CN112955564A - 用于生产可被容易破碎并具有增加的多不饱和脂肪酸含量的生物质的方法 - Google Patents

用于生产可被容易破碎并具有增加的多不饱和脂肪酸含量的生物质的方法 Download PDF

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Abstract

根据本发明，已发现当选择在产PUFA的细胞的培养中使用的硫酸盐的量，使得在细胞生长期的最后阶段硫酸盐浓度降至零，在最终产物中获得了容易破碎的生物质，其具有增加的多不饱和脂肪酸(PUFA)质量比例。

Description

用于生产可被容易破碎并具有增加的多不饱和脂肪酸含量的 生物质的方法
本发明涉及用于生产具有增加的多不饱和脂肪酸含量的容易破碎(aufschlieβbaren)的生物质的方法，并且涉及可通过所述方法获得的生物质。
在现有技术中已描述了用于生产含有多不饱和脂肪酸(PUFA)的生物质的方法。此处经常使用的是网粘菌(Netzschleimpilze)，其在细胞中以相对大的量天然积累多不饱和脂肪酸作为储藏脂质。
这些微藻类在海水中自然生长，意味着微藻类的培养最初是在具有高氯化物含量的培养基中进行的。然而，高氯化物含量不适合在钢生物反应器中培养，因为它们会引起金属腐蚀。
因此，在现有技术中已描述了具有低氯化物含量，并且相反地具有高硫酸盐含量的发酵培养基作为替代发酵培养基。
然而，在此情况下，获得的藻类生物质通常具有有限的PUFA含量，可能是因为高硫酸盐含量意味着以存在的PUFA量为代价，最终产物中形成的细胞壁的比例相对高。此外，由于高硫酸盐含量，细胞壁相当稳定，这使得从细胞中释放油变得困难。
根据本发明，令人惊讶地发现通过在发酵期间限制硫酸盐含量，形成的PUFA的相对比例可明显增加，并且发现同时实现的细胞壁稳定性的降低可以明显地促进从细胞中释放油，这可能是通过硫酸盐限制来使细胞壁不稳定，以达到无需大量机械力的消耗即可实现从细胞中释放油的程度。
因此本发明的目的是提供一种用于提供含有PUFA的生物质的方法，其中获得的生物质在最终产物中具有增加的PUFA质量比例(massen-anteil)，并且同时促进最终产品中存在的PUFA的释放。同时，旨在优选在该方法中能够使用非腐蚀性发酵培养基。
通过生产含有PUFA的生物质的方法实现了本发明的目的，其特征在于，通过在发酵培养基中培养产PUFA的细胞来生产生物质，在所述发酵培养基中调节硫酸盐的含量，使得在发酵的最后阶段培养基中硫酸盐含量降至零。
为优化产油的目的，根据本发明的方法优选包括生长期和随后的产油期。在开放生长期首先发生的是发酵培养基中存在的产PUFA的细胞的生物质的培养和增加-其中产油被最大限度地抑制-结果是在培养基中建立了可能的最高生物质密度，而在随后的产油期(通常通过特定措施起动(Einleitung))中发生的主要是通过生物质的细胞产油，而细胞的生长至少尽可能停止。这意味着在产油期，生物质的增加至少主要不是归因于细胞计数的增加，而是归因于脂质在存在的细胞的细胞内部的积累。通过提供最佳的生长条件使生长期的细胞生长成为可能，而可通过限制单个或多个限制性因素(尤其是营养组分，例如氮源)来起动向产油期的转变。
根据本发明，“发酵的最后阶段”优选理解为意味着产油期。
根据本发明的方法，优选地其特征(zeichnen)在于培养基中硫酸盐浓度在生长期的后半段(优选在生长期的最后八分之一，特别优选刚好在产油期开始之前)降至零。
本发明进一步提供了可通过根据本发明的方法获得的生物质，优选包含破囊壶菌科的细胞的生物质。
已经发现根据本发明特别有利的是指定了培养基中的硫酸盐的含量，使得所获得的生物质中的最终硫酸盐浓度为7至10g每公斤生物质。然后，细胞仍具有足够的稳定性以保护存在的PUFA免受不希望的氧化降解。就此而言，由于添加的硫酸盐被细胞完全同化，因此可以容易地计算出添加的硫酸盐的量。以这种方式，获得的是易于破坏但仍足够稳定(以便能够被转移到干燥的生物质中)的生物质。由于相对不稳定的细胞壁，因此根据本发明的生物质可以优选地通过使用低机械力，优选仅使用至多12Wh/kg、特别优选至多10或8Wh/kg、特别是1至12Wh/kg、1至10Wh/kg或2至8Wh/kg的力作用而破碎。
类似地，本发明还提供了使用根据本发明的方法可获得的生物质。
因此，本发明特别地进一步提供了含有PUFA的生物质，其具有7至10g硫酸盐、优选7.5至9.5g硫酸盐每千克生物质。
根据本发明，“硫酸盐含量”应理解为意味着硫酸盐的总含量，即相对于生物质游离的和结合的(特别是有机结合的)硫酸盐的含量。可假设生物质中存在的大部分硫酸盐作为外多糖(Exopolysacchariden)(其参与微生物细胞壁的形成)的组成存在。
根据本发明，硫酸盐含量优选地通过确认获得的生物质的硫含量来测定，因为生物质中存在的大部分硫可归因于存在的硫酸盐。由于存在的硫酸盐的量，可忽略可归因于其它来源的硫。因此，可容易地从确认的硫的量确认存在的硫酸盐的量。
就此而言，优选地依照DIN EN ISO 11885通过元素分析来测定生物质的硫含量。为分析生物质的硫含量，在分析前将样品的适当等分试样破坏(优选使用硝酸和过氧化氢在240℃在压力下)，以确保存在的硫容易得到。
根据本发明，“生物质”、“干生物质”、“产PUFA的细胞的生物质”或“产PUFA的细胞的干生物质”通常应理解为意味着可测定的干生物质。
在此背景下，优选如下测定样品中存在的干生物质的量：收集均质样品并离心以分离出液体组分。此后，用水洗涤通过离心获得的生物质以溶解盐和任何另外可溶组分，然后再次离心。最后将由此获得的干生物质在干燥柜中干燥过夜。在此背景下，样品中存在的干生物质的百分比由干燥后测定的干生物质的质量与所研究的样品的初始质量之间的商得出。由此确认的干生物质还额外包含由生物质形成的油。
