0	100
25	0	100
25,1	70	30
35	70	30

Přibližné retenční časy: pravastatin 8,6-9,0 minuty; compactinová kyselina 11,6-12,0 minuty; pravastatin-lakton 15,0-15,5 minuty; compactin 16,5-17,0 minuty.

Při výrobě pravastatinu se vodný roztok sodné soli kyseliny compactinové přidá v 96. hodině kultivace. Pro tento krok se substrát připraví v pevné formě následujícím způsobem. Compactin-lakton se hydrolyzuje v 0,2 M roztoku hydroxidu sodného po dobu 2 hodin při 40 °C, potom se pH reakční směsi upraví na 7,5 kyselinou chlorovodíkovou a neutralizovaný roztok se převrství na Diaion HP-20 adsorbentní kolonu; chlorid sodný vzniklý během neutralizace se eliminuje promytím kolony vodou a potom se sodná sůl kyseliny compactinové eluuje z kolony 50% vodným roztokem acetonu. Potom se eluát destiluje ve vakuu a vodný zbytek se lyofilizuje. Po neutralizaci vodného roztoku alkalického hydrolyzátu compactinu může být tento roztok také použit přímo jako substrát. V případě sodné soli kyseliny compactinové se obsah hydrolyzátu měří HPLC a roztok se uchovává při teplotě 20 °C do použití.

···· « ·· · ·· ·· • · · · «·· · » · ·

Vyšší pH media dosažené 4. den fermentace je výhodnější pro hydroxylaci compactinového substrátu. Přidávání compactinové substrátu je zahájeno tehdy, když pH media přesáhne 6,3. 4. den fermentace se přidá tolik sterilně filtrovaného vodného roztoku sodné soli kyseliny compactinové, kolik je potřeba k dosažení koncentrace 500 gg/ml. Glukosa se také přidává do kultury z 50% roztoku sterilizovaného při 121 °C během 25 minut následujícím způsobem: pokud je pH media vyšší než 6,7, přidává se 1% glukosy vzhledem k objemu media, zatímco pokud je pH v rozmezí 6,3-6,7, přidává se 0,5% glukosy vzhledem k objemu media. Sodná sůl kyseliny compactinové se spotřebuje z media během 24 hodin, jak bylo zjištěno HPLC analýzou transformace. V takovém případě se na každý ml media přidá dalších 500 pg compactinu. Kromě compactinového substrátu se také přidává glukosa, způsobem popsaným výše. Morfologie kultury po 120 hodinách je charakterizována růstem malých pelet (průměr pelety: 0,5-3,0 mm). Po 24 hodinách je z media spotřebována také druhá dávka substrátu a proto se přidá další dávka sodné soli kyseliny compactinové nutná pro dosažení koncentrace 500 pg/ml a zároveň se přidá glukosa v množství závislém na pH substrátu. Od 4 dne fermentace se substrát a glukosa přidávají denně popsaným způsobem do 17-18. dne fermentace.

Pro získání produktu z media je výhodné vzít v úvahu skutečnost, že během biokonverze se pravastatin tvoří ve formě kyseliny, takže může být izolován z filtrátu media adsorpcí na kolonu obsahující aniontovou iontoměničovou pryskyřici. Pro izolaci produktu je výhodné použít silně bazickou aniontovou iontoměničovou pryskyřici, kterou je polystyren-divinylbenzenový polymer obsahující kvarterní ammoniové aktivní skupiny. Produkt může být adsorbován přímo z filtrátu media pomocí smísení aniontové iontoměničové ··«· · · · · ·· ·· • · · ♦ 1 ♦ · · «· · • · · * · · · · • ···· ···· · ·· ··· ·· ··· ·· ···· pryskyřice v hydroxylové formě a filtrátu. Produkt adsorbovaný na aniontovou iontoměničovou pryskyřici může být eluován z kolony směsi aceton-voda obsahující kyselinu octovou nebo chlorid sodný, výhodně směsí aceton-voda (1:1) obsahující 1% chlorid sodný. Frakce obsahující pravastatin se smísí a aceton přítomný v eluátu se oddestiluje ve vakuu. pH koncentrátu se upraví na 3,5-4,0 15% kyselinou sírovou a vodný roztok se extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátový extrakt se promyje vodou a suší se přes bezvodý síran sodný. Potom se z pravastatinu připraví laktonový derivát. Uzavření laktonového kruhu se provede v suchém roztoku ethylacetátu při teplotě místnosti, za míšení, pomocí indukce tvorby laktonového kruhu kyselinou trifluoroctovou přítomnou v katalytickém množství. Postup transformace se ověří chromatografii na tenké vrstvě (TLC). Po dokončení tvorby laktonu se ethylacetátový roztok promyje nejprve 5% vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a potom vodou, potom se suší přes bezvodý síran sodný a odpaří se ve vakuu. Odpařený zbytek se zpracuje v roztoku acetonu aktivním uhlím a potom se znovu odpaří a rekrystalizuje se z alifatického alkoholu obsahujícího 1-4 atomy uhlíku, výhodně, z ethanolu. Odpařený zbytek z rekrystalizace původní kapaliny se přečistí chromatografii na silikagelu za použití směsi ethylacetát-nhexan s postupně stoupající koncentrací ethylacetátu jako eluens.

Z pravastatin-laktonu získaného po rekrystalizaci a po chromatografickém přečištění se pravastatin získá hydrolýzou při teplotě místnosti v acetonu pomocí ekvivalentního množství hydroxidu sodného. Když je tvorba sodné soli pravastatinu dokončena, naředí se reakční směs vodou a neutralizuje se a aceton se oddestiluje ve vakuu. Pravastatin se adsorbuje ze získaného vodného zbytku na kolonu obsahující Dianon HP-20 ·· ** · ·· « ·· ·· • · · · 9·· * · · 9 pryskyřici, promyje se deionizovanou vodou a eluuje se z kolony směsí aceton-deionizovaná voda. Frakce obsahující pravastatin se kombinují, aceton se oddestiluje a po lyofilizaci vodného zbytku se získá pravastatin ve vysoké čistotě, který může být rekrystalizován ze směsi ethylacetátethanol.

V průběhu celého postupu může být veškerý pravastatin adsorbován. Během uzavření laktonu se může také tvořit 3ahydroxy-iso-compactin a jiné vedlejší produkty. Ačkoliv tyto reakce snižují výtěžek izolace, mohou být tyto sloučeniny separovány výše popsanou přečišťovací metodou a potom může být pravastatin vyroben tímto způsobem ve farmaceuticky přijatelné kvalitě.

Po dokončeni biokonverze může být pravastatin extrahován buď z fermentačního media, nebo z filtrátu získaného po separaci filamentosních buněk plísně. Filamentosní buňky plísně mohou být eliminovány buď filtrací, nebo odstředěním; nicméně, v průmyslové výrobě je výhodné provést extrakci celého media. Před extrakcí se pH fermentačního media nebo filtrátu upraví na 3,5-3,7 pomocí anorganické kyseliny, výhodně pomocí ředěné kyseliny sírové. Extrakce se provede esterem kyseliny octové a alifatickým alkoholem obsahujícím 24 atomů uhlíku, výhodně ethylacetátem nebo isobutylacetátem. Krok extrakce by měl být proveden velmi rychle, aby se eliminovala tvorba laktonového derivátu z pravastatinu při kyselém pH.

