KR100648541B1 - 프라바스타틴을 제조하기 위한 미생물학적인 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식(2)의 화합물(R은 알칼리금속 또는 암모늄염을 나타냄)로부터 화학식(1)의 화합물을 제조하는 신규한 미생물학적인 방법에 관한 것으로서, 화학식(2)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는 곰팡이 균주의 수중 배양 및 새체 전환 과정에서 형성된 화학식(1)의 생성물을 분리하고 정제함으로써 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 화학식(2)의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는 모티에렐라 마큘라타 섬유상 곰팡이 종의 균주를 동화가능한 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기염을 함유하는 영양 배지에서 배양하는 단계, 발효 브로스로부터 형성된 생성물을 분리하는 단계 및 화학식 (1)의 화합물을 분리하고 이를 정제하는 단계를 포함한다. 모티에렐라 마큘라타 의 신규한 균주 또한 개시되어 있다.

화학식(1) 화학식(2)

Description

프라바스타틴을 제조하기 위한 미생물학적인 방법{MICROBIAL PROCESS FOR PREPARING PRAVASTATIN}

본 발명은 프라바스타틴 제조 방법에 관한 것이며, 특히 공업적 규모로 프라바스타틴을 제조하기 위한 미생물학적인 방법에 대한 것이다.

죽상동맥경화증 및 특히 관상동맥폐색증의 가장 위험한 원인은 플라즈마의 높은 콜레스테롤 농도이다. 최근 20년간 콜레스테롤 생합성 속도 제한에 중요한 효소로서 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A 리덕타제(EC.1.1.1.34)가 집중적으로 연구되어 왔다. 프라바스타틴(화학식 1) 및 기타의 관련 화합물(콤팍틴, 메비놀린, 심바스타틴)은 HMG-CoA 리덕타제 효소의 경쟁적 억제제이다[A.Endo 등, J.Antibiot.29,1346-1348(1976); A.Enco 등, FEBS Lett.72,323-326(1976); C.H.Kuo 등, J.Org.Chem.48,1991(1983)].

화학식(1)

프라바스타틴은 콤팍틴 대사의 연구 과정에서 개의 소변으로부터 M.Tanaka 등에 의해 최초로 분리(결과 비공개)되었다(Arai,M.등, Sankyo Keneyusyo Nenpo 40,1-38,1988). 최근에 프라바스타틴은 치료시에 가장 유리한 작용 메카니즘을 갖는 콜레스테롤 저하제이다. 이 제제의 가장 중요한 특성은 조직 선택성인데, 즉 콜레스테롤 형성의 주요 부위 2곳(예컨대, 간 및 소장)에서 콜레스테롤 합성을 억제하며, 기타의 기관에서는 세포간 효소 억제 효과가 거의 검출되지 않는다. 동시에 메비놀린 및 심바스타틴의 콜레스테롤 생합성 억제 효과는 대부분의 기관에서 현저하다(T.Koga 등,Biochim. Biophys.Acta,1045,115-120,1990)

프라바스타틴은 보다 친유성인 메비놀린 및 심바스타틴과 화학적 구조가 거의 다르다. 메비놀린 및 심바스타틴의 경우에는, 헥사히드로나프탈렌 골격의 C-1 탄소 원자에 연결되어 있는 치환체가 6-원 락톤 고리로 종결되는 반면에, 프라바스타틴의 경우에는 락톤고리 대신에 생물학적으로 활성이며 개방되어 있는 디히드록시산 나트륨 염 형태로 존재한다. 또 다른 중요한 구조적 차이로서, 프라바스타틴에서는 헥사히드로나프탈렌 고리의 C-6 위치에서 메비놀린 및 심바스타틴의 메틸기 대신에 히드록시기가 발견될 수 있으므로 결과적으로 친수성 특성이 보다 증가한다.

상기 구조적 차이의 결과로서 프라바스타틴은 작은 정도로만 말초 세포의 친수성 막을 통해 통과할 수 있다(A.T.M., Serajuddin 등, J.Pharm.Sci.80,830-834,1991).

프라바스타틴의 공업적인 생산은 2개의 발효 공정에 의해 수행될 수 있다. 첫째, 미생물 단계의 콤팍틴을 제조한 후, 2번째 발효 공정에서 기질로서 콤팍틴산 나트륨염이 6β-위치에서 미생물학적 히드록실화에 의해 프라바스타틴으로 전환된다.

이미 공개된 특허에 따르면, 콤팍틴의 미생물 히드록실화는 다양한 속에 속하는 곰팡이종들, 노카르디아(Nocardia) 속에 속하는 섬유상 세균, 악티노마두라(Actinomadura) 및 스트렙토마이시스(Streptomyces) 속으로 다양한 범위에서 수행될 수 있다(벨기에 특허 출원 제895090호, 일본 특허 출원 제5,810,572호, 미국 특허 제4,537,859호 및 미국 특허 제4,346,227호 및 유럽 특허공개공보 제0605230호). 콤팍틴 기질의 생체전환(bioconversion)은 무코 히에말리스(Mucor hiemalis), 신세팔라스트럼 니그리칸스(Syncephalastrum nigricans), 컨닝하멜라 에키눌라타(Cunninghamella echinulata) 와 같은 섬유상 곰팡이를 이용하여 500 ㎍/㎖의 농도로 및 원핵생물에 속하는 노카르디아(Nocardia), 악티노마두라(Actinomadura) 및 스트렙토마이시스(Streptomyces) 균주 2000∼4000 ㎍/㎖의 농도로 개시되었다.

섬유상 곰팡이로 프라바스타틴을 제조하는 경우에 겪는 일반적인 문제점은 콤팍틴의 항진균성 효과 때문에 미생물이 비록 낮은 농도에서라도 배양물에 공급되는 콤팍틴 기질을 견뎌낼 수 없다는 데 있다(Serizawa 등, J.antibiotics,36,887∼891,1983). 이러한 기질의 세포 독성 또한 스트렙토마이시스 카르보필러스 (Streptomyces carbophilus) 의 히드록실화에서 관찰되며, 이것은 일본 연구원들에 의해 광범위하게 연구되었다(M.Hosobuchi 등, Biotechnology and Bioengineering, 42,815-820,1993).

일본 저자는 스트렙토마이시스 카르보필러스 균주의 히드록실화 능력을 재조합 DNA 기술로 개선시키려고 노력하였다. 시토크롬 P-450 모노옥시게나제계가 콤팍틴의 히드록실화에 필요하다(Matsuoka 등, Eur.J.Biochem.184,707-713,1989). 그러나 상기 저자들에 따르면, 세균성 시토크롬 P-450 모노옥시게나제계에서 하나가 아니라 수개의 단백질들이 전자 이동에 관여하고, 이것은 DNA 기술의 이용을 가중시킨다. 프라바스타틴 제조를 위한 비용을 절감하기 위한 미생물학적인 히드록실화의 개발은 매우 어렵고 복잡한 업무이다.

본 발명의 목적은 콤팍틴으로부터 프라바스타틴을 공업적 규모로 제조하는 신규한 미생물 공정을 고안하는 것이며, 이것은 종래 공지된 기술에 비해 보다 유리한 조건에서 프라바스타틴을 제조하는 것이다. 본 출원인은 작업중에, 콤팍틴을 고농도의 프라바스타틴으로 미생물 형질전환하는데 적용할 수 있는 히드록실라제 효소를 가진 미생물 균주를 발견하기 위해 노력하였다.

발명의 개요

본 발명은 화학식 (2)의 기질 화합물로부터 화학식 (1)의 화합물을 제조하는 미생물학적인 방법으로서 (a) 동화가능한 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기염을 함유하는 영양 배지에서 화학식(2)의 화합물을 6β-히드록실화시킬 수 있는 모티에렐라 마큘라타(Mortierella maculata) 섬유상 곰팡이 종의 균주를 배양하는 단계, (b) 상기 기질을 공급하여 모티에렐라 마큘라타 의 향상된 배양물로 형질전환시키 는 단계, (c) 상기 기질을 생체전환 마지막까지 발효시키는 단계, (d) 화학식 (1)의 화합물을 배양 브로스(culture broth)로부터 분리하는 단계, 및 (e) 화학식 (1)의 화합물을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

화학식 (1)

화학식(2)

이때, R은 알칼리 금속 또는 암모늄 이온이다.

또한 본 발명은 생물학적으로 순수한 배양물로서 헝가리 부다페스트, 농업 및 공업용 미생물 국립 수집소에 수탁번호 NCAIM(P)F 001266으로 기탁된 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97 균주 및 이의 돌연변이의 생물학적으로 순수한 배양물로서 헝가리 부다페스트, 농업 및 공업용 미생물 국립 수집소에 수탁번호 NCAIM(P)F 001267로 기탁된 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97/15/13 균주에 관한 것이다.