干生物质中存在的脂肪比例优选地通过在甲醇/氯仿溶液中摄取干生物质并随后对由此获得的样品进行超声处理来测定。随后将如此获得的样品用氢氧化钾皂化并使用盐酸酸化。此后，使用BF3(甲醇中的30％三氟化硼)将游离脂肪酸甲基化，并通过具有温度梯度的分配色谱法进行分离。然后通过火焰离子化检测(FID)进行检测。
根据本发明，“无脂质生物质”相应地被理解为意味着干生物质减去由此确认的脂肪比例。
根据本发明，可以以不同方式调节培养基中期望的硫酸盐浓度。
根据本发明，至关重要的是在发酵过程中硫酸盐浓度降至零，优选在生长期的后半段硫酸盐浓度降至零，特别优选在生长期的最后八分之一阶段硫酸盐浓度降至零。在此背景下，特别优选当刚好在产油期开始之前硫酸盐浓度降至零时，特别是产油期开始之前至多3小时，优选至多2小时，尤其是至多1小时。这可以容易地通过在发酵开始时的起始培养基中首先已完全填充所需的硫酸盐的量(所谓的进料方法)。所需的硫酸盐的量可以容易地计算出来，因为用于形成生物质的细胞完全同化以相对少量添加的硫酸盐。
当使用所谓的分批进料方法时，可替代地可以在发酵过程中计量所需的硫酸盐的量，或者因此，可以首先填充一些硫酸盐，并且在发酵过程中计量其余的硫酸盐。
特别是当在发酵过程中出现产生的生物质的量超过最初的计算值时，可以通过随后计量加入硫酸盐来确保所得的生物量具有足够的细胞稳定性以防止过早的油释放。
在优选的实施方案中，选择起始培养基中的硫酸盐量，使得至少在细胞的生长期的前30％的时间段期间，优选至少在细胞的生长期的前40％、50％或60％，并且特别是前70％、80％或90％的时间段期间，硫酸盐浓度高于细胞的饱和浓度。在此背景下，在特定阶段期间，硫酸盐浓度优选为至少5g硫酸盐每千克无脂质生物质。
根据本发明，所使用的硫酸盐优选为硫酸钠、硫酸铵或硫酸镁以及它们的混合物。根据本发明，硫酸盐的进料也可替代地或额外地通过使用被硫酸盐污染或补充硫酸盐的工业原料来进行。
根据本发明，进一步令人惊讶地发现，降低硫酸盐浓度也可与低氯化物浓度组合，意味着可使用非腐蚀性发酵培养基获得生物质。
因此，优选地，根据本发明的方法进一步特征在于：根据本发明使用的发酵培养基在整个发酵期间具有小于1g/l，特别是小于500mg/l，并且优选小于250mg/l的氯化物浓度。
本发明的生物质优选具有不超过2g每千克生物质，特别是0.5至1.8g，并且特别优选0.5至1.5g每千克生物质的氯化物含量。
根据本发明，“氯化物含量”应理解为意味着可测定的氯的量。例如，可根据DIN ENISO 11885通过元素分析测定存在的氯的量。氯在生物质中以被称为“氯化物”的盐的形式存在。当本申请提及“氯化物”或“氯离子”时，一直意味着仅氯离子或可检测的氯的量，而不是氯盐(其除氯离子外还一直包括阳离子抗衡离子)的量。
产PUFA的细胞优选是已天然产PUFA的细胞；然而，它们也可以是通过适当的基因技术方法能够产PUFA的细胞。在此背景下，生产可以是自养的、兼养的或异养的。
相应地，根据本发明的生物质包括此类细胞，并且优选地基本上由此类细胞组成。
优选地，细胞是异养地产PUFA的细胞。根据本发明，细胞优选采取藻类、真菌(特别是酵母)或原生生物的形式。特别优选地，细胞是微生物，特别是微生物藻类或真菌。
产油酵母的合适细胞特别是子囊菌酵母属(Yarrowia)、念珠菌属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球菌属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)的菌株。
根据本发明的生物质优选包含分类单元网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)(Labyrinthulea,Netzschleimpilze,Schleimnetze)的细胞，特别是破囊壶菌科的那些。破囊壶菌科包括以下属：Althomia、Aplanochytrium、Elnia、Japonochytrium、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、Aurantiochytrium、Oblongichytrium、或Ulkenia。尤其优选以下属的细胞：破囊壶菌属、裂殖壶菌属、Aurantiochytrium或Oblongichytrium，尤其是Aurantiochytrium属的那些细胞。特别优选的菌株是Aurantiochytrium limacinum SR21菌株(IFO 32693)。
根据本发明的生物质优选采取发酵培养方法的产物的形式。相应地，生物质不仅可含有待被破坏的细胞，而且可含有发酵培养基的组分。这些组分尤其可采取盐、消泡剂以及未反应的碳源和/或氮源的形式。此生物质中的细胞含量优选为至少70重量％，优选为至少75重量％。任选地，在进行细胞破坏过程前，可通过合适的洗涤步骤将生物质中的细胞含量增加至例如至少80重量％或至少90重量％。然而，获得的生物质也可直接用于细胞破坏过程。
优选地，生物质中的细胞的特征在于以下事实：在每种情况中，它们基于细胞干质量含有至少20重量％，优选至少30重量％，特别是至少40重量％的PUFA。
在优选的实施方案中，多数脂质以甘油三酯的形式存在，其中细胞中存在的脂质的优选至少50重量％，特别是至少75重量％，并且在尤其优选的实施方案中至少90重量％以甘油三酯的形式存在。
