WO2020094751A1 - Verfahren zur herstellung einer leicht aufschliessbaren biomasse mit erhöhtem gehalt an polyungesättigten fettsäuren - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer leicht aufschliessbaren biomasse mit erhöhtem gehalt an polyungesättigten fettsäuren Download PDF

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WO2020094751A1
WO2020094751A1 PCT/EP2019/080458 EP2019080458W WO2020094751A1 WO 2020094751 A1 WO2020094751 A1 WO 2020094751A1 EP 2019080458 W EP2019080458 W EP 2019080458W WO 2020094751 A1 WO2020094751 A1 WO 2020094751A1
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weight
biomass
sulfate
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fermentation
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PCT/EP2019/080458
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Horst Priefert
Jens Schneider
Joachim WINDAU
Gabriel ZÁVODSKÝ
Christian Rabe
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Evonik Operations Gmbh
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/158—Fatty acids; Fats; Products containing oils or fats
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an easily digestible biomass with an increased content of polyunsaturated fatty acids and to a biomass obtainable by this method.
  • microalgae naturally grow in seawater, so that the microalgae were initially cultivated in media with a high chloride content.
  • high chloride levels are unsuitable for cultivation in steel bioreactors because they cause corrosion of the metal.
  • the Aigen biomass obtained generally has a limited PUFA content, possibly because the high sulfate content means that the proportion of cell wall formed in the final product is relatively high at the expense of the amount of PUFAs contained.
  • the cell wall is also quite stable, which makes it difficult to release the oil from the cells.
  • the relative proportion of PUFAs formed can be increased significantly and that the release of the oil from the cells can be significantly facilitated by the reduction in the stability of the cell wall which is achieved at the same time by limiting the sulfate, the cell wall can be destabilized to such an extent that the oil can be released from the cells without great mechanical effort.
  • the object of the present invention was therefore to provide a method for providing a biomass containing PUFAs, in which the biomass obtained has an increased mass fraction of PUFAs in the final product and at the same time the release of the PUFAs contained in the final product is facilitated. At the same time, it should preferably be possible to use a non-corrosive fermentation medium in the process.
  • the object of the invention is achieved by a method for producing a biomass containing PUFAs, characterized in that for the production of the biomass, the cells producing PUFAs are cultivated in a fermentation medium, the sulfate content being adjusted so that the sulfate content in the last phase of fermentation falls to zero.
  • Methods according to the invention preferably comprise a growth phase and a subsequent oil production phase in order to optimize oil production.
  • a growth phase the cultivation and the increase of the biomass in the Fermentation medium containing PUFAs producing cells - as far as possible
  • the “last phase of the fermentation” preferably means the oil production phase.
  • Processes according to the invention are preferably characterized in that the sulfate concentration in the fermentation medium drops to zero in the second half of the growth phase, preferably in the last eighth of the growth phase, particularly preferably shortly before the oil production phase begins.
  • the present invention furthermore relates to biomasses, preferably those which contain cells of the family of the Thraustochytriaceae, which can be obtained by methods according to the invention.
  • biomasses according to the invention can accordingly preferably use low mechanical forces, preferably already apply a force of up to 12 Wh / kg, particularly preferably up to 10 or 8 Wh / kg, in particular 1 to 12 Wh / kg, 1 up to 10 Wh / kg or 2 to 8 Wh / kg.
  • Another object of the present invention is also a biomass that can be obtained with a method according to the invention.
  • Another object of the present invention is therefore in particular a biomass containing PUFAs, which has a sulfate content of 7 to 10 g sulfate, preferably 7.5 to 9.5 g sulfate, per kg biomass.
  • sulfate content is understood to mean the total content of sulfate, ie the content of free and bound, in particular organically bound, sulfate in relation to the biomass. It can be assumed that the majority of the sulfate contained in the biomass is present as a component of exopolysaccharides that contribute to the formation of the cell wall
  • Microorganisms are involved.
  • the sulfate content is preferably determined by determining the sulfur content of the biomass obtained, since the majority of the sulfur contained in the biomass can be attributed to the sulfate contained. Sulfur, which can be traced to other sources, is negligible due to the amount of sulfate contained. The amount of sulfate contained can thus be readily determined from the amount of sulfur found.
  • the sulfur content of the biomass is preferably determined by elemental analysis in accordance with DIN EN ISO 11885. For the analysis of the sulfur content of the biomass
  • bio-dry mass of PUFAs producing cells is generally to be understood as the determinable bio-dry mass.
  • the amount of dry biomass contained in a sample is preferably determined as follows: A homogeneous sample is taken and for the purpose of separating the liquid
  • Bio dry mass after drying and initial mass of the examined sample also includes the oil formed by the biomass.
  • the fat content contained in the dry biomass is preferably determined by taking up the dry biomass in a methanol / chloroform solution and subsequent ultrasound treatment of the sample thus obtained. - The sample thus obtained is then saponified with potassium hydroxide and acidified using hydrochloric acid. The free fatty acids are then methylated using BF3 (30% boron trifluoride in methanol) and by partition chromatography using a
  • lipid-free biomass is understood to mean the dry biomass minus the fat content determined in this way.
  • the desired sulfate concentration in the medium can be set in different ways.
  • the sulfate concentration drops to zero in the course of the fermentation, the sulfate concentration preferably falling to zero in the second half of the growth phase, particularly preferably in the last eighth of the time of the growth phase. It is particularly preferred here if the sulfate concentration shortly before the start of the oil production phase, in particular up to 3 hours, preferably up to 2 hours, especially up to one hour before the start of the oil production phase. - This can be achieved simply by completely introducing the required amount of sulfate in the batch medium at the start of the fermentation (so-called batch process). The amount of sulfate required can be easily calculated since the cells used to form the biomass completely assimilate the sulfate added in a relatively small amount.
  • the amount of sulfate required can alternatively be metered in during the fermentation, or a portion of the sulfate can be introduced accordingly and the rest metered in during the fermentation.
  • the amount of sulfate in the batch medium is selected such that the sulfate concentration changes at least during the first 30% of the time in the growth phase of the cells, preferably at least during the first 40, 50 or 60%, in particular during the first 70, 80 or 90%, the time of the growth phase of the cells, above that
  • Saturation concentration of the cells is located.
  • the sulfate concentration is preferably at least 5 g sulfate per kg lipid-free biomass during the specified phase.
  • sodium sulfate, ammonium sulfate or magnesium sulfate and mixtures thereof are preferably used as the sulfate salt.
  • the sulfate can alternatively or additionally also be introduced by using technical
  • Raw materials are made that are contaminated or supplemented with sulfate.
  • Shutting down the sulfate concentration can also be combined with low chloride concentrations so that the biomass can be obtained with a non-corrosive fermentation medium.
  • a method according to the invention is therefore preferably further characterized in that the fermentation medium used according to the invention has a chloride concentration of less than 1 g / l, in particular less than 500 mg / l, preferably less than 250 mg / l, during the entire fermentation.
  • Biomasses according to the invention preferably have a chloride content of at most 2 grams per kg of biomass, in particular 0.5 to 1.8 g, particularly preferably 0.5 to 1.5 g, per kg of biomass.
  • chloride content means the amount of determinable chlorine.
  • the amount of chlorine present can be determined, for example, by elemental analysis according to DIN EN ISO 11885.
  • Chlorine is present in the biomass in the form of salts called "chlorides".
  • chlorides or “chloride ions” are referred to in the present application, only the amount of chloride or detectable chlorine is meant, not the amount of chloride salts, which in addition to the chloride ion are always cationic Include counterions.
  • the cells that produce PUFAs are preferably cells that already naturally produce PUFAs, but it can also be cells that have been enabled to produce PUFAs by appropriate genetic engineering methods. The production can be autotrophic, mixotrophic or heterotrophic.
  • the biomass according to the invention accordingly comprises such cells and preferably consists essentially of such cells.
  • the cells are preferably those which produce PUFAs heterotrophically.
  • the cells are preferably algae, fungi, in particular yeasts, or protists.
  • the cells are particularly preferably microorganisms, in particular microbial algae or fungi.
  • Strains of Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon and Lipomyces are particularly suitable as cells of oil-producing yeasts.
  • a biomass according to the invention preferably comprises cells of the taxon Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, network slime molds, slime networks), in particular those of the family of Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, network slime molds, slime networks), in particular those of the family of Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, network slime molds, slime networks), in particular those of the family of
  • Thraustochytriaceae The genera Althornia, Aplanochytrium, Elnia, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium and Ulkenia belong to the family of Thraustochytriaceae. It is particularly preferably cells of the genera Thraustochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium or Oblongichytrium, especially those of the genus Aurantiochytrium.
  • the trunk is a particularly preferred trunk
  • Aurantiochytrium limacinum SR21 (IFO 32693).
  • the biomass according to the invention is preferably the product of a fermentative cultivation process.
  • the biomass can be used in addition to
  • cells to be digested also contain constituents of the fermentation medium. These components can in particular be salts, anti-foaming agents and unreacted carbon sources and / or nitrogen sources.
  • the cell content in this biomass is preferably at least 70% by weight, preferably at least 75% by weight.
  • the cell content in the biomass can, if necessary, be carried out before the cell disruption process is carried out
  • corresponding washing steps can be increased, for example, to at least 80 or at least 90% by weight.
  • the biomass obtained can also be used directly in the cell disruption process.
  • the cells of the biomass are preferably distinguished by the fact that they have a PUFA content of at least 20% by weight, preferably at least 30% by weight, in particular at least 40% by weight, in each case based on the dry cell mass.
  • a majority of the lipids are in the form of triglycerides, preferably at least 50% by weight, in particular at least 75% by weight and in a particularly preferred embodiment at least 90% by weight of the lipids contained in the cell Form of triglycerides are present.
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • HUFAs highly unsaturated fatty acids
  • the PUFAs can be present in the cell in free form or in bound form.
  • Examples of the presence in bound form are phospholipids and esters of PUFAs, in particular monoacyl, diacyl and triacylglycerides.
  • a majority of the PUFAs are in the form of triglycerides, preferably at least 50% by weight, in particular at least 75% by weight and in a particularly preferred embodiment at least 90% by weight of the PUFAs contained in the cell Form of triglycerides are present.
  • Preferred PUFAs are omega-3 fatty acids and omega-6 fatty acids, omega-3 fatty acids being particularly preferred.
  • Preferred omega-3 fatty acids are the
  • Eicosapentaenoic acid (EPA, 20: 5w-3), in particular the (5Z, 8Z, 1 1 Z, 14Z, 17Z) eicosa-5,8, 1 1, 14, 17-pentaenoic acid, and the docosahexaenoic acid (DHA, 22: 6w-3), especially the
  • Docosahexaenoic acid is particularly preferred.
  • Thraustochytriales are described in detail in the prior art (see e.g. WO91 / 07498, WO94 / 08467, WO97 / 37032, W097 / 36996, W001 / 54510).
  • the production is usually carried out by culturing cells in the presence of a carbon source and a nitrogen source in a fermenter. Biomass densities of more than 100 grams per liter and production rates of more than 0.5 grams of lipid per liter per hour can be achieved.
  • the process is preferably carried out as a so-called fed-batch process, i.e. that the carbon source and possibly also the nitrogen and phosphate sources are fed incrementally during the fermentation.
  • lipid production can be induced by different measures, for example by limiting the nitrogen source, the phosphate source or the oxygen content or combinations thereof.
  • Both alcoholic and non-alcoholic carbon sources can be considered as carbon sources.
  • alcoholic carbon sources are methanol, ethanol and isopropanol.
  • non-alcoholic carbon sources are fructose, glucose, sucrose, molasses, starch and corn syrup, as well as organic acids such as acetic acid, propionic acid and medium and long chain fatty acids and their salts.
  • Processes which are preferred according to the invention are distinguished in that at least one carbon source is metered into the medium continuously during the complete fermentation process.
  • inorganic and organic nitrogen sources can be considered as nitrogen sources.
  • inorganic nitrogen sources are nitrates and ammonium salts, especially ammonium sulfate and ammonium hydroxide.
  • organic nitrogen sources are amino acids, especially glutamate, and urea.