발명의 상세한 설명

약 5500개의 원핵 균주 및 진핵 균주를 총괄하는 본 출원인의 분류 프로그램에서, 23개의 미생물을 선택하였는데, 이것은 반대로 콤팍틴을 히드록실화할 수 있는 것들이다. 이들 균주들 중에서 섬유상 곰팡이가 공개된 특허로부터 공지된 균주와 비교하여 콤팍틴에 대한 보다 높은 내성으로 인해 프라바스타틴의 생성에 보다 적합하다는 것을 증명하였다. 분류학적인 연구에 따르면, 이들 균주는 모티에렐라 속(모티에렐라 마큘라타 n.sp.)에 속하는 종들의 신규한 표본들로 증명되었다. 선택된 곰팡로부터 신규한 균주를 한편으로는 돌연변이-선택 방법을 적용함으로써 분리하고, 다른 한 편으로는 균주의 히드록실라제 효소를 유도하여 분리하는데, 이들 중 어느것도 지금까지 공지된 것보다 고농도로 콤팍틴 기질을 프라바스타틴으로 히드록실화시킬 수 있었다. 변이인자로서, 물리적 및 화학적 변이원을 사용하였다(UV 방사선, 메틸메탄 술포네이트, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘). 변이원으로 처리한 후에, 1배체 세포를 제조하기 위하여, 포자 현탁액을 베노밀-함유 한천 플레이트상에 분산시켜 놓고, 히드록실라제 효소를 유도하기 위해 성장된 콜로니를 100 ㎍/㎖의 8-데-(2-메틸-부티릴)-콤팍틴-함유 한천 플레이트 또는 콤팍틴-함유 한천 플레이트상에 주입하였다. 이들 방법을 실시함으로써, 모균주에 비해 현저히 높은 정도로 콤팍틴으로부터 프라바스타틴으로 전환시킬 수 있는 신규한 균주로부터 돌연변이 균주를 제조하였다.

최적화 실험의 과정에서, 본 출원인은 가장 유익한 주입 조성물 및 콤팍틴 히드록실화를 위한 가장 유리한 생체전환 배지 뿐 아니라, 고농도의 콤팍틴을 반복적으로 제공하기위한 최적 방법을 연구하였다.

결론적으로, 본 발명은 농업 및 공업용 미생물 국립 수집소(Department of Microbiology and Biotechnology, University of Horticulture and the Food Industry Budapest)에 기탁번호 NCAIM(P)F 001266 및 기탁번호 NCAIM(P)F 001267로 각각 기탁된 모티에렐라 마큘라타 라는 분리된 곰팡이의 E-97 및 E-97/15/13로 명명된 균주가 적절한 발효 조건하에서 고농도로 프라바스타틴을 생성할 수 있는 반면, 6α-히드록시-콤팍틴, 2α-히드록시-콤팍틴, 8-데-(2-메틸-부티릴)-콤팍틴, 3α, 5β-디히드록시-5,6-디히드로-이소콤팍틴, 8α,β-히드록시-콤팍틴 및 콤팍틴의 2-메틸-부티릴 측쇄의 2 및 3 위치에서 히드록실화된 유도체의 산 형태와 같이 바람직하지 못한 관련 화합물은 생체전환 과정에서 소량 또는 극소량만 형성되었다. 따라서, 이들 균주는 공업적 규모로 프라바스타틴을 제조하는 데에 특히 적절하다.

공업적 규모로 활성 인자를 경제적으로 제조하는 것이 콤팍틴 기질의 농도 함수라는 점을 고려한다면, 고농도의 콤팍틴 및 프라바스타틴 농도를 견뎌낼 수 있는 균주를 갖는 것이 중요하다. 결론적으로, 본 발명의 보다 중요한 부분은 종래의 곰팡이 분리물의 히드록실화 능력이 돌연변이 선택법 및 효소 유도법을 실시함으로써 개선된다는 것, 및 기질을 공급하기 위한 적절한 방법을 개발함으로써 다량의 콤팍틴을 프라바스타틴으로 히드록실화시키는 것이 단일한 단계로 가능하다는 점을 인식하는 것이다. 결론적으로, 모티에렐라 마큘라타 n.sp.E-97/15/13으로 명명된 신규한 돌연변이 균주는 프라바스타틴의 제조에 특히 적합하다.

공지된 모티에렐라 스페시스 의 가장 중요한 특징적인 점들과 비교한 분리된 신규한 곰팡이 종들의 분류학적인 특징들을 하기에 수록하였다.

홀로타입 균주 모티에렐라 마큘라타 nov.spec.E-97의 분류학적인 설명

녹말-카제인-맥아 추출물-한천 배지에서 기균사를 성장시켰다(10 ㎛ 이상 두께의 층을 기질 균사위에 덮는다). 초기에는 치밀하게 짜여진 백색 균사웨브로 보이는데, 여기에 나중에 수 mm 직경의 황색의 홀씨형성 점들이 드문드문 나타난다(전술한 새로운 이름 "마큘라터스": 얼룩짐). 이러한 황색 착색은 기균사 웨브의 보다 넓은 연속적인 표면들을 점한다. 기질 균사의 색은 자팩(Czapek)-, 블러디 자팩(bloody-Czapek)-, 티로신-, 녹말-카제인-, 맥아 추출물 등의 한천 배지상에서 거의 무색이거나 연황색이다. 기질 균사 웨브의 색은 효모 추출물-글루코스-펩톤 배지에서 연홍색이다. 전술한 배지에서 분산가능하고 용해가능한 안료는 제조된 적이 없거나 또는 다만 아주 드물게 미미한 황색으로 이들 배지상에 착색이 일어난다. E-97 균주의 콜로니는 다수의 다른 모티에렐라 종과 유사하게 휘발성 오일을 제조하므로 (이사벨리나 절편의 종들은 제외) 매우 특징적인 강한 냄새를 발산시킬 수 있다.

포자낭자루(도1의 1∼7번)는 기균사상에 국부적으로 서로 매우 상이한 위치에서 매우 많은 수로 자주 나타난다(그러나 기질 균사상에서는 보다 적다). 그들은 분지쇄가 없고 다만 거의 직선형이거나 구부러져 있다. 그들의 길이는 통상 60∼80 ㎛ 사이이다. 압도적인 다수의 경우에서 개시점은 다소 짧긴하지만 심하게 부푼 기중 웨브의 균사 절편이고, 이로부터 그들은 격벽으로 분리된다. 포자낭자루 그 자체도 부풀 수 있으나(때로는 심하게)(6번에 도시), 포자낭 방향에서 5.0∼9.0 ㎛ 내지 1.0∼2.0 ㎛로 점차 좁아진다. 포자낭자루밑에서 그들이 결코 더 넓어지지 않는다는 것은 중요한 분류학적 특성이다(8번 참조).

포자낭들은 구형이고; 일부 경우에는 살짝 눌린 구형이다. 직경은 약 6.0 ∼17.0 ㎛이고, 다른 모티에렐라 종들의 포자낭 측정값에 비해 상대적으로 작다. 포자낭은 다수의 포자를 포함할 수 있으나, 단지 하나의 포자만을 포함하는 포자낭도 존재한다. 포자낭 (9)는 원통형이거나 조금은 타원형에 가깝다. 그 크기는 3.0-5.0 x 1.5-2.0 ㎛ 이다. 개별적인 포자내에서 하나 또는 두개의 작고 짙은 구형의 오일 방울(10)이 존재할 수 있다. 포자낭 격벽의 매우 느슨한 붕괴때문에, 습윤성 주변 상태에서 포자는 재빨리 흩어질 것이다. 포자낭의 붕괴이후, 포자낭자루의 말단에서 때로는 미세한 쇠스랑에 유사한 "칼라(collar)" 및 매우 짧은 초기(통상적이지 않음) 중축을 관찰할 수 있다. 구형 또는 원통형의 무성아(15-28)는 상이한 대부분의 특징적인 배지상에서 발생될 수 있다. 통상 그 크기는 10∼25 ㎛이다. 배양물에서, 연쇄적인 구형 무성아(13), 발육기의 세포, 삽입된 무성아(15-23), 다른 균사 주위에 한 균사가 특정 나사선으로 성장하는 것과 관련된 균사(11), 문합(anastomotic)-유사한 구조 및 거대세포 등도 발견될 수 있다. 또한 기균사에서 거대하고(50-250 pm 직경) 매우 밀집된 균사 웨브(14)가 나타나지만 검출가능한 접합자는 존재하지 않았다.

E-97 균주의 배양물은 질산염을 아질산염으로 환원시킬 수 있으며, 녹말, 에스쿨린, 아르기닌 또는 젤라틴을 가수분해시키지 않지만 트윈 폴리소르베이트를 가수분해시키고 파라핀 하이드로카본을 분해하지 않는다. 우라아제 활성을 갖는 E-97 균주의 배양물은 pH 7.0 내지 pH 9.0 사이에서 양호한 성장을 나타내며, 최대 2 % NaCl을 견딘다. 크산틴, 히포크산틴, 레시틴, 티로신 및 아데닌의 효과는 나타나지 않는다. 상기 배양물의 강산성 제조물은 글루코스, 프럭토스, 글리세린 및 갈락토스로부터는 검출될 수 있었지만 크실로스, 아라비노스, 라피노스, 소르비톨, 이노시톨, 이눌린 등으로부터의 제조물은 매우 약하거나 거의 발생되지 않았다. 피루베이트 및 아세테이트에서 약한 성장이 관찰되었으나, 벤조에이트, 살리실레이트, 시트레이트, 락테이트, 숙시네이트, 타르타레이트 및 말로네이트에서는 성장이 발견되지 않았다. 배지에서 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스 및 프럭토스가 양호하게 성장되는 것이 관찰되었다. 크실로스, 아라비노스, 람노스, 수크로스, 라피노스, 만니톨 및 이노시톨로 유용성 실험을 한 결과는 좋지 않은 것으로 증명되었다. 상기 배양물은 셀룰로스를 분해하지 않는다.