优选地，细胞中存在的脂肪酸的至少10重量％，特别是至少20重量％，尤其优选20至60重量％，特别是20至40重量％是PUFA。
根据本发明，多不饱和脂肪酸(PUFA)理解为意味着具有至少两个C-C双键的脂肪酸。根据本发明，在PUFA中优选高度不饱和脂肪酸(HUFA)。根据本发明，HUFA理解为意味着具有至少四个C-C双键的脂肪酸。
PUFA可以以游离形式或结合形式存在于细胞中。以结合形式存在的实例是PUFA的磷脂和酯，特别是单酰基甘油酯、二酰基甘油酯和三酰基甘油酯。在优选的实施方案中，多数PUFA以甘油三酯的形式存在，其中细胞中存在的PUFA的优选至少50重量％，特别是至少75重量％，并且在尤其优选的实施方案中至少90重量％以甘油三酯的形式存在。
优选的PUFA是ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸，其中ω-3脂肪酸是尤其优选的。在此背景下，优选的ω-3脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA,20:5ω-3)，特别是(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-二十碳5,8,11,14,17-五烯酸，以及二十二碳六烯酸(DHA,22:6ω-3)，特别是(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-二十二碳-4,7,10,13,16,19-六烯酸，其中二十二碳六烯酸是尤其优选的。
在现有技术中已详细描述了产生含PUFA的细胞(尤其是破囊壶菌目)的方法(参见例如WO91/07498、WO94/08467、WO97/37032、WO97/36996、WO01/54510)。通常通过在碳源和氮源存在下在发酵罐中培养细胞来进行生产。在此背景下，可实现大于100克每升的生物质密度和大于0.5克脂质每小时每升的生产率。该方法优选以所谓的分批进料方法进行，即在发酵期间逐步加进碳源以及可能的氮源和磷酸盐源。一旦达到期望的生物质，可通过多种措施(例如通过限制氮源、磷酸盐源或氧含量或它们的组合)诱导脂质产生。
合适的碳源是醇和非醇碳源两者。醇碳源的实例是甲醇、乙醇和异丙醇。非醇碳源的实例是果糖、葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉和玉米糖浆，以及有机酸如乙酸、丙酸和中链和长链脂肪酸以及它们的盐。根据本发明优选的方法的特征在于在完全发酵过程中将至少一种碳源连续计量加入培养基。
合适的氮源是无机氮源和有机氮源两者。无机氮源的实例是硝酸盐和铵盐，特别是硫酸铵和氢氧化铵。有机氮源的实例是氨基酸，特别是谷氨酸和尿素。
根据本发明，产油期的起动优选如WO 01/54510中所述通过限制至少一种限制性营养组分，优选通过限制至少一种氮源来进行。
除使用的硫酸盐和任何氯化物外，在发酵期间还可任选地使用其它盐，尤其是选自碳酸钠、碳酸氢钠、苏打灰或无机磷化合物的那些盐。如果使用其它盐，这些盐各自优选以小于12g/l，特别是小于8g/l，并且特别优选小于5g/l的量使用。在主发酵开始时，发酵培养基中的总盐含量优选为5至30g/l，特别是10至20g/l。
此外，还可添加有机磷化合物和/或已知的促进生长的物质，例如酵母提取物或玉米浆，以对发酵具有积极影响。
优选在pH为4至11，特别是6至10，并且优选在温度为至少20℃，特别是20℃至40℃，并且特别优选至少30℃发酵细胞。典型的发酵过程大约占用100小时。
根据本发明，优选将细胞发酵至生物质密度为至少50g/l、60g/l或70g/l，特别是50至250g/l或60至220g/l，优选至少80g/l或90g/l，特别是80至200g/l，特别优选至少100g/l，并且特别是100至180g/l。在此背景下，数据基于相对于发酵完成后发酵液总体积的干生物质含量。干生物质的含量是通过从发酵液中过滤生物质，随后用水洗涤，然后完全干燥(例如在微波炉中)并且最后确认干重来测定的。
在根据本发明优选的一个实施方案中，刚好在产油期开始前，优选在生物质密度已达到至少50g、特别优选至少80g、100g、120g或140g每升发酵培养基后，硫酸盐浓度降至零。
在收获细胞后或任选甚至在收获细胞前不久，优选将细胞进行巴氏灭菌以杀死细胞并使可能促进脂质降解的酶失活。
发酵完成后，可将获得的发酵液直接或任选地在事先浓缩后进行油分离方法，以提取存在的油。此类油分离方法例如在WO 01/53512和WO2011/153246中描述。
可替代地，发酵完成后也可收获含有PUFA的生物质。为此，优选也首先浓缩发酵液。
根据本发明，优选通过离心、过滤、倾析和/或溶剂蒸发来浓缩发酵液，以便首先从生物质中分离出大部分发酵培养基。优选使用鼓式干燥机、隧道式干燥机通过喷雾干燥或真空蒸发来实现溶剂蒸发。特别地，还可使用旋转蒸发器、薄膜蒸发器或降膜蒸发器来实现溶剂蒸发。溶剂蒸发的合适替代方式是例如逆向渗透以浓缩发酵液。
为获得生物质，优选将如此获得的浓缩发酵液优选通过流化床制粒进一步干燥。优选地，通过随后的干燥方法，生物质的水分含量减少至低于15重量％，特别是低于10重量％，并且特别优选低于5重量％。
在收获细胞后或任选甚至在收获细胞前不久，优选将细胞进行巴氏灭菌以杀死细胞并使可能促进脂质降解的酶失活。
在根据本发明特别优选的一个实施方案中，根据本发明，在例如如WO 2015/052048中所述的流化床制粒方法或喷嘴喷雾干燥方法中干燥生物质。
在干燥方法中，可任选地将二氧化硅作为防结块剂添加到生物质中，从而可将生物质转化为易于管理的状态。为此目的，优选将包含生物质的发酵液以及二氧化硅喷洒至特定的干燥区中。可替代地，优选仅在干燥方法后将生物质与二氧化硅混合。在此方面，还特别参考专利申请WO 2015/052048。