Z extraktu v organickém rozpouštědle může být pravastatin ve formě kyseliny přenesen ve formě sodné soli do vodné fáze, například, z ethylacetátového extraktu může být pravastatin extrahován 5% hydrogenuhličitanem sodným v objemovém poměru ···· · ·· · ·· ·· • · · · 9 · · · · · · • · ♦ ♦ · · · » • ♦ · ·♦· ··· ·· ··· ·· ··· ·· ····

1/10 a 1/20 nebo slabě alkalickou vodou (pH 7,5-8,0). Bylo zjištěno, že pravastatin může být získán v čisté formě z výše uvedeného alkalického vodného extraktu chromatografii na koloně s použitím neiontové adsorpční pryskyřice. Výhodným způsobem je nejprve odstraněni rozpouštědla rozpuštěného ve vodné fázi destilací vodného alkalického extraktu ve vakuu, a potom zpracováním vodného extraktu na Diaion HP-20 koloně.

Sodná sůl pravastatinu adsorbovaná na koloně se přečistí elucí směsí se zvyšujícím se obsahem acetonu ve vodném roztoku a potom se hlavní frakce obsahující pravastatin kombinují a zahustí se ve vakuu. Vodný koncentrát se přečistí další chromatografii na jiné Diaion HP-20 koloně za zisku koncentrátu obsahujícího čistý pravastatin, ze kterého může být po dalším přečištění na aktivním uhlí a lyofilizaci získán pravastatin ve farmaceuticky přijatelné kvalitě.

Tento izolační postup se skládá z méně stupňů než předešlý postup, protože nezahrnuje tvorbu laktonu pravastatinu a jeho hydrolýzu. Během izolace je pravastatin vystaven kyselému prostředí, ve kterém je méně stabilní než v alkalických nebo neutrálních roztocích, pouze po omezenou dobu, a proto prakticky nejsou během izolace tvořeny artefakty.

Dále bylo zjištěno, že chromatografie na Sephadex LH-20 Dextranovém gelu (hydroxypropylovaný derivát) je výhodně použita pro přečištění pravastatinu. Při použití této metody může být vyroben pravastatin s čistotou přesahující 99,5% (jak je měřeno HPLC).

Během našich pokusů bylo zjištěno, že z extraktů v organickém rozpouštědle, výhodně z ethylacetátových nebo isobutylacetátových extraktů kultivačního media nebo filtrátu ·♦·· · ·· 4 44 44 • 44 4 4 ··4444

4 444·· 4 • 444* 44444 ··· 444 4 44 ·· ·44 44 »44 444444 kultivačního media filamentosní plísně nebo filamentosni bakterie, jako je Mortierella maculata n.sp. kmen schopný 6βhydroxylace sloučeniny obecného vzorce (II), může být pravastatin vysrážen ve formě krystalické soli se sekundárními aminy. Dále bylo zjištěno, že pro tvorbu soli jsou vhodné některé sekundární aminy obsahující alkylové, cykloalkylové, aralkylové nebo arylové substituenty. Příklady použitelných netoxických sekundárních aminů jsou dioktylamin, dicyklohexylamin, dibenzylamin. Izolace solí s organickými sekundárními aminy, například dibenzylaminové soli, se provedla přidáním 1,5 ekvivalentu (vzhledem k pravastatinu) dibenzylaminu do extraktu, potom zahuštěním extraktu destilací ve vakuu na 5% původního objemu, potom přidáním dalšího dibenzylaminu do zahuštěného materiálu v množství 0,2 ekvivalentu. Krystalická dibenzylaminová sůl se vysráží z koncentrátu. Krystalický surový produkt se přefiltruje a suší se ve vakuu. Potom se získaný materiál pročistí aktivním uhlím a rekrystalizuje se z acetonu.

V postupu uvedeném výše, ve kterém se provádí extrakce organickým rozpouštědlem a reextrakce při alkalickém pH, se může použít způsob izolace založený na tvorbě soli se sekundárním aminem místo přečištění na chromatografické koloně. V tomto případě je výhodné vysrážet dibenzylaminovou sůl pravastatinu z isobutylacetátového extraktu získaného po okyselení alkalického vodného extraktu.

Soli pravastatinu s organickými sekundárními aminy mohou být transformovány na pravastatin pomocí reakce s hydroxidem sodným nebo alkoxidem sodným, výhodně ethoxidem sodným.

Transformace je podrobně popsána pro dibenzylaminovou sůl pravastatinu. Rekrystalizovaná dibenzylaminová sůl se ···· Φ · · · Φ· ΦΦ

Φ ΦΦ Φ φ ΦΦ Φ · f φ • · φ Φ Φ φ Φ Φ

Φ ♦ Φ ΦΦφ Φ Φ φ ·· ·ΦΦ ·Φ ··· ΦΦ ΦΦΦΦ suspenduje ve směsi isobutylacetát-voda a potom se do suspenze přidá ekvivalentní množství hydroxidu sodného ve vodném roztoku, za míšení a udržování pH v rozmezí 8,0-8,5. Po vymizení suspenze se fáze separují a vodný roztok obsahující pravastatin se promyje dvakrát isobutyl-acetátem. Vodný roztok se přečistí pomocí aktivního uhlíku a lyofilizuje se za zisku pravastatinu ve farmaceuticky přijatelné kvalitě.

Jedním výhodným způsobem transformace dibenzylaminové soli pravastatinu na pravastatin je suspendování rekrystalizované dibenzylaminové soli v ethanolu, potom přidání ekvivalentního nebo o něco vyššího množství ethoxidu sodného do suspenze za míšení, potom zahuštěni reakční směsi ve vakuu a přidání acetonu, za vysrážení pravastatinu v krystalické formě z koncentrátu.

Jiným výhodným způsobem transformace dibenzylaminové soli pravastatinu na pravastatin je rozpuštění rekrystalizované dibenzylaminové soli ve směsi ethylacetát-ethanol a přidání ekvivalentního nebo o něco vyššího množství hydroxidu sodného v ethanolu do roztoku, za vysrážení pravastatinu.

Izolace pravastatinu přes sůl se sekundárním aminem je jednodušší než jakýkoliv dříve známý postup izolace. Během izolace nejsou tvořeny artefakty a separace pravastatinu od vedlejších produktů biokonverze a od různých metabolických produktů biosyntetizovaných hydroxylujícími mikroorganismy může být provedena bez použití jakýchkoliv chromatografických metod.

Struktury pravastatinu, pravastatin-laktonu a izolovaných solí pravastatinu se sekundárními aminy byly ověřeny metodami UV, IR, ^XH-NMR, ¹³C-NMR a hmotnostní spektrometrií.

Příklady provedeni vynálezu

Vynález bude nyní popsán v následujících příkladech, které jsou pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklad 1

Suspenze spor byla připravena s 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného získaného ze 7-10 denní kultury Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266) schopné 6P~hydroxylovat compactin na šikmém agaru obsahujícím sladový extrakt-kvasinkový extrakt a tato suspenze byla použita pro naočkování 100 ml očkovacího media PI sterilizovaného v 500 ml Erlenmeyerově baňce.