계통적인 위치: E-97 균주는 모티에렐라세아 과에 속하고 모티에렐라속의 일반 구성원이며: 포자낭은 통상 다수의 포자를 포함하고, 중축은 극도로 축소되었고, 무성아가 자주 나타나며, 접합자의 발생이 검출되고, 콜로니는 매우 특징적인 강한 냄새를 발산한다. 모티에렐라 속에서, E-97 균주는 "절편 알피나"의 전형적인 형태이다. 후자는 매우 짧은 비-분지형의 포자낭자루(최대길이 20 ㎛) 및 미세한 포자낭을 특징으로 한다(Zycha,H.und Siepmann,R,Mucorales, Eine Beschreibung aller Gattungen und Arten Dieser Pilzgruppe. D-3301 Lehre, Verl.von J.Cramer.1969). 알피나 절편의 구성원 중에서, E-97 균주는 모티에렐라. 탁스테리(M.thaxteri) Bjorling 1936 및 모티에렐라 레니스포라(M.renispora) Dixon-Stewart 1932 와 매우 유사하다. 그러나, 표1의 데이터에 E-97 균주 및 이들 두 종들의 특징적인 성질의 차이점을 명백하게 나타내고 있다. 따라서, 본원 발명의 신규한 종들로서 본 출원인은 모티에렐라 마큘라타 nov.spec.E-97라는 이름의 균주를 소개하고자 한다.

중요한 특징적인 성질에 기초하여모티에렐라 레니스포라및모티에렐라 탁스테리 종들과모티에렐라 마큘라타 nov.spec. 의 E-97 홀로타입 균주를 비교
	모티에렐라 레니스포라	모티에렐라 균주 E-97	모티에렐라. 탁스테리
포자낭자루 근원	통상적이지만 균사는 횡적으로 부풀어진 균사로로부터 유래하며, 통상의 것보다 넓고, 확장됨.	횡적으로 기균사로부터 유래하거나(부풀어졌거나 정상적임) 또는 기질 균사의 절편으로부터 분리되지 않음.	횡적으로 기균사로부터 부풀어지고 분리된 절편으로부터 유래하거나 또는 기질 균사의 절편으로부터 분리됨.
포자낭자루의 형태 및 크기	10㎛ 내지 3 ㎛로 상부를 향해 점차 감소해감. 길이는 약 200 ㎛임.	거의 직선형이거나 구부러져있으며, 분지되지 않음. 5-9㎛ 내지 1.5-2.5 ㎛로 정점을 향해 그 폭이 점차 감소해감. 길이는 약 60-80 ㎛임. 정점은 결코 넓어지지 않음.	길이는 약 60-90 ㎛임. 개시점은 약 5-7㎛ 이고, 정점은 1.5-2 ㎛로 감소됨. 확장된 포자낭하에서 즉시 측정.
포자낭의 형태 및 크기	무색. 직경은 25 ㎛.	거의 구형(6-17 ㎛ 직경)이지만 거의 드물게 눌려있음. 일반적으로 다수의 포자를 포함하나, 드물게 하나의 포자만을 포함하기도 함.	구형(12-20 ㎛ 직경). 다수의 포자를 포함하지만 특정 배지에서는 단지 하나의 포자를 갖는 포자낭도 있음.
포자낭의 격벽(막)	확산막. 붕괴후에 칼라 유사한 구조가 남음.	붕괴. 쇠스랑 유사한 칼라가 남음.	붕괴. 약간 후면이 구부러진 칼라가 남음.
포자의 형태 및 크기	대략 신장 형태. 유리질 구조. 크기는 2 x 4 ㎛	원통형. 길이(3 x 5 ㎛)는 폭(1.5-2 ㎛)을 배가하여 초과함.	3.5-4 x 1.5-2 ㎛ 디멘션의 타원 유리질 포자
무성아	대부분의 상이한 배지에서 발생.	매우 다양한 배지에서 자주 발생. 거의 기균사임. 구형 또는 길게 연장됨 (10-25 ㎛)	기질 균사내의 삽입된 타원형의 무성아(10-14 ㎛).
접합자	모든 특징적인 배지에서 자주 발생. 덮개 균사와 함께 직경이 약 500 ㎛임. 덮개 균사가 없으면 30 ㎛임.	미검출.	관찰안됨.
균사 웨브의 밀집 촛점		크고 밀집되게 짜여진 균사 촛점(50-250 ㎛).자주 나타나지만 접합자는 없음.	기존 배양물에서 크고(100-125 ㎛)황회색의 밀집된 균사 웨브. 접합자 없음.
기균사의 색 및 습관	느슨함. 항상 백색 균사 웨브.	황색 점이 있는 백색.	처음에는 거미줄 형이고 나중에는 보다 밀집됨.

본 발명에 따른 프라바스타틴 제조 방법에서, 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97 로 명명된 곰팡이 균주 또는 E-97/15/13 으로 명명된 이의 돌연변이체의 배양물 을 사용하는 것이 바람직하다. 선택된 균주는 빠르게 성장하므로 매우 유리하다. 탄소 공급원으로서 글루코스, 글리세린, 프럭토스 또는 갈락토스를 쉽게 사용할 수 있다. 질소 공급원으로서 효모 추출물, 펩톤, 카세인, 육 추출물, 대두분, 콘 스팁 리쿼, 질산나트륨 또는 황산 암모늄을 사용할 수 있다.

프라바스타틴의 제조를 위하여 사용되는 배양 배지에 그 밖에도 전술한 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기염, 예컨대 인산 2수소 칼륨, 염화마그네슘, 황산마그네슘, 극소량의 원소(제일철, 망간염), 아미노산 및 소포제가 존재하는 영양배지 일 수가 있으며, 이는 영양 브로스(액체 영양배지) 일 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양에 따르면, E-97 균주로 명명된 모티에렐라 마큘라타 n.sp. 또는 E-97/15/13 으로 명명된 이의 돌연변이체[NCAIM(P)F 001267]의 사면 한천 배양물로부터 제조된 포자 현탁액은 주입 배지에 뿌린 후 25-30 ℃, 바람직하게는 24-28℃, 가장 바람직하게는 28℃에서 3일 동안 배양된 10 % 주입 배양물을 생체전환 배지로 이전한다. 이후, 약 25∼28℃에서, 바람직하게는 약 28℃에서 4일간 항온배양시킨 후, 글루코스 및 콤팍틴산의 나트륨염을 배양물로 공급하였다. 공급된 콤팍틴 기질의 농축물에 따라, 호기성 조건하에서 2 내지 12일간 추가적으로 계속 배양하며, pH는 5.5 내지 7.5 사이에서, 바람직하게는 7.0에서 유지시킨다. 교반하고 통풍되는 조건하에서 생체전환을 실시하는데, 이때 공기유속은 0.2 vvm 일 때, 교반기의 교반속도는 400/분이다.

발효 공정중에, 콤팍틴 기질의 생체 전환은 고압 액체 크로마토그래피법 (HPLC)으로 실시된다. 이 방법에 따라, 브로스 샘플은 메탄올로 2배 희석되고 원심분리시킨 후 상청액은 다음 파라미터하에서 HPLC 분석용으로 사용한다: 물 분석 HPLC 장치; 컬럼: 뉴클레오실 C₁₈ 10 ㎛; 검출 파장:238 nm; 주사부피: 20 ㎕, 유속: 1 ㎖/분; 구배용출법 사용, 용리액: A=인산의 0.05% 수용액. B=아세토니트릴.

구배용출법

시간(분)	용리액 A(%)	용리액 B(%)
0	70	30
20	0	100
25	0	100
25.1	70	30
35	70	30

대략적인 체류시간 : 프라바스타틴 8.6-9.0 분; 콤팍틴산 11.6-12.0 분; 프라바스타틴 락톤 15.0-15.5 분, 콤팍틴 16.5-17.0 분.

프라바스타틴 제조를 위하여 콤팍틴산의 나트륨염 수용액을 배양 96 시간째에 첨가한다. 이러한 공정에서 기질은 다음과 같은 고형물질로 제조된다. 콤팍틴 락톤은 40 ℃ 에서 2시간 동안 0.2 M 수산화나트륨 용액에서 가수분해되고, 이후 반응 혼합물의 pH 는 염산에 의해 7.5로 조절되며, 중화된 용액을 Diaion HP-20 흡착 컬럼상에 중층시킨다; 형성된 염산나트륨을 중화동안 컬럼의 수성 세정에 의해 제거한 후, 콤팍틴산의 나트륨염을 50 % 수성아세톤으로 컬럼으로부터 용출시킨다. 그 후, 용출액을 진공하에서 증류시키고 수성 잔류물을 동결건조시킨다. 중화후에 콤팍틴의 염기성 가수분해물의 수용액도 기질로 직접 사용할 수 있다. 이 경우에 가수분해물의 콤팍틴산 나트륨염 함량은 HPLC 로 측정하고 용액은 사용하기까지 -20 ℃ 에서 유지시킨다.

발효 4일째까지 브로스의 pH 가 더욱 높아지면, 콤팍틴 기질의 하이드록실레 이션에 더욱 유리해진다. 콤팍틴 기질은 브로스의 pH가 6.3을 초과하는 경우에 공급을 개시되게 한다. 발효 4일 째에 콤팍틴산 나트륨염의 멸균 여과된 수용액을 500 ㎍/㎖ 농도에 도달하기까지 요구되는 양 만큼 첨가한다. 글루코스 또한 다음과 같이 25분간 121 ℃에서 멸균된 50 % 용액으로부터 배양물에 공급된다: 브로스의 pH가 6.7 이상이면, 글루코스 1 %가 브로스의 부피와 비례하여 첨가되는 반면, pH가 6.3-6.7 이내이면, 공급된 글루코스의 양은 0.5 %이다. 콤팍틴산 나트륨염은 24시간 후에 브로스로부터 소모되며, 형질전환은 HPLC로 측정함으로써 분석한다. 이 경우에, 각 ㎖의 브로스에 대해 다시 콤팍틴 500 ㎍을 첨가한다. 콤팍틴 기질 외에, 글루코스 또한 전술한 바와 같이 공급한다. 120 시간 배양물의 형태는 작은 펠렛의 성장물을 특징으로 한다(펠렛의 직경:0.5-0.3 mm). 24시간 후에, 기질의 2차 투여도 브로스로부터 소모되므로 전체 브로스내에 이를 500 ㎍/㎖ 농도로 생산하는 콤팍틴산 나트륨 염의 추가 부분은 브로스 pH 에 따라 공급하는 글루코스에 비례한다. 발효 4일 째에 기질 및 글루코스 공급은 발효 17일 내지 18일 째까지 전술한 바와 같이 매일 반복된다.

