ES2240072T3

ES2240072T3 - Procedimiento microbiano para la preparacion de pravastatina.

Info

Publication number: ES2240072T3
Application number: ES00911709T
Authority: ES
Inventors: Antonia Jekkel; Attila Konya; Istvan Barta; Eva Ilkoy; Gyorgy Somogyi; Gabor Ambrus; Gyula Horvath; Karoly Albrecht; Istvan M. Szabo; Julianna Mozes Nee Suto; Janos Salat; Attila Andor; Laszlo Birincsik; Sandor Boros; Ildiko Lang; Margit Bidlo Nee Igloy
Original assignee: Institute for Drugs Research Ltd
Current assignee: Teva Hungary Pharmaceutical Marketing PLC
Priority date: 1999-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2020-02-03
Also published as: KR20060061406A; IS6036A; HRP20010577A2; PT1154979E; DE60019898T2; YU55701A; AR023368A1; HUP0200650A2; DE60019898D1; CN1347400A; KR100648541B1; AR061765A2; BR0009180A; MXPA01007807A; CA2361701A1; CA2361701C; CN1537935A; JP4197312B2; PL350317A1; HK1042686A1

Abstract

Procedimiento microbiano para la preparación del compuesto de **fórmula** a partir de un compuesto substrato, en la que R representa un metal alcalino o un ión amónico, que comprende las etapas siguientes: a) cultivar una cepa de la especie del hongo filamentoso Mortierella maculata capaz de 6â-hidroxilar un compuesto en un medio nutricio que contiene fuentes de nitrógeno y carbono asimilables y sales minerales, b) suministrar el substrato objeto de transformación al cultivo desarrollado de Mortierella maculata, c) fermentar el substrato hasta finalizar la bioconversión, d) separar el compuesto del caldo de cultivo, y e) aislar el compuesto.

Description

Procedimiento microbiano para la preparación de pravastatina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de pravastatina, y particularmente a un procedimiento microbiano para la producción de pravastatina a escala industrial.

Antecedentes de la invención

El factor de riesgo más alto de la ateroesclerosis y especialmente, de la oclusión coronaria, es el alto nivel de colesterol en el plasma. En las dos últimas décadas se ha examinado ampliamente la 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A reductasa (EC.1.1.1.34) como la enzima clave que limita la tasa de biosíntesis del colesterol. La pravastatina, un compuesto de la fórmula I,

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y otros compuestos relacionados (compactina, mevinolina, sinvastatina) son los inhibidores competitivos de la enzima HMG-CoA reductasa [A. Endo et al., J. Antibiot. 29, 1346-1348 (1976); A. Endo et al., FEBS Lett. 72, 323-326 (1976); C.H. Kuo et al., J. Org. Chem. 48, 1991 (1983)].

La pravastatina se aisló en primer lugar por M. Tanaka et al (resultados no publicados) de la orina de un perro durante el examen del metabolismo de la compactina (Arai, M. et al., Sankyo Kenkyusyo Nenpo, 40, 1-38, 1988). La pravastatina es habitualmente un agente que disminuye el colesterol con el mecanismo de acción más ventajoso. Su carácter más importante es la selectividad tisular, es decir, que inhibe la síntesis del colesterol en dos sitios principales de la colesterogénesis, tales como el hígado y el intestino delgado, mientras que en otros órganos no se detecta fácilmente el efecto limitante de la enzima intracelular. Al mismo tiempo, el efecto limitante de la mevinolina y de la sinvastatina sobre la biosíntesis del colesterol es significativo en la mayoría de los órganos (T. Koga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1045, 115-120, 1990).

La pravastatina difiere esencialmente en la estructura química de la mevinolina y de la sinvastatina, que tienen un carácter más lipofílico. En el caso de estos últimos compuestos, el sustituyente que se conecta al átomo de carbono C-1 de la estructura hexahidronaftalénica acaba en un anillo lactónico de 6 elementos, mientras que en el caso de la pravastatina, en vez del anillo de lactona, se encuentra la forma de la sal sódica dihidroxiácida abierta, biológicamente activa. Otra diferencia estructural importante es que en vez del grupo metilo de la mevinolina y de la sinvastatina en la posición C-6 del anillo hexahidronaftalénico, en la pravastatina puede encontrarse un grupo hidroxilo, que da lugar a un aumento ulterior en el carácter hidrofílico.

Como resultado de las diferencias estructurales mencionadas anteriormente, la pravastatina es capaz de penetrar sólo mínimamente a través de la membrana lipofílica de las células periféricas (A.T.M., Serajuddin et al., J. Pharm. Sci. 80, 830-834, 1991).

La producción industrial de pravastatina puede obtenerse mediante dos procedimientos de fermentación. En la primera etapa microbiológica, se prepara la compactina, y entonces, durante una segunda fermentación, la sal sódica de la compactina ácida como substrato es convertida a pravastatina mediante hidroxilación microbiana en la posición 6\beta.

Según las patentes publicadas, la hidroxilación microbiana de la compactina puede realizarse en diversos grados con especies fúngicas que pertenecen a distintos géneros, y con bacterias filamentosas que pertenecen al género Nocardia, con los géneros Actinomadura y Streptomyces(memoria de patente belga nº 895090, memoria de patente japonesa nº 5.810.572, patentes US nº 4.537.859 y nº 4.346.227, y la solicitud de la patente europea publicada nº 0605230). La bioconversión del substrato de compactina se publicó a una concentración de 500 \mug/ml utilizando hongos filamentosos tales como Mucor hiemalis, Syncephalastrum nigricans, Cunninghamella echinulata y en 2000 a 4000 \mug/ml con cepas de Nocardia, Actinomadura y Streptomyces pertenecientes a los procariotas.

Un problema general que se ha experimentado en los casos de preparación de la pravastatina con hongos filamentosos es que, debido al efecto antifúngico de la compactina, los microorganismos no pueden tolerar el substrato de compactina que se suministra al cultivo, incluso a concentraciones bajas (Serizawa et al., J. Antibiotics, 36, 887-891, 1983). La toxicidad celular de este substrato también se observó en la hidroxilación con Streptomyces carbophilus, estudiada ampliamente por los investigadores japoneses (M. Hosobuchi et al., Biotechnology and Bioengineering, 42, 815-820, 1993).

Los autores japoneses trataron de mejorar la capacidad hidroxilante de la cepa de Streptomyces carbophilus con técnicas de ADN recombinante. Para la hidroxilación de la compactina, es necesario un sistema citocromo P-450 monooxigenasa (Matsuoka et al., Eur. J. Biochem. 184, 707-713, 1989). Sin embargo, según los autores, en el transporte electrónico del sistema citocromo P-450 monooxigenasa bacteriano no actúa una, sino varias proteínas que complican la aplicación de las técnicas de ADN. El desarrollo de un procedimiento microbiológico de hidroxilación para la preparación de pravastatina, de un coste adecuado, constituye una tarea extremadamente dificultosa y compleja.

El objetivo de la presente invención es elaborar un nuevo procedimiento microbiano para la preparación de pravastatina a escala industrial a partir de la compactina, que producirá pravastatina en unas condiciones más ventajosas que las conocidas anteriormente. Durante el trabajo de investigación, se intentó encontrar ante todo una cepa de microorganismo con una enzima hidroxilasa que pudiera adaptarse para la transformación microbiana de compactina a pravastatina a alta concentración.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento microbiano para la preparación del compuesto de fórmula (I)

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a partir de un compuesto substrato de fórmula (II),

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en la que R representa un metal alcalino o un ión amónico, que comprende las etapas siguientes: (a) cultivar una cepa de la especie del hongo filamentoso Mortierella maculata capaz de 6\beta-hidroxilar un compuesto de fórmula (II) en un medio nutricio que contiene fuentes de nitrógeno y carbono asimilables y sales minerales, (b) suministrar el substrato objeto de transformación al cultivo desarrollado de Mortierella maculata, (c) fermentar el substrato hasta que finalice la bioconversión, (d) separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de cultivo, y (e) aislar el compuesto de fórmula (I).

La presente invención se refiere además a un cultivo biológicamente puro de la cepa E-97 n. sp. de Mortierella maculata depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro NCAIM(P)F 001266, y un cultivo biológicamente puro de su mutante, la cepa E-97/15/13 n. sp. de Mortierella maculata depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro NCAIM(P)F 001267.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una muestra de las características físicas de Mortierella maculata n. sp. E-97.

Descripción detallada de la invención

Durante el programa de rastreo, que comprendió aproximadamente 5.500 cepas procarióticas y eucarióticas, se seleccionaron 23 microorganismos, que eran capaces de hidroxilar la compactina en oposición. De entre estas cepas, una forma de hongo filamentoso se mostró más apropiada para producir pravastatina, debido a su mayor resistencia con respecto a la compactina, cuando se comparó con las cepas conocidas de las patentes ya publicadas. Según la investigación taxonómica, esta cepa demostró constituir una nueva representante de las especies pertenecientes al género Mortierella (Mortierella maculata n. sp). A partir de las formas de hongo seleccionadas se aisló, por un lado, una nueva cepa aplicando procedimientos de selección por mutación y por el otro, induciendo a la enzima hidroxilasa de la cepa, la cual fue capaz de hidroxilar el substrato de compactina a pravastatina a una concentración mayor que la publicada hasta la fecha. Como agentes mutagénicos, se aplicaron agentes físicos y químicos (irradiación UV, metil metano sulfonato, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina). Después de los tratamientos mutagénicos para preparar células haploides, la suspensión de esporas se extendió sobre placas de agar que contenían benomil, inoculándose entonces las colonias que se habían desarrollado sobre placas que contenían 100 \mug/ml de 8-de-(2-metil-butiril)-compactina o placas de agar que contenían compactina, para inducir la enzima hidroxilasa. Aplicando estos procedimientos, a partir de la nueva cepa se preparó una cepa mutante que es capaz de convertir la compactina a pravastatina en un grado significativamente superior que el de la cepa parental.