  • the oil production phase is preferably initiated according to the invention, as described in WO 01/54510, by limiting at least one limiting nutrient component, preferably by limiting at least one nitrogen source.
  • salts in particular selected from sodium carbonate, can optionally also be used in the fermentation.
  • Sodium bicarbonate, soda ash or inorganic phosphorus compounds can be used. If further salts are used, these are preferably used in each case in an amount of less than 12 g / l, in particular less than 8 g / l, particularly preferably less than 5 g / l.
  • the total salt content in the fermentation medium is at the beginning of the
  • Main fermentation preferably 5 to 30 g / l, in particular 10 to 20 g / l.
  • organic phosphorus compounds and / or known ones
  • growth-stimulating substances such as yeast extract or corn steep liquor, can be added to positively influence the fermentation.
  • the cells are preferably fermented at a pH of 4 to 11, in particular 6 to 10, and preferably at a temperature of at least 20 ° C., in particular 20 to 40 ° C., particularly preferably at least 30 ° C.
  • a typical fermentation process takes up to about 100 hours.
  • the cells are preferably up to a biomass density of at least 50, 60 or 70 g / l, in particular 50 to 250 g / l or 60 to 220 g / l, preferably at least 80 or 90 g / l, in particular 80 to 200 g / l, particularly preferably at least 100 g / l, in particular 100 to 180 g / l, fermented.
  • the information here relates to the dry matter content in relation to the total volume of the fermentation broth after the end of the fermentation. The dry matter content is determined by filtering the biomass from the
  • Fermentation broth then washing with water, then drying completely - for example in the microwave - and finally determining the dry weight.
  • the sulfate concentration drops to zero shortly before the start of the oil production phase, preferably after a biomass density of at least 50 g, particularly preferably at least 80, 100, 120 or 140 g, has been reached per liter of fermentation medium.
  • the cells are preferably pasteurized after the cells have been harvested or, if appropriate, even shortly before the cells are harvested, in order to kill the cells and inactivate enzymes which could promote the breakdown of the lipids.
  • the fermentation broth obtained can be subjected to an oil isolation process immediately or, if appropriate, after prior concentration, in order to recover the oil contained.
  • oil insulation processes are described, for example, in WO 01/53512 and WO 201 1/153246.
  • the biomass containing PUFAs can also be harvested after the end of the fermentation.
  • the fermentation broth is preferably first concentrated.
  • the fermentation broth is preferably concentrated by centrifugation, filtration, decanting and / or solvent evaporation in order to first separate a large part of the fermentation medium from the biomass.
  • Solvent evaporation is preferably carried out using a drum dryer, a tunnel dryer, spray drying or vacuum evaporation.
  • Solvent evaporation can in particular also be carried out using a rotary evaporator, a thin-film evaporator or a falling film evaporator.
  • a rotary evaporator a thin-film evaporator or a falling film evaporator.
  • Solvent evaporation can also be used, for example, in reverse osmosis to narrow down the fermentation broth.
  • the concentrated fermentation broth thus obtained is preferably further dried, preferably by fluid bed granulation.
  • the subsequent drying preferably reduces the moisture content of the biomass to below 15% by weight, in particular below 10% by weight, particularly preferably below 5% by weight.
  • the cells are preferably pasteurized after the cells have been harvested or, if appropriate, even shortly before the cells are harvested, in order to kill the cells and inactivate enzymes which could promote the breakdown of the lipids.
  • the biomass is dried in a fluidized bed granulation process or in a
  • Nozzle spray drying processes as described for example in WO 2015/052048.
  • silica can be added to the biomass as an anti-caking agent during drying in order to convert it into a more manageable state.
  • the fermentation broth containing biomass and the silica are preferably sprayed into the respective drying zone for this purpose.
  • the biomass is preferably mixed with the silica only after drying.
  • patent application WO 2015/052048 is also made in particular to patent application WO 2015/052048.
  • a biomass to be used according to the invention has a concentration of silica, in particular hydrophilic or hydrophobic silica, of 0.2 to 10% by weight, in particular 0.5 to 5% by weight, especially 0.5 up to 2% by weight.
  • Drying preferably gives a free-flowing, finely divided or coarse-grained product, preferably granules. If necessary, a product with the desired grain size can be obtained from the granules obtained by sieving or dust removal.
  • customary organic or inorganic auxiliaries or carriers such as starch, gelatin,
  • Feed processing can be used as a binding, gelling or thickening agent.
  • free-flowing is to be understood as meaning a powder that consists of a series of
  • Glass outlet vessels with differently sized outlet openings can at least flow freely out of the vessel with the opening 5 millimeters (small: soaps, oils, fats, waxes 94, 12 (1968)).
  • finely divided means a powder with a predominant proportion (> 50%) of a grain size of 20 to 100 micrometers in diameter.
  • “coarse-grained” means a powder with a predominant proportion (> 50%) of a grain size of 100 to 2500 micrometers in diameter.
  • dust-free is to be understood as a powder which contains only small proportions ( ⁇ 10%, preferably ⁇ 5%) of particle sizes below 100 micrometers.
  • the grain or particle sizes are preferably determined by methods of laser diffraction spectrometry.
  • the methods to be used are described in the textbook "Particle size measurement in laboratory practice” by R.H. Müller and R. Schuhmann,
  • the products obtained by drying processes according to the invention preferably have a proportion of at least 80% by weight, in particular at least 90% by weight, particularly preferably at least 95% by weight, of particles with a particle size of 100 to 3500
  • Microns preferably 100 to 3000 microns, especially 100 to 2500 microns.
  • the products of a fluidized bed granulation process obtained according to the invention preferably have a proportion of at least 80% by weight, in particular at least 90% by weight, particularly preferably at least 95% by weight, of particles with a particle size of 200 to 3500 micrometers, preferably 300 to 3000 microns, especially 500 to 2500 microns.
  • the products of a spray drying process obtained according to the invention preferably have a proportion of at least 80% by weight, in particular at least 90% by weight, particularly preferably at least 95% by weight, of particles with a particle size of 100 to 500 micrometers, preferably 100 to 400 microns, especially 100 to 300 microns.
  • the products obtained according to the invention of a spray drying process and subsequent granulation process preferably have a proportion of at least 80% by weight, in particular at least 90% by weight, particularly preferably at least 95% by weight, of particles with a particle size of 100 to 1000 micrometers.
  • the proportion of dust i.e. Particles with a grain size of less than 100 micrometers are preferably at most 10% by weight, in particular at most 8% by weight, particularly preferably at most 5% by weight, especially at most 3% by weight.
  • the bulk density of the products according to the invention is preferably 400 to 800 kg / m 3 , particularly preferably 450 to 700 kg / m 3 .
  • Another object of the present invention is therefore also a feed that comprises a biomass according to the invention and further feed ingredients.
  • the further feed ingredients are preferably selected from protein-containing, carbohydrate-containing, nucleic acid-containing and lipid-soluble components as well as optionally further fat-containing components and further from other additives such as minerals, vitamins, pigments and amino acids.
  • it can also contain structuring substances to improve the texture or appearance of the feed.
  • binders can also be used, for example, to influence the consistency of the feed.
  • a preferred component that is both a nutritional substance and a structuring substance is starch.
  • composition used according to the invention is preferably characterized in that it contains a biomass according to the invention in an amount of 1 to 25% by weight, preferably 2 to 20% by weight, in particular 3 to 15% by weight, especially 4 to 12 % By weight.
  • This feed or the composition used to produce the feed preferably further has at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 33 to 67% by weight, preferably 39 to 61% by weight , in particular 44 to 55% by weight;
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • omega-3 fatty acids 1 to 7% by weight, preferably 1.5 to 5.5% by weight, in particular 2 to 5% by weight, especially 2.5 to 4.5 % By weight;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed or a composition suitable for producing the feed, which has at least one, preferably all, of the following properties:
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed or a composition suitable for producing the feed, which has at least one, preferably all, of the following properties:
  • a content of biomass according to the invention in particular a labyrinthulea biomass according to the invention, preferably a Thraustochytriaceae biomass according to the invention, of 2 to 24% by weight, preferably 4 to 22% by weight, in particular 9 to 20% by weight all 11 to 18% by weight;
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • omega-3 fatty acids 1 to 7% by weight, preferably 1.5 to 5.5% by weight, in particular 2 to 5% by weight, especially 2.5 to 4.5 % By weight;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed or a composition suitable for producing the feed, which has at least one, preferably all, of the following properties:
  • an aurantiochytrium or schizochytrium biomass according to the invention preferably an aurantiochytrium limacinum biomass according to the invention, especially an aurantiochytrium limacinum SR21 biomass according to the invention, of 1 to 25% by weight, preferably 2 to 20% by weight, in particular 3 to 15% by weight, especially 4 to 12% by weight;
  • PUFAs polyunsaturated fatty acids
  • omega-3 fatty acids 1 to 7% by weight, preferably 1.5 to 5.5% by weight, in particular 2 to 5% by weight, especially 2.5 to 4.5 % By weight;
  • a DHA content of 0.5 to 3% by weight, preferably 0.8 to 2.8% by weight, in particular 1 to 2.8% by weight, especially 1.3 to 2.4 % By weight, in particular 1.3 to 2.2% by weight.
  • An extrudate can be obtained by extruding the aforementioned compositions. These extrudates represent a preferred subject of the present invention.
  • the feed is preferably extruded with an energy input of 12-28 Wh / kg, in particular 14-26 Wh / kg, particularly preferably 16-24 Wh / kg, especially 18- 22 Wh / kg.
  • a screw or twin-screw extruder is preferably used in the extrusion process.
  • the extrusion process is preferably carried out at a temperature of 80-220 ° C, in particular 80-130 ° C, especially 95-110 ° C, a pressure of 10-40 bar, and a shaft rotation speed of 100-1000 rpm, in particular 300- 700 rpm.
  • the residence time of the introduced mixture is preferably 5 to 30 seconds, in particular 10 to 20 seconds.
  • the extrusion process can optionally be a compacting and / or
  • Compression step include.
  • the components are preferably intimately mixed with one another. This is preferably done in a drum equipped with blades. In a preferred embodiment, this mixing step is carried out by water vapor injection, in particular in order to cause the starch preferably contained to swell.
  • the steam injection is preferably carried out at a pressure of 1 to 5 bar, particularly preferably at a pressure of 2 to 4 bar.
  • the other feed ingredients are preferably comminuted - if necessary - before mixing with the Aigen biomass to ensure that a homogeneous mixture is obtained in the mixing step.
  • the other feed ingredients can be comminuted, for example, using a hammer mill.
  • the extrudate produced preferably has a diameter of 1 to 14 mm, preferably 2 to 12 mm, in particular 2 to 6 mm, and preferably also has a length of 1 to 14 mm, preferably 2 to 12 mm, in particular 2 to 6 mm .
  • the length of the extrudate is adjusted by using a cutting tool during extrusion.
  • the length of the extrudate is preferably chosen so that it approximately corresponds to the diameter of the extrudate.
  • the diameter of the extrudate is determined by the choice of the sieve diameter.
  • the extrusion process is followed by the loading of the extrudate obtained with oil.
  • the extrudate is preferably first dried to a moisture content of at most 5% by weight. The loading of the extrudate
  • Extrusion product with oil can be carried out according to the invention, for example by placing the extrudate in oil or spraying the extrudate with oil, but it is carried out according to the invention
  • Feedstuffs are obtained in this way, the biomasses according to the invention preferably in an amount of 1 to 25% by weight, in particular 2 to 20% by weight, particularly preferably 3 to 15% by weight, especially 4 to 12% by weight. %, contain.