브로스로부터 생성물을 회수하기 위하여, 생체전환동안 프라바스타틴이 산 형태로 형성되고, 따라서 음이온 교환 수지 컬럼상이 흡착에 의하여 브로스의 여과물로부터 분리될 수 있다는 사실을 고려하는 것이 유리하다. 생성물을 분리하기 위하여 4차 암모늄 활성기를 가지고 있는 폴리스티렌-디비닐벤젠 중합체인 강염기 음이온 교환 수지를 이용하는 것이 유리하다. 히드록실 형으로 존재하는 음이온 교환수지를 혼합함으로써 생성물을 브로스의 여과물로부터 직접 이에 흡착시킬 수 있 다. 이온 교환 수지상에 흡착되는 생성물은 아세트산 또는 염화나트륨-함유 아세톤-물 혼합물, 바람직하게는 1 % 염화나트륨 함유 아세톤-물(1:1) 혼합물에 의해 컬럼에서 용출될 수 있다. 프라바스타틴-함유 분획물들을 합해서 용출액에 존재하는 아세톤을 진공하에서 증류시킨다. 농출물의 pH 는 15 % 황산으로 pH 3.5-4.0로 조절하고, 수용액은 에틸아세테이트로 추출한다. 에틸아세테이트 추출물은 물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한다. 이후에, 락톤 유도체를 프라바스타틴으로부터 제조한다. 락톤 고리는 연속적인 교반하에서 촉매양으로 존재하는 트리플루오로아세트산으로 락톤 형성을 유도함으로써 실온에서 건조된 에틸아세테이트 용액내에서 생성된다. 형질전환 공정은 박막 크로마토그래피 분석(TLC)에 의해 검증된다. 락톤 형성을 완료한 후에, 에틸아세테이트 용액을 처음에는 5% 탄산수소나트륨 수용액으로 세전하고 물로 세정한 후, 무수 황산나트륨으로 건조시키고 진공하에서 증발시킨다. 증발된 잔류물은 챠콜로 아세톤 용액에서 처리한 후, 다시 증발시키고 C₁∼C₄ 지방족 알콜, 바람직하게는 에탄올로부터 재결정한다. 재결정 모액의 증발 잔류물은 용리액으로서 에틸아세테이트 함량을 점차 증가시킨 에틸아세테이트-n-헥산의 혼합물을 이용한 실리가겔 크로마토그래피로 정제한다.

재결정 및 크로마토그래피의 정제후 얻어지는 프라바스타틴 락톤으로부터 프라바스타틴을 동량의 수산화나트륨을 갖는 아세톤에서 실온으로 가수분해함으로써 제조한다. 프라바스타틴 나트륨염의 형성이 완료되면, 반응 혼합물을 물로 희석하고 중화시킨 후, 아세톤함량을 진공하에서 증류시킨다. 프라바스타틴을 수득된 수성 잔류물로부터 Diaion HP-20 수지-함유 컬럼상에서 흡착시키고, 탈이온수로 세척 한 후 컬럼으로부터 아세톤-탈이온수 혼합물로 용출시킨다. 이후 프라바스타틴 분획물을 합하고, 아세톤 성분을 증류 제거하고 수성 잔류물을 동결건조시킨 후에 프라바스타틴을 고순도로 수득할 수 있으며, 이것은 에틸아세테이트-에탄올 혼합물로 재결정할 수 있다.

상기 과정 중에, 프라바스타틴 전량을 흡착시킬 수 있다. 프라바스타틴의 락톤 고리 형성 중에 3α-히드록시-이소-콤팍틴 및 기타 부산물 또한 형성될 수 있다. 이들 후자의 반응이 분리 수율을 감소시킴에도 불구하고 이들 화합물을 전술한 정제방법에 의해 분리할 수 있고, 결론적으로 프라바스타틴을 약학적으로 허용가능한 품질로 상기 방법에 의해 제조할 수 있다.

생체전환을 완료한 후에, 프라바스타틴은 발효 브로스 또는 섬유상 곰팡이 세포 분리후 얻어진 여과물로부터 추출될 수 있다. 섬유상 곰팡이 세포는 여과 또는 원심분리에 의해 제거될 수 있으나, 공업적 규모로 전체 브로스 추출물을 제조하는 것이 유리하다. 추출전에 발효 브로스 또는 브로스의 여과 pH를 무기산, 바람직하게는 묽은 황산으로 3.5-3.7로 조절하였다. 아세트산과 C₂₄의 지방족 알콜 에스테르, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 이소부틸 아세테이트로 추출한다. 추출 단계는 산성 pH에서 프라바스타틴으로부터 락톤 유도체의 형성을 피하기 위하여 매우 신속하게 실시되어야 한다.

유기 용매 추출물로부터 산 형태의 프라바스타틴이 나트륨염으로서 수성상으로 이전될 수 있다. 예컨대, 에틸아세테이트 추출물로부터 프라바스타틴은 약알칼리수(pH 7.5-8.0) 또는 5% 탄산수소나트륨 1/10 및 1/20 부피비로 추출할 수 있다. 프라바스타틴을 순수한 형태로 상기 수득한 알칼리 수성 추출물로부터 비이온성 흡착 수지를 이용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 회수할 수 있다는 것을 발견하였다. 유리한 방법으로는 알칼리 수성 추출물로부터 진공 증류에 의해 수성상에서 용해된 용매를 우선 제거하고, 이후에 수성 추출물은 Diaion HP-20 컬럼상에 충전시킨다.

컬럼에 흡착되는 프라바스타틴 나트륨염은 수용액의 아세톤 함량을 점차 증가시켜 용출함으로써 정제한 후, 프라바스타틴-함유 주요 분획물을 합하고 이것을 진공하에서 농축시킨다. 수성 농축물을 다른 Diaion HP-20 컬럼상에서 크로마토그래피에 의해 더 정제시키고 순수한 프라바스타틴을 함유하는 용출액을 얻으며, 이것을 챠콜로 정화시키고 냉동건조한 후 프라바스타틴을 약학적으로 허용가능한 품질로 수득할 수 있다.

프라바스타틴의 락톤 형성과 이것의 가수분해가 공정에 포함되지 않았기 때문에, 이러한 분리 공정은 이전에 비해 보다 적은 수의 단계로 구성된다. 분리중에, 프라바스타틴을 제한된 시간동안만 산성 상태에 노출시키는데, 이러한 상태하에서는 중성 또는 알칼리성 용액에서 보다 덜 안정하므로, 결론적으로 이러한 분리공정 동안 인공물이 실질적으로 형성되지 않는다.

더욱이, 세파덱스 LH-20 덱스트란 겔(히드록시프로필계 유도체)상에서의 크로마토그래피가 프라바스타틴을 정제하기 위해 사용하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다. 이러한 방법을 이용함으로써 99.5 %(HPLC 측정)를 초과하는 순도의 프라바스타틴이 제조될 수 있다.

본 실험 중에 섬유상 곰팡이 또는 섬유상 박테리아 균주, 그들중 일반식(2) 의 화합물을 6β-히드록실화할 수 있는 모티에렐라 마큘라타 n.sp.균주의 질산 브로스 또는 브로스의 유기 용매 추출물로부터, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 이소부틸 아세테이트 추출물로부터, 프라바스타틴을 2차아민으로 결정형 염으로 침전시킬 수 있다는 것을 인식할 수 있었다. 염 형성을 위하여 알킬, 시클로알킬-, 아르알킬- 또는 아릴-치환체를 함유하는 수개의 2차 아민이 적합하다는 것을 추가적으로 발견하였다. 적절하게는 비-독성 2차 아민을 그들(예컨대, 디옥틸아민, 디시클로헥실아민, 디벤질아민) 중에서 선택한다. 유기 2차 아민 염(예컨대, 디벤질아민염) 중간체는 추출물 중 프라바스타틴 함량의 1.5 당량으로 디벤질아민을 첨가함으로써 분리한 후, 그 추출물을 진공 증류에 의해 농축하여 최초 부피의 5%로 만들고, 디벤질아민의 나머지 양은 농축물에 0.2 당량 비율로 첨가한다. 상기 결정형디벤질아민염은 농축물로부터 침전시킨다. 결정형 조생성물을 여과하고 진공에서 건조시킨다. 이후에 챠콜로 정화시키고 아세톤으로 재결정한다.

유기 용매 추출 및 알칼리성 pH 에서의 재추출 단계를 포함하는 전술한 방법에 있어서, 2차 아민염 형성에 기초한 분리 방법은 컬럼 크로마토그래피 정제 방법의 대체용으로 또한 사용될 수 있다. 이 경우에, 알칼리성 수성 추출물의 산성화 후에 얻어지는 이소부틸 아세테이트 추출물로부터 프라바스타틴 디벤질아민 염을 침전시키는 것이 유리하다.

프라바스타틴 유기 2차 아민염은 수산화나트륨 또는 나트륨 알콕시드, 바람직하게는 나트륨 에톡시드에 의해 프라바스타틴으로 형질전환된다.

형질전환은 프라바스타틴 디벤질아민염의 경우 상세히 설명되어 있다. 재결 정된 디벤질아민염은 이소부틸 아세테이트-물 혼합물에서 현탁된 후 8.0-8.5의 pH 의 범위에서 계속 교반함으로써 동량의 수산화나트륨을 수용액상태로 현탁액에 첨가한다. 현탁액이 사라진 후에, 상들을 분리하여 프라바스타틴-함유 수용액을 이소부틸아세테이트로 2회 세정한다. 수용액을 활성탄으로 정화시키고 동결건조하여 약학적으로 허용가능한 품질의 프라바스타틴을 수득한다.