Durante los experimentos de optimización se determinaron la composición del inóculo más beneficioso, y el medio de bioconversión más ventajoso para la hidroxilación de la compactina, así como el procedimiento óptimo para el suministro repetido de la compactina a una alta concentración.

Consecuentemente, la presente invención se basa en el reconocimiento de que las cepas designadas E-97 y E-97/15/13 del hongo aislado denominado Mortierella maculata, que fueron depositadas con los números de registro NCAIM(P)F 001266 y NCAIM(P)F 001267 respectivamente, en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (Department of Microbiology and Biotechnology, University of Horticulture and the Food Industry, Budapest) bajo condiciones apropiadas de fermentación, son capaces de fabricar con un alto rendimiento la pravastatina, mientras que los compuestos relacionados no deseados tales como las formas ácidas de 6\alpha-hidroxi-compactina, 2\alpha-hidroxi-compactina, 8-de-(2-metil-butiril)-compactina, 3\alpha,5\beta-dihidroxi-5,6-dihidro-isocompactina, 8\alpha-\beta-hidroxi-compactina y los derivados hidroxilados en las posiciones 2 y 3 de la cadena lateral 2-metil-butiril de la compactina, se obtienen sólo en cantidades pequeñas o significativas durante la bioconversión. Así, estas cepas son especialmente apropiadas para fabricar la pravastatina a escala industrial.

Teniendo en cuenta que la producción con un bajo coste del ingrediente activo a escala industrial es función de la concentración del substrato de compactina, es importante tener una cepa que sea capaz de tolerar concentraciones altas de compactina y pravastatina. En consecuencia, otra parte importante de la invención es el reconocimiento de que la capacidad de hidroxilación del hongo original aislado puede mejorarse aplicando los procedimientos de selección mediante mutación e inducción enzimática y, además, de que mediante el desarrollo de un procedimiento apropiado de suministro del substrato, la hidroxilación de grandes cantidades de compactina a pravastatina pueda realizarse en un procedimiento único. En conclusión, la nueva cepa mutante denominada como Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 es especialmente apropiada para la producción de la pravastatina.

Las características taxonómicas de las nuevas especies fúngicas aisladas, comparándolas con los atributos diagnósticos más importantes de las especies conocidas de Mortierella, se describen a continuación.

Descripción taxonómica de la cepa holotipo Mortierella maculata nov. spec. E-97

En medio de agar-extracto de malta-caseína-almidón, el micelio aéreo se desarrolla bien (una capa de más de 10 \mum de grueso sobre el micelio substrato). Al principio aparece como una red blanca de hifas estrechamente entrelazadas, en las que las últimas manchas esporulantes amarillentas de algunos mm de diámetro aparecen de forma dispersa (la nueva denominación "maculatus" se refiere a lo anterior: manchadas). Esta coloración amarillenta puede a veces ocupar las superficies continuas más grandes de la red aérea. El color del micelio del substrato se presenta sobre medio de agar Czapek, Czapek sangre, tirosina, caseína-almidón, extracto de malta, etc., decolorado en su mayor parte o ligeramente amarillento. El color de la red del micelio del substrato es ligeramente rojizo sobre el medio extracto de levadura-glucosa-peptona. Sobre los medios que se han listado anteriormente, no tuvo lugar la producción de pigmentos solubles y difusibles, o sólo raramente se produjo una coloración amarillenta. Las colonias de la cepa E-97, debido a su producción de aceite volátil, y de modo similar, otras muchas especies de Mortierella, (excepto las especies de la sección Isabellina), pueden producir una exudación de un aroma intenso muy
característico.

Los esporangióforos, designados con los números de referencia 1 a 7 en la Figura 1, se desarrollan localmente en grandes cantidades, frecuentemente, sobre las hifas aéreas (pero menos en las del substrato) a distancias uno de otro muy diferentes. No presentan ramificaciones, sino que son en su mayoría curvados o rectos. Su longitud está generalmente entre 60 y 80 \mum. El punto de arranque en una abrumadora mayoría de los casos está constituido por un diámetro fuertemente engrosado y más o menos corto de las hifas de la red aérea, a partir del cual están separados por septos. Los mismos esporangióforos pueden estar asimismo hinchados (a veces muy hinchados), tal como se muestra en el número de referencia 6, pero en la dirección del esporangio se estrechan gradualmente, desde 5,0 y 9,0 \mum a 1,0 y 2,0 \mum. Constituye un importante carácter taxonómico que los esporangióforos, por debajo, nunca se ensanchan (véase el número de referencia (8)).

Los esporangios son esféricos; en algunos casos, esferas ligeramente aplanadas. Su diámetro está aproximadamente entre 6,0 y 17,0 \mum, relativamente pequeño comparado con el tamaño de los esporangios de otras especies de Mortierella. Los esporangios pueden contener muchas esporas, pero también existen esporangios que sólo contienen una. Las esporas (9) son cilíndricas o menos ovales. Su tamaño está entre 3,0 a 5,0 x 1,5 a 2,0 \mum. En el interior de las esporas individuales, pueden encontrarse una o dos pequeñas gotas oleosas esféricas oscuras (10). Debido a la muy fácil desintegración de la pared del esporangio, en los entornos húmedos, las esporas se dividirán fácilmente. Después de la desintegración del esporangio, a veces en el extremo de los esporangióforos, pueden observarse un fino "collar" tipo horca y una columela rudimentaria muy corta (y que no es típica). Las yemas (15) a (28) que son esféricas o cilíndricas pueden encontrarse en la mayoría de los distintos medios diagnósticos. Habitualmente, el tamaño está entre 10 y 25 \mum. En los cultivos, pueden encontrarse cadenas de yemas esféricas (13), células en ciernes, yemas intercaladas (15) a (23), asociaciones de hifas de crecimiento particular espiral de una de ellas aproximadamente otras (11), estructuras de tipo anastomótico y células gigantes. En el micelio aéreo, pueden apreciarse también redes de hifas voluminosas muy densas (50 a 250 pm de diámetro) (14) sin la presencia de cigotos detectables.

Los cultivos de la cepa E-97 pueden reducir nitratos a nitritos, no hidrolizan el almidón, la esculina, la arginina o la gelatina, pero hidrolizan los polisorbatos Tween y no descomponen los hidrocarburos parafínicos. Los cultivos de la cepa E-97 tienen actividad ureasa, muestran un buen desarrollo entre pH 7,0 y 9,0 y toleran un NaCl máximo del 2%. Los efectos de la xantina, hipoxantina, lecitina, tirosina y adenina, son negativos. Se ha detectado una intensa producción de ácido de los cultivos a partir de la glucosa, fructosa, glicerina y galactosa, pero muy débil o inexistente a partir de xilosa, arabinosa, rafinosa, sorbitol, inositol, inulina, etc. Se detectó un débil crecimiento con piruvato y acetato, pero no se pudo encontrar con benzoato, salicilato, citrato, lactato, succinato, tartrato y malonato. Se observó un buen crecimiento con glucosa y fructuosa como únicas fuentes de carbono en el medio. Los ensayos de utilización con xilosa, arabinosa, ramnosa, sacarosa, rafinosa, manitol e inositol, mostraron ser negativos. Los cultivos no descomponen la celulosa.

Situación sistemática: La cepa E-97 pertenece a la familia Mortiereláceas y es un miembro típico del género Mortierella: Los esporangios contienen generalmente muchas esporas, la columella está extremadamente reducida, las yemas están frecuentemente presentes, no se ha detectado la presencia de cigotos y las colonias exudan un aroma fuerte muy característico. En el género Mortierella, la cepa E-97 representa típicamente la "Sección Alpina". Ésta puede caracterizarse por esporangióforos muy cortos que no se ramifican (longitud máxima hasta 200 \mum), y esporangios diminutos (Zycha, H. y Siepmann, R, Mucorales. Eine Beschreibung aller Gattungen und Arten dieser Pilzgruppe. D-3301 Lehre, Verl. von J.Cramer. 1969). Entre los miembros de la sección Alpina, la cepa E-97 muestra la mayor similitud con las especies M. thaxteri Björling 1936 y M. renispora Dixon-Stewart 1932. Sin embargo, los datos en la Tabla 1 muestran claramente las diferencias en las propiedades diagnósticas de la cepa E-97 de estas dos especies. De acuerdo con esto, como nueva especie, presentamos la cepa en la presente memoria con el nombre de Mortierella maculata nov. spec. E-97.

TABLA 1 Comparación de la cepa holotipo E-97 de Mortierella maculata n. sp. con las especies M. renispora y M. thaxteri basándose en propiedades diagnósticas clave

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En el procedimiento para la preparación de la pravastatina según la presente invención, se utiliza preferentemente el cultivo de la cepa fúngica denominada Mortierella maculata n. sp. E-97 o de su forma mutante, denominada E-97/15/13. La cepa seleccionada presenta importantes ventajas, debido a su rápido crecimiento. Como fuente de carbono, utiliza fácilmente glucosa, glicerina, fructosa o galactosa. Como fuente de nitrógeno puede utilizar extracto de levadura, peptona, caseína, extracto de carne, harina de soja, licor de maíz, nitrato sódico, o sulfato amónico.

En el medio de cultivo utilizado para la producción de pravastatina, además de las fuentes anteriormente mencionadas de carbono y nitrógeno, pueden encontrarse sales minerales, por ejemplo, fosfato dihidrógeno potásico, cloruro magnésico, sulfato magnésico, elementos traza (sales ferrosas, de manganeso), aminoácidos y agentes antiespuma.