  • these feeds preferably furthermore have at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 30 to 60% by weight, preferably 35 to 55% by weight, in particular 40 to 50% by weight;
  • omega-3 fatty acids 1 to 6% by weight, preferably 1.5 to 5% by weight, in particular 2 to 4.5% by weight, especially 2.5 to 4% by weight. -%;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed, in particular an extrudate, which has at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 30 to 60% by weight, preferably 35 to 55% by weight , in particular 40 to 50 wt .-%;
  • omega-3 fatty acids 1 to 6% by weight, preferably 1.5 to 5% by weight, in particular 2 to 4.5% by weight, especially 2.5 to 4% by weight. -%;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed, in particular an extrudate, which has at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 30 to 60% by weight, preferably 35 to 55% by weight , in particular 40 to 50 wt .-%;
  • Labyrinthulea biomass according to the invention preferably one according to the invention
  • Thraustochytriaceae biomass from 1 to 25% by weight, preferably 2 to 20% by weight, in particular 3 to 15% by weight, especially 4 to 12% by weight;
  • omega-3 fatty acids 1 to 6% by weight, preferably 1.5 to 5% by weight, in particular 2 to 4.5% by weight, especially 2.5 to 4% by weight. -%;
  • a preferred object according to the invention is therefore also a feed, in particular an extrudate, which has at least one, preferably all, of the following properties: a) a total protein content of 30 to 60% by weight, preferably 35 to 55% by weight. -%, in particular 40 to 50 wt .-%;
  • an aurantiochytrium or schizochytria biomass according to the invention preferably an aurantiochytrium limacinum biomass according to the invention, especially an aurantiochytrium limacinum SR21 biomass according to the invention, of 1 to 25% by weight, preferably 2 to 20% by weight, in particular 3 to 15% by weight, especially 4 to 12% by weight;
  • omega-3 fatty acids 1 to 6% by weight, preferably 1.5 to 5% by weight, in particular 2 to 4.5% by weight, especially 2.5 to 4% by weight. -%;
  • a DHA content of 0.5 to 3% by weight, preferably 0.8 to 2.5% by weight, in particular 1 to 2.5% by weight, especially 1.2 to 2.2% % By weight, in particular 1.2 to 2.0% by weight.
  • fats in particular oils, animal and also of vegetable origin can be used as fat-containing component according to the invention.
  • vegetable oils for example soybean oil, rapeseed oil, sunflower seed oil, flaxseed oil or palm oil and mixtures thereof, are particularly suitable as the fatty component.
  • fish oil can optionally also be used in small quantities as a fatty component.
  • the protein-containing component can be, for example, soy protein,
  • Pea protein, wheat gluten or corn gluten and mixtures thereof can be used.
  • Fish protein, krill meal, mussel meal, squid meal or shrimp shells can be used, for example, as a protein-containing component which additionally contains fats. These are summarized below under the term "marine flour”. In a preferred one
  • Embodiment comprises a feed according to the invention marine flour, preferably fish meal, in an amount of 3 to 18% by weight, in particular 5 to 15% by weight, especially 7 to 13% by weight.
  • wheat flour, sunflower flour or soy flour and mixtures thereof can be used as the carbohydrate-containing component.
  • animal feed according to the invention in particular an oil-coated extrudate according to the invention, in animal breeding, it has been found that this promotes the growth of the animals to a particular extent and improves the stress state of the animals.
  • Another object of the present invention is also a method for breeding animals, characterized in that a feed according to the invention is administered to them.
  • the present invention relates in particular to a method for increasing the growth of animals, characterized in that a feed according to the invention is administered to them.
  • Another object of the present invention is in particular also a method for increasing the proportion of omega-3 fatty acids, in particular DHA, in the muscle tissue of animals, characterized in that a feed according to the invention is administered to them.
  • the feed is preferably administered at least every two days, preferably at least once a day.
  • Another object of the present invention is also the use of a
  • Animal feed according to the invention for increasing the growth in animals for increasing the growth in animals.
  • Another object of the present invention is also the use of a
  • Another object of the present invention is also the use of a
  • Animal feed according to the invention for improving the health status of animals, in particular for improving the stress status of animals.
  • Another object of the present invention is also the use of a
  • Animal feed according to the invention to enable stress-reduced breeding of the animals.
  • the bred animals which are fed with a feed according to the invention are preferably poultry, pigs or cattle.
  • the bred animals are particularly preferably marine animals, particularly preferably finfish or crustaceans. These include carp, tilapia, catfish, tuna, salmon, trout, baramundi, bream, perch, cod, shrimp, lobster, crab, shrimp and crayfish.
  • the animals bred are particularly preferably salmon.
  • Preferred types of salmon are the Atlantic salmon, the sockeye salmon, the masu salmon, the king salmon, the ketal salmon, the silver salmon, the Danube salmon, the Pacific salmon and the humpback salmon.
  • the bred animals can in particular also be fish, which are subsequently processed into fish meal or fish oil.
  • the fish are preferably herring, pollack, menhaden, anchovies, capelin or cod.
  • the fish meal or fish oil thus obtained can in turn be used in aquaculture for the breeding of edible fish or crustaceans.
  • the bred animals can also be small organisms that are used as feed in aquaculture. These small creatures can be, for example, nematodes, crustaceans or rotifers.
  • the marine animals can be grown in ponds, tanks, basins or in delimited areas in the sea or in lakes, in particular in cages or net pens. The cultivation can serve to breed the finished edible fish, but can also be used to breed juveniles, which are then released to the
  • the feed according to the invention is accordingly preferably a feed for use in the breeding of the aforementioned animals.
  • Example 1 Production of the biomass by fermentation of Aurantiochytrium limacinum SR21 in a medium with a high sulfate content and subsequent drying of the
  • the cells were cultivated for approx. 70 h in a feed process using a steel fermenter with a fermenter volume of 2 liters and a total starting mass of approx. 700 g and a total final mass of approx. 1.5 kg.
  • a glucose solution (570 g / kg glucose) was metered in during the process (“fed-batch process”)
  • composition of the starting medium was as follows:
  • Medium 1 20 g / kg glucose; 4 g / kg yeast extract; 2 g / kg ammonium sulfate; 12 or 16 g / kg sodium sulfate; 2.46 g / kg magnesium sulfate (heptahydrate); 0.45 g / kg potassium chloride; 4.5 g / kg potassium dihydrogen phosphate; 0.1 g / kg thiamine (HCl); 5 g / kg trace element solution.
  • the composition of the trace element solution was as follows: 35 g / kg hydrochloric acid (37%); 1.86 g / kg manganese chloride (tetrahydrate); 1.82 g / kg zinc sulfate (heptahydrate); 0.818 g / kg sodium EDTA; 0.29 g / kg boric acid; 0.24 g / kg sodium molybdate (dihydrate); 4.58 g / kg calcium chloride (dihydrate); 17.33 g / kg iron sulfate (heptahydrate); 0.15 g / kg copper chloride (dihydrate).
  • the cultivation was carried out under the following conditions: cultivation temperature 28 ° C;
  • the fermentation took place up to a biomass density of 80 g / l before the oil production phase was initiated by limiting phosphate and nitrogen. Due to the high sulfate content in the starting medium, the sulfate concentration is always above the saturation limit of the cells, which is around 5 g per kg of dry biomass, until the end of the fermentation, ie also until the end of the oil production phase.
  • biomass obtained is referred to below as “biomass 1” (12 g / kg sodium sulfate in the starting medium) or “biomass 2” (16 g / kg sodium sulfate in the starting medium).
  • biomass 1 (12 g / kg sodium sulfate in the starting medium
  • biomass 2 (16 g / kg sodium sulfate in the starting medium).
  • the sulfur content of the biomass was determined in accordance with DIN ISO 11885.
  • Example 2 Production of the biomass by fermentation of Aurantiochytrium limacinum SR21 in a medium with a low sulfate content and subsequent drying of the biomass
  • the cells were cultivated for approx. 70 h in a feed process using a steel fermenter with a fermenter volume of 2 liters with a total starting mass of 712 g and a total final mass of approx. 1.5 kg.
  • a glucose solution (570 g / kg glucose) was metered in during the process (“fed-batch process”)
  • composition of the starting medium was as follows:
  • the composition of the trace element solution was as follows: 35 g / kg hydrochloric acid (37%); 1.86 g / kg manganese chloride (tetrahydrate); 1.82 g / kg zinc sulfate (heptahydrate); 0.818 g / kg sodium EDTA; 0.29 g / kg boric acid; 0.24 g / kg sodium molybdate (dihydrate); 4.58 g / kg calcium chloride (dihydrate); 17.33 g / kg iron sulfate (heptahydrate); 0.15 g / kg copper chloride (dihydrate).
  • the cultivation was carried out under the following conditions: cultivation temperature 28 ° C;
  • the fermentation broths were heated to 60 ° C. for 20 minutes in order to prevent further cell activity.
  • the biomass was then dried in two stages
  • Fermentation broth concentrated by evaporation to a dry matter of about 20 wt .-%.
  • the concentrated fermentation broth was then spray dried using a Production MinorTM Spray Dryer (GEA NIRO) at an inlet temperature of
  • Biomasses 1 and 2 are biomasses obtained by fermentation with a high sulfate content according to Example 1, while Biomass 3 is a biomass obtained by fermentation with a low sulfate content according to Example 2 has been.
  • the fermentation process which was carried out with a low sulfate content and led to biomass 3, produced a product with a significantly higher purity, that is to say a product with a significantly increased proportion of DHA, than the process with a high Sulphate content was carried out and led to biomass 1 and 2.
  • the sulfate content in the biomass obtained is significantly lower than in the process with a high sulfate content.

Abstract

Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass wenn bei der Kultivierung von PUFAs produzierenden Zellen die eingesetzte Sulfat-Menge so gewählt wird, dass die Sulfat-Konzentration in der letzten Phase der Wachstumsphase der Zellen auf null sinkt, eine leicht aufschließbare Biomasse erhalten wird, die einen erhöhten Massen-Anteil an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) im finalen Produkt aufweist.

Description

Verfahren zur Herstellung einer leicht aufschließbaren Biomasse mit erhöhtem Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer leicht aufschließbaren Biomasse mit erhöhtem Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren sowie eine durch dieses Verfahren erhältliche Biomasse.
Verfahren zur Herstellung von polyungesättigte Fettsäuren (PUFAs) enthaltender Biomasse sind im Stand der Technik bereits beschrieben. Häufig werden hierbei Netzschleimpilze eingesetzt, die natürlicherweise polyungesättigte Fettsäuren als Speicherlipide in größerer Menge in der Zelle akkumulieren.
Natürlicherweise wachsen diese Mikroalgen in Meerwasser, so dass anfangs eine Kultivierung der Mikroalgen in Medien mit hohem Chlorid-Gehalt erfolgte. Hohe Chlorid-Gehalte sind jedoch für die Kultivierung in Stahl-Bioreaktoren ungeeignet, da sie die Korrosion des Metalls herbeiführen.
Als alternative Fermentationsmedien sind daher solche mit niedrigem Chlorid-Gehalt und stattdessen hohem Sulfat-Gehalt im Stand der Technik beschrieben.
Die erhaltene Aigen-Biomasse weist hierbei jedoch in der Regel einen begrenzten Gehalt an PUFAs auf, möglicherweise, weil aufgrund der hohen Sulfat-Menge der Anteil an ausgebildeter Zellwand im finalen Produkt auf Kosten der Menge an enthaltenen PUFAs relativ hoch ist.
Aufgrund des hohen Sulfat-Gehalts ist die Zellwand zudem recht stabil, was die Freisetzung des Öls aus den Zellen erschwert.
Überraschenderweise hat sich erfindungsgemäß herausgestellt, dass durch Limitierung des Sulfat- Gehalts während der Fermentation der relative Anteil an gebildeten PUFAs deutlich gesteigert werden kann und dass durch die gleichzeitig erzielte Verringerung der Stabilität der Zellwand die Freisetzung des Öls aus den Zellen deutlich erleichtert werden kann, wobei die Zellwand durch die Limitierung des Sulfats soweit destabilisiert werden kann, dass eine Freisetzung des Öls aus den Zellen ohne großen mechanischen Kraftaufwand erreicht werden kann.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein Verfahren zur Bereitstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse zur Verfügung zu stellen, bei welchem die erhaltene Biomasse einen erhöhten Massen-Anteil an PUFAs im finalen Produkt aufweist und zugleich die Freisetzung der enthaltenen PUFAs aus dem finalen Produkt erleichtert ist. Gleichzeitig soll bei dem Verfahren vorzugsweise ein nicht-korrosives Fermentationsmedium eingesetzt werden können.
Gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der Biomasse eine Kultivierung der PUFAs produzierenden Zellen in einem Fermentationsmedium erfolgt, wobei der Sulfat-Gehalt so eingestellt wird, dass der Sulfat-Gehalt in der letzten Phase der Fermentation auf null fällt.
Erfindungsgemäße Verfahren umfassen vorzugsweise zwecks Optimierung der Ölproduktion eine Wachstumsphase und eine sich daran anschließende Ölproduktionsphase. In der vorangehenden Wachstumsphase erfolgt zunächst die Anzucht sowie die Erhöhung der Biomasse der in dem Fermentationsmedium enthaltenen PUFAs produzierenden Zellen - bei weitestgehender
Unterdrückung der Ölproduktion so dass eine möglichst hohe Biomassendichte im Medium eingestellt wird, während in der sich anschließenden Ölproduktionsphase, die in der Regel durch spezielle Maßnahmen eingeleitet wird, überwiegend die Ölproduktion durch die Zellen der Biomasse erfolgt, wobei das Wachstum der Zellen zumindest weitestgehend angehalten ist. D.h., dass in der Ölproduktionsphase die Erhöhung der Biomasse zumindest primär nicht auf eine Vermehrung der Zellzahl, sondern auf die Akkumulation von Lipiden im Zellinnern der vorhandenen Zellen zurückzuführen ist. - Das Wachstum der Zellen in der Wachstumsphase wird durch Bereitstellung optimaler Wachstumsbedingungen ermöglicht, während der Übergang in die Ölproduktionsphase durch Limitierung einzelner oder mehrerer limitierender Faktoren,
insbesondere Nährstoffkomponenten wie beispielsweise Stickstoffquellen, eingeleitet werden kann. Mit„letzter Phase der Fermentation“ ist erfindungsgemäß vorzugsweise die Ölproduktionsphase gemeint.
Erfindungsgemäße Verfahren zeichnen sich vorzugsweise dadurch aus, dass die Sulfat- Konzentration im Fermentationsmedium in der zweiten Hälfte der Wachstumsphase, vorzugsweise im letzten Achtel der Wachstumsphase, besonders bevorzugt kurz vor Beginn Ölproduktionsphase, auf null fällt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Biomassen, vorzugsweise solche, die Zellen der Familie der Thraustochytriaceae enthalten, die durch erfindungsgemäße Verfahren erhältlich sind.
Als erfindungsgemäß besonders vorteilhaft hat sich herausgestellt, den Sulfat-Gehalt im Medium so vorzugeben, dass sich eine finale Sulfat-Konzentration in der erhaltenen Biomasse von 7 bis 10 g pro kg Biomasse einstellt. Die Zellen besitzen dann noch eine hinreichende Stabilität, um die enthaltenen PUFAs vor unerwünschtem oxidativen Abbau zu schützen. Die Menge an
hinzuzugebendem Sulfat kann hierbei auf einfache Weise berechnet werden, weil das
hinzugegebene Sulfat durch die Zellen vollständig assimiliert wird. Auf diese Weise wird eine Biomasse erhalten, die leicht aufschließbar, jedoch noch hinreichend stabil ist, um in eine trockene Biomasse überführt werden zu können. Aufgrund der relativ instabilen Zellwand können erfindungsgemäße Biomassen entsprechend vorzugsweise unter Anwendung niedriger mechanischer Kräfte, vorzugsweise bereits unter Anwendung einer Krafteinwirkung von bis zu 12 Wh/kg, besonders bevorzugt bis zu 10 oder 8 Wh/kg, insbesondere 1 bis 12 Wh/kg, 1 bis 10 Wh/kg oder 2 bis 8 Wh/kg, aufgebrochen werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenso eine Biomasse, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.
Weiterer Gegentand der vorliegenden Erfindung ist daher insbesondere eine PUFAs enthaltende Biomasse, die einen Sulfat-Gehalt von 7 bis 10 g Sulfat, vorzugsweise 7,5 bis 9,5 g Sulfat, pro kg Biomasse aufweist.
Unter„Sulfat-Gehalt“ ist erfindungsgemäß in Bezug auf die Biomasse der Gesamtgehalt an Sulfat, also der Gehalt an freiem und gebundenem, insbesondere organisch gebundenem, Sulfat zu verstehen. Es ist davon auszugehen, dass der Großteil des in der Biomasse enthaltenen Sulfats als Bestandteil von Exopolysacchariden vorliegt, die an der Ausbildung der Zellwand der
Mikroorganismen beteiligt sind.
Die Bestimmung des Sulfat-Gehalts erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise durch Ermittlung des Schwefel-Gehalts der erhaltenen Biomasse, da der Großteil des in der Biomasse enthaltenen Schwefels auf das enthaltene Sulfat zurückzuführen ist. Schwefel, der auf andere Quellen zurückzuführen ist, ist aufgrund der Menge des enthaltenen Sulfats zu vernachlässigen. Aus der Menge des ermittelten Schwefels kann somit ohne weiteres die Menge an enthaltenem Sulfat ermittelt werden.
Der Schwefel-Gehalt der Biomasse wird hierbei vorzugsweise durch Elementaranalyse gemäß DIN EN ISO 11885 bestimmt. Für die Analyse des Schwefelgehalts der Biomasse werden
entsprechende Aliquote der Probe vor der Analyse vorzugsweise mit Salpetersäure und
Wasserstoffperoxid bei 240°C unter Druck aufgeschlossen, um die freie Zugänglichkeit des enthaltenen Schwefels sicherzustellen.
Unter„Biomasse“,„Biotrockenmasse“,„Biomasse PUFAs produzierender Zellen“ oder
„Biotrockenmasse PUFAs produzierender Zellen“ ist erfindungsgemäß generell die bestimmbare Biotrockenmasse zu verstehen.
Die Menge an in einer Probe enthaltenen Biotrockenmasse wird hierbei vorzugsweise wie folgt bestimmt: Eine homogene Probe wird entnommen und zwecks Abtrennung der flüssigen
Bestandteile zentrifugiert. Anschließend wird die durch Zentrifugation erhaltene Biomasse mit Wasser gewaschen, um Salze und ggf. weitere lösliche Bestandteile in Lösung zu bringen, und danach erneut zentrifugiert. - Die so erhaltene Biotrockenmasse wird abschließend im
Trockenschrank über Nacht getrocknet. Der prozentuale Anteil an in der Probe enthaltener Biotrockenmasse ergibt sich hierbei aus dem Quotienten zwischen Masse an bestimmter
Biotrockenmasse nach Trocknung und Ausgangsmasse der untersuchten Probe. Die somit ermittelte Biotrockenmasse umfasst auch noch das durch die Biomasse gebildete Öl.
Der in der Biotrockenmasse enthaltene Fettanteil wird vorzugsweise bestimmt durch Aufnahme der Biotrockenmasse in einer Methanol/Chloroform-Lösung und anschließende Ultraschall-Behandlung der so erhaltenen Probe. - Die so erhaltene Probe wird anschließend mit Kaliumhydroxid verseift und mittels Salzsäure sauer gestellt. Anschließend werden die freien Fettsäuren mittels BF3 (30% Bortrifluorid in Methanol) methyliert und durch Verteilungschromatographie mit einem
Temperaturgradienten aufgetrennt. Die Detektion erfolgt anschließend mittels Flammenionisations- Detektion (FID).
Unter„lipidfreier Biomasse“ ist erfindungsgemäß entsprechend die Biotrockenmasse abzüglich des so ermittelten Fettanteils zu verstehen.
Die Einstellung der gewünschten Sulfat-Konzentration im Medium kann erfindungsgemäß auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Erfindungsgemäß ist wesentlich, dass die Sulfat-Konzentration im Verlauf der Fermentation auf null fällt, wobei die Sulfat-Konzentration vorzugsweise in der zweiten Hälfte der Wachstumsphase, besonders bevorzugt im letzten Achtel der Zeit der Wachstumsphase auf null fällt. Es ist hierbei besonders bevorzugt, wenn die Sulfat-Konzentration kurz vor Beginn der Ölproduktionsphase, insbesondere bis zu 3 Stunden, vorzugsweise bis zu 2 Stunden, vor allem bis zu einer Stunde, vor Beginn der Ölproduktionsphase, auf null fällt. - Dies kann einfach dadurch erreicht werden, indem die erforderliche Menge an Sulfat bereits zu Beginn der Fermentation im Satzmedium vollständig vorgelegt wird (sog. Batch-Verfahren). Die Menge an benötigtem Sulfat lässt sich einfach berechnen, da die zur Bildung der Biomasse eingesetzten Zellen das in relativ geringer Menge hinzugegebene Sulfat vollständig assimilieren.
Bei Anwendung eines sogenannten Fed-Batch-Verfahrens kann alternativ die Menge an benötigtem Sulfat im Verlauf der Fermentation zudosiert werden oder entsprechend ein Teil des Sulfats vorgelegt und der Rest im Verlauf der Fermentation zudosiert werden.
Insbesondere dann, wenn sich im Verlauf der Fermentation herausstellt, dass die Menge an produzierter Biomasse den ursprünglich kalkulierten Wert übertrifft, kann durch nachträgliches Zudosieren von Sulfat sichergestellt werden, dass die resultierende Biomasse über ausreichende Zellstabilität verfügt, um eine vorzeitige Freisetzung des Öls zu verhindern.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Sulfatmenge im Satzmedium so gewählt, dass sich die Sulfat-Konzentration zumindest während der ersten 30 % der Zeit der Wachstumsphase der Zellen, vorzugsweise zumindest während der ersten 40, 50 oder 60 %, insbesondere während der ersten 70, 80 oder 90 %, der Zeit der Wachstumsphase der Zellen, oberhalb der
Sättigungskonzentration der Zellen befindet. - Die Sulfat-Konzentration beträgt hierbei während der angegebenen Phase vorzugsweise mindestens 5 g Sulfat pro kg lipidfreier Biomasse.
Als Sulfat-Salz wird erfindungsgemäß vorzugsweise Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Magnesiumsulfat sowie Mischungen davon eingesetzt. Die Zuführung des Sulfats kann erfindungsgemäß alternativ oder zusätzlich auch durch den Einsatz von technischen
Rohmaterialien erfolgen, die mit Sulfat verunreinigt oder supplementiert sind.
Es hat sich erfindungsgemäß weiterhin überraschenderweise herausgestellt, dass das
Herunterfahren der Sulfat-Konzentration auch mit niedrigen Chlorid-Konzentrationen kombiniert werden kann, so dass die Biomasse mit einem nicht-korrosiven Fermentationsmedium erhalten werden kann.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zeichnet sich daher vorzugsweise weiterhin dadurch aus, dass das erfindungsgemäß eingesetzte Fermentationsmedium während der gesamten Fermentation eine Chlorid-Konzentration von weniger als 1 g/l, insbesondere weniger als 500 mg/l, bevorzugt weniger als 250 mg/l, aufweist.
Erfindungsgemäße Biomassen weisen vorzugsweise einen Chlorid-Gehalt von maximal 2 Gramm pro kg Biomasse, insbesondere 0,5 bis 1 ,8 g, besonders bevorzugt 0,5 bis 1 ,5 g pro kg Biomasse, auf.
Mit "Chlorid-Gehalt" ist erfindungsgemäß die Menge an bestimmbarem Chlor gemeint. Die Menge an vorhandenem Chlor kann beispielsweise durch Elementaranylse gemäß DIN EN ISO 11885 bestimmt werden. Chlor liegt in der Biomasse in Form von Salzen vor, die“Chloride” genannt werden. Wenn in der vorliegenden Anmeldung von„Chloriden“ oder„Chlorid-Ionen“ die Rede ist, so ist stets nur die Menge an Chlorid bzw. nachweisbarem Chlor gemeint, nicht die Menge an Chlorid-Salzen, welche neben dem Chlorid-Ion stets auch kationische Gegenionen umfassen. Bei den PUFAs produzierenden Zellen handelt es sich vorzugsweise um Zellen, die bereits natürlicherweise PUFAs produzieren, es kann sich jedoch auch um Zellen handeln, die durch entsprechende gentechnische Verfahren dazu in die Lage versetzt wurden, PUFAs zu produzieren. Die Produktion kann hierbei autotroph, mixotroph oder heterotroph erfolgen.