Složení media PI:

Glukosa 50 g

Sojová moučka 20 g v 1000 ml vody.

Před sterilizací se pH media upravilo na 7,0 a potom se provedla sterilizace při 121 °C po dobu 25 minut. Kultura se třepala na rotační třepačce (250 rpm, amplituda 2,5 cm) po dobu 3 dnů při teplotě 28 °C, potom se 10 ml získané kultury přeneslo do 100-100 ml biokonverzního media MU/4 v 500 ml Erlenmeyerově baňce sterilizovaného po dobu 25 minut při 121 °c.

Složení media MU/4:

g g

Glukosa

Sojová moučka kasein-pepton ··· · · · ·· ·· ♦ · · «· « · · · • « · · · · · · • · · · ♦ · · · · ·· ··· ·· »·· ·« ····

Asparagin

Dihydrogenfosforečnan draselný v 1000 ml vody.

g

0,5 g

Před sterilizaci se pH media upravilo na 7,0 a potom se provedla sterilizace při 121 °C po dobu 25 minut.

Baňky se třepaly na rotační třepačce (250 rpm, amplituda

2,5 cm) po dobu 4 dnů při teplotě 25 °C, potom se 50-50 mg compactinové substrátu (sodný sůl kyseliny compactinové) přidalo ve sterilně přefiltrované formě do kultur a kultivace pokračovala. 5. den se dalších 50-50 mg sodné soli kyseliny compactinové přidalo do kultur plísně a fermentace pokračovala po dobu dalších 24 hodin. Obsah pravastatinu v mediu se určil HPLC. fermentace pokračovala po dobu 168 hodin. Na konci biokonverze byla průměrná koncentrace pravastatinu ve fermentačním mediu 620 gg/ml.

Příklad 2

V laboratorním fermentačním tanku o pracovním objemu 5 1 se připravilo MU/S biokonverzní medium, složky kultivačního media se přidaly v množství odpovídajícím 5 litrům, ale objem se doplnil pouze do 4,5 litru a potom se provedla sterilizace po dobu 45 minut při 121 °C a naočkování 500 ml inokulační kultury připravené podle příkladu 1.

ml získané kultury přeneslo do 100-100 ml biokonverzního media MU/4 v 500 ml Erlenmeyerově baňce sterilizovaného po dobu 25 minut při 121 °C.

Složení media MU/8:

Glukosa g

·«<· · » ·» ·· • ·· ···· · · · · ·»♦ » · · ·«· • 9 ·♦· ♦· ··· «<·····

Glycerin 20g

Sojová moučka 20g

Pepton 5g

Dihydrogenfosforečnan draselný0,5 g

Polypropylenglykol 20001,0 g v 1000 ml vody.

Před sterilizaci se pH media upravilo na 7,0.

Fermentace se provedla při 28 °C za míšeni při 4 00 rpm a provzdušňováni ode dna rychlostí 60 litrů/hodinu po dobu 4 dnů. Na konci 2 dne po přenosu kultury se začala silně tvořit pěna, což se snížilo přidáním dalšího polypropylenglykolu 2000. Na začátku fermentace (16-20 hodin) se pH snížilo z počáteční hodnoty 6,5 na 5,0-5,5, a potom se 3. den začalo zvyšovat a dosáhlo hodnoty 6,3-7,5 4. den. Přidávání compactinového substrátu mohlo začít tehdy, když dosáhlo pH media hodnoty 6,3. 4. den fermentace se přidalo 2,5 g compactinového substrátu ve formě sterilně filtrovaného vodného roztoku. Objem 0,5-1,0% glukosy vzhledem k objemu media se přidával do kultury podle pH ve formě 50% roztoku sterilizovaného při 121 °C po dobu 25 minut současně se substrátem. Po 24 hodinách se compactinový substrát v kultuře spotřeboval, což se detekovalo HPLC analýzou vzorků odebraných z fermentačniho tanku. V takovém případě se přidaly další 2,5 g substrátu a glukosy, způsobem popsaným výše, a biokonverze pokračovala po dobu 24 hodin, kdy byl substrát přeměněn na pravastatin.

Po dokončení fermentace se 5,1 litrů media obsahujícího 630 pg/ml pravastatin přefiltrovalo přes filtr. Dva litry vody se přidaly k separovanému myceliu a potom se myceliová suspenze mísila podobu 1 hodiny a přefiltrovala se. Tyto dva filtráty se smísily a aplikovaly se za průtoku 500 ml/hodinu do kolony obsahující 138 g (50 ml) Dovex AI 400 (OH) pryskyřice (průměr kolony 3,4 cm, výška lože 28 cm) a potom se pryskyřicové lože promylo 300 ml deionizované vody. Potom se eluce z kolony provedla za použití 1 litru směsi aceton-voda (1:1) obsahující 10 g chloridu sodného. Objem každé frakce byl 100 ml. Eluát se analyzoval následující metodou chromatografie na tenké vrstvě (TLC): adsorbent: Kieselgel 60 F254 DC (Měrek) hliníková folie; vyvíjecí systém: směs aceton-benzen-kyselina octová (50:50:30); detekce: kyselina fosfomolybdenová. Rf hodnota pro pravastatin je 0,5. Frakce obsahující produkt se kombinovaly a aceton se oddestiloval ve vakuu. pH 400 ml koncentrátu se upravilo na 3,5-4,0 pomocí 15% kyseliny sírové a potom se koncentrát extrahoval třikrát 150 ml ethylacetátu. Ethylacetátové extrakty se kombinovaly a sušily se přes bezvodý síran sodný. Potom se pravastatin-lakton připravil z kyseliny pravastatinu přidáním kyseliny trifluoroctové v katalytickém množství za kontinuálního míšení při teplotě okolí. Tvorba laktonu pravastatinu se kontrolovala TLC (Rf hodnota pravastatin-laktonu ve výše uvedeném TLC systému je 0,7). Po dokončení tvorby laktonu se ethylacetát promyl 2x50 ml 5% vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, potom 50 ml vody, sušil se přes bezvodý síran sodný a odpařil se ve vakuu. Odpařený zbytek získaný v množství 3 g se rozpustil ve 100 ml acetonu a pročistil se 0,3 g aktivního uhlí. Potom se aktivní uhlí odfiltrovalo a aceton se odpařil ve vakuu. Získaný surový produkt se krystalizoval z 20 ml ethanolu. Vysrážený krystalický pravastatin-lakton se odfiltroval a promyl se na filtru 30 ml n-hexanu a sušil se při teplotě okolí ve vakuu. Tímto způsobem se získalo 1,5 g chromatograficky čistého pravastatin-laktonu. Teplota tání 140-142 °C, [a]_D= +194 ⁰ (c=0,5, methanol). Původní kapalina z krystalizace se odpařila ve vakuu a získal se 1,2 g zbytek, který se zpracoval

··«· •	• ··	• <	• • ·	• 4» • 9	• 9
• *	•	• »	*	9 9	9
		»4		··	9 999

chromatografii na koloně obsahující 24 g Kieselgel 60 adsorbent (průměr kolony 1,6 cm, výška lože 20 cm). Surový produkt rozpuštěný v 5 ml benzenu se převrstvil na kolonu. Pro eluci se použila směs ethylacetát-n-hexan, ve které se postupně zvyšoval obsah ethylacetátu. Lakton pravastatinu mohl být eluován z kolony směsí 60% ethylacetát-40% n-hexan. Frakce se kontrolovaly TLC za použití ethylacetátu-n-hexanu (9:1) jako vyvíjecího rozpouštědla. Frakce obsahující pravastatinlakton se kombinovaly a odpařily se ve vakuu. Tímto způsobem se získalo 0,3 g čistého produktu, jehož kvalita byla stejná jako kvalita pravastatin-laktonu získaného krystalizací.