Según una forma de realización preferida de la presente invención, la suspensión de esporas que se ha preparado a partir del cultivo de agar inclinado en un tubo de ensayo de la Mortierella maculata n. sp. denominada cepa E-97 o de su mutante [NCAIM(P)F 001267] denominado E-97/15/13, se siembra en un medio de inoculación; entonces, el 10% del cultivo de inoculación, que se cultiva durante 3 días entre 25 y 30ºC aproximadamente, preferentemente entre 24 y 28ºC, y muy preferentemente a 28ºC aproximadamente, se transfiere al medio de bioconversión. Entonces, se incuba durante 4 días a una temperatura de entre 25ºC y 28ºC aproximadamente preferentemente a aproximadamente 28ºC, suministrándose entonces la glucosa y la sal sódica del ácido de compactina al cultivo. Dependiendo de la concentración del substrato de compactina que se ha suministrado, el cultivo se continua entre 2 y 12 días más bajo condiciones aeróbicas, mientras que el pH se mantiene entre 5,5 y 7,5, preferentemente a 7,0. La bioconversión se realiza bajo condiciones de aireación y de agitación, y si la velocidad del flujo aéreo es de 0,2 vvm, la de rotación del agitador es de 400/min.

Durante la fermentación, se hizo el seguimiento de la bioconversión del substrato de compactina mediante un procedimiento de cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Según este procedimiento, la muestra del caldo de cultivo se diluye dos veces con metanol y se centrifuga, y el sobrenadante se utiliza para el análisis HPLC bajo los siguientes parámetros: Equipo analítico Waters de HPLC; columna: Nucleosil C_{18} 10 \mum; longitud de onda detectora: 238 nm; volumen de inyección: 20 \mul, velocidad de flujo: 1 ml/min; se utiliza gradiente de elución, con los eluyentes: A= solución acuosa al 0,05% de ácido fosfórico, B = acetonitrilo.

Gradiente de elución

Tiempo (min)	Eluyente A (%)	Eluyente B (%)
0	70	30
20	0	100
25	0	100
25,1	70	30
35	70	30

Tiempos aproximados de retención: pravastatina, de 8,6 a 9,0 min; ácido de compactina de 11,6 a 12,0 min; pravastatina lactona de 15,0 a 15,5 min, compactina de 16,5 a 17,0 min.

Para la producción de pravastatina, la solución acuosa de la sal sódica del ácido de compactina se añade en la hora 96ª del cultivo. Para este procedimiento, el substrato se prepara en forma sólida de la manera siguiente. La compactina lactona es hidrolizada en una solución de hidróxido sódico 0,2 M durante 2 horas a 40ºC, ajustándose entonces el pH de la reacción a 7,5 mediante ácido clorhídrico y la solución neutralizada se dispuso en forma de capa sobre una columna adsorbente Diaion HP-20; el cloruro sódico formado durante la neutralización se eliminó mediante lavado acuoso de la columna, y entonces, la sal sódica del ácido de compactina se eluyó a partir de la columna mediante acetona acuosa al 50%. A continuación, el eluado se destiló al vacío y el residuo acuoso se liofilizó. Después de la neutralización, la solución acuosa del hidrolizado alcalino de la compactina puede utilizarse directamente, asimismo, como substrato. En este caso, el contenido de la sal sódica del ácido de compactina del hidrolizado se mide mediante HPLC, y la solución se mantiene a -20ºC hasta que vaya a aplicarse.

Cuanto más alto fue el pH del caldo de cultivo alcanzado en el cuarto día de la fermentación, más ventajosa fue la hidroxilación del substrato de compactina. Se dejó que el suministro del substrato de compactina se iniciara cuando el pH del caldo de cultivo sobrepasara 6,3. Como mucho, en el 4º día de la fermentación de la solución acuosa filtrada estéril del ácido de compactina, se añadió tanta sal sódica de ácido de compactina como se necesitó, hasta obtener una concentración de 500 \mug/ml. Asimismo, también se añadió al cultivo glucosa, a partir de una solución de ésta al 50%, esterilizada a 121ºC durante 25 minutos, de la siguiente forma: si el pH del caldo de cultivo era superior al valor de 6,7, se añadió glucosa al 1%, en relación con el volumen del caldo de cultivo, mientras que si el pH estaba entre 6,3 y 6,7, la cantidad suministrada de glucosa fue del 0,5%. La sal sódica del ácido de compactina se consumió a partir del caldo de cultivo después de 24 horas, analizándose su transformación mediante la HPLC. En este caso, por cada ml del caldo de cultivo, se añadieron otros 500 \mug de compactina. Además del substrato de compactina, se suministró asimismo glucosa, tal como se ha descrito anteriormente. La morfología del cultivo a las 120 horas se caracteriza por el pequeño crecimiento del sedimento (diámetro del sedimento, entre 0,5 y 3,0 mm). Después de 24 horas, la segunda dosis del substrato también se consumió a partir del caldo de cultivo, por lo que otra parte de la sal sódica del ácido de compactina que produce una concentración de 500 \mug/ml en todo el caldo de cultivo, se añadió paralelamente al suministro de glucosa dependiente del valor del pH del caldo de cultivo. A partir del cuarto día y hasta los días 17º a 18º de la fermentación, los suministros de substrato y de la glucosa se repitieron diariamente de la forma descrita anteriormente.

Para la recuperación del producto a partir del caldo de cultivo, es ventajoso considerar el hecho de que durante la bioconversión la pravastatina se constituye en su forma ácida, por lo que puede aislarse a partir del filtrado del caldo de cultivo mediante su adsorción sobre una columna de resina de intercambio aniónico. Para el aislamiento del producto, es ventajoso utilizar una resina de intercambio aniónico fuertemente básica que es un polímero de poliestireno-divinilbenceno que vehiculiza grupos activos de amonio cuaternario. El producto puede adsorberse directamente a partir del filtrado del cultivo, mezclando con éste la resina de intercambio aniónico que se encuentra en forma hidroxílica. El producto que se adsorbe en la resina de intercambio iónico puede eluirse a partir de la columna mediante ácido acético o una mezcla agua-acetona que contiene cloruro sódico, preferentemente una mezcla de agua-acetona (1:1) que contiene cloruro sódico al 1%. Las fracciones que contienen la pravastatina se combinan y la acetona que se encuentra en el eluado se destila al vacío. El pH del concentrado se ajusta del orden de 3,5 a 4,0 con ácido sulfúrico al 15% y la solución acuosa se extrae con acetato de etilo. El extracto de acetato de etilo se lava con agua y se seca con sulfato sódico anhidro, Entonces, a partir de la pravastatina, se prepara el derivado lactónico. El cierre del anillo de lactona se realiza en solución de acetato de etilo seco a temperatura ambiente, bajo agitación continua induciendo la formación de lactona con la presencia, en cantidades catalíticas, del ácido trifluoroacético. El procedimiento de transformación se comprueba mediante análisis de cromatografía en capa fina (TLC). Después de finalizar la formación de la lactona, la solución de acetato de etilo se lava primero con solución acuosa al 5% de carbonato de hidrógeno sódico y a continuación con agua, secándose entonces con sulfato sódico anhidro y evaporándose al vacío. El residuo de la evaporación se trata en solución de acetona con carbón, se evapora otra vez y se vuelve a cristalizar a partir de un alcohol alifático que contiene un átomo de carbono 1 a 4, preferentemente a partir de etanol. El residuo de evaporación del licor madre de recristalización se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice, aplicando la mezcla de acetato de etilo-n-hexano aumentando gradualmente el contenido del acetato de etilo como eluyente.

A partir de la pravastatina lactona obtenida después de recristalización y de purificación cromatográfica, se prepara la pravastatina mediante hidrólisis a temperatura ambiente en acetona, con una cantidad equivalente de hidróxido sódico. Cuando la formación de la sal sódica de pravastatina se completa, la mezcla reactiva se diluye con agua y se neutraliza, destilándose al vacío el contenido en acetona. La pravastatina se adsorbe a partir del residuo acuoso obtenido en una columna que contiene resina Diaion HP-20, se lava con agua desionizada y se eluye a partir de la columna con una mezcla de acetona-agua desionizada. Entonces, las fracciones que contienen pravastatina se combinan, el contenido de acetona se destila y después de liofilización del residuo acuoso, puede obtenerse la pravastatina con una gran pureza, pudiéndose recristalizar a partir de una mezcla de acetato de etilo-etanol.

Durante el procedimiento, la cantidad total de pravastatina puede ser adsorbida. Durante el cierre de la lactona de la pravastatina, pueden formarse asimismo la 3\alpha-hidroxi-iso-compactina y otros productos de desecho. Aunque estas últimas reacciones disminuyen el rendimiento del aislamiento, aquéllos compuestos pueden separarse mediante el procedimiento de purificación anteriormente mencionado y, en consecuencia, la pravastatina puede prepararse de esta forma de una calidad farmacéuticamente aceptable.

Después de finalizar la bioconversión, la pravastatina puede extraerse a partir del caldo de cultivo o del filtrado obtenido después de la separación de las células fúngicas filamentosas. Las células fúngicas filamentosas pueden eliminarse mediante filtración o centrifugación; sin embargo, es ventajoso, especialmente a escala industrial, realizar una extracción del caldo de cultivo en su totalidad. Antes de la extracción, el pH del caldo de cultivo de la fermentación o del filtrado de éste, se ajusta a un valor de entre 3,5 y 3,7 con un ácido mineral, preferentemente con ácido sulfúrico diluido. La extracción se realiza con un éster del ácido acético y un alcohol alifático que contiene 24 átomos de carbono, preferentemente con acetato de etilo o acetato isobutílico. Las etapas de extracción deberán realizarse, y muy rápidamente para evitar la formación del derivado de lactona a partir de la pravastatina, a un pH ácido.