Die erfindungsgemäße Biomasse umfasst entsprechend solche Zellen und besteht vorzugsweise im Wesentlichen aus solchen Zellen.
Bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um solche, die PUFAs heterotroph produzieren. Es handelt sich bei den Zellen erfindungsgemäß vorzugsweise um Algen, Pilze, insbesondere Hefen, oder Protisten. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um Mikroorganismen, insbesondere um mikrobielle Algen oder Pilze.
Als Zellen von öl-produzierenden Hefen kommen insbesondere Stämme von Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon und Lipomyces in Betracht.
Eine erfindungsgemäße Biomasse umfasst vorzugsweise Zellen des Taxons Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, Netzschleimpilze, Schleimnetze), insbesondere solche der Familie der
Thraustochytriaceae. Zu der Familie der Thraustochytriaceae gehören die Gattungen Althornia, Aplanochytrium, Elnia, Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium und Ulkenia. Besonders bevorzugt handelt es sich um Zellen der Gattungen Thraustochytrium, Schizochytrium, Aurantiochytrium oder Oblongichytrium, vor allem um solche der Gattung Aurantiochytrium. Ein besonders bevorzugter Stamm stellt der Stamm
Aurantiochytrium limacinum SR21 (IFO 32693) dar.
Bei der erfindungsgemäßen Biomasse handelt es sich vorzugsweise um das Produkt eines fermentativen Kultivierungsverfahrens. Die Biomasse kann entsprechend neben den
aufzuschließenden Zellen auch noch Bestandteile des Fermentationsmediums enthalten. Bei diesen Bestandteilen kann es sich insbesondere um Salze, Antischaummittel und nicht umgesetzte Kohlenstoffquelle und/oder Stickstoffquelle handeln. Der Zellgehalt in dieser Biomasse beträgt vorzugsweise mindestens 70 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 75 Gew.-%. Der Zellgehalt in der Biomasse kann gegebenenfalls vor Durchführung des Zellaufschlussverfahrens durch
entsprechende Waschschritte beispielsweise auf mindestens 80 oder mindestens 90 Gew.-% erhöht werden. Die erhaltene Biomasse kann jedoch auch direkt in dem Zellaufschlussverfahren eingesetzt werden.
Die Zellen der Biomasse zeichnen sich vorzugsweise dadurch aus, dass sie einen PUFA-Gehalt von mindestens 20 Gew.-%, vorzugsweise mindestens 30 Gew.-%, insbesondere mindestens 40 Gew.-%, jeweils bezogen auf die Zelltrockenmasse, aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform liegt ein Großteil der Lipide in Form von Triglyceriden vor, wobei vorzugsweise mindestens 50 Gew.-%, insbesondere mindestens 75 Gew.-% und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform mindestens 90 Gew.-% der in der Zelle enthaltenen Lipide in Form von Triglyceriden vorliegen.
Vorzugsweise handelt es sich bei mindestens 10 Gew.-%, insbesondere mindestens 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 20 bis 60 Gew.-%, insbesondere 20 bis 40 Gew.-%, der in der Zelle enthaltenen Fettsäuren um PUFAs. Unter polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) werden erfindungsgemäß Fettsäuren verstanden, die mindestens zwei C-C-Doppelbindungen aufweisen. Unter den PUFAs sind erfindungsgemäß hochungesättigte Fettsäuren (HUFAs) bevorzugt. Unter HUFAs werden erfindungsgemäß
Fettsäuren verstanden, die mindestens vier C-C-Doppelbindungen aufweisen.
Die PUFAs können in der Zelle in freier Form oder in gebundener Form vorliegen. Beispiele für das Vorliegen in gebundener Form sind Phospholipide und Ester der PUFAs, insbesondere Monoacyl-, Diacyl- und Triacylglyceride. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt ein Großteil der PUFAs in Form von Triglyceriden vor, wobei vorzugsweise mindestens 50 Gew.-%, insbesondere mindestens 75 Gew.-% und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform mindestens 90 Gew.-% der in der Zelle enthaltenen PUFAs in Form von Triglyceriden vorliegen.
Bevorzugte PUFAs stellen omega-3-Fettsäuren und omega-6-Fettsäuren dar, wobei omega-3- Fettsäuren besonders bevorzugt sind. Bevorzugte omega-3-Fettsäuren stellen hierbei die
Eicosapentaensäure (EPA, 20:5w-3), insbesondere die (5Z,8Z,1 1 Z, 14Z,17Z)-Eicosa-5,8, 1 1 , 14, 17- pentaensäure, und die Docosahexaensäure (DHA, 22:6w-3), insbesondere die
(4Z,7Z,10Z, 13Z, 16Z, 19Z)-Docosa-4,7, 10, 13, 16, 19-hexaensäure, dar, wobei die
Docosahexaensäure besonders bevorzugt ist.
Verfahren zur Herstellung der PUFAs enthaltenden Zellen insbesondere der Ordnung
Thraustochytriales sind im Stand der Technik ausführlich beschrieben (siehe z.B. WO91/07498, WO94/08467, WO97/37032, W097/36996, W001/54510). Die Herstellung erfolgt in der Regel dadurch, dass Zellen in Anwesenheit einer Kohlenstoffquelle und einer Stickstoffquelle in einem Fermenter kultiviert werden. Es können hierbei Biomasse-Dichten von mehr als 100 Gramm pro Liter und Produktionsraten von mehr als 0,5 Gramm Lipid pro Liter pro Stunde erreicht werden.
Das Verfahren wird vorzugsweise als sogenanntes Fed-Batch-Verfahren durchgeführt, d.h. dass die Kohlenstoffquelle und gegebenenfalls auch die Stickstoff- und Phosphatquellen inkrementeil während der Fermentation zugeführt werden. Die Lipid-Produktion kann nach Erreichen der gewünschten Biomasse durch unterschiedliche Maßnahmen induziert werden, beispielsweise durch Limitierung der Stickstoffquelle, der Phosphatquelle oder des Sauerstoffgehalts oder Kombinationen davon.
Als Kohlenstoffquelle kommen sowohl alkoholische als auch nicht-alkoholische Kohlenstoffquellen in Betracht. Beispiele für alkoholische Kohlenstoffquellen sind Methanol, Ethanol und Isopropanol. Beispiele für nicht-alkoholische Kohlenstoffquellen sind Fructose, Glucose, Saccharose, Molassen, Stärke und Maissirup, sowie organische Säuren wie Essigsäure, Propionsäure sowie mittel- und langkettige Fettsäuren sowie deren Salze. Erfindungsgemäß bevorzugte Verfahren zeichnen sich dadurch aus, dass mindestens eine Kohlenstoffquelle kontinuierlich während des kompletten Fermentationsverfahrens dem Medium zudosiert wird.
Als Stickstoffquelle kommen sowohl anorganische als auch organische Stickstoffquellen in Betracht. Beispiele für anorganische Stickstoffquellen sind Nitrate und Ammoniumsalze, insbesondere Ammoniumsulfat und Ammoniumhydroxid. Beispiele für organische Stickstoffquellen sind Aminosäuren, insbesondere Glutamat, und Harnstoff. Die Einleitung der Ölproduktionsphase erfolgt erfindungsgemäße vorzugsweise, wie in WO 01/54510 beschrieben, durch Limitierung mindestens einer limitierenden Nährstoffkomponente, vorzugsweise durch Limitierung mindestens einer Stickstoffquelle.
Neben Sulfaten und gegebenenfalls eingesetzten Chloriden können bei der Fermentation gegebenenfalls auch weitere Salze, insbesondere ausgewählt aus Natriumcarbonat,
Natriumhydrogencarbonat, Sodaasche oder anorganischen Phosphorverbindungen, eingesetzt werden. Sofern weitere Salze eingesetzt werden, werden diese vorzugsweise jeweils in einer Menge von weniger als 12 g/l, insbesondere weniger als 8 g/l, besonders bevorzugt weniger als 5 g/l eingesetzt. Der Gesamtsalzgehalt im Fermentationsmedium beträgt zu Beginn der
Hauptfermentation vorzugsweise 5 bis 30 g/l, insbesondere 10 bis 20 g/l.
Zusätzlich können auch organische Phosphorverbindungen und/oder bekannte
wachstumsstimulierende Stoffe, wie etwa Hefeextrakt oder Maisquellwasser, hinzugegeben werden, um die Fermentation positiv zu beeinflussen.
Die Fermentation der Zellen erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 4 bis 11 , insbesondere 6 bis 10, sowie vorzugsweise bei einer Temperatur von mindestens 20°C, insbesondere 20 bis 40°C, besonders bevorzugt mindestens 30 °C. Ein typisches Fermentationsverfahren dauert bis zu etwa 100 Stunden.
Die Zellen werden erfindungsgemäß vorzugsweise bis zu einer Biomassendichte von mindestens 50, 60 oder 70 g/l, insbesondere 50 bis 250 g/l oder 60 bis 220 g/l, bevorzugt mindestens 80 oder 90 g/l, insbesondere 80 bis 200 g/l, besonders bevorzugt mindestens 100 g/l, insbesondere 100 bis 180 g/l, fermentiert. Die Angaben beziehen sich hierbei auf den Gehalt an Biotrockenmasse in Bezug auf das Gesamtvolumen der Fermentationsbrühe nach Beendigung der Fermentation. Der Gehalt an Biotrockenmasse wird bestimmt durch Abfiltrieren der Biomasse aus der
Fermentationsbrühe, anschließendes Waschen mit Wasser, danach vollständige Trocknung - beispielsweise in der Mikrowelle - und schließlich Feststellung des Trockengewichts.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform fällt die Sulfat-Konzentration kurz vor Beginn der Ölproduktionsphase, vorzugsweise nachdem eine Biomassendichte von mindestens 50 g, besonders bevorzugt mindestens 80, 100, 120 oder 140 g pro Liter Fermentationsmedium erreicht wurde, auf null.
Vorzugsweise erfolgt nach der Ernte der Zellen oder gegebenenfalls auch schon kurz vor der Ernte der Zellen eine Pasteurisierung der Zellen, um die Zellen abzutöten und Enzyme, die den Abbau der Lipide befördern könnten, zu inaktivieren.
Nach Beendigung der Fermentation kann die erhaltene Fermentationsbrühe unmittelbar oder gegebenenfalls nach vorheriger Aufkonzentrierung einem Ölisolationsverfahren unterzogen werden, um das enthaltene Öl zu gewinnen. Derartige Ölisolationsverfahren werden beispielsweise in WO 01/53512 und WO 201 1/153246 beschrieben.
Alternativ kann nach Beendigung der Fermentation auch die Ernte der PUFAs enthaltenden Biomasse erfolgen. Hierzu erfolgt vorzugsweise auch zunächst eine Aufkonzentrierung der Fermentationsbrühe. Die Aufkonzentrierung der Fermentationsbrühe erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise durch Zentrifugation, Filtration, Dekantieren und/oder Lösungsmittelverdampfung, um zunächst einen Großteil des Fermentationsmediums von der Biomasse abzutrennen. Die
Lösungsmittelverdampfung erfolgt vorzugsweise unter Einsatz eines Trommeltrockners, eines Tunneltrockners, durch Sprühtrocknung oder Vakuumverdampfung. Die
Lösungsmittelverdampfung kann insbesondere auch unter Einsatz eines Rotationsverdampfers, eines Dünnschichtverdampfers oder eines Fallfilmverdampfers erfolgen. Alternativ zur
Lösungsmittelverdampfung kommt beispielsweise auch die Umkehrosmose zur Einengung der Fermentationsbrühe in Betracht.
Um die Biomasse zu erhalten, wird die so erhaltene konzentrierte Fermentationsbrühe vorzugswiese weiter getrocknet, vorzugsweise durch Fließbettgranulation. Vorzugsweise wird durch das anschließende Trocknen der Feuchtigkeitsgehalt der Biomasse auf unter 15 Gew.-%, insbesondere auf unter 10 Gew.-%, besonders bevorzugt auf unter 5 Gew.-%, reduziert.