Dvě šarže pravastatin-laktonu se kombinovaly a sodná sůl se připravila následujícím způsobem: 1,8 g pravastatin-laktonu se rozpustilo ve 20 ml acetonu a za míšení se přidalo 4,5 ml 1 M vodného roztoku hydroxidu sodného a potom se roztok mísil po dobu půl hodiny při teplotě místnosti. Po dokončení tvorby soli se 20 ml vody přidalo do směsi a roztok se neutralizoval a aceton se potom odpařil ve vakuu. Vodný koncentrát se zpracoval chromatografii na koloně naplněné 150 ml Diaion HP20 pryskyřice (průměr kolony 2,6 cm, výška lože 30 cm). Pro eluci se použila směs aceton-deionizovaná voda, ve které se koncentrace acetonu zvyšovala po 5% krocích. Pravastatin mohl být eluován z kolony směsí aceton-deionizovaná voda obsahující 15% aceton. Frakce se analyzovaly TLC. Frakce obsahující produkt se kombinovaly a aceton se odpařil ve vakuu. Lyofilizací vodného zbytku se získalo 1,3 g pravastatinu. Chromatograficky čistý produkt se krystalizoval ze směsi ethanol a ethylacetát.

Teplota tání: 170-173 °C (rozklad) [a]^D ₂₀= +156° (c=0,5, ve vodě) Ultrafialové absorpční spektrum (20 gg/ml, v methanolu): X_max = 231, 237, 245 nm ···« · ·< 9 ·· Ο· ··· ···« 4 Φ * · • 4 · · · 4 9 · ♦ · 4 · · ··· ··« ·· ··· 4· ·Φβ· (log ε -4,263; 4,311; 4,136)

Infračervené absorpční spektrum (KBr): νΟΗ 3415, vCH 2965, vc =0 1730, VCOO 1575 cm^-1.

1H-NMR spektrum (D2O, δ, ppm): 0,86, d, 3H (2-CH₃) ; 5,92, dd,

J=10,0 a 5,4 Hz, 1H (3-H); 5,99, d, J=10,0 Hz, 1H (4-H); 5,52, br 1H (5-H); 4,24, m, 1H (6-H); 5,34, br, 1H (8-H); 4,06, m,

1H (P-H), 3,65, m, 1H (b-H); 1,05, d, 3H (2'-CH₃); 0,82, t, 3H (4 ' -H₃) .

¹³C-NMR spektrum (D2O, δ, ppm): 15,3, q (2-CH₃) ; 139,5, d (C-3) ;

129,5, d, (C-4); 138,1, s (C-4a), 127,7, d (C-5); 66,6, d (C6); 70,1, d (C-8); 182,6 s (COO-); 72,6, d (C-P); 73,0, d (Co); 182,0, s (C-l') 18,8; q (2'-CH₃); 13,7, q (C-4').

Pozitivní FAB hmotnostní spektrum (charakteristické ionty):

[M+Na]⁺ 469; [M+H]⁺ 447.

Negativní FAB hmotnostní spektrum (charakteristické ionty):

[M-H]⁺ 445, [M-Na]⁺ 423, m/z 101 (kyselina 2-methyl-máselná-H]”

Příklad 3

V laboratorním fermentačním tanku o pracovním objemu 5 1 se způsobem popsaným v příkladu 1 připravilo MU/4 biokonverzní kultivační medium, složky kultivačního media se přidaly v množství odpovídajícím 5 litrům, ale objem se doplnil pouze do 4,5 litru. Potom se provedla sterilizace po dobu 45 minut při 121 °C a naočkování 500 ml inokulační kultury připravené podle příkladu 1. Fermentace se provedla při 25 °C za míšení rychlostí 300 rpm a provzdušňování 50 litrů/hodinu po dobu 4 dnů. Potom se do kultury přidalo 5 g compactinového substrátu a biokonverze se provedla způsobem podle příkladu 2.

Po dokončení biokonverze se 4,9 litru media, které obsahovalo 660 μg/ml pravastatin, přefiltrovalo a separované mycelium se promylo 2x1 litrem deionizované vody. pH ···· · ·· ··· ·· • · · · ··· · ·· · • · ····· · • ···« · · · · · • · ···· ·· ··· ·· ··· ·· ···· kombinovaného filtrátu o objemu 5,6 litru se upravilo 20% kyselinou sirovou na 3,5-3,7 a potom se kyselý filtrát mísil s 2750 ml ethylacetátu po dobu 30 minut. Potom se fáze separovaly. Vodná fáze se znovu extrahovala 4740 ml ethylacetátu a potom se pH směsi voda-ethylacetát upravilo na

7,5-8,0 pomocí 1 M hydroxidu sodného. Po 20 minutovém míšení se fáze separovaly a ethylacetátový extrakt se extrahoval 2x235 ml deionizované vody způsobem popsaným výše. Kombinovaný slabě alkalický vodný roztok o objemu 280 ml se zahustil na objem 280 ml. Koncentrovaný vodný roztok se vnesl do chromatografické kolony (poměr výška:průměr = 6,5) naplněné Diaion HP-20 (Mitsubishi Co., Japan) neiontovou pryskyřicí. Adsorpce na kolonu byla provedena při průtoku 250-300 ml/hodinu a kolona se potom promyla 84 0 ml deionizované vody. Potom se kolona eluovala v následujícím pořadí 800 ml 5%, 1000 ml 10%, 500 ml 15% a 500 ml 20% acetonu ve vodě. Během eluce se odebíraly 50 ml frakce, které se analyzovaly TLC podle příkladu 2. Frakce obsahující pravastatin jako hlavní složku se smísily a získaný roztok se zahustil ve vakuu na objem 260 ml. Zahuštěný vodný roztok se zpracoval na koloně obsahující 260 ml Diaion HP-20 pryskyřice. Po adsorpci pravastatinu na kolonu se kolona promyla 790 ml deionizované vody, potom se eluovala vodným roztokem acetonu v 260-260 ml podílech se postupně zvyšující se koncentrací acetonu (2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 12,5, 15,0 a 20,0%). Během chromatografie na koloně se odebíraly 25 ml frakce a obsah pravastatinu ve frakcích se analyzoval způsobem popsaným výše. Frakce obsahující pravastatin jako jedinou složku podle TLC se kombinovaly a odpařily se ve vakuu. Potom se 0,3 g aktivního uhlí přidalo do koncentrovaného vodného roztoku (přibližně 30 ml) a pravastatin se pročišťoval při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Potom se aktivní uhlí odstranilo z roztoku filtrací a

filtrát se lyofilizoval. Tímto způsobem se získalo 1,62 g pravastatinu v lyofilizované formě.