在优选的实施方案中，干燥方法后，根据本发明待使用的生物质具有0.2至10重量％，特别是0.5至5重量％，尤其是0.5至2重量％的二氧化硅(特别是亲水性或疏水性二氧化硅)浓度。
优选通过干燥方法获得自由流动的细粒度的或粗粒度的产物，优选颗粒。具有期望的粒径的产物可任选地从通过筛分或粉尘分离获得的颗粒获得。
如果获得了自由流动的细粒度的粉末，可任选地将其转变为粗粒度的、易于自由流动的并且基本上无粉尘的产物，可通过适当的压实或制粒方法存储产物。
通常在食品加工或饲料加工中用作粘合剂、胶凝剂或增稠剂的常规有机或无机助剂或载体如淀粉、明胶、纤维素衍生物或类似物质可任选地用于随后的制粒或压实方法中。
根据本发明，“自由流动”应理解为意味着可不受阻碍地从具有不同出口开口尺寸的一系列玻璃流出容器中流出，至少从具有5毫米开口的容器中流出的粉末(Klein：Seifen，
Figure BDA0003053201740000081
Fette，Wachse 94，12(1968))。
根据本发明，“细粒度”应理解为意味着具有主要级分(＞50％)的直径20至100微米的粒径的粉末。
根据本发明，“粗粒度”应理解为意味着具有主要级分(＞50％)的直径100至2500微米的粒径的粉末。
根据本发明，“无粉尘”应理解为意味着仅含有低级分(＜10％，优选＜5％)的低于100微米的粒径的粉末。
根据本发明优选通过激光衍射光谱法测定粒径。在R.H.Müller和R.Schuhmann，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart(1996)的教科书“
Figure BDA0003053201740000091
der Laborpraxis”[Particle size measurement inlaboratory practice]”，和M.Rhodes，Wiley&Sons(1998)的教科书“Introduction toParticle Technology”中描述了可用的方法。由于可使用多种方法，优选使用R.H.Müller和R.Schuhmann的教科书中首次引用的可用方法用于测量粒径。
通过根据本发明的干燥方法获得的产物优选具有至少80重量％，特别是至少90重量％，特别优选至少95重量％的具有100至3500微米，优选100至3000微米，尤其是100至2500微米的粒径的颗粒的级分。
在此情况下，根据本发明的流化床制粒方法获得的产物优选具有至少80重量％，特别是至少90重量％，特别优选至少95重量％的具有200至3500微米，优选300至3000微米，尤其是500至2500微米的粒径的颗粒的级分。
相比之下，根据本发明的喷雾干燥方法获得的产物优选具有至少80重量％，特别是至少90重量％，特别优选至少95重量％的具有100至500微米，优选100至400微米，尤其是100至300微米的粒径的颗粒的级分。
根据本发明的喷雾干燥方法和随后的制粒方法获得的产物优选具有至少80重量％，特别是至少90重量％，特别优选至少95重量％的具有100至1000微米的粒径的颗粒的级分。
粉尘的级分(即具有小于100微米的粒径的颗粒)优选为至多10重量％，特别是至多8重量％，特别优选至多5重量％，尤其是至多3重量％。
根据本发明的产物的堆积密度为优选400至800kg/m3，特别优选450至700kg/m3。
因此，本发明还进一步提供了包含根据本发明的生物质以及另外的饲料成分的饲料。
就此而言，另外的饲料成分优选选自含蛋白质、含碳水化合物、含核酸和脂溶性组分，并且如果合适，还选自其它含脂肪组分，且此外还选自其它添加剂如矿物质、维生素、色素和氨基酸。此外，除营养物外，还可存在结构化剂，例如以改善饲料的质地或外观。此外，也可使用例如粘合剂以影响饲料的稠度。优选采用的既构成营养物又构成结构化剂的组分是淀粉。
根据本发明，根据本发明的饲料或用于生产根据本发明的饲料的组合物优选特征在于以下事实：其含有1至25％重量％，优选2至20重量％，特别是3至15重量％，尤其是4至12重量％的量的根据本发明的生物质。
所述饲料或用于生产饲料的组合物优选额外具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)33至67重量％、优选39至61重量％、特别是44至55重量％的总蛋白质含量；
b)5至25重量％、优选8至22重量％、特别是10至20重量％、尤其是12至18重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选6至17重量％、尤其优选8至14重量％的总淀粉含量；
d)2至13重量％、优选3至11重量％、特别是4至10重量％、尤其是5.5至9重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1至7重量％、优选1.5至5.5重量％、特别是2至5重量％、尤其是2.5至4.5重量％的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5至3重量％、优选0.8至2.8重量％、特别是1至2.8重量％、尤其是1.3至2.4重量％、特别是1.3至2.2重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供饲料或适于生产饲料的组合物，其具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)33至67重量％、优选39至61重量％、特别是44至55重量％的总蛋白质含量；