Vorzugsweise erfolgt nach der Ernte der Zellen oder gegebenenfalls auch schon kurz vor der Ernte der Zellen eine Pasteurisierung der Zellen, um die Zellen abzutöten und Enzyme, die den Abbau der Lipide befördern könnten, zu inaktivieren.
Die erfindungsgemäße Trocknung der Biomasse erfolgt in einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform in einem Wirbelschichtgranulationsverfahren oder einem
Düsensprühtrocknungsverfahren, wie beispielsweise in WO 2015/052048 beschrieben.
Der Biomasse kann während der Trocknung gegebenenfalls Kieselsäure als Antibackmittel zugesetzt werden, um sie in einen besser handhabbaren Zustand zu überführen. Die Biomasse enthaltende Fermentationsbrühe sowie die Kieselsäure werden hierzu vorzugsweise in die jeweilige Trocknungszone eingesprüht. Alternativ wird die Biomasse vorzugsweise erst nach der Trocknung mit der Kieselsäure vermischt. Es wird diesbezüglich insbesondere auch auf die Patentanmeldung WO 2015/052048 verwiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist eine erfindungsgemäß einzusetzende Biomasse nach der Trocknung eine Konzentration an Kieselsäure, insbesondere hydrophiler oder hydrophober Kieselsäure, von 0,2 bis 10 Gew.-%, insbesondere 0,5 bis 5 Gew.-%, vor allem 0,5 bis 2 Gew.-%, auf.
Durch die Trocknung wird vorzugweise ein rieselfähiges, feinteiliges oder grobkörniges Produkt, vorzugsweise Granulat, erhalten. Gegebenenfalls kann aus dem erhaltenen Granulat durch Sieben oder Staubabtrennung ein Produkt mit der gewünschten Korngröße erhalten werden.
Sofern ein rieselfähiges feinteiliges Pulver erhalten wurde, kann dieses gegebenenfalls durch geeignete Kompaktier- oder Granulierverfahren in ein grobkörniges, gut rieselfähiges, lagerbares und weitgehend staubfreies Produkt überführt werden.
Bei dieser anschließenden Granulation oder Kompaktierung können gegebenenfalls übliche organische oder anorganische Hilfsstoffe beziehungsweise Träger wie Stärke, Gelatine,
Cellulosederivate oder ähnliche Stoffe, die üblicherweise in der Lebensmittel- oder
Futterverarbeitung als Binde-, Gelier- oder Verdickungsmittel Verwendung finden, eingesetzt werden. Unter„rieselfähig“ ist erfindungsgemäß ein Pulver zu verstehen, das aus einer Serie von
Glasauslaufgefäßen mit verschieden großen Auslassöffnungen mindestens aus dem Gefäß mit der Öffnung 5 Millimeter ungehindert auslaufen kann (Klein: Seifen, Öle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)). Unter„feinteilig“ ist erfindungsgemäß ein Pulver mit einem überwiegenden Anteil (> 50 %) einer Korngröße von 20 bis 100 Mikrometer Durchmesser zu verstehen.
Unter„grobkörnig“ ist erfindungsgemäß ein Pulver mit einem überwiegenden Anteil (>50 %) einer Korngröße von 100 bis 2500 Mikrometer Durchmesser zu verstehen.
Unter„staubfrei“ ist erfindungsgemäß ein Pulver zu verstehen, das lediglich geringe Anteile (< 10 %, vorzugsweise < 5 %) an Korngrößen unter 100 Mikrometer enthält.
Die Bestimmung der Korn- bzw. Teilchengrößen erfolgt erfindungsgemäß vorzugsweise durch Methoden der Laserbeugungsspektrometrie. Die anzuwendenden Methoden sind im Lehrbuch „Teilchengrößenmessung in der Laborpraxis“ von R.H. Müller und R. Schuhmann,
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) sowie im Lehrbuch„Introduction to Particle Technology“ von M. Rhodes, Verlag Wiley & Sons (1998) beschrieben. Sofern unterschiedliche Methoden anwendbar sind, wird bevorzugt die zuerst genannte anwendbare Methode aus dem Lehrbuch von R.H. Müller und R. Schuhmann zur Teilchengrößenmessung angewendet.
Die durch erfindungsgemäße Trocknungsverfahren erhaltenen Produkte besitzen vorzugsweise einen Anteil von mindestens 80 Gew.-%, insbesondere mindestens 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, an Partikeln mit einer Korngröße von 100 bis 3500
Mikrometern, vorzugsweise 100 bis 3000 Mikrometern, vor allem 100 bis 2500 Mikrometern.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Produkte eines Wirbelschichtgranulationsverfahrens besitzen hierbei vorzugsweise einen Anteil von mindestens 80 Gew.-%, insbesondere mindestens 90 Gew.- %, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, an Partikeln mit einer Korngröße von 200 bis 3500 Mikrometern, vorzugsweise 300 bis 3000 Mikrometern, vor allem 500 bis 2500 Mikrometern. Die erfindungsgemäß erhaltenen Produkte eines Sprühtrocknungsverfahrens besitzen hingegen vorzugsweise einen Anteil von mindestens 80 Gew.-%, insbesondere mindestens 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, an Partikeln mit einer Korngröße von 100 bis 500 Mikrometern, vorzugsweise 100 bis 400 Mikrometern, vor allem 100 bis 300 Mikrometern.
Die erfindungsgemäß erhaltenen Produkte eines Sprühtrocknungsverfahrens und anschließenden Granulationsverfahrens besitzen vorzugsweise einen Anteil von mindestens 80 Gew.-%, insbesondere mindestens 90 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 95 Gew.-%, an Partikeln mit einer Korngröße von 100 bis 1000 Mikrometern.
Der Anteil an Staub, d.h. Teilchen mit einer Korngröße von kleiner 100 Mikrometern, liegt vorzugsweise bei maximal 10 Gew.-%, insbesondere maximal 8 Gew.-%, besonders bevorzugt maximal 5 Gew.-%, vor allem maximal 3 Gew.-%.
Das Schüttgewicht der erfindungsgemäßen Produkte liegt vorzugsweise bei 400 bis 800 kg/m3, besonders bevorzugt bei 450 bis 700 kg/m3.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Futtermittel, das eine erfindungsgemäße Biomasse sowie weitere Futtermittelinhaltsstoffe umfasst. Die weiteren Futtermittelinhaltsstoffe sind hierbei vorzugsweise ausgewählt aus proteinhaltigen, kohlenhydrathaltigen, nukleinsäurehaltigen und lipidlöslichen Komponenten sowie gegebenenfalls weiteren fetthaltigen Komponenten und weiterhin aus anderen Zusatzstoffen wie Mineralien, Vitaminen, Pigmente und Aminosäuren. Daneben können neben Nährsubstanzen auch strukturgebende Substanzen enthalten sein, um etwa die Textur oder das Erscheinungsbild des Futtermittels zu verbessern. Weiterhin können beispielsweise auch Bindemittel eingesetzt werden, um die Konsistenz des Futtermittels zu beeinflussen. Eine bevorzugt eingesetzte Komponente, die sowohl eine Nährsubstanz als auch eine strukturgebende Substanz darstellt, ist Stärke.
Ein erfindungsgemäßes Futtermittel bzw. eine zur Herstellung eines erfindungsgemäßen
Futtermittels verwendete Zusammensetzung zeichnet sich erfindungsgemäß vorzugsweise dadurch aus, dass es eine erfindungsgemäße Biomasse in einer Menge von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, insbesondere 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%, enthält. Dieses Futtermittel bzw. die zur Herstellung des Futtermittels verwendete Zusammensetzung weist vorzugsweise weiterhin mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften auf: a) einen Gesamt-Protein-Gehalt von 33 bis 67 Gew.-%, vorzugsweise 39 bis 61 Gew.-%, insbesondere 44 bis 55 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettghalt von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 22 Gew.-%,
insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, vor allem 12 bis 18 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 17 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 14 Gew.-%;
d) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 13 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 1 1 Gew.-%, insbesondere 4 bis 10 Gew.-%, vor allem 5,5 bis 9 Gew.-%;
e) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 7 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5,5 Gew.- %, insbesondere 2 bis 5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4,5 Gew.-%;
f) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,8 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,8 Gew.-%, vor allem 1 ,3 bis 2,4 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 2,2 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel bzw. eine zur Herstellung des Futtermittels geeignete Zusammensetzung, die über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt:
a) einen Gesamt-Proteingehalt von 33 bis 67 Gew.-%, vorzugsweise 39 bis 61 Gew.-%, insbesondere 44 bis 55 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 22 Gew.-%, insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, vor allem 12 bis 18 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 17 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 14 Gew.-%;
d) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 13 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 1 1 Gew.-%, insbesondere 4 bis 10 Gew.-%, vor allem 5,5 bis 9 Gew.-%;
e) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 7 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5,5 Gew.- %, insbesondere 2 bis 5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4,5 Gew.-%; f) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,8 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,8 Gew.-%, vor allem 1 ,3 bis 2,4 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 2,2 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel bzw. eine zur Herstellung des Futtermittels geeignete Zusammensetzung, die über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt:
a) einen Gesamt-Proteingehalt von 33 bis 67 Gew.-%, vorzugsweise 39 bis 61 Gew.-%, insbesondere 44 bis 55 Gew.-%,
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 22 Gew.-%, insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, vor allem 12 bis 18 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 17 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 14 Gew.-%;
d) einen Gehalt an erfindungsgemäßer Biomasse, insbesondere einer erfindungsgemäßen Labyrinthulea-Biomasse, bevorzugt einer erfindungsgemäßen Thraustochytriaceae-Biomasse, von 2 bis 24 Gew.-%, vorzugsweise 4 bis 22 Gew.-%, insbesondere 9 bis 20 Gew.-%, vor allem 11 bis 18 Gew.-%;
e) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 13 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 1 1 Gew.-%, insbesondere 4 bis 10 Gew.-%, vor allem 5,5 bis 9 Gew.-%;
f) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 7 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5,5 Gew.- %, insbesondere 2 bis 5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4,5 Gew.-%;
g) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,8 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,8 Gew.-%, vor allem 1 ,3 bis 2,4 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 2,2 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel bzw. eine zur Herstellung des Futtermittels geeignete Zusammensetzung, die über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt:
a) einen Gesamt-Protein-Gehalt von 33 bis 67 Gew.-%, vorzugsweise 39 bis 61 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fett-Gehalt von 5 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 8 bis 22 Gew.-%, insbesondere 10 bis 20 Gew.-%, vor allem 12 bis 18 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 6 bis 17 Gew.-%, besonders bevorzugt 8 bis 14 Gew.-%;
d) einen Gehalt an einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrien oder Schizochytrien-Biomasse, bevorzugt einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrium limacinum-Biomasse, vor allem einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrium limacinum SR21 -Biomasse, von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, insbesondere 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%;
e) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 13 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 1 1 Gew.-%, insbesondere 4 bis 10 Gew.-%, vor allem 5,5 bis 9 Gew.-%;
f) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 7 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5,5 Gew.- %, insbesondere 2 bis 5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4,5 Gew.-%;
g) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,8 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,8 Gew.-%, vor allem 1 ,3 bis 2,4 Gew.-%, insbesondere 1 ,3 bis 2,2 Gew.-%. Durch Extrusion der zuvor genannten Zusammensetzungen lässt sich ein Extrudat erhalten. Diese Extrudate stellen einen bevorzugten Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar. Die Extrusion des Futtermittels erfolgt hierbei vorzugsweise bei einem Energieeintrag von 12 - 28 Wh/kg, insbesondere 14 - 26 Wh/kg, besonders bevorzugt 16 - 24 Wh/kg, vor allem 18 - 22 Wh/kg.
Im Extrusionsverfahren wird hierbei vorzugsweise ein Schnecken- oder Doppelschneckenextruder eingesetzt. Das Extrusionsverfahren wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 80 - 220° C, insbesondere 80 - 130 °C, vor allem 95 - 1 10°C, einem Druck von 10 - 40 Bar, und einer Wellenumlaufgeschwindigkeit von 100 - 1000 rpm, insbesondere 300 - 700 rpm, durchgeführt. Die Verweilzeit des eingebrachten Gemisches beträgt vorzugsweise 5 - 30 Sekunden, insbesondere 10 - 20 Sekunden.