Příklad 4

Ze šikmé kultury Mortierella maculata n.sp. E-97 /NCAIM(P)F 001266) kultivované po dobu 10-12 dnů se připravila suspenze spor v 5 ml sterilního 0,9% roztoku chloridu sodného, a tato suspenze se použila pro naočkování 500 ml VHIG inokulačního media, které bylo sterilizováno v 3000 ml Erlenmeyerově baňce.

Složení VHIG media:

Glukosa 30g

Masový extrakt 8g

Kvasinkový extrakt 1g

Tween-80 (polyoxyethylen(20)sorbitan-monooleát)0,5 g v 1000 ml vody.

Před sterilizací se pH media upravilo na 7,0 a potom se provedla sterilizace při 121 °C po dobu 25 minut. Kultura se kultivovala po dobu 3 dnů na rotační třepačce (250 rpm, amplituda 2,5 cm) a potom se získané inokulum kultury použilo pro naočkováni laboratorního fermentačniho tanku obsahujícího

biokonverzní kultivační medium PK v 5 litrovém pracovním obj emu.
Složení PK media:
Glukosa	40 g
Pepton	5 g
Sojová moučka	20 g
K2HPO4	2 g
KH2PO4	1 g
NaNO3	2 g

KC1 v 1000 ml vody.

0,5 h

Před sterilizaci se pH media upravilo na 7,0. Po provedení naočkování, se kultivace, přidání substrátu a biokonverze provedly stejně jako v příkladu 2 a pravastatin se potom izoloval z media, ve kterém byla jeho koncentrace na konci fermentace 650 gg/ml.

Na konci fermentace se pH 4,9 litrů media obsahujícího 650 gg/ml pravastatinu upravilo za míšeni 2M hydroxidem sodným na

9,5-10,0 a potom se pH po jedné hodině míšení upravilo na 3,53,7 pomocí 20% kyseliny sírové. Potom se acidický roztok extrahoval 2,45 litry ethylacetátu. Fáze se separovaly a pomocí odstředění se z emulsifikované organické baze připravil čirý extrakt. Medium se znovu extrahovalo 2x1,22 litry ethylacetátu za použití způsobu uvedeného výše. Ethylacetátové extrakty se kombinovaly a přidalo se 0,4 litru deionizované vody a potom se pH směsi upravilo na 8,0-8,5 1M hydroxidem sodným. Fáze se separovaly a ethylacetátová fáze se extrahovala 2x0,2 1 deionizované vody a pH se upravilo na pH 8,0-8,5 způsobem popsaným výše. pH slabě alkalického roztoku obsahujícího pravastatin se upravilo za míšení pomocí 20% roztoku kyseliny sírové na 3,5-3,7. Získaný kyselý roztok se extrahoval 4x0,2 litry ethylacetátu. Kombinované ethylacetátové extrakty se promyly 2x0,2 litry deionizované vody, potom se do ethylacetátového roztoku přidal 150 mol% dibenzylamin - vypočítaný podle obsahu pravastatin změřeného HPLC. Ethylacetátový roztok se zahustil ve vakuu na objem 0,2 litru. Do získaného koncentrátu se přidal další 20 mol% dibenzylamin a vysrážený roztok se uchovával přes noc při teplotě 0-5 °C. Vysrážená dibenzylaminová sůl pravastatinu se promyla na filtru chladným ethylacetátem a potom dvakrát n···· · ·· · ·· • ·· · » ·· ♦ ♦ ♦ · · • · · ·· ··· ·· hexanem, a nakonec se sušila ve vakuu při teplotě 40-50 °C. Získaný surový produkt (3,9 g) se rozpustil ve 100 ml methanolu při teplotě místnosti a potom se roztok pročistil 0,45 g aktivního uhlí. Potom se methyalkoholový extrakt zahustil ve vakuu. Odpařený zbytek se rozpustil ve 120 ml acetonu při vnější teplotě 62-66 °C a roztok se potom ochladil na teplotu místnosti. Potom rekrystalizace pokračovala přes noc při teplotě 0-5 °C. Vysrážené krystaly se přefiltrovaly a potom se promyly na filtrech dvakrát chladným acetonem a dvakrát n-hexanem. Rekrystalizovaná dibenzylaminová sůl pravastatinu se suspendovala ve směsi 160 ml isobutylacetátu a 80 ml deionizované vody. Potom se do suspenze přidal za míšení v ekvivalentním množství hydroxid sodný. Po vymizení suspenze se fáze separovaly a roztok obsahující pravastatin se promyl 2x30 ml isobutylacetátu. Získaný vodný roztok se pročistil aktivním uhlím. Vodný filtrát se zahustil na objem přibližně 20 ml. Získaný vodný roztok se vnesl do chromatografické kolony (délka:průměr = 22) naplněné 0,4 litry Sephadex LH-20 gelu (dodavatel: Pharmacia, Sweden). Během chromatografie se jako eluens použila deionizovaná voda a odebíraly se 20 ml frakce. Frakce se analyzovaly TLC a frakce obsahující pravastatin také HPLC za použití výše popsaných metod. Frakce obsahující čistý pravastatin se smísily a lyofilizovaly se. Tímto způsobem se získalo 1,75 g pravastatin, jehož čistota byla vyšší než 99,5% podle HPLC.

Příklad 5

Ze šikmé kultury Mortierella maculata n.sp. E-97 /NCAIM(P)F 001266) kultivované po dobu 10-12 dnů se připravila suspenze spor v 5 ml sterilního 0,9% roztoku chloridu sodného, a tato suspenze se použila pro naočkování 500 ml inokulačního media, za použití způsobu popsaného v příkladu 4. V laboratorním ···· · ♦· · ·· • · · · » ·· · · • · · · · · · fermentačním tanku o pracovním objemu 5 litrů se PC/4 biokonverzní kultivační medium sterilizovalo po dobu 45 minut při 121 °C a naočkovalo se inokulační kulturou.

Složeni media PC/4:

Sladový extrakt	5, 0	O. o
Sojová moučka	1,0	%
Pepton	1,0	o. o
Kukuřičný výluh	1,0	o. o
MgSOí x 7 H2O	0,1	%

v 1000 ml vody.

Před sterilizací se pH media upravilo na 7,0. Po provedení naočkování, se kultivace, přidání substrátu a biokonverze provedly stejně jako v příkladu 2 a získalo se 5,1 litrů media s koncentrací 610 gg/ml pravastatinu.