b)5至25重量％、优选8至22重量％、特别是10至20重量％、尤其是12至18重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选6至17重量％、尤其优选8至14重量％的总淀粉含量；
d)2至13重量％、优选3至11重量％、特别是4至10重量％、尤其是5.5至9重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1至7重量％、优选1.5至5.5重量％、特别是2至5重量％、尤其是2.5至4.5重量％的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5至3重量％、优选0.8至2.8重量％、特别是1至2.8重量％、尤其是1.3至2.4重量％、特别是1.3至2.2重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供饲料或适于生产饲料的组合物，其具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)33至67重量％、优选39至61重量％、特别是44至55重量％的总蛋白质含量；
b)5至25重量％、优选8至22重量％、特别是10至20重量％、尤其是12至18重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选6至17重量％、尤其优选8至14重量％的总淀粉含量；
d)2至24重量％、优选4至22重量％、特别是9至20重量％、尤其是11至18重量％的根据本发明的生物质、特别是根据本发明的网粘菌纲生物质、优选根据本发明的破囊壶菌科生物质的生物质的含量；
e)2至13重量％、优选3至11重量％、特别是4至10重量％、尤其是5.5至9重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1至7重量％、优选1.5至5.5重量％、特别是2至5重量％、尤其是2.5至4.5重量％的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5至3重量％、优选0.8至2.8重量％、特别是1至2.8重量％、尤其是1.3至2.4重量％、特别是1.3至2.2重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供饲料或适于生产饲料的组合物，其具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)33至67重量％、优选39至61重量％、特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)5至25重量％、优选8至22重量％、特别是10至20重量％、尤其是12至18重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选6至17重量％、尤其优选8至14重量％的总淀粉含量；
d)1至25重量％、优选2至20重量％、特别是3至15重量％、尤其是4至12重量％的根据本发明的Aurantiochytrium或裂殖壶菌属生物质、优选根据本发明的Aurantiochytriumlimacinum生物质、尤其是根据本发明的Aurantiochytrium limacinum SR21生物质的含量；
e)2至13重量％、优选3至11重量％、特别是4至10重量％、尤其是5.5至9重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1至7重量％、优选1.5至5.5重量％、特别是2至5重量％、尤其是2.5至4.5重量％的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5至3重量％、优选0.8至2.8重量％、特别是1至2.8重量％、尤其是1.3至2.4重量％、特别是1.3至2.2重量％的DHA含量。
通过挤出上述组合物，可获得挤出物。本发明优选提供所述挤出物。就此而言，饲料的挤出优选以12至28Wh/kg，特别是14至26Wh/kg，尤其优选16至24Wh/kg，尤其是18至22Wh/kg的能量输入进行。
就此而言，在挤出方法中优选采用螺杆挤出机或双螺杆挤出机。挤出方法优选在80至220℃，特别是80至130℃、尤其是95至110℃的温度，10至40bar的压力以及100至1000rpm，特别是300至700rpm的杆旋转速度进行。起动的混合物的停留时间为优选5至30秒、特别是10至20秒。
挤出方法可任选地包括压实步骤和/或压缩步骤。
优选在进行挤出方法前将各组分彼此密切混合。这优选在配备有叶片的鼓中进行。在优选的实施方案中，此混合步骤包括注入蒸汽，特别是以便导致优选存在的淀粉膨胀。就此而言，蒸汽的注入优选在1至5bar的压力、特别优选在2至4bar的压力进行。
在与藻类生物质混合前，如果需要，优选将其它饲料成分粉碎，以便确保在混合步骤中获得均匀混合物。其它饲料成分的粉碎可例如使用锤式粉碎机进行。
产出的挤出物优选具有1至14mm，优选2至12mm，特别是2至6mm的直径，并且优选还具有1至14mm，优选为2至12mm，特别是2至6mm的长度。在挤出期间，使用切割工具设定挤出物的长度。优选选择挤出物的长度使得其大致对应于挤出物的直径。挤出物的直径通过选择筛直径来限定。