A partir del extracto del disolvente orgánico, la pravastatina en forma ácida puede transferirse como sal sódica a a la fase acuosa. Por ejemplo, a partir de un extracto de acetato de etilo, la pravastatina puede extraerse en una proporción volumétrica de 1/10 y de 1/20 del carbonato de hidrógeno sódico al 5%, o de agua ligeramente alcalina (pH entre 7,5 y 8,0). Se descubrió que la pravastatina puede recuperarse en forma pura a partir del extracto acuoso alcalino obtenido anteriormente mediante cromatografía en columna, aplicando una resina no iónica de adsorción. Un procedimiento ventajoso es eliminar en primer lugar el disolvente disuelto en la fase acuosa mediante destilación al vacío a partir del extracto acuoso alcalino, y entonces cargar éste en una columna Diaion HP-20.

Adsorbiéndose la sal sódica de la pravastatina en la columna se purifica por elución, aumentando gradualmente el contenido de acetona de las soluciones acuosas, combinándose y concentrándose al vacío, entonces, las fracciones principales que contienen pravastatina. El concentrado acuoso es purificado posteriormente mediante cromatografía en otra columna Diaion HP-20, obteniendo un eluado que contiene pravastatina pura, a partir del cual, después de clarificación con carbón y liofilización, puede obtenerse la pravastatina de una calidad farmacéuticamente aceptable.

Este procedimiento de aislamiento está constituido por menos etapas que el anterior, ya que la formación de la lactona de la pravastatina y su hidrólisis no están implicadas en el procedimiento. Durante el aislamiento, la pravastatina se expone a condiciones ácidas durante sólo un tiempo limitado, bajo las cuales es menos estable que en las soluciones alcalinas o neutras, y en consecuencia, durante este procedimiento de aislamiento no se forman prácticamente artefactos.

Además, se descubrió que la cromatografía sobre el gel de Dextrano LH-20 de Sephadex (derivado hidroxipropilado) se utiliza ventajosamente para purificar la pravastatina. Aplicando este procedimiento puede producirse pravastatina que sobrepase la pureza del 99,5% (medida mediante HPLC).

Durante los experimentos de la presente invención, se reconoció que a partir del extracto del disolvente orgánico, preferentemente del extracto de acetato de etilo o del acetato de isobutilo del caldo de cultivo, o del nitrato del caldo de cultivo del hongo filamentoso de las cepas bacterianas filamentosas, entre ellas la de Mortierella maculata n. sp. capaz de hidroxilar en posición 6\beta un compuesto de fórmula general (II), la pravastatina puede precipitarse, con aminas secundarias, como una sal cristalina. Además, se constató que para la formación de la sal, son apropiadas varias aminas secundarias que contenían sustituyentes alquilo, cicloalquilo-, aralquilo-, o arilo-. De entre ellas se seleccionaron oportunamente aminas secundarias no tóxicas, por ejemplo, dioctilamina, diciclohexilamina, dibencilamina. El aislamiento de las sales orgánicas intermediarias de las aminas secundarias, por ejemplo, de la sal de la dibencilamina, se llevó a cabo añadiendo dibencilamina en una cantidad equivalente a 1,5, relacionada con el contenido de pravastatina del extracto, concentrándose entonces éste mediante destilación al vacío al 5% de su volumen original, añadiéndose entonces otra cantidad de dibencilamina al concentrado en una proporción equivalente de 0,2. La sal cristalina de dibencilamina precipita a partir del concentrado. El producto en bruto cristalino se filtra y se seca al vacío. Entonces, se clarifica con carbón y se vuelve a cristalizar en acetona.

En el procedimiento que se menciona anteriormente, en el que están implicadas la extracción del disolvente orgánico y la reextracción a pH alcalino, el procedimiento de aislamiento que se basa en la formación de las sales de las aminas secundarias puede utilizarse asimismo para reemplazar la purificación con la columna cromatográfica. En este caso, es ventajoso precipitar la sal de dibencilamina de la pravastatina a partir del extracto de acetato isobutílico obtenido después de la acidificación del extracto acuoso alcalino.

Las sales orgánicas de las aminas secundarias pueden transformarse en pravastatina mediante hidróxido sódico o con un alcóxido sódico, preferentemente etóxido sódico.

La transformación se detalla en el caso de la sal de dibencilamina de la pravastatina. La sal de dibencilamina que se ha vuelto a cristalizar, se suspende en una mezcla de agua y acetato de isobutilo, añadiéndose entonces una cantidad equivalente de hidróxido sódico en solución acuosa a la suspensión, manteniendo el pH entre 8,0 y 8,5 mediante agitación. Después de la desaparición de la suspensión, las fases se separan y la solución acuosa que contiene pravastatina se lava dos veces con acetato de isobutilo. La solución acuosa se clarifica con carbono activado y se liofiliza, produciendo pravastatina de una calidad farmacéuticamente aceptable.

Un procedimiento preferido para transformar la sal de dibencilamina de la pravastatina en pravastatina es suspender la sal de dibencilamina recristalizada en etanol, añadir entonces bajo agitación a la suspensión la cantidad equivalente o un pequeño exceso de etóxido sódico, concentrar entonces la mezcla reactiva al vacío y añadir acetona: la pravastatina se precipita en forma cristalina a partir del concentrado.

Otro procedimiento preferido para transformar la sal de dibencilamina de la pravastatina en pravastatina es suspender la sal de dibencilamina recristalizada en una mezcla de etanol- acetato de etilo, añadir una cantidad equivalente o un pequeño exceso de hidróxido sódico en etanol a la solución, y la pravastatina se precipita.

El aislamiento de la pravastatina a través de una sal amínica secundaria intermediaria constituye un procedimiento más sencillo que cualquiera de los procedimientos de aislamiento anteriormente conocidos. Durante el procedimiento, no se forman artefactos, y la separación de la pravastatina de los productos de desecho de la bioconversión y de los diversos productos metabólicos sintetizados por el microorganismo hidroxilante puede resolverse sin aplicar ningún procedimiento cromatográfico.

Las estructuras de la pravastatina, pravastatina lactona y de las sales de las aminas secundarias aisladas de la pravastatina, se han verificado mediante UV, IR, ^{1}H-RMN, ^{13}C-RMN y procedimientos de espectroscopía de masas.

Ejemplos

La invención se describirá y entenderá más claramente haciendo referencia a los ejemplos que se expresan a continuación, que se presentan a título de ilustración y no limitativo del alcance de la invención.

Ejemplo 1

Se preparó una suspensión de esporas con 5 ml de una solución de cloruro sódico al 0,9% obtenida a partir de un cultivo inclinado en un tubo de ensayo, de agar con extracto de levadura-extracto de malta con una duración de entre 7 y 10 días, de una cepa de Mortierella maculata nov. spec. E-97 [NCAIM(P)F 001266], capaz de 6\beta-hidroxilar la compactina, utilizándose la suspensión para inocular 100 ml de medio PI de inoculación esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml.

Composición del medio PI

glucosa	50 g
harina de soja	20 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a 7,0, esterilizándose éste entonces a 121ºC durante 25 minutos. El cultivo se agitó mediante un agitador rotatorio (250 rpm, 2,5 cm de amplitud) durante 3 días a 28ºC, transfiriéndose entonces 10 ml del cultivo obtenido a 100-100 ml de medio de bioconversión MU/4 esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml durante 25 minutos a 121ºC.

Composición del medio MU/4

glucosa	40 g
harina de soja	20 g
caseína-peptona	1g
asparagina	2 g
fosfato dihidrógeno potásico	0,5 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a 7,0, esterilizándose éste entonces a 121ºC durante 25 minutos.

Los matraces se agitaron en un agitador rotatorio (250 rpm, 2,5 cm de amplitud) durante 4 días a 25ºC, añadiéndose entonces a los cultivos 50-50 mg de substrato de compactina (sal sódica del ácido de compactina) en forma acuosa filtrada estéril, continuándose entonces el cultivo. De modo similar, en el 5º día, otros 50-50 mg de la sal sódica del ácido de compactina se añadieron a los cultivos de hongos, y se continuó la fermentación durante otras 24 horas. El contenido en pravastatina del caldo de cultivo se determinó mediante HPLC. La fermentación se continuó durante 168 horas. Al final de la bioconversión, la concentración promedio de la pravastatina del caldo de fermentación fue de 620 \mug/ml.

Ejemplo 2

En un fermentador a escala de laboratorio con un volumen de trabajo de 5 litros, se preparó un medio de cultivo MU/S de bioconversión, y los componentes del medio de cultivo que se añadieron correspondían a un volumen de 5 litros, pero se cargó sólo hasta 4,5 litros, esterilizándose entonces durante 45 minutos a 121ºC y sembrándose con 500 ml del cultivo de inoculación, preparado según el Ejemplo 1.

Composición del medio MU/8

glucosa	20 g
glicerina	20 g
harina de soja	20 g
peptona	5 g
fosfato dihidrógeno de potasio	0,5 g
polipropilenglicol 2000	1 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a un valor de 7,0.