프라바스타틴 디벤질아민염을 프라바스타틴으로 변화시키는 하나의 바람직한 방법은 에탄올에서 재결정된 디벤질아민염을 현탁시킨 후에, 동량 또는 약간 많은 양의 나트륨 에톡시드를 교반하에 현탁액에 첨가하고 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고 아세톤을 첨가함으로써 프라바스타틴을 농축물로부터 결정형으로 침전시킨다.

프라바스타틴 디벤질아민염을 프라바스타틴으로 변화시키는 또 하나의 바람직한 방법은 재결정된 디벤질아민염을 에틸아세테이트-에탄올 혼합물에 용해시키고 에탄올 중 동량 또는 그보다 조금 많은 양의 나트륨 히드록시드를 용액에 첨가함으로써 프라바스타틴을 침전시킨다.

프라바스타틴을 2차 아민염 중간체를 경유하여 분리하는 것은 종래의 공지된 분리 방법에 비해 보다 단순한 방법이다. 상기 방법 중에, 인공물이 형성되지 않으며, 생체전환의 부산물 및 히드록실화하는 미생물에 의해 생합성된 다양한 대사 산물로부터 프라바스타틴을 분리하는 것은 임의의 크로마토그래피법을 이용하지 않아도 가능하다.

프라바스타틴, 프라바스타틴 락톤 및 프라바스타틴의 분리된 2차 아민염의 구조는 UV, IR, ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 질량분광학법에 의해 검증될 수 있다.

도1은 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97의 물리적 특성들을 도시한 것이다.

본 발명은 다음의 실시예들을 참고로 하여 보다 완전하게 설명되고 이해될 수 있을 것이다. 본 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 방법으로도 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

포자 현탁액을 콤팍틴을 6β-히드록실화 시킬 수 있는 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97[NCAIM(P)F 001266] 균주의 7-10일된 숙성된 맥아 추출물-효모 추출물 한천 사면 배양물로부터, 0.9% 염화나트륨 용액 5 ㎖로 제조하고 현탁액을 500 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 멸균된 100 ㎖ 주입물 배지 PI 를 주입하는 데 사용한다.

배지 PI의 조성:

1000 ㎖의 수돗물에

글루코스 50 g

대두분 20 g

멸균 전에, 배지의 pH를 7.0으로 조절한 후 121 ℃ 에서 25 분 동안 멸균시켰다. 배양물을 28 ℃ 에서 3일간 회전진탕기(250 rpm, 2.5 cm 진폭)상에서 진탕시키고, 수득된 배양물 10 ㎖를 121 ℃에서 25분간 500 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 멸균된 100-100 ㎖ 생체전환 배지 MU/4 로 이전시켰다.

배지 MU/4의 조성:

1000 ㎖의 수돗물에

글루코스 40 g

대두분 20 g

카제인-펩톤 1 g

아스파라긴 2 g

인산 2수소칼륨 0.5 g

멸균 전에, 배지의 pH를 7.0으로 조절한 후 121 ℃ 에서 25 분 동안 멸균시켰다.

플라스크를 25 ℃ 에서 4일간 회전진탕기(250 rpm, 2.5 cm 진폭)상에서 진탕시키고, 50-50 mg 의 콤팍틴 기질(콤팍틴산 나트륨염)을 멸균-여과된 수성 형태로 배양물에 첨가한 후 배양을 계속하였다. 유사하게 5일째에 다른 50-50 mg 콤팍틴산 나트륨염을 곰팡이 배양물에 첨가하고 추가적으로 24시간 동안 계속 발효하였다. 브로스 중의 프라바스타틴 함량은 HPLC로 측정하였다. 발효를 168 시간 동안 지속하였다. 생체전환 완료시 발효 브로스의 평균 프라바스타틴 농도는 620 ㎍/㎖ 이었다.

실시예 2

5 리터의 유효 부피의 실험실용 발효기에서 MU/S 생체전환 배양 배지를 제조하고, 배양 배지의 성분들을 5 리터 부피에 상응한 양으로 첨가하지만 4.5 리터에만 충전시킨 후에 121 ℃에서 45분간 멸균시키고 실시예 1에 따라 제조된 주입 배 양물 500 ㎖을 뿌렸다.

배지 MU/8의 조성:

1000 ㎖의 수돗물에

글루코스 20 g

글리세린 20 g

대두분 20 g

펩톤 20 g

인산 2수소칼륨 0.5 g

폴리프로필렌글리콜 2000 1 g

멸균 전에, 배지의 pH를 7.0으로 조절하였다.

28 ℃에서 400 rpm 의 교반 속도, 아래 방향으로부터 60 ℓ/시의 통기 속도로 4일 동안 발효시켰다. 이전 후 2일 째에, 배양물이 기포를 격심하게 형성하기 시작하고, 이것은 폴리프로필렌글리콜 2000을 추가적으로 첨가함으로써 감소시킬 수 있다. 발효 개시단계(16 내지 20 시간) 에서 pH 가 6.5 의 초기값에서 5.0-5.5로 감소된 후에, 3일 째에 올라가기 시작하고 4일 째에 6.3-7.5에 도달하였다. 브로스의 pH가 6.3 을 초과한 경우 콤팍틴 기질 공급을 개시하도록 한다. 발효 4일 째에 2.5 g의 콤팍틴 기질을 멸균 여과 수용액에 첨가하였다. 브로스 0.5-1.0 % 글루코스의 부피로 계산된 양을 pH 에 따라 기질 공급과 비례하도록 25분간 121 ℃에서 멸균된 50 % 용액의 형태로 배양물에 첨가하였다. 24시간 후에, 콤팍틴 기질이 배양물로부터 소모되는데 이것은 발효기로부터 취한 샘플로부터 HPLC 에 의해 검출 하였다. 이경우 다른 2.5 g 의 콤팍틴 기질 및 글루코스를 전술한 바와 같이 첨가하고 기질이 프라바스타틴으로 전환될 때 생체전환을 24시간 동안 추가로 계속하였다.

발효가 완료된 후에, 630 ㎍/㎖ 프라바스타틴을 함유하는 5.1 리터의 브로스를 여과 클로스에서 여과하였다. 2리터의 물을 분리된 균사체에 첨가한 후 균사체 현탁액을 1시간동안 교반하고 여과하였다. 이들 2개의 여과물을 합해서 138 g(250 ㎖) Dowex Al 400(OH) 수지를 함유하는 컬럼(컬럼 직경 3.4 cm, 수지층 높이: 28cm)상에서 500 ㎖/시 의 유속으로 통과시킨 후에, 수지층을 300 ㎖ 탈이온수로 세정하였다. 이어서, 수지를 10 g 의 염화나트륨을 함유하는 1 리터 아세톤-물 (1:1) 혼합물로 용출하였다. 분획물의 부피는 각각 100 ㎖였다. 용출액을 다음의 박막 크로마토그래피(TLC)법으로 분석하였다: 흡착제: Kieselgel 60 F₂₅₄ DC(Merck) 알루미늄 호일; 전개 용매: 아세톤-벤젠-아세트산(50:50:3) 혼합물; 검출: 포스포몰리브산 시약으로. 프라바스타틴의 R_f 값은 0.5 이었다. 생성물을 함유하는 분획물을 합해서 아세톤을 진공하에서 증류시켰다. 400 ㎖의 농축물을 15 % 황산으로 pH 3.5-4.0으로 조절하고 150 ㎖ 에틸아세테이트로 3회 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물을 합해서 무수 황산나트륨으로 건조하였다. 이어서, 프라바스타틴 락톤을 프라바스타틴산으로부터 실온에서 계속 교반하면서 트리플루오로아세트산을 촉매량 첨가함으로써 제조하였다. 프라바스타틴 락톤 형성은 TLC(프라바스타틴 락톤의 R_f 값은 상기 TLC 에서 0.7)로 조절하였다. 락톤 형성을 완결한 후,에틸아세테이트를 2 x 50 ㎖ 5% 수성 탄산수소나트륨 용액으로 세정하고 50 ㎖의 물로 세정한 후 무수 황산나트륨으로 건조시키고 진공에서 증발시켰다. 3 g의 양으로 얻어진 증발 잔류물을 100 ㎖ 의 아세톤에 용해시키고 0.3 g 의 챠콜로 정화시켰다. 이후 챠콜을 여과시켜 버리고 아세톤을 진공에서 증발시켰다. 얻어진 조생성물을 20 ㎖ 에탄올로부터 결정하였다. 침전된 결정형 프라바스타틴 락톤을 여과시키고 30 ㎖ n-헥산으로 여과기에서 세정하고 실온 진공하에서 건조하였다. 이러한 방법으로 크로마토그래피로 순수해진 프라바스타틴 락톤 1.5g 을 얻었다. 융점 140-142℃, [α]_D = +194°(c=0.5, 메탄올). 결정화의 모액을 진공에서 증발시켜 1.2 g의 증발 잔류물을 수득하는데, 이것은 24 g의 Kieselgel 60 흡착제 함유 컬럼(컬럼 직경: 1.6 cm, 층높이: 20 cm)상에서 크로마토그래피되었다. 5 ㎖ 벤젠 중에 용해된 조생성물을 컬럼에 넣었다. 용출을 위하여 에틸아세테이트-n-헥산 혼합물을 사용하는데, 이때 에틸아세테이트 함량은 점차 증가된다. 프라바스타틴 락톤을 60 % 에틸아세테이트-40% n-헥산의 혼합물로 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다. 분획물을 전개 용매로서 에틸아세테이트-n-헥산(9:1) 혼합물을 사용하여 TLC 로 조절하였다. 프라바스타틴 락톤-함유 분획물을 합해서 진공에서 증발시켰다. 이 방법에 따라, 0.3 g의 순수한 생성물을 얻고, 이것의 품질은 결정에 의해 수득된 프라바스타틴 락톤의 품질과 동일하다.