在根据本发明优选的一个实施方案中，在挤出方法后用油加载获得的挤出物。为此，优选首先将挤出物干燥至水分含量不多于5重量％。根据本发明，可通过例如将挤出物置于油中或用油喷洒挤出物而用油加载挤出产物；然而，根据本发明，优选真空镀膜。
以此方式，获得了饲料，其以优选1至25重量％，特别是2至20重量％，尤其优选3至15重量％，尤其是4至12重量％的量含有根据本发明的生物质。
相应地，所述饲料优选额外具有以下特性的至少一种，优选全部：
a)30至60重量％、优选35至55重量％、特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)15至35重量％、优选18至32重量％、特别是20至30重量％、尤其是22至28重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选5至15重量％、尤其优选7至13重量％的总淀粉含量；
d)2至12重量％、优选3至10重量％、特别是4至9重量％、尤其是5至8重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1至6重量％、优选1.5至5重量％、特别是2至4.5重量％、尤其是2.5至4重量％的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5至3重量％、优选0.8至2.5重量％、特别是1至2.5重量％、尤其是1.2至2.2重量％、特别是1.2至2.0重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供具有以下特性的至少一种，优选全部特性的饲料，特别是挤出物：
a)30至60重量％、优选35至55重量％、特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)15至35重量％、优选18至32重量％、特别是20至30重量％、尤其是22至28重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选5至15重量％、尤其优选7至13重量％的总淀粉含量；
d)2至12重量％、优选3至10重量％、特别是4至9重量％、尤其是5至8重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
e)1至6重量％、优选1.5至5重量％、特别是2至4.5重量％、尤其是2.5至4重量％的ω-3脂肪酸含量；
f)0.5至3重量％、优选0.8至2.5重量％、特别是1至2.5重量％、尤其是1.2至2.2重量％、特别是1.2至2.0重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供具有以下特性的至少一种，优选全部特性的饲料，特别是挤出物：
a)30至60重量％、优选35至55重量％、特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)15至35重量％、优选18至32重量％、特别是20至30重量％、尤其是22至28重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％、特别是至多20重量％、优选5至15重量％、尤其优选7至13重量％的总淀粉含量；
d)1至25重量％、优选2至20重量％、特别是3至15重量％、尤其是4至12重量％的根据本发明的生物质、特别是根据本发明的网粘菌纲生物质、优选根据本发明的破囊壶菌科生物质的含量；
e)2至12重量％、优选3至10重量％、特别是4至9重量％、尤其是5至8重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1至6重量％、优选1.5至5重量％、特别是2至4.5重量％、尤其是2.5至4重量％的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5至3重量％、优选0.8至2.5重量％、特别是1至2.5重量％、尤其是1.2至2.2重量％、特别是1.2至2.0重量％的DHA含量。
因此，本发明优选还提供具有以下特性的至少一种，优选全部特性的饲料，特别是挤出物：
a)30至60重量％，优选35至55重量％，特别是40至50重量％的总蛋白质含量；
b)15至35重量％，优选18至32重量％，特别是20至30重量％，尤其是22至28重量％的总脂肪含量；
c)至多25重量％，特别是至多20重量％，优选5至15重量％，尤其优选7至13重量％的总淀粉含量；
d)1至25重量％，优选2至20重量％，特别是3至15重量％，尤其是4至12重量％的根据本发明的Aurantiochytrium或裂殖壶菌属生物质、优选根据本发明的Aurantiochytriumlimacinum生物质、尤其是根据本发明的Aurantiochytrium limacinum SR21生物质的含量；
e)2至12重量％，优选3至10重量％，特别是4至9重量％，尤其是5至8重量％的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量；
f)1至6重量％，优选1.5至5重量％，特别是2至4.5重量％，尤其是2.5至4重量％的ω-3脂肪酸含量；
g)0.5至3重量％，优选0.8至2.5重量％，特别是1至2.5重量％，尤其是1.2至2.2重量％，特别是1.2至2.0重量％的DHA含量。
根据本发明，除根据本发明待使用的生物质外，使用的含脂肪组分可为动物和植物两者来源的脂肪，特别是油。根据本发明，合适的含脂肪组分特别是植物油，例如大豆油、菜籽油、葵花籽油、亚麻籽油或棕榈油以及它们的混合物。此外，鱼油也可任选地以低的量用作含脂肪组分。