La fermentación se realizó a 28ºC, con una velocidad de agitación de 400 rpm y con un grado de aireación de 60 litros/hora durante 4 días a partir de la dirección del fondo. En el 2º día después de la transferencia, el cultivo empezó a producir espuma intensamente, que disminuyó añadiendo más polipropilenglicol 2000. Al comienzo de la fermentación (16 a 20 horas) el pH disminuyó desde el valor inicial de 6,5 a entre 5,0 y 5,5, y entonces, desde el 3^{er} día empezó a aumentar y alcanzó entre 6,3 y 7,5 en el cuarto día. Se permitió que el suministro del substrato de compactina empezara si el pH del caldo de cultivo era superior a 6,3. En el 4º día de la fermentación, se añadieron 2,5 g de substrato de compactina en solución acuosa filtrada estéril. Se añadió al cultivo glucosa entre el 0,5 y el 1,0%, calculada para el volumen del caldo de cultivo dependiendo del pH, en forma de una solución al 50% esterilizada a 121ºC durante 25 minutos paralelamente al suministro del substrato. Después de 24 horas, el substrato de compactina se consumió a partir del cultivo, detectándose mediante HPLC a partir de las muestras tomadas del fermentador. En este caso otros 2,5 g de substrato de compactina y glucosa se añadieron tal como se ha descrito anteriormente, y la bioconversión se continuó durante otras 24 horas, cuando el substrato se convirtió a pravastatina.

Después de finalizar la fermentación, 5,1 litros del caldo de cultivo que contenían 630 \mug/ml de pravastatina se filtraron sobre un paño de filtro. Se añadieron dos litros de agua al micelio separado, agitándose entonces la suspensión del micelio durante una hora y filtrándose. Estos dos filtrados se combinaron y se hicieron pasar con una velocidad de flujo de 500 ml/hora a través de una columna Dowex Al 400 (OH) que contenía 138 g (250 ml) de resina (diámetro de columna 3,4 cm), altura del lecho de resina de 28 cm), lavándose entonces este lecho de la resina con 300 ml de agua desionizada. A continuación, se realizó la elución a partir de la resina mediante una mezcla de 1 litro de acetona-agua (1:1) que contenía 10 g de cloruro sódico. El volumen de las fracciones fue de 100 ml cada una. El eluado se analizó mediante el siguiente procedimiento cromatográfico en capa fina (procedimiento TLC): adsorbente: lámina flexible de aluminio Kieselgel 60 F _{254} DC (Merck); disolvente de revelado: mezcla de acetona-benceno-ácido acético (50:50:3); detección: con el reactivo ácido fosfomolíbdico. El valor de R_{f} de la pravastatina es de 0,5. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y la acetona se destiló al vacío. El pH del concentrado de 400 ml se ajustó a entre 3,5 y 4,0 mediante ácido sulfúrico al 15%, extrayéndose entonces tres veces con 150 ml de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo se combinaron y secaron con sulfato sódico anhidro. A continuación, se preparó la pravastatina lactona a partir de la pravastatina ácida, añadiendo a temperatura ambiente, bajo agitación continua, ácido trifluoroacético en cantidades catalíticas. La formación de pravastatina lactona se controló mediante TLC (el valor R_{f} de la pravastatina lactona en el sistema TLC anterior es de 0,7). Después de completarse la formación de la lactona, el acetato de etilo se lavó con 2 x 50 ml de solución acuosa al 5% de carbonato de hidrógeno sódico, lavándose entonces con 50 ml de agua, secándose con sulfato sódico anhidro y evaporándose al vacío. El residuo de evaporación obtenido en una cantidad de 3 g, se disolvió en 100 ml de acetona y se clarificó con 0,3 g de carbón. Entonces se filtró el carbón y la acetona se evaporó al vacío. El producto en bruto obtenido se cristalizó a partir de 20 ml de etanol. La pravastatina lactona cristalina precipitada se filtró y se lavó sobre el filtro con 30 ml de n-hexano, secándose a temperatura ambiente al vacío. De esta forma, se obtuvieron 1,5 g de pravastatina cromatográficamente pura. Temperatura de ebullición, 140-142ºC [\alpha]^{D}= +194º (c= 0,5, metanol). El licor madre de la cristalización se evaporó al vacío, obteniéndose un residuo de evaporación de 1,2 g, el cual se cromatografió en una columna que contenía 24 g de adsorbente Kieselgel 60 (diámetro de la columna: 1,6 cm, altura del lecho: 20 cm). El producto en bruto disuelto en 5 ml de benceno, se depositó en la columna. Para la elución se utilizaron mezclas de acetato de etilo-n-hexano en las que el contenido en acetato de etilo aumentaba gradualmente. La pravastatina lactona puede eluirse a partir de la columna con la mezcla de acetato de etilo al 60% n-hexano al 40%. Las fracciones se controlaron mediante TLC utilizando la mezcla de acetato de etilo-n-hexano (9:1) como disolvente de revelado. Las fracciones que contenían pravastatina-lactona se combinaron y evaporaron al vacío. Según este procedimiento, se obtuvieron 0,3 g de producto puro, siendo su calidad, idéntica a la de la pravastatina lactona obtenida por cristalización.

Los dos lotes de pravastatina lactona se combinaron y se preparó la sal sódica según el procedimiento siguiente: 1,8 g de pravastatina lactona se disolvieron en 20 ml de acetona, y con agitación, se añadieron 4,5 ml de hidróxido sódico 1M acuoso, agitándose entonces la solución durante una media hora a temperatura ambiente. Cuando la formación de la sal finalizó, 20 ml de agua se añadieron a la mezcla y la solución fue neutralizada, evaporándose entonces la acetona al vacío. El concentrado acuoso fue cromatografiado en una columna rellena con 150 ml de resina Diaion HP 20 (diámetro de la columna: 2,6 cm, altura del lecho: 30 cm). Como agentes eluyentes se utilizaron mezclas de acetona-agua desionizada, en las que la concentración de acetona aumentó en etapas del 5%. La pravastatina puede eluirse a partir de la columna mediante una mezcla de agua desionizada-acetona que contiene acetona al 15%. Las fracciones se analizaron mediante TLC. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y la acetona se evaporó al vacío. Se obtuvieron 1,3 g de pravastatina mediante liofilización del residuo acuoso. El producto cromatográficamente puro se cristalizó a partir de una mezcla de etanol y acetato de etilo.

Temperatura de fusión: 170-173ºC (descomposición)

[\alpha]^{D} _{20}= +156º, (c= 0,5, en agua).

Espectro de absorción del ultravioleta (20 \mug/ml, en metanol): \lambda_{max} = 231, 237, 245 nm (log \varepsilon-4,263; 4,311; 4,136)

Espectro de absorción infrarrojo (KBr): \nuOH 3415, \nuCH 2965, \nuC=O 1730, \nuCOO^{-} 1575 cm^{-1}

Espectro ^{1}H-RMN (D_{2}O, \delta, ppm): 0,86, d, 3H (2-CH_{3}); 5,92, dd, J=10,0 y 5,4 Hz, 1H (3-H); 5,99, d, J=10,0 Hz, 1H (4-H); 5,52, br 1H (5-H); 4,24, m, 1H (6-H); 5,34, br, 1H (8-H); 4,06, m, 1H (\beta-H), 3,65, m, 1H (\delta-H); 1,05, d, 3H (2'-CH_{3}); 0,82, t, 3H (4'-H_{3}).

Espectro ^{13}C-RMN (D_{2}O, \delta, ppm): 15,3, q (2-CH_{3}); 139,5, d, (C-3); 129,5, d, (C-4); 138,1, s, (C-4a), 127,7, d, (C-5); 66,6 d (C-6); 70,1, d (C-8); 182,6, s, (COO^{-}); 72,6, d (C-\beta); 73,0 d (C-\delta); 182,0, s (C-1'); 18,8, q (2'-CH_{3}); 13,7, q (C-4').

Espectro de masas FAB positivo (iones característicos):

[M + Na]^{-} 469; [M + H]^{+} 447.

Espectro de masas FAB negativo (iones característicos):

[M-H]^{-} 445, [M-Na]^{+} 423, m/z 101 [ácido 2-metil-butírico-H]^{-}

Ejemplo 3

En un fermentador a escala de laboratorio con un volumen de trabajo de 5 litros, se preparó un medio de cultivo MU/4 de bioconversión según se describe en el Ejemplo 1, y aunque se cargó hasta 4,5 litros, la composición del medio de cultivo se calculó hasta 5 litros, esterilizándose entonces durante 45 minutos a 121ºC y sembrándose con 500 ml del cultivo de inoculación, preparado según el Ejemplo 1. La fermentación se realizó a 25ºC, aplicando una velocidad de agitación de 300 rpm y con una tasa de aireación de 50 litros/hora durante 4 días. Después de suministrar 5 g de substrato de compactina al cultivo, se realizó la bioconversión según el Ejemplo 2.