Das Extrusionsverfahren kann gegebenenfalls einen Kompaktierungs- und/oder einen
Kompressionsschritt umfassen.
Vor der Durchführung des Extrusionsverfahrens werden die Komponenten vorzugsweise innig miteinander vermischt. Dies geschieht vorzugsweise in einer Trommel, die mit Schaufeln ausgestattet ist. Bei diesem Mischungsschritt erfolgt in einer bevorzugten Ausführungsform eine Wasserdampfinjektion, insbesondere um die Quellung der vorzugsweise enthaltenen Stärke zu bewirken. Die Wasserdampfinjektion wird hierbei vorzugsweise bei einem Druck von 1 bis 5 bar, besonders bevorzugt bei einem Druck von 2 bis 4 bar, durchgeführt.
Die weiteren Futtermittelinhaltsstoffe werden vor dem Vermischen mit der Aigen-Biomasse - soweit erforderlich - vorzugsweise zerkleinert, um sicherzustellen, dass bei dem Mischungsschritt ein homogenes Gemisch erhalten wird. Das Zerkleinern der weiteren Futtermittelinhaltsstoffe kann beispielsweise unter Verwendung einer Hammer-Mühle erfolgen.
Das erzeugte Extrudat hat vorzugsweise einen Durchmesser von 1 bis 14 mm, vorzugsweise 2 bis 12 mm, insbesondere 2 bis 6 mm, und weist vorzugsweise auch eine Länge von 1 bis 14 mm, vorzugsweise 2 bis 12 mm, insbesondere 2 bis 6 mm, auf. Die Länge des Extrudats wird durch Einsatz eines Schneidwerkzeugs während der Extrusion eingestellt. Die Länge des Extrudats wird vorzugsweise so gewählt, dass es dem Durchmesser des Extrudats in etwa entspricht. Der Durchmesser des Extrudats wird durch Wahl des Siebdurchmessers festgelegt.
In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform schließt sich an das Extrusionsverfahren die Beladung des erhaltenen Extrudats mit Öl an. Hierzu wird das Extrudat vorzugsweise zunächst auf einen Feuchtigkeitsgehalt von maximal 5 Gew.-% getrocknet. Die Beladung des
Extrusionsprodukts mit Öl kann erfindungsgemäß beispielsweise durch Einlegen des Extrudats in Öl oder Besprühen des Extrudats mit Öl erfolgen, sie erfolgt erfindungsgemäß jedoch
vorzugsweise durch Vakuumbeschichtung.
Auf diese Weise werden Futtermittel erhalten, die erfindungsgemäße Biomassen vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 25 Gew.-%, insbesondere 2 bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%, enthalten.
Diese Futtermittel weisen entsprechend vorzugsweise weiterhin mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften auf: a) einen Gesamt-Proteingehalt von 30 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 35 bis 55 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 15 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 18 bis 32 Gew.-%, insbesondere 20 bis 30 Gew.-%, vor allem 22 bis 28 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 bis 13 Gew.-%;
d) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 12 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-%, insbesondere 4 bis 9 Gew.-%, vor allem 5 bis 8 Gew.-%;
e) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere 2 bis 4,5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4 Gew.-%;
f) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,5 Gew.-%, vor allem 1 ,2 bis 2,2 Gew.-%, insbesondere 1 ,2 bis 2,0 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel, insbesondere ein Extrudat, das über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt: a) einen Gesamt-Proteingehalt von 30 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 35 bis 55 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 15 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 18 bis 32 Gew.-%, insbesondere 20 bis 30 Gew.-%, vor allem 22 bis 28 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 bis 13 Gew.-%;
d) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 12 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-%, insbesondere 4 bis 9 Gew.-%, vor allem 5 bis 8 Gew.-%;
e) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere 2 bis 4,5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4 Gew.-%;
f) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,5 Gew.-%, vor allem 1 ,2 bis 2,2 Gew.-%, insbesondere 1 ,2 bis 2,0 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel, insbesondere ein Extrudat, das über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt: a) einen Gesamt-Proteingehalt von 30 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 35 bis 55 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fettgehalt von 15 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 18 bis 32 Gew.-%, insbesondere 20 bis 30 Gew.-%, vor allem 22 bis 28 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 bis 13 Gew.-%;
d) einen Gehalt an einer erfindungsgemäßen Biomasse, insbesondere einer
erfindungsgemäßen Labyrinthulea-Biomasse, vorzugsweise einer erfindungsgemäßen
Thraustochytriaceae-Biomasse, von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, insbesondere 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%;
e) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 12 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-%, insbesondere 4 bis 9 Gew.-%, vor allem 5 bis 8 Gew.-%; f) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere 2 bis 4,5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4 Gew.-%;
g) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,5 Gew.-%, vor allem 1 ,2 bis 2,2 Gew.-%, insbesondere 1 ,2 bis 2,0 Gew.-%. Ein erfindungsgemäß bevorzugter Gegenstand ist daher auch ein Futtermittel, insbesondere ein Extrudat, das über mindestens eine, vorzugsweise alle, der folgenden Eigenschaften verfügt: a) einen Gesamt-Protein-Gehalt von 30 bis 60 Gew.-%, vorzugsweise 35 bis 55 Gew.-%, insbesondere 40 bis 50 Gew.-%;
b) einen Gesamt-Fett-Gehalt von 15 bis 35 Gew.-%, vorzugsweise 18 bis 32 Gew.-%, insbesondere 20 bis 30 Gew.-%, vor allem 22 bis 28 Gew.-%;
c) einen Gesamt-Stärkegehalt von maximal 25 Gew.-%, insbesondere maximal 20 Gew.-%, vorzugsweise 5 bis 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 7 bis 13 Gew.-%;
d) einen Gehalt an einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrien- oder Schizochytrien- Biomasse, bevorzugt einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrium limacinum-Biomasse, vor allem einer erfindungsgemäßen Aurantiochytrium limacinum SR21 -Biomasse, von 1 bis 25 Gew.-%, vorzugsweise 2 bis 20 Gew.-%, insbesondere 3 bis 15 Gew.-%, vor allem 4 bis 12 Gew.-%;
e) einen Gehalt an polyungesättigten Fettsäuren (PUFAs) von 2 bis 12 Gew.-%,
vorzugsweise 3 bis 10 Gew.-%, insbesondere 4 bis 9 Gew.-%, vor allem 5 bis 8 Gew.-%;
f) einen Gehalt an omega-3-Fettsäuren von 1 bis 6 Gew.-%, vorzugsweise 1 ,5 bis 5 Gew.-%, insbesondere 2 bis 4,5 Gew.-%, vor allem 2,5 bis 4 Gew.-%;
g) einen Gehalt an DHA von 0,5 bis 3 Gew.-%, vorzugsweise 0,8 bis 2,5 Gew.-%, insbesondere 1 bis 2,5 Gew.-%, vor allem 1 ,2 bis 2,2 Gew.-%, insbesondere 1 ,2 bis 2,0 Gew.-%. Als fetthaltige Komponente können erfindungsgemäß neben der erfindungsgemäß einzusetzenden Biomasse Fette, insbesondere Öle, tierischen als auch solche pflanzlichen Ursprungs eingesetzt werden. Als fetthaltige Komponente kommen erfindungsgemäß insbesondere Pflanzenöle in Betracht, beispielsweise Sojabohnenöl, Rapssamenöl, Sonnenblumenkernöl, Flachssamenöl oder Palmöl sowie Mischungen davon. Daneben kann gegebenenfalls auch Fischöl als fetthaltige Komponente in geringen Mengen eingesetzt werden.
Als proteinhaltige Komponente können erfindungsgemäß beispielsweise Sojaprotein,
Erbsenprotein, Weizengluten oder Maisgluten sowie Mischungen davon eingesetzt werden.
Als proteinhaltige Komponente, die zusätzlich Fette enthält, können beispielsweise eingesetzt werden Fischmehl, Krillmehl, Muschelmehl, Kalmarmehl oder Schrimpsschalen. Diese werden im Folgenden unter dem Begriff„marines Mehl“ zusammengefasst. In einer bevorzugten
Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Futtermittel marines Mehl, vorzugsweise Fischmehl, in einer Menge von 3 bis 18 Gew.-%, insbesondere 5 bis 15 Gew.-%, vor allem 7 bis 13 Gew.-%.
Als kohlenhydrathaltige Komponente können beispielsweise Weizenmehl, Sonnenblumenmehl oder Sojamehl sowie Mischungen davon eingesetzt werden. Beim Einsatz erfindungsgemäßer Futtermittel, insbesondere eines erfindungsgemäßen ölbeschichteten Extrudats, in der Tierzucht, hat sich herausgestellt, dass dieses in besonderem Maße das Wachstum der Tiere fördert sowie den Stress-Zustand der Tiere verbessert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Anzucht von Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass diesen ein erfindungsgemäßes Futtermittel verabreicht wird. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist hierbei insbesondere ein Verfahren zur Steigerung des Wachstums von Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass diesen ein erfindungsgemäßes Futtermittel verabreicht wird.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ebenso ein Verfahren zur Erhöhung des Anteils an omega-3-Fettsäuren, insbesondere DHA, im Muskelgewebe von Tieren, dadurch gekennzeichnet, dass diesen ein erfindungsgemäßes Futtermittel verabreicht wird.
Verzugsweise wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren das Futtermittel mindestens alle zwei Tage, vorzugsweise mindestens einmal täglich, verabreicht.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenso die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Futtermittels zur Steigerung des Wachstums bei Tieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Futtermittels zur Erhöhung des Anteils an omega-3-Fettsäuren im
Muskelgewebe bei Tieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Futtermittels zur Verbesserung des Gesundheitszustands von Tieren, insbesondere zur Verbesserung des Stress-Zustands von Tieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung eines
erfindungsgemäßen Futtermittels zur Ermöglichung einer stress-reduzierten Anzucht der Tiere.
Bei den angezüchteten Tieren, die mit einem erfindungsgemäßen Futtermittel gefüttert werden, handelt es sich vorzugsweise um Geflügel, Schweine oder Rinder.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei den angezüchteten Tieren jedoch um marine Tiere, besonders bevorzugt um Flossenfische oder Crustaceen. Hierzu zählen insbesondere Karpfen, Tilapia, Welse, Thunfisch, Lachs, Forellen, Baramundi, Brassen, Barsche, Kabeljau, Schrimps, Hummer, Krabben, Garnelen und Krebse. Besonders bevorzugt handelt es sich bei den angezüchteten Tieren um Lachse. Bevorzugte Lachsarten stellen hierbei der Atlantische Lachs, der Rotlachs, der Masu-Lachs, der Königslachs, der Ketalachs, der Silberlachs, der Donaulachs, der Pazifische Lachs und der Buckellachs dar.
Bei den angezüchteten Tieren kann es sich insbesondere auch um Fische handeln, die anschließend zu Fischmehl oder Fischöl verarbeitet werden. Bei den Fischen handelt es sich hierbei vorzugsweise um Hering, Pollack, Menhaden, Anchovis, Kapelan oder Kabeljau. Das so erhaltene Fischmehl oder Fischöl kann wiederum in der Aquakultur zur Zucht von Speisefischen bzw. Crustaceen eingesetzt werden.
Es kann sich bei den angezüchteten Tieren jedoch auch um Kleinlebewesen handeln, die in der Aquakultur als Futtermittel eingesetzt werden. Bei diesen Kleinlebewesen kann es sich beispielsweise um Nematoden, Crustaceen oder Rotiferen handeln. Die Anzucht der marinen Tiere kann in Teichen, Tanks, Becken oder auch in abgegrenzten Arealen im Meer oder in Seen, hierbei insbesondere in Käfigen oder Netzpferchen, erfolgen. Die Anzucht kann dazu dienen, den fertigen Speisefisch heranzuzüchten, jedoch auch eingesetzt werden, um Jungfische heranzuzüchten, die anschließend freigesetzt werden, um den
Wildfischbestand aufzustocken.