根据本发明，使用的含蛋白质组分可以是例如大豆蛋白、豌豆蛋白、小麦面筋或玉米面筋以及它们的混合物。
下列实例可用作额外含有脂肪的含蛋白质组分：鱼粉、磷虾粉、蚌粉、鱿鱼粉或虾壳。这些在下文中被归入术语“海产粉”。在优选的实施方案中，本发明的饲料以3至18重量％，特别是5至15重量％，尤其是7至13重量％的量包含海产粉，优选鱼粉。
使用的含碳水化合物组分可以是例如小麦粉、向日葵粉或大豆粉以及它们的混合物。
当在动物养殖中使用根据本发明的饲料，特别是根据本发明的油包被的挤出物时，越来越明显的这尤其促进了动物的生长并改善了动物的应激水平。
本发明还进一步提供了用于养殖动物的方法，其特征在于，对其施用根据本发明的饲料。
对此而言，本发明特别提供了增加动物生长的方法，其特征在于，对其施用根据本发明的饲料。
本发明特别类似地进一步提供了用于增加动物肌肉组织中的ω-3脂肪酸，特别是DHA的分数的方法，其特征在于，对其施用根据本发明的饲料。
优选地，在根据本发明的方法中，至少每两天一次，优选至少每天一次施用饲料。
本发明进一步类似地提供了根据本发明的饲料在增加动物生长中的用途。
本发明同样进一步提供了根据本发明的饲料在增加动物肌肉组织中的ω-3脂肪酸分数中的用途。
本发明同样进一步提供了根据本发明的饲料在改善动物的身体状况，特别是在改善动物的应激水平中的用途。
本发明同样进一步提供了根据本发明的饲料在允许动物的应激减少的养殖中的用途。
用本发明的饲料喂养的养殖动物优选是家禽、猪或牛。
然而，养殖的动物尤其优选是海洋动物，特别优选有鳍鱼或甲壳类。这些特别包括鲤鱼、罗非鱼、鲶鱼、金枪鱼、鲑鱼、鳟鱼、澳洲肺鱼、鳊鱼、金鲈、鳕鱼、虾、龙虾、蟹、对虾和小龙虾。养殖的动物尤其优选鲑鱼。在此背景下，鲑鱼的优选类型是大西洋鲑、红鲑、masusalmon、王鲑、大马哈鱼、银鲑、多瑙河鲑、太平洋鲑和粉红鲑。
养殖的动物特别地也可以是鱼，其随后被加工为鱼粉或鱼油。就此而言，鱼优选是鲱鱼、绿鳕、油鲱、凤尾鱼、毛鳞鱼或鳕鱼。如此获得的鱼粉或鱼油又可用于水产养殖，以养殖食用鱼或甲壳类。
然而，养殖的动物也可以是在水产养殖中用作饲料的小型生物。这些小型生物可采取例如线虫类、甲壳类或轮虫类的形式。
海洋动物的养殖可在池塘、水箱、盆或在海洋或湖泊的隔离区域中进行，特别是在此情况下在笼或网箱中进行。养殖可用于养殖成品食用鱼，但也可用于养殖随后放生以补充野生鱼群的鱼苗。
在鲑鱼养殖中，鱼优选首先在淡水水箱或人工水道中生长为二龄鲑，然后在漂浮在海中并优选锚定在海湾或峡湾中的笼或网箱中继续生长。
相应地，根据本发明的饲料优选是用于上述动物的养殖的饲料。
示例性实施方案
实施例1通过在具有高硫酸盐含量的培养基中发酵Aurantiochytrium limacinumSR21并随后干燥生物质来生产生物质
使用具有2升的发酵罐容积的钢发酵罐在进料过程中将细胞培养约70小时，其中总起始质量为约700g以及获得的最终总质量为约1.5kg。在过程期间，计量加入葡萄糖溶液(570g/kg葡萄糖)(“分批进料过程”)。
起始培养基的组成如下：
培养基1：20g/kg葡萄糖；4g/kg酵母提取物；2g/kg硫酸铵；12g/kg或16g/kg硫酸钠；2.46g/kg硫酸镁(七水合物)；0.45g/kg氯化钾；4.5g/kg磷酸二氢钾；0.1g/kg硫胺素(HCl)；5g/kg微量元素溶液。
微量元素溶液的组成如下：35g/kg盐酸(37％)；1.86g/kg氯化锰(四水合物)；1.82g/kg硫酸锌(七水合物)；0.818g/kg EDTA钠；0.29g/kg硼酸；0.24g/kg钼酸钠(二水合物)；4.58g/kg氯化钙(二水合物)；17.33g/kg硫酸亚铁(七水合物)；0.15g/kg氯化铜(二水合物)。
培养在以下条件下进行：培养温度28℃；曝气率0.5vvm，搅拌器速度600至1950rpm，使用氨水(25％v/v)将生长期的pH控制为4.5。通过限制磷酸盐和氮气起动产油期之前，进行发酵至生物质密度达到80g/l。由于起始培养基中直至发酵结束(即包括直至产油期结束)的高硫酸盐含量，硫酸盐浓度一直高于细胞的饱和极限，为约5g每千克干生物质。以下将获得的生物质称为“生物质1”(在起始培养基中12g/kg硫酸钠)和“生物质2”(在起始介质中16g/kg硫酸钠)。
通过根据DIN ISO 11885测定生物质中的硫含量来测定获得的生物质中的硫酸盐含量。
实施例2：通过在具有低硫酸盐含量的培养基中发酵Aurantiochytriumlimacinum SR21并随后干燥生物质来生产生物质
使用具有2升的发酵罐容积的钢发酵罐在进料过程中将细胞培养约70小时，其中总起始质量为约712g以及获得的最终总质量为约1.5kg。在过程期间，计量加入葡萄糖溶液(570g/kg葡萄糖)(“分批进料过程”)。
起始培养基的组成如下：
培养基1：20g/kg葡萄糖；4g/kg酵母提取物；0g/kg硫酸铵；2.46g/kg硫酸镁(七水合物)；0.45g/kg氯化钾；4.5g/kg磷酸二氢钾；0.1g/kg硫胺素(HCl)；5g/kg微量元素溶液。
微量元素溶液的组成如下：35g/kg盐酸(37％)；1.86g/kg氯化锰(四水合物)；1.82g/kg硫酸锌(七水合物)；0.818g/kg EDTA钠；0.29g/kg硼酸；0.24g/kg钼酸钠(二水合物)；4.58g/kg氯化钙(二水合物)；17.33g/kg硫酸亚铁(七水合物)；0.15g/kg氯化铜(二水合物)。