2개의 프라바스타틴 락톤 뱃취를 합하여 나트륨염을 다음의 방법에 따라 제조하였다: 1.8 g 의 프라바스타틴 락톤을 20 ㎖ 아세톤에 용해시키고 교반하에서 4.5 ㎖의 1M 수성 수산화나트륨을 첨가한 후 용액을 실온에서 30분 동안 교반하였 다. 염 형성이 완료되었을 때, 20 ㎖의 물을 혼합물에 첨가하고 용액을 중화시킨 후 아세톤을 진공하에서 증발시켰다. 수성 농축물을 150 ㎖ Diaion HP 20 수지(컬럼 직경: 2.6 cm, 층높이: 30 cm)상에서 크로마토그래피하였다. 용출제로서 아세톤-탈이온수의 혼합물을 사용하는 경우 아세톤의 농축물을 5 % 단계에서 증가시켰다. 프라바스타틴을 15 % 아세톤 함유 아세톤-탈이온수 혼합물에 의해 컬럼으로부터 용출시킬 수 있다. 분획물을 TLC 로 분석하였다. 상기 생성물을 함유하는 분획물을 합해서 아세톤을 진공에서 증발시켰다. 수성 잔류물의 동결건조에 의해 1.3 g 의 프라바스타틴을 수득하였다. 크로마토그래피로 순수해진 생성물을 에탄올과 에틸아세테이트의 혼합물로 결정하였다.

융점: 170-173 ℃(분해)

[α]_D = +156°(c=0.5, 물 중에서)

자외선 흡수 스펙트럼(20 ㎍/㎖, 메탄올 중에서): λ_max = 231,237,245 nm

(log ε-4.263;4.311;4.136)

적외선 흡수 스펙트럼(KBr):υOH 3415, υCH 2965, υC=O 1730 υCOO^- 1575 cm^-1.

H-NMR 스펙트럼(D₂O,δ,ppm): 0.86,d,3H(2-CH₃);5.92, dd,J=10.0 및 5.4 Hz, 1H(3-H);5.99, d,J=10.0 Hz, 1H(4-H); 5.52, br 1H(5-H).4.24, m 1H(6-H); 5.34, br, 1H(8-H); 4.06, m, 1H(β-H), 3.65, m, 1H(δ-H); 1.05,d,3H(2'-CH₃); 0.82,t,3H(4'-H₃).

¹³C-NMR 스펙트럼(D₂O,δ,ppm) 15.3,q(2-CH₃); 139.5,d(C-3); 129.5,d,(C-4); 138.1,s(C-4a), 127.7,d(C-5); 66.6,d(C-6); 70.1,d(C-8); 182.6 s (COO^-); 72.6.d(C-β); 73.0,d(C-δ); 182.0,s(C-1')18.8; q(2'-CH₃); 13.7,q(C-4')

양성 FAB 질량 스펙트럼(특징적인 이온):

[M+Na]^- 469;[M+H]⁺ 447

음성 FAB 질량 스펙트럼(특징적인 이온):

[M-Na]^- 455;[M-Na]^- 423, m/z 101 [2-메틸-부티르산-H]^_

실시예 3

5 리터 유효 부피의 실험실용 발효기에서 생체전환 배양 배지 MU/4 를 실시예 1에 따라 제조하고, 상기 물질을 4.5 리터 부피로 충전함에도 불구하고, 배양 배지의 조성은 5 리터로 계산하였다. 이후, 121 ℃에서 45분간 멸균하고 실시예 1에 따라 제조된 주입 배양물 500 ㎖로 주입하였다. 300 rpm의 교반속도 및 50 ℓ/시 의 통기 속도로 4일간 처리함으로써 25 ℃에서 발효시켰다. 5 g 의 콤팍틴 기질을 배양물에 공급한 후에 실시예 2에 따라 생체전환을 실시하였다.

생체전환을 완료한 후, 660 ㎍/㎖ 프라바스타틴을 함유하는 4.9 리터 브로스를 여과하고 분리된 균사체를 2 x 1 리터의 탈이온수에서 현탁에 의해 세정하였다. 합해진 5.6 리터의 브로스 여과액의 pH 를 20 % 황산에 의해 3.5-3.7로 조절한 후 산성 여과액을 30분간 2750 ㎖ 에틸아세테이트로 교반하였다. 이어서,상기 상들을 분리하였다. 수성상을 다시 2 x 1375 ㎖ 에틸아세테이트로 추출하였다. 470 ㎖ 탈이온수를 합해진 4750 ㎖ 에틸아세테이트 추출물에 첨가한 후, 수성 에틸아세테이트 혼합물의 pH 를 1M 수산화나트륨으로 7.5-8.0으로 조절하였다. 20 분 교반한 후에, 상기 상들을 분리하고 에틸아세테이트 추출물을 2 x 235 ㎖ 탈이온수로 전술한 바와 같이 추출하였다. 이후 합한 약 알칼리성 용액 1080 ㎖를 280 ㎖ 부피로 진공에서 농축하였다. 농축된 수용액을 280 ㎖ Diaion HP-20(일본 미쯔비시사) 비-이온성 수지로 충전된 크로마토그래피 컬럼상에 적층하였다(높이: 직경의 비율=6.5). 컬럼상의 흡착은 250-300 ㎖/시 의 유속으로 실시한 후, 컬럼을 840 ㎖ 탈이온수로 세정하였다. 이어서, 컬럼을 순서대로 800 ㎖ 5%, 1000 ㎖ 10%, 500 ㎖ 15% 및 500 ㎖ 20%-함유수를 이용하여 용출하였다. 용출 과정에서, 50 ㎖ 분획물을 수집하는데, 이것은 실시예2의 TLC 법으로 분석하였다. 주성분으로서 프라바스타틴을 함유하는 분획물들을 합해서 얻어진 용액을 진공하에서 260 ㎖ 부피로 농축하였다. 농축된 수용액을 260 ㎖ Diaion HP-20 수지를 함유하는 컬럼상에서 크로마토그래피하였다. 프라바스타틴의 흡착 후, 컬럼을 790 ㎖ 탈이온수로 세정한 후 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0 및 20.0 %으로 아세톤 함량을 점차 증가시켜 260-260 ㎖ 부분에서 수성 아세톤 용액으로 용출하였다. 컬럼 크로마토그래피의 과정에서 25 ㎖ 분획물을 수집하고, 분획물의 프라바스타틴 함량을 전술한 바와 같이 분석하였다. TLC 에 의해 유일한 성분으로 프라바스타틴을 함유하는 분획물을 합하고 진공에서 증발시켰다. 이어서, 0.3 g 의 챠콜을 농축된 수용액에 첨가하고(약 30 ㎖) 프라바 스타틴을 실온에서 30분 동안 정화하였다. 이후 챠콜을 용액으로부터 여과에 의해 제거하고 여과액을 냉동건조하였다.이러한 방법으로 1.62 g 의 프라바스타틴을 냉동건조된 형태로 수득하였다.

실시예 4

10-12일간 배양된 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97 [NCAIM(P)F 001266] 균주로의 사면배양물로부터, 포자 현탁액을 5 ㎖의 멸균 0.9 % 염화나트륨 용액으로 제조하고, 이 현탁액을 이용하여 3000 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 멸균된 500 ㎖ VHIG 주입물 배지를 주입하였다.

배지 VHIG의 조성:

1000 ㎖의 수돗물에

글루코스 30 g

육 추출물 8 g

효모 추출물 1 g

트윈-80 (폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 모노올레이트) 0.5 g

멸균 전에, 배지의 pH를 7.0으로 조절하고 121 ℃에서 25분간 멸균하였다. 배양물을 3일간 회전진탕기(250 rpm, 진폭 2.5 cm) 상에서 배양하고 수득된 주입물 배양물을 사용하여 생체전환 배양 배지 PK 를 함유하는 5 리터의 유효 부피의 실험실용 발효기에 주입하였다.

배지 PK의 조성:

1000 ㎖의 수돗물에

글루코스 40 g

펩톤 5g

대두분 20 g

K₂HPO₄ 2g

KH₂PO₄ 1g

NaNO₃ 2g

KCl 0.5 g

멸균 전에, 배지의 pH를 7.0으로 조절하였다. 주입, 배양후, 기질 공급 및 생체전환을 실시예 2에 따라 수행하고 발효 완료시 그 농도가 650 ㎍/㎖ 인 브로스로부터 프라바스타틴을 분리하였다.