Después de finalizar la bioconversión, el caldo de 4,9 litros, que contenía 660 \mug/ml de pravastatina, se filtró y el micelio separado se lavó suspendiéndolo en 2x1 litros de agua desionizada. El pH del filtrado combinado de 5,6 litros del caldo de cultivo se ajustó mediante el ácido sulfúrico al 20% a entre 3,5 y 3,7, agitándose entonces el filtrado ácido con 2750 ml de acetato de etilo durante 30 minutos. A continuación, las fases se separaron. La fase acuosa se extrajo otra vez con 2x1375 ml de acetato de etilo. 470 ml de agua desionizada se añadieron al extracto combinado de 4740 ml de acetato de etilo, ajustándose entonces el pH de la mezcla acuosa de acetato de etilo a entre 7,5 y 8,0 mediante hidróxido sódico 1M. Después de 20 minutos de agitación, las fases se separaron, extrayéndose entonces el extracto de acetato de etilo con 2x235 ml de agua desionizada, tal como se ha descrito anteriormente. Entonces la solución acuosa combinada débilmente alcalina de un volumen de 1080 ml, se concentró al vacío hasta un volumen de 280 ml. La solución acuosa concentrada se depositó en una columna cromatográfica (proporción de la altura al diámetro = 6,5) rellena con 280 ml de resina no iónica Diaion HP-20 (Mitsubishi, Co., Japón). La adsorción en la columna se realizó a una velocidad de flujo de 250 a 300 ml/hora, lavándose entonces la columna con 840 ml de agua desionizada. A continuación, la columna se eluyó en el orden siguiente, con 800, 1000, 500 y 500 ml de agua, que contenían respectivamente 5%, 10%, 15% y 20% de acetona. Durante la elución se recuperaron fracciones de 50 ml, que se analizaron mediante el procedimiento TLC que se ha procurado en el Ejemplo 2. Las fracciones que contenían pravastatina como componente principal, se combinaron y la solución obtenida se concentró al vacío hasta un volumen de 260 ml. La solución acuosa concentrada se cromatografió en una columna que contenía resina Diaion HP-20 en un volumen de 260 ml. Después de la adsorción de la pravastatina, la columna se lavó con 790 ml de agua desionizada, eluyéndose entonces con soluciones acuosas de acetona en porciones de 260-260 ml aumentando gradualmente el contenido en acetona de la siguiente manera: 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 12,5, 15,0 y 20,0%. Durante la cromatografía en columna se recuperaron fracciones de 25 ml, y el contenido en pravastatina de las fracciones se analizó tal como se indicó anteriormente. Las fracciones que contenían pravastatina como único componente mediante la TLC, se combinaron y evaporaron al vacío. A continuación, se añadieron 0,3 g de carbón a la solución acuosa concentrada (aproximadamente 30 ml) y la pravastatina se clarificó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Entonces, el carbón se eliminó mediante filtración a partir de la solución y el filtrado se liofilizó. De esta forma se obtuvieron
1,62 g de pravastatina en forma liofilizada.

Ejemplo 4

A partir del cultivo inclinado en un tubo de ensayo de la cepa de Mortierella maculata nov. spec. E-97 [NCAIM(P)F 001266] cultivada entre 10 y 12 días, se preparó una suspensión de esporas con 5 ml de solución estéril de cloruro sódico al 0,9%, utilizándose esta suspensión para inocular 500 ml de medio inóculo VHIG, esterilizándose en un matraz Erlenmeyer de 3000 ml.

Composición del medio VHIG

glucosa	30 g
extracto de carne	8 g
extracto de levadura	1 g
Tween-80 (polioxietileno (20) sorbitan monooleato)	0,5 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a 7,0 y dicha esterilización se realizó a 121ºC durante 25 minutos. El cultivo se realizó durante 3 días en un agitador rotatorio (250 rpm, amplitud 2,5 cm), utilizándose entonces el cultivo obtenido del inóculo para inocular un fermentador a escala de laboratorio que contenía medio de cultivo de bioconversión PK en un volumen de trabajo de 5 litros.

Composición del medio PK

glucosa	40 g
peptona	5 g
harina de soja	20 g
K_{2}HPO_{4}	2 g
KH_{2}PO_{4}	1 g
NaNO_{3}	2 g
KCl	0,5 g
en 1000 ml de agua corriente.

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a 7,0. Después de la inoculación, el cultivo, el suministro del substrato y la bioconversión se realizaron según el Ejemplo 2, aislándose entonces la pravastatina del caldo en el cual su concentración fue de 650 \mug/ml al final de la fermentación.

Finalizando la fermentación, el pH de los 4,9 litros del caldo que contenía 650 \mug/ml de pravastatina, se ajustó bajo agitación continua con hidróxido sódico 2M a un pH entre 9,5 y 10,0, ajustándose entonces después de una hora de agitación a pH entre 3,5 y 3,7 con ácido sulfúrico al 20%. A continuación, la solución ácida se extrajo con 2,45 litros de acetato de etilo. Las fases se separaron, y mediante centrifugación se preparó un extracto limpio a partir de la fase orgánica emulsificada. El caldo se extrajo otra vez con 2 x 1,22 litros de acetato de etilo mediante el procedimiento que se ha proporcionado anteriormente. Los extractos de acetato de etilo se combinaron y se añadieron 0,4 litros de agua desionizada, ajustándose entonces el pH de la mezcla a entre 8,0 y 8,5 con hidróxido sódico 1M. Las fases se separaron, y la fase de acetato de etilo se extrajo con 2 x 0,2 litros de agua desionizada de pH entre 8,0 y 8,5 como se ha explicado anteriormente. El pH de la pravastatina combinada que contenía una solución acuosa alcalina débil se ajustó bajo agitación con una solución de ácido sulfúrico al 20% con un pH de entre 3,5 y 3,7. La solución ácida obtenida se extrajo con 4 x 0,2 litros de acetato de etilo. Los extractos combinados de acetato de etilo se lavaron con 2 x 0,2 litros de agua desionizada, añadiéndose entonces a la solución de acetato de etilo dibencilamina en un porcentaje de 150 moles -calculados para el contenido de pravastatina medido mediante HPLC-. La solución de acetato de etilo se concentró al vacío hasta un volumen de 0,2 litros. Posteriormente, se añadió dibencilamina en un porcentaje de 20 moles al concentrado obtenido, y la solución que precipitó se mantuvo durante la noche a entre 0 y 5ºC. La sal de dibencilamina de pravastatina que había precipitado, se filtró, lavándose el precipitado sobre el filtro con acetato de etilo enfriado y entonces dos veces con n-hexano, y secándolo finalmente al vacío entre 40 y 50ºC. El producto en bruto obtenido (3,9 g) se disolvió en 100 ml de metanol a temperatura ambiente, clarificándose entonces la solución mediante 0,45 g de carbón. A continuación, el filtrado de alcohol metilo se concentró al vacío. El residuo evaporado se disolvió en 120 ml de acetona a una temperatura externa de entre 62 y 66ºC, enfriándose entonces la solución a temperatura ambiente. A continuación, se continuó la recristalización por la noche a entre 0 y 5ºC. Los cristales que precipitaron se filtraron, lavándose entonces éstos sobre el filtro dos veces con acetona fría y dos veces con n-hexano. La sal de dibencilamina recristalizada de pravastatina se suspendió en la mezcla de 160 ml de acetato de isobutilo y de 80 ml de agua desionizada. A continuación, se añadió a la suspensión, bajo agitación, hidróxido sódico en una cantidad equivalente. Después de la desaparición de la suspensión, las fases se separaron y la solución acuosa que contenía la pravastatina se lavó con 2 x 30 ml de acetato de isobutilo. La solución acuosa obtenida se clarificó con carbón. Entonces, el filtrado acuoso se concentró hasta un volumen de 20 ml aproximadamente. La solución acuosa obtenida se cargó en una columna cromatográfica (altura: diámetro=22) rellena con 0,4 litros de gel LH-20 en Sephadex (proveedor: Pharmacia, Suecia). Durante la cromatografía, se utilizó el agua desionizada como el eluyente, y se recuperaron fracciones de 20 ml. Las fracciones se analizaron mediante TLC, y asimismo, entonces, las que contenían pravastatina, mediante HPLC utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Las fracciones que contenían pravastatina pura se combinaron y liofilizaron. De esta forma, se obtuvieron 1,75 g de pravastatina, cuya pureza es mayor que el 99,5% mediante
HPLC.

Ejemplo 5

A partir del cultivo inclinado en un tubo de ensayo de la cepa de Mortierella maculata n. spec. E-97 [NCAIM(P)F 001266] cultivada entre 10 y 12 días, se preparó una suspensión de esporas con 5 ml de solución estéril de cloruro sódico al 0,9%, y entonces 500 ml del medio de inoculación se inocularon con ella tal como se describe en el Ejemplo 4. En un fermentador a escala de laboratorio con un volumen de trabajo de 5 litros, el medio de cultivo PC/4 de bioconversión es esterilizado durante 45 minutos a 121ºC y es inoculado, entonces, con el cultivo de
siembra.

Composición del medio PC/4

Extracto de malta	5,0%
Harina de soja	1,0%
Peptona	1,0%
Licor de maíz	1,0%
MgSO_{4} x 7H_{2}O	0,1%
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a 7,0. Después de la inoculación, el cultivo y el suministro del substrato se realizaron según el Ejemplo 2, y entonces, se obtuvieron 5,1 litros de caldo con una concentración de 610 \mug/ml de pravastatina.

A partir del caldo se produjeron mediante el procedimiento que se da a conocer en el Ejemplo 4, 3,7 g del producto en bruto de la sal de dibencilamina de pravastatina, a partir del cual se obtuvieron 2,9 g de la sal de dibencilamina de pravastatina, después de recristalización. La sal de dibencilamina pravastatina recristalizada se suspendió en 45 ml de etanol, añadiéndose entonces bajo agitación hidróxido sódico en un porcentaje de 110 moles, suministrando una solución de hidróxido sódico etanólica 1 M. La agitación de la solución continuó durante media hora, añadiéndose entonces a ella 0,3 g de carbón y agitando durante otra media hora. La solución se filtró entonces, y el filtrado se concentró hasta 15 ml. Entonces, se añadieron 60 ml de acetona al concentrado a una temperatura de entre 56 y 60ºC. La solución obtenida se enfrió a temperatura ambiente, manteniéndola entonces durante la noche a +5ºC. A continuación, se filtró el precipitado, lavándose entonces con 2 x 20 ml de acetona, 2 x 20 ml de acetato de etilo y 2 x 20 ml de n-hexano, secándose finalmente al vacío. Los 1,7 g resultantes de pravastatina se disolvieron en etanol, se clarificaron con carbono y se cristalizaron a partir de una mezcla de acetato de etilo-etanol. De esta forma, se obtuvieron 1,54 g de pravastatina que fueron idénticos con el producto del Ejemplo 2.