Z media se způsobem podle příkladu 4 získalo 3,7 g surové dibenzylaminové soli pravastatinu, ze které se po rekrystalizaci získalo 2,9 g dibenzylaminové soli pravastatinu. Rekrystalizovaná dibenzylaminové sůl pravastatinu se suspendovala ve 45 ml ethanolu a potom se za míšení přidal 110 mol% hydroxid sodný v 1M ethanolovém roztoku hydroxidu sodného. Roztok se mísil po dobu 1/2 hodiny a potom se přidalo 0,3 g aktivního uhlí a roztok se mísil další 1/2 hodinu. Roztok se přefiltroval a filtrát se zahustil na 15 ml. Ke koncentrátu se při teplotě 56-60 °C přidalo 60 acetonu. Získaný roztok se ochladil na teplotu místnosti a přes noc se uchovával při teplotě +5 °C. Potom se sraženina odfiltrovala, promyla se 2x20 ml acetonu, 2x20 ml ethylacetátu a 2x20 ml nhexanu a nakonec se sušila ve vakuu. Získaných 1,7 g surového pravastatinu se rozpustilo v ethanolu, přečistilo aktivním uhlím a krystalizovalo ze směsi ethanol-ethylacetát. Tímto • · · · způsobem se získalo 1,54 g pravastatinu, který byl identický jako produkt příkladu 2.

Příklad 6

Stejně jako v příkladu 4 se ze šikmé kultury Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266) kultivované po dobu 710 dnů naočkovalo 500 ml inokulačního media MI sterilizovaného ve 3000 ml Erlenmeyerově baňce a provedla se inkubace při 28 °C po dobu 3 dnů na rotační třepačce.

Složení media MI:

Glukosa	40 g
Kasein	5 g
KC1	0,5 g
NaNO3	3 5
KH2PO4	2 g
MgSC>4 x 7 H2O	0,5 g
FeSO4 x 7 H20	0,01 g
v 1000 ml vody.

Před sterilizací se pH media upravilo na 6,0 a sterilizace se provedla při 121 °C po dobu 35 minut. Získaná kultura se naočkovala do 5 litrů biokonverzního media P12 sterilizovaného ve fermentačním tanku.

Složení media P12:

Glukosa g

Sladový extrakt	50 g
Kvasinkový extrakt	5 g
Kukuřičný výluh	5 g
MgSO4 x 7 H2O	1 g
Tween 80	0,5 g

···· * ·· · ·· ·· • ·· · ·«· · · · · • « · » · · · · • ···* ···· · • · · · · · · ♦ · ·· · · · ·· ♦·· · * ···» v 1000 ml vody.

Před sterilizací se pH media upravilo na 7,0 a potom se sterilizace provedla při 121 °C po dobu 45 minut. Fermentace, přidávání substrátu a biokonverze se provedly stejně jako v příkladu 2. Po dokončení biokonverze se pravastatin přítomný v koncentraci 62 gh/ml izoloval následujícím způsobem.

pH 5,15 litrů media obsahujícího 620 gg/ml pravastatinu se upravilo na 9,5 pomocí 2M hydroxidu sodného a směs se mísila při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Medium se přefiltrovalo a mycelium se promylo 1x2 litry a potom 1x0,5 litrem vody. Filtráty se kombinovaly a pH vodného roztoku se upravilo na 3,7 pomocí 20% kyseliny sírové a směs se extrahovala 2,5 litry a potom 1,5 litrem ethylacetátú. Ethylacetátové extrakty se kombinovaly, promyly se 2x0,5 litry vody a přidalo se 1,95 g dicyklohexylaminu. Ethylacetátový extrakt se zahustil při 40 °C na 200 ml za rdukovaného tlaku a do koncentrátu se znovu přidalo 0,195 g dicyklohexylaminu a směs se mísila při 15 °C po dobu 6 hodin. Vysrážený krystalický materiál se přefiltroval, promyl se 20 ml a 15 ml ethylacetátú a sušil se při 40 °C. Tímto způsobem se získalo 3,51 g surového produktu. Po rekrystalizaci surového produktu ve směsi acetonethanol se získalo 3,05 g dicyklohexylaminové soli pravastatinu (teplota tání 162-168 °C), která se přeměnila na pravastatin způsobem podle příkladu 5.

Příklad 7

Fermentace, přidávání substrátu a biokonverze se provedly s kmenem Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266) způsobem popsaným v příkladu 2. Pravastatin získaný biokonverzí se izoloval z media následujícím způsobem.

litrů kultivačního media obsahujícího 650 pg/ml pravastatinu se přefiltrovalo přes filtrační tkaninu, mycelium plísně se smísilo se 2 litry 0,1 M hydroxidu sodného na dobu 1 hodiny a potom se směs přefiltrovala. Dva filtráty se smísily a pH směsi se upravilo na 3,5-4,0 15% kyselinou sírovou. Potom se roztok extrahoval 2x1,8 1 ethylacetátu. Kombinované ethylacetátové fáze se promyly 800 ml vody. Přidalo se 400 ml deionizované vody a pH směsi se upravilo na 8,0-8,5 pomoci 1M hydroxidu sodného. Směs se mísila po dobu 15 minut a potom se fáze separovaly. 300 ml vody se přidalo k ethylacetátové fázi a pH se upravilo na 8,0-8,5. Po míšení po dobu 15 minut se fáze separovaly. Do ethylacetátové fáze se znovu přidalo 300 ml vody a pH se upravilo na 8,0-9,5. Směs se potom mísila po dobu 15 minut. Dvě fáze se znovu separovaly. Všechny vodné fáze se kombinovaly a pH.se upravilo na 3,5-4,0 15% kyselinou sírovou a potom se provedla extrakce 3x300 ml ethylacetátu. Kombinované ethylacetátové extrakty se promyly 150 ml vody, sušily se pomocí bezvodého síranu sodného a přefiltrovaly se. Potom se 150 mol% dioktylaminu - vzhledem k obsahu pravastatinu - přidalo do ethylacetátového extraktu, ethylacetát se odpařil na přibližně 1/10 objemu a do vysrážení se přidával aceton. Směs se ponechala při teplotě 5 °C přes noc. Sraženina se odfiltrovala na G-4 filtru, promyla se 20 ml acetonu a potom 20 ml n-hexanu a sušila se ve vakuu při teplotě místnosti. 3,3 g získané surové dioktylaminové soli pravastatinu se rekrystalizovalo z 20 ml acetonu, což vedlo k zisku 2,7 g čisté dioktylaminové soli pravastatinu. Teplota tání - 143-146 °C. Dioktylaminové sůl pravastatinu se přeměnila na pravastatin způsobem popsaným v příkladu 5.

···· · ♦· · ·· ·· • «· · ♦ · · · · · · • « · · · · · ·

Příklad 8

Mutantní kmen Mortierella maculata n.sp. E-97/15/13 (NCAIM(P)F 001267) byl připraven indukcí hydroxylační schopnosti Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266), která je schopna 6P-hydroxylace compactinu, pomocí pokusů mutace-selekce a indukce enzymu.

Námi izolovaný kmen Mortierella maculata n.sp. E-97 (NCAIM(P)F 001266) byl kultivován na MS šikmém agaru při 28 °C po dobu 7 dnů.

Složení agarového media MS:

Glukosa 4 g

Sladový extrakt 10 g Kvasinkový extrakt 4 ,g Agar 20 g v 1000 ml destilované vody.