생체전환을 완료한 후, 650 ㎍/㎖ 프라바스타틴을 함유하는 4.9 리터 브로스의 pH를 2M 수산화나트륨으로 지속적으로 교반하면서 9.5-10.0로 조절하고, 한 시간 교반 후에 20 % 황산으로 pH를 3.5-3.7로 조절하였다. 이어서, 산성용액을 2.45 리터의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상을 분리하고 원심분리로 정화된 추출물을 에먼션화된 유기상으로부터 제조하였다. 브로스를 다시 2 x 1.22 리터의 에틸아세테이트로 전술한 방법으로 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물들을 합해서 0.4 리터의 탈이온수를 첨가한 후 혼합물의 pH 를 1M 수산화나트륨으로 8.0-8.5로 조절하였다. 상기 상들을 분리하고 에틸아세테이트상을 전술한 바와 같이 pH 8.0-8.5의 탈이온수 2 x 0.2 리터로 추출하였다. 약 알칼리성 용액을 함유하는 합한 프라바스 타틴의 pH를 20 % 황산 용액으로 교반하에 3.5-3.7로 조절하였다. 수득된 산성용액을 4x 0.2 리터의 에틸아세테이트로 추출하였다. 합한 에틸아세테이트 추출물을 2 x 0.2 리터의 탈이온수로 세정한 후 150 몰%의 디벤질아민(HPLC에 의해 측정된 프라바스타틴 함량에 대해 계산)을 에틸아세테이트 용액에 첨가하였다. 에틸아세테이트 용액을 진공하에서 0.2 리터로 농축하였다. 추가적으로 20 몰%의 디벤질아민을 수득된 농축물에 첨가하고 침전된 용액을 0-5℃에서 밤새 방치하였다. 침전된 프라바스타틴 디벤질아민염을 여과한 후 침전물을 여과기에서 차가운 에틸아세테이트로 세정하고 2회에 걸쳐 n-헥산으로 세정한 후 최종적으로 진공하에서 40-50 ℃ 으로 건조하였다. 수득된 조생성물(3.9 g)을 실온에서 100 ㎖ 메탄올에 용해시킨 후 용액을 0.45 g 챠콜로 정화하였다. 이후 메틸알콜성의 여과물을 진공에서 농축하였다. 증발된 잔류물을 120 ㎖ 아세톤에서 외부온도 62-66 ℃로 용해시키고 용액을 실온에서 냉각하였다. 이어서, 재결정을 0-5℃에서 밤새 계속하였다. 침전된 걸정을 여과한 후 결정을 여과지에서 2회에 걸쳐 차가운 아세톤으로, 또한 2회에 걸쳐 n-헥산으로 세정하였다. 개결정된 프라바스타틴 디벤질아민염을 160 ㎖ 이소부틸아세테이트와 80 ㎖ 탈이온수의 혼합물에서 현탁하였다. 이어서, 수산화나트륨을 교반하에 현탁액에 동량 첨가하였다. 현탁액이 사라진 후, 상기 상들을 분리하고 프라바스타틴 함유 수용액을 2 x 30 ㎖ 이소부틸아세테이트로 세정하였다. 수득된 수용액을 챠콜로 정화하였다. 이후 수성 여과액을 약 20 ㎖의 부피로 농축하였다. 수득된 수용액을 0.4 리터 Sephadex LH-20 겔(판매: 스위스, 파마시아)로 충전된 크로마토그래피 컬럼(높이:직경 = 22)상에 넣었다. 크로마토그래피 과정에서 탈이온 수를 용출액으로 사용하여 20 ㎖ 분획물을 수집하였다. 분획물을 TLC 로 분석한 후 프라바스타틴을 함유하는 상기 분획물들을 전술한 방법을 이용하여 HPLC 에 의해 분석하였다. 순수한 프라바스타틴을 함유하는 분획물을 합해서 냉동건조하였다. 이러한 방식으로 1.75 g 의 프라바스타틴을 수득하였고, 이것의 순도는 HPLC 로 측정하였을 때 99.5 % 를 초과한다.

실시예 5

포자 현탁액을 10-12일간 배양된 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97 [NCAIM(P)F 001266] 균주로의 사면배양물로부터 5 ㎖의 멸균 0.9 % 염화나트륨 용액을 이용하여 제조하고, 500 ㎖ 주입물 배지를 전술한 실시예 4와 같이 주입하였다. 유효 부피 5 리터의 실험실용 발효기에서 PC/4 생체전환 배양 배지를 121 ℃에서 45분간 멸균하고 종자 배양물로 제조하고 주입하였다.

배지 PC/4의 조성:

1000 ㎖의 수돗물에

맥아 추출물 5.0 %

대두분 1.0 %

펩톤 1.0 %

콘 스팁 리쿼 1.0 %

MgSO₄ x 7 H₂O 0.1 %

멸균 전에, 배지의 pH를 7.0으로 조절하였다. 주입 후에 실시예 2에 따라 배양하고 기질을 공급한 후, 610 ㎍/㎖ 농도의 프라바스타틴을 함유한 5.1 리터의 브 로스를 수득하였다.

브로스 3.7 g 으로부터, 프라바스타틴 디벤질아민염 조생성물을 실시예 4의 방법에 의해 제조하고, 이로부터 재결정 후 2.9 g의 프라바스타틴 디벤질아민염을 수득하였다. 재결정된 프라바스타틴 디벤질아민염을 45 ㎖ 에탄올에서 현탁시킨 후, 교반하에서 110 몰% 수산화나트륨을 에탄올계 수산화나트륨 1 M 용액을 공급함으로써 첨가하였다. 용액을 계속 30분간 교반한 후 0.3 g 의 챠콜을 용액에 첨가하고 다시 30분간 교반하였다. 용액을 여과하고, 여과액을 15 ㎖을 농축시켰다. 이후 60 ㎖ 아세톤을 56-60 ℃에서 농축물에 첨가하였다. 수득된 용액을 실온으로 냉각시키고, +5℃에서 밤새 방치하였다. 이어서, 침전물을 여과하고 2 x 20 ㎖ 아세톤, 2 x 20 ㎖ 에틸아세테이트, 2 x 20 ㎖ n-헥산으로 세정하고 최종적으로 진공하에서 건조하였다. 얻어진 1.7 g 의 조생성물 프라바스타틴을 에탄올에 용해시킨 후 챠콜로 세정하고 에탄올-에틸 아세테이트 혼합물로 결정하였다. 이러한 방식으로 실시예 2의 생성물과 동일한 1.54 g 의 프라바스타틴을 수득하였다.

실시예 6

실시예 4에서 전술한 바와 같이, 7-10일간 배양된 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97 [NCAIM(P)F 001266] 균주로의 사면배양물로부터, 3000 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 멸균된 500 ㎖ 주입물 배지 MI를 주입하고 회전진탕기에서 3일간 28 ℃에서 항온배양하였다.

배지 MI의 조성:

1000 ㎖의 수돗물에

글루코스 40 g

카제인 5 g

KCl 0.5 g

NaNO₃ 3 g

K₂HPO₄ 2 g

MgSO₄ x 7 H₂O 0.5 g

FeSO₄ x 7 H₂O 0.01 g

멸균 전에, 배지의 pH를 6.0으로 조절하고 121 ℃에서 35분간 멸균하였다. 수득된 종자 배양물을 발효기에서 멸균된 5 리터 생체전환 배지 P12 로 주입하였다.

배지 P12의 조성:

1000 ㎖의 수돗물에

글루코스 10 g

맥아 추출물 50 g

효모 추출물 5 g

콘 스팁 리쿼 5 g

MgSO₄ x 7 H₂O 1 g

트윈-80 0.5 g

멸균 전에, 배지의 pH를 7.0으로 조절하고 121 ℃에서 45분간 멸균하였다. 실시예 2에 따라 발효, 기질 공급 및 생체전환을 수행하였다. 생체전환을 완료한 후, 620 ㎍/㎖의 농도에서 형성된 프라바스타틴을 다음과 같이 분리하였다:

620 ㎍/㎖ 프라바스타틴을 함유하는 5.15 리터 브로스를 2 M 수산화나트륨으로 pH 9.5 가 되도록 조절한 후 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 브로스를 여과하고 균사체를 1 x 2 리터의 현탁액 및 1 x 0.5 리터의 물로 세정하였다. 여과물을 합해서 수용액을 20 % 황산으로 pH 3.7로 조절하고 2.5 리터의 에틸아세테이트 및 1.5 리터의 에틸아세테이트로 순서대로 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물들을 합해서 2 x 0.5 리터의 물로 세정하고 1.95 g 의 디시클로헥실아민을 첨가하였다. 에틸아세테이트 추출물을 40 ℃ 감압하에서 200 ㎖로 농축하고, 0.195 g 의 디시클로헥실아민을 농축물에 다시 첨가한 후 15 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 침전된 결정물질을 여과하였고, 20 ㎖ 에틸아세테이트 및 15 ㎖ 에틸아세테이트로 세정한 후 40 ℃에서 건조하였다. 이러한 방식으로 3.51 g 의 조생성물을 수득하였다. 아세톤-에탄올 혼합물에서 조생성물의 재결정 후, 3.05 g 의 프라바스타틴 디시클로헥실아민염을 수득하였드며(융점:162-168 ℃), 이것을 실시예 5에 따라 프라바스타틴으로 전환하였다.

실시예 7

실시예 2에서 전술한 바와 같이, 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97 [NCAIM(P)F 001266] 균주로 발효, 기질 공급 및 생체배양을 수행하였다. 생체전환의 결과 수득된 프라바스타틴은 다음과 같이 브로스로부터 분리하였다.