Ejemplo 6

Tal como se describe en el Ejemplo 4, a partir del cultivo inclinado en un tubo de ensayo de la cepa de Mortierella maculata n. spec. E-97 [NCAIM(P)F 001266] cultivada entre 7 y 10 días, un medio MI de inoculación de 500 ml esterilizado en un matraz Erlenmeyer de 3000 ml, se inoculó e incubó a 28ºC durante 3 días en un agitador rotatorio.

Composición del medio MI

glucosa	40 g
caseína	5 g
KCl	0,5 g
NaNO_{3}	3 g
KH_{2}PO_{4}	2 g
MgSO_{4} x 7H_{2}O	0,5 g
FeSO_{4} x 7H_{2}O	0,01 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a 6,0 y dicha esterilización se llevó a cabo a 121ºC durante 35 minutos. El cultivo de siembra obtenido se inoculó en un medio P12 de bioconversión de 5 litros, esterilizado en un fermentador.

Composición del medio P12

glucosa	10 g
extracto de malta	50 g
extracto de levadura	5 g
licor de maíz	5 g
MgSO_{4} x 7H_{2}O	1 g
Tween -80	0,5 g
en 1000 ml de agua corriente

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a 7,0 y dicha esterilización se realizó a 121ºC durante 45 minutos. La fermentación, el suministro del substrato y la bioconversión se realizaron según el Ejemplo 2. Después de finalizar la bioconversión, la pravastatina formada en una concentración de 620 \mug/ml, se aisló del modo siguiente:

El pH de 5,15 litros del caldo de cultivo que contenían 620 \mug/ml de pravastatina se ajustó con hidróxido sódico 2M a un valor de 9,5, agitándose entonces a temperatura ambiente durante 1 hora. El caldo se filtró y el micelio se lavó con una suspensión en 1 x 2 litros y entonces en 1 x 0,5 litros de agua. Los filtrados se combinaron y el pH de la solución acuosa se ajustó con ácido sulfúrico al 20% al valor 3,7, extrayéndose con 2,5 litros entonces con 1,5 litros de acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo se combinaron, se lavaron con 2 x 0,5 litros de agua, añadiéndose 1,95 g de diciclohexilamina. El extracto de acetato de etilo se concentró a 40ºC a 200 ml bajo presión reducida, y se añadieron otra vez al concentrado 0,195 g de diciclohexilamina, el cual se agitó entonces a 15ºC durante 6 horas. El material cristalino se precipitó, se lavó con 20 ml y con 15 ml de acetato de etilo y se secó a 40ºC. De esta forma se obtuvieron 3,51 g del producto en bruto. Después de la recristalización del producto en bruto en una mezcla acetona-etanol, se obtuvieron 3,05 g de la sal de diciclohexilamina de la pravastatina (temperatura de fusión: entre 162 y 168ºC), que se convirtió a pravastatina según el Ejemplo 5.

Ejemplo 7

La fermentación, suministro del substrato y bioconversión se realizaron con la cepa de Mortierella maculata n. spec. E-97 [NCAIM(P)F 001266], tal como se describe en el Ejemplo 2. La pravastatina obtenida como resultado de la bioconversión se aisló del caldo de la forma siguiente:

5 litros del caldo de cultivo que contenían 630 \mug/ml de pravastatina se filtraron sobre un paño de filtro. El micelio del hongo se agitó en 2 litros de solución de hidróxido sódico 0,1 M durante una hora, filtrándose. Estos dos filtrados se combinaron y el pH se ajustó con ácido sulfúrico al 15% a un valor de entre 3,5 y 4,0. A continuación, la solución se extrajo con 2 x 1,8 litros de acetato de etilo. Las fases de acetato de etilo combinadas se lavaron con 800 ml de agua. Entonces, se añadieron 400 ml de agua desionizada y el pH de la mezcla se ajustó mediante hidróxido sódico 1M a un valor de entre 8,0 y 8,5. La mezcla se agitó durante 15 minutos, separándose entonces las fases. Se añadieron 300 ml de agua a la fase de acetato de etilo y el pH se ajustó entre 8,0 y 8,5. Después de agitar durante 15 minutos, las fases se separaron. Se añadieron otra vez 300 ml de agua a la fase de acetato de etilo y el pH se ajustó entre 8,0 y 9,5, Entonces, la mezcla se agitó durante 15 minutos. Las dos fases se separaron otra vez. Todas las fases acuosas se combinaron y el pH se ajustó con ácido sulfúrico al 15% a un valor de entre 3,5 y 4,0, extrayéndolas entonces con 3 x 300 ml de acetato de etilo. Los extractos combinados de acetato de etilo se lavaron con 150 ml de agua, se sacaron con sulfato sódico anhidro y se filtraron. Entonces, se añadió al extracto de acetato de etilo dioctilamina en un porcentaje de 150 moles-calculado para el contenido de pravastatina. El acetato de etilo se evaporó hasta 1/10 del volumen aproximadamente y se añadió la acetona hasta precipitación. La mezcla se mantuvo a +5ºC durante la noche. El precipitado se filtró en un filtro G-4, se lavó con 20 ml de acetona y entonces con 20 ml de n-hexano y se secó al vacío a temperatura ambiente. Los 3,3 g obtenidos de la sal de dioctilamina en bruto de la pravastatina se volvieron a cristalizar a partir de 20 ml de acetona, dando lugar a 2,7 g puros de la sal dioctilamina de la pravastatina. Temperatura de fusión: 143-146ºC. La sal de dioctilamina de la pravastatina se convirtió a pravastatina con el procedimiento dado a conocer en el Ejemplo 5.

Ejemplo 8

Mediante el desarrollo de la capacidad de hidroxilación de la cepa Mortierella maculata n. spec. E-97, aislada del entorno natural, que es capaz de 6\beta-hidroxilar la compactina, en los experimentos que se consideran detalladamente a continuación, de selección mutacional y de inducción enzimática; Se obtuvo la cepa mutante Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 [NCAIM(P)F 001267].

La cepa de Mortierella maculata n. sp. E-97 [NCAIM(P)F 001266] aislada en la presente invención, se cultivó en un medio inclinado de MS agar a 28ºC durante 7 días.

Composición del medio MS agar

glucosa	4 g
extracto de malta	10 g
extracto de levadura	4 g
agar	20 g
en 1000 ml de agua corriente

Las esporas se lavaron lejos de los cultivos inclinados con 5 ml de cloruro sódico al 0,9%, transfiriendo después, entonces, la suspensión de las esporas a una placa estéril de Petri donde se irradiaron con luz ultravioleta durante 1 minuto. A continuación, se añadió N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina a la suspensión de esporas a la concentración final de 2000 \mug/ml. Entonces, la suspensión se transfirió a un matraz Erlenmeyer de 100 ml, agitándose a una temperatura de 28ºC a una velocidad de 150 rpm durante 20 minutos. A continuación, las esporas se sedimentaron mediante centrifugación, a una velocidad de 4000 rpm durante 10 minutos, y se suspendió entonces en una solución estéril de cloruro sódico al 0,9%. La suspensión se esparció sobre una placa de MUVB agar que contenía 10 \mug/ml de benomil y sangre desfibrinada al 1%.

Composición del medio MU-VB agar

glucosa	40 g
asparagina	2 g
peptona	2,5 g
fosfato dihidrógeno potásico	0,5 g
agar	20 g

en 990 ml de agua destilada; después de esterilización, el medio se completó con 10 ml de sangre bovina y 10 mg de benomil.

Las placas de agar se incubaron a 28ºC durante 7 días, transfiriéndose entonces las colonias que se desarrollaban, mediante selección al azar, a tubos de ensayo que contenían el medio PS de agar.

Composición del medio PS agar

glucosa	40 g
peptona micológica	10 g
agar	15 g
en 1000 ml de agua destilada.

Antes de la esterilización, el pH del medio se ajustó a un valor de entre 5,6 y 5,7. La esterilización se llevó a cabo a 121ºC durante 20 minutos.

Los cultivos inclinados se incubaron a 28ºC durante 12 días, y su producción de pravastatina se ensayó en experimentos de matraces de agitación, tal como se describe en el Ejemplo 1. Mediante este procedimiento se seleccionó la cepa mutante Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13, que produjo pravastatina que sobrepasó una tasa de conversión del 60% a partir del substrato que se había aplicado de la sal sódica del ácido de compactina, alcanzando una concentración de 1000 \mug/ml.

La enzima hidroxilasa de la cepa de Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 fue inducida por el cultivo sobre el medio MU-VB agar que contenía 100 \mug/ml 8-de-(2-metil-butiril) compactina y/o compactina. Después de la selección al azar de las colonias que se estaban desarrollando, se transfirieron a cultivos inclinados MU-VB que contenían inductores. La producción de pravastatina de los cultivos inclinados que se desarrollaban, fue analizada mediante el procedimiento que se explica en el Ejemplo 1, con la diferencia de que el suministro del substrato compactina en la cantidad de 500 \mug/ml se llevó a cabo a partir del 4º día de la fermentación para otros 11 días, y el substrato de la compactina sódica se añadió gradualmente durante los 12 días convertido completamente a pravastatina. Al finalizar la bioconversión llevada a cabo en 50 cultivos en matraces de agitación a partir de 30 g de substrato de compactina sódica, la formación de 18,5 g de pravastatina se midió mediante HPLC. La recuperación de la pravastatina a partir de los caldos combinados de la fermentación, se llevó a cabo según el procedimiento que se explica a continuación.