Spory se vymyly ze šikmých kultur 5 ml 0,9% roztoku chloridu sodného a po přenesení suspenze spor do sterilní Petriho misky se spory ozařovaly ultrafialovým světlem po dobu 1 minuty. Potom se do suspenze spor přidal N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin v konečné koncentraci 2000 gg/ml. Potom se suspenze přenesla do 100 ml Erlenmeyerovi baňky a třepala se při teplotě 28 °C rychlostí 150 rpm po dobu 20 minut. Potom se spory sedimentovaly odstředěním rychlostí 4000 rpm po dobu 10 minut a suspendovaly se ve sterilním 0,9% roztoku chloridu sodného. Suspenze se naočkovala na agarovou plotnu MU-VB obsahující 10gg/ml benomylu a 1% defibrinované krve.

·· · · ·· · ·· ·· ·♦«· · ♦ · · • · 4 · · ·

Složení agarového media MU-VB:

Glukosa 40 g

Asparagin 2 g Pepton 2,5 g Dihydrogenfosforečnan draselný 0,5 g Agar 20 g v 990 ml destilované vody; po sterilizaci se medium doplnilo 10 ml hovězí krve a 10 mg benomylu.

Agarové plotny se inkubovaly při 28 °C po dobu 7 dnů a potom se narostlé kolonie náhodně vybrané přenesly do testovacích zkumavek obsahujících agarové medium PS.

Složení agarového media PS:

Glukosa g

Mykologický pepton 10 g

Agar g

v 1000 ml destilované vody.

Před sterilizací se pH media

Sterilizace se provedla při 121 upravilo na 5,6-5,7. °C po dobu 20 minut.

Šikmé kultury se inkubovaly při 28 °C po dobu 12 dnů a jejich produkce pravastatinu se testovala postupem uvedeným v příkladu 1. Mutantní kmen Mortierella maculata n.sp. E97/15/13 byl selektován tímto způsobem a dosahoval 60% konverze sodné soli kyseliny compactinové v koncentraci 1000 pg/ml na pravastatin.

Hydroxylasa kmene Mortierella maculata n.sp. E-97/15/13 byla indukována kultivací na MU-VB agaru obsahujícím 100 pg/ml 8-de-(2-methyl-butyryl)compactin a/nebo compactin. Náhodně • · · · vybrané kolonie se přenesly do induktoru obsahujícího Μϋ-VB šikmá media. Produkce pravastatinu v kulturách byla testována způsobem popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem, že přidávání compactinového substrátu v množství 500 μg/ml se provádělo od 4 dne fermentace po dobu dalších 11 dnů a compactin sodný se přidával postupně v průběhu dvanácti dnů, když byl zcela přeměněn na pravastatin. Na konci biokonverze provedené v 50 kulturách se z 30 g compactinu sodného získalo 18,5 g pravastatinu, jak bylo měřeno HPLC. Získání pravastatinu z kombinovaných fermentačních medií bylo provedeno následujícím způsobem.

Po dokončení fermentace se pH 5,5 litrů media obsahujícího pravastatin v koncentraci 3360 μg/ml upravilo na 3,5-3,7 pomocí 20% roztoku kyseliny sírové. Potom se kyselý roztok extrahoval 2,75 litry ethylacetátu. Fáze se separovaly a čirý extrakt se připravil odstředěním emulsifikované organické fáze. Medium se extrahovalo ještě dvakrát 1,37 litry ethylacetátu, jak bylo popsáno výše. Kombinované ethylacetátové extrakty se promyly 2 x 1,15 litry deionizované vody, a potom se do ethylacetátového roztoku přidal 150 mol% dibenzylamin - vypočítaný podle obsahu pravastatin změřeného HPLC. Ethylacetátový roztok se zahustil ve vakuu na objem 0,23 litru. Do získaného koncentrátu se přidal další 20 mol% dibenzylamin a vysrážený roztok se uchovával přes noc při teplotě 0-5 °C. Vysrážená dibenzylaminová sůl pravastatinu se přefiltrovala a potom se sraženina promyla suspendováním v chladném ethylacetátu a potom dvakrát v n-hexanu, a nakonec se sušila ve vakuu při teplotě 40-50 °C. Získaný surový produkt (22,4 g) se rozpustil v 0,67 litru acetonu při teplotě 62-66 °C a potom se roztok pročistil 2,2 g aktivního uhlí. Po pročištění se acetonový filtrát zahustil ve vakuu na objem 0,56 litru. Krystaly vysrážené z koncentrátu se znovu rozpustily při teplotě ···· · ♦· · ·♦ • · 4 · ♦ « · 9 9 9 • t «·· » « · • · * · · · 4 · · · · · · > · · uvedené výše a roztok se ochladil na teplotu místnosti. Potom rekrystalizace pokračovala přes noc při teplotě 0-5 °C. Vysrážené krystaly se přefiltrovaly a potom se promyly dvakrát chladným acetonem a dvakrát n-hexanem.

Rekrystalizované dibenzylaminová sůl pravastatinu se sušila ve vakuu při teplotě 40-50 °C. Získaná dibenzylaminová sůl pravastatinu (14,8 g) se rozpustila při teplotě 40-44 °C v 740 ml směsi ethylacetát-ethanol (9:1) a potom se do roztoku přidalo 110 mol% hydroxidu sodného za zisku 1M ethanolového roztoku. Míšení získaného vysráženého roztoku pokračovalo po dobu 1,5 hodiny při teplotě místnosti a potom se srážení dokončilo chlazením ledem po dobu 1-1,5 hodiny. Potom se sraženina odfiltrovala a promyla se dvakrát 150 ml chladného ethylacetátu a 2x150 ml n-hexanu a nakonec se sušila ve vakuu při teplotě 40-50 °C. Získaný pravastatin se rozpustil v ethanolu, pročistil se 1,0 g aktivního uhlí a potom se rekrystalizoval ze směsi ethanol-ethylacetát. Tímto způsobem se získalo 9,4 g pravastatin s fyzikálními konstantami odpovídajícími hodnotám uvedeným v příkladu 2.

Je třeba si uvědomit, že ačkoliv byla popsána některá výhodná provedení, zahrnuje vynález také variace a modifikace popsaných provedeni. Rozsah vynálezu je tedy omezen pouze připojenými patentovými nároky.

Claims (35)

1. Mikrobiální způsob přípravy sloučeniny vzorce (I) ze substrátu vzorce (II) kde R znamená alkalický kov nebo ammoniový iont; vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

(a) kultivaci filamentosní plísně kmene Mortierella maculata schopné ββ-hydroxylace sloučeniny vzorce (II) v živném mediu obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku a anorganické soli;

(b) přidávání substrátu, který má být transformován, do kultury Mortierella maculata;

(c) fermentováni substrátu do konce biokonverze;

···· · ·· · ·· *· ··· · · ·· · « · « • · · · · · · · • · · · 9 · · • · * ·· ··· · · ·· · » (d) separování sloučeniny vzorce (I) z kultivačního media; a (e) izolaci sloučeniny vzorce (I).

2. Způsob podle nároku 1 v y z nač u j i c i se tím, že mediem je živné medium. 3. Způsob podle nároku 2 v y z nač u j i c i se tím, že

stupeň separování sloučeniny vzorce (I) z kultivačního media je proveden adsorpcí na aniontovou iontoměničovou pryskyřici.

4. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že stupeň separování sloučeniny vzorce (I) z kultivačního media je proveden extrakcí organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou, po které následuje příprava jejího laktonového derivátu nebo soli sekundárního aminu jako meziproduktu.

5. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že stupeň separování sloučeniny vzorce (I) z kultivačního media je proveden přečištěním alkalického vodného extraktu získaného z extrakce fermentačního media organickým rozpouštědlem pomocí chromatografie na neiontové adsorpční pryskyřici.

6. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že kmen Mortierella maculata je Mortierella maculata n. sp. E-97 kmen uložený v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, pod přírůstkovým č. NCAIM(P)F 001266.

7. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že kmen Mortierella maculata je Mortierella maculata n. sp. E97/15/13, uložený v National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, pod přírůstkovým č. NCAIM(P)F 001267.

·44· ·· 44» 44

4 44 4« 444444 • · 4 4 · 444 * 4444 · 4 4 4·

4« 44444« ♦· ··· 44 ·44 44 4444

8. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že enzym hydroxylasa kmene použitého pro transformaci je indukován 8-de-(2-methyl-butyryl)compactinenem nebo compactinenm.

9. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že sloučenina vzorce (II) je jako substrát přidávána do kultury současně s přidáváním živin, a tím, že přidávání živin závisí na pH kultury a je v množství 0,5-0,1% vzhledem k objemu media.

10. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že stupeň fermentace je proveden na mediu obsahujícím zdroj uhlíku vybraný ze skupiny zahrnující glukosu, fruktosu a glycerin.

11. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že stupeň fermentace je proveden na mediu obsahujícím zdroj dusíku vybraný ze skupiny zahrnující sojovou moučku, pepton, kasein, kvasinkový extrakt a masový extrakt.

12. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím, že sloučenina vzorce (I) tvořená během biokonverze je separována z kultivačního media adsorpcí z filtrátu media a z vodného výplachu mycelia na aniontové iontoměničové pryskyřici, elucí sloučeniny vzorce (I) z pryskyřice, transformací sloučeniny vzorce (I) zcela na laktonovou formu, izolováním laktonového derivátu, hydrolyzováním laktonového derivátu hydroxidem sodným a odsolením sloučeniny vzorce (I) na neiontové adsorpční pryskyřici.

13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že aniontová iontoměničová pryskyřice obsahující polystyrendivinylbenzenový polymer obsahující kvarterní ammoniové aktivní skupiny je použita pro separaci sloučeniny vzorce (I) z filtrátu media.

14. Způsob podle nároku 4vyznačující se tím, že sloučenina vzorce (I) tvořená během biokonverze se extrahuje ve formě kyseliny z media, kde medium bylo okyseleno na pH 3,5-3,7, nebo z filtrátu media, organickým rozpouštědlem němísitelným s vodou.

15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedeným organickým rozpouštědlem němísitelným s vodou je ethylacetát.

16. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedeným organickým rozpouštědlem němísitelným s vodou je isobutylacetát.

17. Způsob podle nároku 5vyznačující se tím, že uvedené sloučenina vzorce (I) je extrahována ve formě sodné soli z organického rozpouštědla vodným roztokem hydroxidu sodného a je přečištěna na neiontové adsorpční pryskyřici.

18. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že sloučenina vzorce (I) je vysrážena z extraktu v krystalické formě pomocí sekundárního aminu obsahujícího alkylové, cykloalkylové, aralkylové nebo arylové substituenty.

19. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že krystalická sůl se sekundárním aminem se suspenduje ve směsi Ci-4alkyl esteru kyseliny octové a vody; do suspenze se ···· · ♦· · φφ ·* • φφ · · ·· · ·· « • · · · · φ φ φ • · ♦ · φ φ · « t * φφφ ♦ φ φ φ φ φ ·· ··« ·4 999 99 ΦΦΦΦ přidá ekvivalentní množství hydroxidu sodného ve vodném roztoku tak, že se vytvoří organická fáze a vodná fáze; organická a vodná fáze se separuji; vodná fáze se promyje isobutylacetátem a potom se pročistí aktivním uhlíkem; a vodný roztok se lyofilizuje.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedeným alkylesterem je isobutylester.

21. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že krystalická sůl se sekundárním aminem se suspenduje v alkoholu obsahujícím 1-4 atomy uhlíku; ze suspenze se přidáním ethanolového roztoku hydroxidu sodného připraví roztok sloučeniny vzorce (I); a sloučenina vzorce (I) se vysráží z roztoku acetonem.

22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že uvedeným alkoholem obsahujícím 1-4 atomy uhlíku je ethanol.

23. Způsob podle nároku 18 vyznačující se tím, že uvedená krystalická sůl sekundárního aminu se rozpustí ve směsi Ci-4alkylesteru alkankarboxylové kyseliny obsahující 1-4 atomy uhlíku a alkoholu obsahujícího 1-4 atomy uhlíku; a z roztoku se sloučenina vzorce (I) vysráží v krystalické formě přidáním hydroxidu sodného.

24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedenou směsí je směs ethylacetát-ethanol.

25. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že pravastatin je izolován z fermentačního media prostřednictvím dibenzylaminové soli sloučeniny vzorce (I) ve formě kyseliny.

26. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že kyselinový derivát sloučeniny vzorce (I) je přečištěn přes dicyklohexylaminovou sůl.

27. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že kyselinový derivát sloučeniny vzorce (I) je přečištěn přes dioktylaminovou sůl.

28. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že sloučenina vzorce (I) je přečištěna na alespoň 99,5%, jak je měřeno HPLC za použití gelové chromatografie.

29. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že uvedený kmen Mortierella maculata je kultivován při teplotě přibližně 25 °C až přibližně 30 °C.

30. Biologicky čistá kultura kmene Mortierella maculata n. sp. E-97 uloženého v National Coliection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, pod přírůstkovým č. NCAIM(P)F 001266.

31. Biologicky čistá kultura kmene Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 uloženého v National Coliection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, pod přírůstkovým č. NCAIM(P)F 001267.

32. Mortierellová kultura schopná δβ-hydroxylace sloučeniny vzorce (II) • · · kde R znamená alkalický kov nebo ammoniový iont, která se skládá v podstatě z nového kmene Mortierella maculata n. sp. E-97 uloženého v National Collection of Agricuitural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, pod přírůstkovým č. NCAIM(P)F 001266.

33. Mortierellová kultura schopná 6P~hydroxylace sloučeniny vzorce (II) kde R znamená alkalický kov nebo ammoniový iont, která se skládá v podstatě z nového kmene Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 uloženého v National Collection of Agricuitural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungary, pod přírůstkovým č. NCAIM(P)F 001267.

34. Sodná sůl pravastatinu v krystalické formě.

35. Sodná sůl pravastatinu podle nároku 34, jejíž tavná teplota se pohybuje v rozmezí přibližně od 170 °C do 173 °C.

36. Způsob přípravy sodné soli pravastatinu v krystalické formě, vyznačený tím, že zahrnuje:

a) předložení roztoku obsahujícího pravastatin a sodných kationů v nižším alifatickém alkoholu;

b) přidání ethylacetátu do uvedeného roztoku;

c) krystalizace sodné soli pravastatinu z uvedeného roztoku.

37. Způsob podle nároku 36, vyznačený tím, že nižším alifatickým alkoholem je ethanol.