650 ㎍/㎖ 프라바스타틴을 함유하는 5 리터의 배양물 브로스를 여과 클로스 로 여과하였다. 곰팡이 균사체를 0.1 M 수산화나트륨 용액 2 리터에서 한시간 동안 교반하고 여과하였다. 2개의 여과액을 합해서 15 % 황산으로 pH 3.5-4.0으로 조절하였다. 이어서 상기 용액을 2 x 1.8 리터의 에틸아세테이트로 추출하였다. 합한 에틸아세테이트 상들을 800 ㎖의 물로 세정하였다. 이후, 400 ㎖ 탈이온수를 첨가하고 1 M 의 수산화나트륨으로 혼합물의 pH 를 8.0-8.5로 조절하였다. 혼합물을 15분간 교반한 후, 상들을 분리하였다. 300 ㎖ 의 물을 에틸아세테이트 상에 첨가하고 pH 를 8.0-8.5로 조절하였다. 15분간 교반한 후에, 상들을 분리하였다. 300 ㎖ 의 물을 다시 에틸아세테이트 상에 첨가한 후 pH 를 8.0-9.5로 조절하였다. 이후 혼합물을 15분간 교반하였다. 2개의 상들을 다시 분리하였다. 모든 수성 상들을 합해 15 % 황산으로 pH 3.5-4.0으로 조정한 후 3 x 300 ㎖ 에틸아세테이트로 추출하였다. 합한 에틸아세테이트를 150 ㎖물로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하여 여과하였다. 이후 150 몰% 디옥틸아민(프라바스타틴 함량에 대해 계산)을 에틸아세테이트 추출물에 첨가하였다. 에틸아세테이트를 약 1/10 부피로 증발시키고 아세톤을 침전이 될 때까지 첨가하였다. 혼합물을 +5 ℃에서 밤새 방치하였다. 침전물을 G-4 여과기에서 여과하고 20 ㎖ 아세톤으로 세정 후, 20 ㎖ n-헥산으로 세정하고 실온에서 진공으로 건조하였다. 수득된 조생성물 프라바스타틴 디옥틸아민염 3.3 g 을 20 ㎖ 아세톤으로부터 재결정을 하고 2.7 g 의 순수한 프라바스타틴 디옥틸아민염을 생성하였다. 융점:143-146 ℃. 프라바스타틴 디옥틸아민염을 실시예 5에서와 같은 방법으로 프라바스타틴으로 전환하였다.

실시예 8

천연 산지에서 분리된 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97 균주의 히드록실화 능력(이것은 콤팍틴을 6β-히드록실화 시킬 수 있음)을 개발함으로써 후술할 돌연변이-선택 및 효소 유도 실험에 있어서 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97/15/13[NCAIM(P)F 001267] 돌연변이 균주를 생성하였다.

본 출원인에 의해 분리된 모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97[NCAIM(P)F 001267] 균주를 MS 사면배양 한천 배지상에서 28 ℃로 7일간 배양하였다.

배지 MS의 조성:

1000 ㎖의 증류수에

글루코스 4 g

맥아 추출물 10 g

효모 추출물 4 g

한천 20 g

포자를 사면 배양물로부터 5 ㎖ 0.9 % 염화나트륨 용액으로 세정한 후, 포자 현탁액을 멸균 페트리 접시로 이전시키고 1 분간 자외선을 방사하였다. 이어서, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 최종농도 2000 ㎍/㎖의 포자 현탁액에 첨가하였다. 이후 현탁액을 100 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에 이전시키고 28 ℃에서 20분간 150 rpm 의 속도로 진탕시켰다. 이어서, 포자를 4000 rpm의 속도로 10분간 원심분리에 의해 침강시킨 후, 멸균 0.9 % 염화나트륨 용액으로 현탁하였다. 현탁액을 10 ㎍/㎖ 의 베노밀 및 1 % 피브릴이 제거된 혈액을 함유하는 한천 플레이트 MU-VB상에 분산시켰다.

배지 MU-VB의 조성:

990 ㎖의 증류수에

글루코스 40 g

아스파라긴 2 g

펩톤 2.5 g

인산 2수소 칼륨 0.5 g

한천 20 g

멸균 후, 배지를 10 ㎖의 소혈액 및 10 ㎎의 베노밀을 첨가하여 완성하였다.

한천 플레이트를 28 ℃에서 7일간 항온배양한 후, 성장된 콜로니를 무작위적으로 선택하여 한천 배지 PS 를 함유하는 테스트 튜브로 이전시켰다.

한천 배지 PS의 조성:

1000 ㎖의 증류수에

글루코스 40 g

진균성 펩톤 10 g

한천 15 g

멸균 전에, 배지를 pH 5.6-5.7 로 조절하였다. 멸균은 121 ℃에서 20분 동안 수행하였다.

사면 배양물을 28 ℃에서 12일간 항온배양하고, 이들의 프라바스타틴 증식성을 실시예 1에서 기재한 바와 같은 진탕 플라스크 실험으로 테스트하였다. 모티에 렐라 마큘라타 n.sp. E-97/15/13 돌연변이 균주를 이러한 방법으로 선택하고, 1000㎍/㎖ 농도의 해당 콤팍틴산 나트륨염 기질로부터 60 % 를 초과하는 전환 속도로 프라바스타틴을 생성시켰다.

모티에렐라 마큘라타 n.sp. E-97/15/13 균주의 히드록실라제 효소를 100 ㎍/㎖ 8-데-(2-메틸-부티릴)콤팍틴 및/또는 콤팍틴을 함유하는 MU-VB 한천 배지상에서 배양시켜 유도하였다. 성장 콜로니를 무작위적으로 선택한 후, MU-VB 사면 배양물 함유 유도체로 이전시켰다. 발효 4일 째부터 추가적으로 11일동안 500 ㎍/㎖의 양으로 콤팍틴 기질을 공급하고 콤팍틴 나트륨 기질을 프라바스타틴으로 완전히 전환시키는 12일 동안 점진적으로 첨가하는 점에서 상이하지만 나머지 부분은 실시예 1의 방법에 따라, 성장된 사면 배양물의 프라바스타틴 증식성을 시험하였다. 30 g 의 콤팍틴 나트륨 기질로부터 50 개의 진탕 플라스크 배양물에서 수행하는 생체전환 완료시점까지, 18.5 g 의 프라바스타틴의 형성을 HPLC 로 측정하였다. 발효 브로스를 모두 합하고, 이로부터 프라바스타틴을 다음의 방법으로 회수하였다.

발효를 완료한 후, 3360 ㎍/㎖ 농도의 프라바스타틴이 있는 5.5 리터의 브로스를 20 % 황산으로 pH 3.5-3.7로 조절하였다. 이어서 산성용액을 2.75 리터의 에틸아세테이트로 추출하였다. 상들을 분리하고 정화된 추출물을 에멀션화된 유기상으로부터 원심분리에 의해 제조하였다. 브로스를 2회 더 1.37 리터의 에틸아세테이트로 전술한 바와 같이 추출하였다. 에틸아세테이트 추출물을 합하여 2 x 1.15 리터의 탈이온수로 세정한 후, 150 몰%의 디벤질아민(HPLC 로 측정한 프라바스타틴 함량에 대해 계산)을 에틸아세테이트 용액에 첨가하였다. 에틸아세테이트 용액을 약 0.23 리터의 부피까지 진공에서 농축하였다. 추가적인 20 몰% 디벤질아민을 농축물에 첨가하고 침전 용액을 0-5 ℃에서 밤새 방치하였다. 침전된 프라바스타틴산 디벤질아민염을 여과하고 침전물을 냉각된 에틸아세테이트에서 그리고 2회 n-헥산에서 현탁시킴으로써 세정하였고, 최종적으로 40-50 ℃에서 진공으로 건조하였다. 수득된 조생성물(22.4 g)을 62-66 ℃에서 0.67 리터의 아세톤에 용해시키고, 상기 용액을 2.2 g 의 챠콜로 정화하였다. 정화후, 아세톤 여과물을 진공에서 0.56 리터의 부피로 농축시켰다. 농축물로부터 침전된 결정을 상기 온도에서 다시 용해시킨 후, 상기 용액을 실온으로 냉각시켰다. 이어서, 재결정을 0-5 ℃에서 계속하였다. 침전된 결정을 여과하고 냉각된 아세톤에서 현탁액으로 2회 세정하고 n-헥산에서 2회 세정하였다. 재결정된 프라바스타틴산 디벤질아민염을 진공으로 40-50 ℃에서 건조하였다. 수득된 프라바스타틴산 디벤질아민염(14.8 g)을 740 ㎖ 에틸아세테이트-에탄올 (9:1) 혼합물내에서 40-44 ℃의 온도에서 용해시칸 후, 110 몰%의 수산화나트륨을 1 M 에탄올계 용액의 형태로 용액에 첨가하였다. 수득한 침전된 용액의 교반을 실온에서 30분간 계속한 후, 완전한 침전물을 실시의 결과 또는 1-1.5 시간 동안의 빙냉 결과로서 달성하였다. 이어서, 침전물을 여과하고 2 x 150 ㎖의 냉각된 에틸아세테이트 및 2 x 150 ㎖의 n-헥산으로 세정하고, 마지막으로 40-50 ℃에서 진공으로 건조하였다. 수득된 프라바스타틴을 에탄올에 용해시키고, 1.0 g 의 챠콜로 정화시킨 후 에탄올-에틸아세테이트 혼합물로부터 결정하였다. 이러한 방법으로 9.4 g 의 프라바스타틴을 수득하였고, 물리적인 상수는 실시예 2에 기재되어 있다.

본 발명의 바람직한 태양이 본원 명세서에 기재되어 있을지라도, 본 발명의 범위 및 본지에서 벗어나지 않고 전술된 태양이 변경되고 개질될 수 있다는 것을 당업자라면 알 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 이하에 첨부할 특허청구범위 및 특허법에 의해 요구되는 범위에만 한정되어야 할 것이다.

Claims (37)

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34. 결정형인 프라바스타틴의 나트륨염.
35. 제34항에 있어서, 약 170℃ 내지 약 173℃ 범위의 융점을 갖는 프라바스타틴의 나트륨염.
36. a) 저급 지방족 알콜 중에 프라바스타틴 및 나트륨 양이온을 함유하는 용액을 제공하는 단계;

    b) 상기 용액에 에틸 아세테이트를 첨가하는 단계: 그리고

    c) 상기 용액으로부터 프라바스타틴의 나트륨염을 결정화시키는 단계를 포함하는, 결정형인 프라바스타틴의 나트륨염의 제조 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 저급 지방족 알콜이 에탄올인 방법.

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