Bei der Lachszucht erfolgt vorzugsweise zunächst die Heranzucht bis zum Junglachs in
Süßwasser-Tanks oder künstlichen Wasserströmen und anschließend die weitere Zucht im Meer in schwimmenden Käfigen bzw. Netzpferchen, die vorzugsweise in Buchten oder Fjorden verankert sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Futtermittel handelt es sich entsprechend vorzugsweise um ein Futtermittel zum Einsatz bei der Anzucht der zuvor genannten Tiere.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 : Herstellung der Biomasse durch Fermentation von Aurantiochytrium limacinum SR21 in einem Medium mit hohem Sulfat -Gehalt und anschließende Trocknung der
Biomasse
Die Kultivierung der Zellen erfolgte für ca. 70 h in einem Zulaufverfahren unter Verwendung eines Stahlfermenters mit einem Fermentervolumen von 2 Litern bei einer Gesamt-Startmasse von ca. 700 g und einer erreichten Gesamt-Endmasse von ca. 1 ,5 kg. Während des Verfahrens wurde eine Glucose-Lösung (570 g/kg Glucose) zudosiert („Fed-batch Verfahren“)
Die Zusammensetzung des Startmediums war wie folgt:
Medium 1 : 20 g/kg Glukose; 4 g/kg Hefe-Extrakt; 2 g/kg Ammoniumsulfat; 12 bzw. 16 g/kg Natriumsulfat; 2,46 g/kg Magnesiumsulfat (Heptahydrat); 0,45 g/kg Kaliumchlorid; 4,5 g/kg Kaliumdihydrogenphosphat; 0, 1 g/kg Thiamin (HCl); 5 g/kg Spurenelementlösung.
Die Zusammensetzung der Spurenelementlösung war wie folgt: 35 g/kg Salzsäure (37%); 1 ,86 g/kg Manganchlorid (Tetrahydrat); 1 ,82 g/kg Zinksulfat (Heptahydrat); 0,818 g/kg Natrium-EDTA; 0,29 g/kg Borsäure; 0,24 g/kg Natriummolybdat (Dihydrat); 4,58 g/kg Kalziumchlorid (Dihydrat); 17,33 g/kg Eisensulfat (Heptahydrat); 0, 15 g/kg Kupferchlorid (Dihydrat).
Die Kultivierung erfolgte unter folgenden Bedingungen: Kultivierungstemperatur 28°C;
Belüftungsrate 0,5 vvm, Rührergeschwindigkeit 600 - 1950 rpm, Kontrolle das pH-Werts in der Wachstumsphase bei 4,5 mit Hilfe von Ammoniakwasser (25% v/v). Die Fermentation erfolgte bis zu einer Biomassendichte von 80 g/l, bevor durch Limitierung von Phosphat und Stickstoff die Ölproduktionsphase eingeleitet wurde. Die Sulfat-Konzentration ist aufgrund des hohen Sulfat- Gehalts im Ausgangsmedium bis zum Ende der Fermentation, also auch bis zum Ende der Ölproduktionsphase, stets oberhalb der Sättigungsgrenze der Zellen, die bei ca. 5 g pro kg Biotrockenmasse liegt. Die erhaltenen Biomassen werden im Folgenden„Biomasse 1“ (12 g/kg Natriumsulfat im Startmedium) bzw.„Biomasse 2“ (16 g/kg Natriumsulfat im Startmedium) bezeichnet. Zur Bestimmung des Sulfat-Gehalts der erhaltenen Biomasse wurde der Schwefel-Gehalt der Biomasse gemäß DIN ISO 11885 bestimmt.
Beispiel 2: Herstellung der Biomasse durch Fermentation von Aurantiochytrium limacinum SR21 in einem Medium mit niedrigem Sulfat -Gehalt und anschließende Trocknung der Biomasse
Die Kultivierung der Zellen erfolgte für ca. 70 h in einem Zulaufverfahren unter Verwendung eines Stahlfermenters mit einem Fermentervolumen von 2 Litern bei einer Gesamt-Startmasse von 712 g und einer erreichten Gesamt-Endmasse von ca. 1 ,5 kg. Während des Verfahrens wurde eine Glucose-Lösung (570 g/kg Glucose) zudosiert („Fed-batch Verfahren“)
Die Zusammensetzung des Startmediums war wie folgt:
Medium 1 : 20 g/kg Glukose; 4 g/kg Hefe-Extrakt; 0 g/kg Ammoniumsulfat; 2,46 g/kg
Magnesiumsulfat (Heptahydrat); 0,45 g/kg Kaliumchlorid; 4,5 g/kg Kaliumdihydrogenphosphat; 0,1 g/kg Thiamin (HCl); 5 g/kg Spurenelementlösung.
Die Zusammensetzung der Spurenelementlösung war wie folgt: 35 g/kg Salzsäure (37%); 1 ,86 g/kg Manganchlorid (Tetrahydrat); 1 ,82 g/kg Zinksulfat (Heptahydrat); 0,818 g/kg Natrium-EDTA; 0,29 g/kg Borsäure; 0,24 g/kg Natriummolybdat (Dihydrat); 4,58 g/kg Kalziumchlorid (Dihydrat); 17,33 g/kg Eisensulfat (Heptahydrat); 0,15 g/kg Kupferchlorid (Dihydrat).
Die Kultivierung erfolgte unter folgenden Bedingungen: Kultivierungstemperatur 28°C;
Belüftungsrate 0,5 vvm, Rührergeschwindigkeit 600 - 1950 rpm, Kontrolle das pH-Werts in der
Wachstumsphase bei 4,5 mit Hilfe von Ammoniakwasser (25% v/v). Die Fermentation erfolgte bis zu einer Biomassendichte von 80 g/l, bevor durch Limitierung von Phosphat und Stickstoff die Ölproduktionsphase eingeleitet wurde. Die Sulfat-Konzentration ist bereits bei Einleitung der Ölproduktionsphase unter die Nachweisgrenze von 0,05 g pro kg Fermentationsmedium gefallen und die Sulfat-Konzentration lag entsprechend auch während der gesamten Ölproduktionsphase unterhalb der Nachweisgrenze. Und da keine Zudosierung von Sulfat erfolgte, ist die Sulfat- Konzentration im Verlauf der Ölproduktionsphase auf null gefallen. Die erhaltene Biomasse wird im Folgenden„Biomasse 3“ bezeichnet. Beispiel 3: Aufarbeitung und Vergleich der erhaltenen Biomassen bzw. Verfahren
Nach der Kultivierung wurden die Fermentationsbrühen für 20 Minuten auf 60°C erhitzt um eine weitere Aktivität der Zellen zu unterbinden.
Anschließend erfolgte eine zweistufige Trocknung der Biomasse: Zunächst wurde die
Fermentationsbrühe durch Verdampfung auf eine Trockenmasse von etwa 20 Gew.-% eingeengt. Anschließend erfolgte Sprühtrocknung der eingeengten Fermentationsbrühe unter Verwendung eines Production MinorTM Spray Dryer (GEA NIRO) bei einer Einlasstemperatur der
Trocknungsluft von 340°C. Durch Sprühtrocknung wurde so ein Puder mit einer Trockenmasse von mehr als 95 Gew.-% erhalten. Tabelle 1 : Vergleich der erhaltenen Biomassen
Figure imgf000019_0001
Bei den Biomassen 1 und 2 handelt es sich um Biomassen, die durch Fermentation bei hohem Sulfat-Gehalt gemäß Beispiel 1 erhalten wurden, bei der Biomasse 3 handelt es sich hingegen um eine Biomasse, die durch Fermentation bei niedrigem Sulfat-Gehalt gemäß Beispiel 2 erhalten wurde.
Es ist zu erkennen, dass das Fermentations-Verfahren, das bei niedrigem Sulfat-Gehalt durchgeführt wurde und zur Biomasse 3 führte, ein Produkt mit deutlich höherer Reinheit, also ein Produkt mit deutlich erhöhtem Anteil an DHA, lieferte als diejenige Verfahren, die bei hohem Sulfat- Gehalt durchgeführt wurden und zu den Biomassen 1 und 2 führten. Außerdem ist auch der Sulfat- Gehalt in der erhaltenen Biomasse deutlich niedriger als bei dem Verfahren mit hohem Sulfat- Gehalt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse durch Kultivierung von PUFAs produzierenden Zellen in einem Fermentationsmedium, dadurch gekennzeichnet, dass der
Sulfat-Gehalt so eingestellt wird, dass die Sulfat-Konzentration im Verlauf der Fermentation auf null fällt.
2. Verfahren zur Herstellung einer PUFAs enthaltenden Biomasse gemäß Anspruch 1 , wobei das Verfahren eine Wachstumsphase und eine Ölproduktionsphase umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Konzentration im Fermentationsmedium vor dem Beginn der Ölproduktionsphase auf null fällt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Konzentration im
Fermentationsmedium in der zweiten Hälfte der Wachstumsphase, vorzugsweise im letzten
Achtel der Wachstumsphase, besonders bevorzugt kurz vor Beginn der Ölproduktionsphase, auf null fällt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Menge so vorgegeben wird, dass sich eine finale Sulfat-Konzentration von 7 bis 10, vorzugsweise 7,5 bis 9,5 g Sulfat pro kg Biomasse einstellt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend als weiteren Schritt den mechanischen Aufschluss der erhaltenen Biomasse unter Anwendung niedriger mechanischer Kräfte, vorzugsweise einer Krafteinwirkung von bis zu 12 Wh/kg, insbesondere 1 bis 10
Wh/kg.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die so erhaltene Fermentationsbrühe einer Ölisolation unterworfen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die so erhaltene Fermentationsbrühe - ggf. nach vorheriger Aufkonzentrierung - vorzugsweise bei niedrigem Energieeintrag zu einem Futtermittel weiterverarbeitet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, vorzugsweise in der Wachstumsphase, bis zu einer Biomassendichte von mindestens 50 g pro Liter Fermentationsmedium, insbesondere 50 bis 250 g pro Liter
Fermentationsmedium, vorzugsweise mindestens 80, 100, 120 oder 140 g pro Liter Fermentationsmedium, insbesondere 80, 100, 120 oder 140 g bis 200 oder 220 g pro Liter Fermentationsmedium, kultiviert werden.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Konzentration im
Medium auf null fällt, nachdem eine Biomassendichte von mindestens 50 g, vorzugsweise mindestens 80 g, insbesondere mindestens 100 oder 120 g, pro Liter Fermentationsmedium erreicht wurde.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ölproduktionsphase durch Limitierung mindestens einer limitierenden Nährstoffkomponente, insbesondere durch Limitierung einer Stickstoff-Quelle, eingeleitet wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfat-Konzentration im Medium während der gesamten Zeit der Ölproduktionsphase unter 0,05 g pro kg Fermentationsmedium liegt, vorzugsweise null beträgt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es während der gesamten Fermentation einen Chlorid-Gehalt von maximal 3 g pro kg
Fermentationsmedium enthält.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Mikroorganismen um solche des Taxons Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, Netzschleimpilze, Schleimnetze), insbesondere um solche der Familie der
Thraustochytriaceae, vorzugsweise der Gattungen Althornia, Aplanochytrium, Elnia,
Japonochytrium, Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium oder Ulkenia, vor allem um solche der Gattungen Schizochytrium oder Aurantiochytrium, insbesondere der Spezies Aurantiochytrium limacinum, handelt.
14. PUFAs enthaltende Biomasse, dadurch gekennzeichnet, dass sie Mikroorganismen des
Taxons Labyrinthulomycetes umfasst und einen Sulfat-Gehalt 7 bis 10 g, vorzugsweise 7,5 bis
9,5 g Sulfat pro kg Biomasse aufweist.
15. PUFAs enthaltende Biomasse nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass es sich bei den Zellen des Taxons Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, Netzschleimpilze, Schleimnetze), um solche der Familie der Thraustochytriaceae, vorzugsweise der Gattungen Althornia, Aplanochytrium, Elnia, Japonochytrium,
Schizochytrium, Thraustochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium oder Ulkenia, besonders bevorzugt um solche der Gattungen Schizochytrium oder Aurantiochytrium, insbesondere der Spezies Aurantiochytrium limacinum, handelt.
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