Después de finalizar la fermentación, el pH de los 5,5 litros del caldo con una concentración de pravastatina de 3360 \mug/ml, se ajustó con una solución de ácido sulfúrico al 20% a entre 3,5 y 3,7. A continuación, la solución ácida se extrajo mediante 2,75 litros de acetato de etilo. Las fases se separaron, y se preparó un extracto limpio mediante centrifugación a partir de la fase orgánica emulsificada. El caldo de cultivo se extrajo dos veces más con 1,37 litros de acetato de etilo, tal como se ha descrito anteriormente. Los extractos combinados de acetato de etilo se lavaron con 2 x 1,15 litros de agua desionizada, añadiéndose entonces, a la solución de acetato de etilo, dibencilamina en un porcentaje de 150 moles -calculado para el contenido en pravastatina medido mediante HPLC-. La solución de acetato de etilo se concentró al vacío hasta un volumen de 0,23 litros aproximadamente. Posteriormente se añadieron al concentrado dibencilamina en un porcentaje de 20 moles, y la solución del precipitado se mantuvo durante la noche entre 0 y 5ºC. El precipitado de la sal ácida de dibencilamina de la pravastatina se filtró, lavándose entonces el precipitado suspendiéndolo en acetato de etilo enfriado y a continuación, dos veces en n-hexano, secándolo finalmente de 40 a 50º al vacío. El producto en bruto obtenido (22,4 g)se disolvió en 0,67 litros de acetona a una temperatura de 62 a 66ºC, clarificándose la solución con 2,2 g de carbón. Después de la clarificación, el filtrado de acetona se concentró al vacío hasta un volumen de 0,56 litros. Los cristales que precipitaron del concentrado se disolvieron otra vez a la temperatura anterior, enfriándose entonces la solución a temperatura ambiente. A continuación, se continuó la recristalización por la noche entre 0 y 5ºC. Los cristales que precipitaron se filtraron, y se lavaron por suspensión dos veces en acetona enfriada y dos veces en n-hexano. La sal de dibencilamina ácida recristalizada de la pravastatina se secó al vacío a una temperatura de 40 a 50ºC. La sal de dibencilamina ácida obtenida de la pravastatina (14,8 g) se disolvió a 40-44ºC en 740 ml de una mezcla de acetato de etilo-etanol (9:1), añadiéndose entonces a la solución hidróxido sódico en un porcentaje de 110 moles, en forma de una solución etanólica 1 M. La agitación de la solución precipitada obtenida continuó durante media hora a temperatura ambiente, alcanzándose entonces una precipitación completa como resultado de aplicar frío provocado por el hielo durante entre 1 y 1,5 horas. A continuación, el precipitado se filtró y se lavó con 2 x 150 ml de acetato de etilo enfriado y de 2 x 150 ml de n-hexano,secándose finalmente al vacío a 40 a 50ºC. La pravastatina obtenida se disolvió en etanol, se clarificó con 1,0 g de carbón, se cristalizó entonces a partir de una mezcla de acetato de etilo-etanol. De esta forma, se obtuvieron 9,4 g de pravastatina, con constantes físicas que correspondían a los datos dados en el Ejemplo 2.

Claims

1. Procedimiento microbiano para la preparación del compuesto de fórmula (I)

5

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a partir de un compuesto substrato de fórmula (II),

6

en la que R representa un metal alcalino o un ión amónico, que comprende las etapas siguientes:

a): cultivar una cepa de la especie del hongo filamentoso Mortierella maculata capaz de 6\beta-hidroxilar un compuesto de fórmula (II) en un medio nutricio que contiene fuentes de nitrógeno y carbono asimilables y sales minerales,

b): suministrar el substrato objeto de transformación al cultivo desarrollado de Mortierella maculata,

c): fermentar el substrato hasta finalizar la bioconversión,

d): separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de cultivo, y

e): aislar el compuesto de fórmula (I).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho medio es un caldo de cultivo nutricio.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha etapa de separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de cultivo se realiza por adsorción en una resina de intercambio iónico aniónico.

4. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha etapa de separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de cultivo se realiza mediante extracción con un disolvente orgánico no miscible en agua, seguido por la preparación de su derivado lactónico o de su sal amínica secundaria como intermediario.

5. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha etapa de separar el compuesto de fórmula (I) del caldo de cultivo se realiza mediante purificación del extracto acuoso alcalino obtenido del extracto del disolvente orgánico del caldo de fermentación con cromatografía en una resina adsorbente no iónica.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cepa de Mortierella maculata es la cepa E-97 n. sp. de Mortierella maculata depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro NCAIM(P)F 001266.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la cepa de Mortierella maculata es la cepa E-97/15/13 n. sp. de Mortierella maculata depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro NCAIM(P)F 001267.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la enzima hidroxilasa de la cepa utilizada para la transformación es inducida por la 8-de(2-metil-butiril)compactina o la compactina.

9. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que un compuesto de fórmula (II) como substrato, se añade al cultivo paralelamente a la etapa de suministro, y en el que la etapa de suministro depende del pH del cultivo y su cantidad está relacionada con el volumen del caldo entre el 0,5 y el 1,0%.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de fermentación se realiza en un medio que contiene una fuente de carbono seleccionada de entre el grupo formado por glucosa, fructosa y glicerina.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de fermentación se realiza en un medio que contiene una fuente de nitrógeno seleccionada de entre el grupo formado por harina de soja, peptona, caseína, extracto de levadura y extracto de carne.

12. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el compuesto de fórmula (I) formado durante la bioconversión, se separa del caldo de cultivo por adsorción a partir del filtrado del caldo de cultivo y del agua de lavado del micelio en una resina de intercambio aniónico, eluyendo el compuesto de fórmula (I) a partir de la resina, transformando completamente el compuesto de fórmula (I) en su forma lactónica, aislando el derivado lactónico, hidrolizando el derivado lactónico mediante hidróxido sódico, y desalando el compuesto de fórmula (I) sobre una resina de adsorción no iónica.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha resina de intercambio aniónico que presenta grupos activos de amonio cuaternario que contienen una estructura poliestireno-divinilbencénica, se utiliza para la separación del compuesto de fórmula (I) a partir del filtrado del caldo de cultivo.

14. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el compuesto de fórmula (I) formado durante la bioconversión se extrae en forma ácida a partir del caldo de cultivo, habiendo el caldo sido acidificado a un pH de entre 3,5 y 3,7, o a partir del filtrado del caldo, mediante un disolvente orgánico no miscible en agua.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho disolvente orgánico no miscible en agua es acetato de etilo.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho disolvente orgánico no miscible en agua es acetato de isobutilo.

17. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho compuesto de fórmula (I) se extrae en forma de sal sódica a partir del disolvente orgánico mediante solución acuosa de hidróxido sódico, y se purifica en una resina de adsorción no iónica.

18. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho compuesto de fórmula (I) es precipitado a partir del extracto en forma cristalina con una amina secundaria que contiene sustituyentes alquilo-, cicloalquilo-, aralquilo-, o arilo-.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la sal cristalina de amina secundaria se suspende en una mezcla de un éster alquilo que contiene un átomo de carbono 1-4 de ácido acético y agua; se añade una cantidad equivalente de hidróxido sódico en solución acuosa a la suspensión, de tal modo que se forman una fase orgánica y una fase acuosa; las fases acuosa y orgánica se separan; la fase acuosa se lava con acetato de isobutilo, clarificándose a continuación con carbón activado; y la solución acuosa es liofilizada.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que dicho éster alquilo es éster isobutílico.

21. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la sal cristalina de amina secundaria se suspende en un alcohol que contiene un átomo de carbono 1-4; a partir de la suspensión, se prepara una solución del compuesto de fórmula (I), añadiendo una solución etanólica de hidróxido sódico; y el compuesto de fórmula (I) se precipita a partir de la solución con acetona.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicho alcohol que contiene un átomo de carbono 1-4 es etanol.

23. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que la sal cristalina de amina secundaria se disuelve en una mezcla de un éster alquilo que contiene un átomo de carbono 1-4 de un ácido carboxílico alcano que contiene un átomo de carbono 1-4 y un alcohol que contiene un átomo de carbono 1-4; y a partir de la solución el compuesto de fórmula (I) se precipita en forma cristalina añadiendo hidróxido sódico.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que dicha mezcla es una mezcla de acetato de etilo-etanol.

25. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que la pravastatina es aislada a partir del caldo de fermentación mediante la sal de dibencilamina de la forma ácida del compuesto de fórmula (I).

26. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el derivado ácido del compuesto de fórmula (I) se purifica a través de su sal de dioclohexilamina.

27. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el ácido derivado del compuesto de fórmula (I) se purifica a través de su sal de dioctilamina.

28. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el compuesto de fórmula (I) se purifica hasta por lo menos un 99,5%, tal como se mide mediante HPLC, utilizando cromatografía en gel.

29. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha cepa de Mortieriella maculata se cultiva entre aproximadamente 25 y 30ºC.

30. Cultivo biológicamente puro de la cepa E-97 n. sp. de Mortierella maculata depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro NCAIM(P)F 001266.

31. Cultivo biológicamente puro de la cepa E-97/15/13 n. sp. de Mortierella maculata depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro NCAIM(P)F 001267.

32. Cultivo de Mortierella capaz de 6\beta-hidroxilar un compuesto de fórmula (II)

7

en la que R representa un metal alcalino o un ión amónico, que consiste esencialmente en una nueva cepa de Mortierella maculata n. sp. E-97 depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro NCAIM(P)F 001266.

33. Cultivo de Mortierella capaz de 6\beta-hidroxilar un compuesto de fórmula (II)

8

en la que R representa un metal alcalino o un ión amónico, que consiste esencialmente en una nueva cepa de Mortierella maculata n. sp. E-97/15/13 depositada en la National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Budapest, Hungría, con el número de registro NCAIM(P)F 001267.