培养在以下条件下进行：培养温度28℃；曝气率0.5vvm，搅拌器速度600至1950rpm，使用氨水(25％v/v)将生长期的pH控制为4.5。通过限制磷酸盐和氮气起动产油期之前，进行发酵至生物质密度达到80g/l。起动产油期后，硫酸盐浓度已降至低于0.05g每千克发酵培养基的检测极限，并且硫酸盐浓度在整个产油期期间相应地也低于检测极限。并且由于未计量添加硫酸盐，在产油期的过程中，硫酸盐浓度降至零。以下将获得的生物质称为“生物质3”。
实施例3：检查和比较获得的生物质和方法
培养过程后，将发酵液加热至60℃持续20分钟，以防止进一步的细胞活性。
这以后是生物质的两阶段干燥：首先，通过蒸发将发酵液浓缩至干质量为约20重量％。其后，使用Production MinorTM喷雾干燥器(GEA NIRO)在340℃的干燥空气入口温度对浓缩的发酵液进行喷雾干燥。喷雾干燥因此得到具有干质量为超过95重量％的粉末。
表1：比较获得的生物质
Figure BDA0003053201740000181
生物质1和2是依据实施例1通过在高硫酸盐含量发酵获得的生物质；与之相比，生物质3是依据实施例2通过在低硫酸盐含量发酵获得的生物质。
可以看出，与在高硫酸盐含量进行并导致生物质1和2的那些过程相比，在低硫酸盐含量进行并导致生物质3的发酵过程提供了具有明显更高纯度的产品，即DHA比例明显提高的产品。此外，所获得的生物质中的硫酸盐含量也明显低于使用高硫酸盐含量的方法的情况。

Claims (15)

1.通过在发酵培养基中培养产PUFA的细胞来生产含有PUFA的生物质的方法，其特征在于，调节硫酸盐的含量，使得在发酵过程中硫酸盐浓度降至零。
2.权利要求1的生产含有PUFA的生物质的方法，所述方法包括生长期和产油期，其特征在于，在产油期开始之前发酵培养基中的硫酸盐浓度降至零。
3.权利要求2的方法，其特征在于，在生长期的后半段，优选在生长期的最后八分之一，特别优选刚好在产油期开始之前，发酵培养基中的硫酸盐浓度降至零。
4.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，指定硫酸盐的量，使得最终硫酸盐浓度为7至10g、优选7.5至9.5g硫酸盐每千克生物质。
5.前述权利要求任一项的方法，其包括以下步骤作为另外的步骤：使用低机械力，优选至多12Wh/kg、特别是1至10Wh/kg的力作用获得生物质的机械破碎。
6.权利要求1至5任一项的方法，其特征在于，对由此获得的发酵液进行油的分离。
7.权利要求1至5任一项的方法，其特征在于，任选地在之前浓缩后进一步将由此获得的发酵液加工成饲料，优选在低能量输入的情况下。
8.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，培养细胞，优选在生长期培养细胞，直至以下的生物质密度：至少50g每升发酵培养基，特别是50至250g每升发酵培养基，优选至少80g、100g、120g或140g每升发酵培养基，并且特别是80g、100g、120g或140g至200g或220g每升发酵培养基。
9.权利要求8的方法，其特征在于，在生物质密度已达到至少50g、优选至少80g、特别是至少100g或120g每升发酵培养基后，培养基中的硫酸盐浓度降至零。
10.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，通过限制至少一种限制性营养组分、特别是通过限制氮源来起动产油期。
11.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，在产油期的整个阶段期间培养基中的硫酸盐浓度低于0.05g每千克发酵培养基，并优选为零。
12.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，在整个发酵期间，其含有的氯化物含量为不超过3g每千克发酵培养基。
13.前述权利要求任一项的方法，其特征在于，所述微生物是分类单元网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)(Labyrinthulea,Netzschleimpilze,Schleimnetze)的那些，特别是破囊壶菌科(Familie der Thraustochytriaceae)的那些，优选以下属：Althomia、Aplanochytrium、Elnia、Japonochytrium、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、Aurantiochytrium、Oblongichytrium或Ulkenia，尤其是以下属的那些：裂殖壶菌属或Aurantiochytrium，尤其是物种Aurantiochytrium limacinum。
14.含有PUFA的生物质，其特征在于，其包含分类单元网粘菌纲的微生物，并且其具有7至10g、优选7.5至9.5g硫酸盐每千克生物质的硫酸盐含量。
15.前述权利要求任一项的含有PUFA的生物质，其特征在于，分类单元网粘菌纲(Labyrinthulea,Netzschleimpilze,Schleimnetze)的细胞是破囊壶菌科的那些，优选以下属：Althomia、Aplanochytrium、Elnia、Japonochytrium、裂殖壶菌属、破囊壶菌属、Aurantiochytrium、Oblongichytrium或Ulkenia，特别优选以下属的那些：裂殖壶菌属或Aurantiochytrium，尤其是物种Aurantiochytrium limacinum。
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