NO305762B1

NO305762B1 - Gjaercelle tilhorende arten Phaffia rhodozyma, fremgangsmate for produksjon av astaxanthin og anvendelse av gjaercellen

Info

Publication number: NO305762B1
Application number: NO19885560A
Authority: NO
Inventors: Bent Flenoe; Ib Christensen; Robert Larsen; Steffen Radich Johansen; Eric A Johnson
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1987-04-15
Filing date: 1988-12-14
Publication date: 1999-07-19
Also published as: EP0367765A1; US5972642A; JPH0714340B2; DE3883539D1; WO1988008025A1; NO885560L; DE3883539T2; KR890700658A; JPH1169969A; IS1580B; EP0367765B2; ATE93537T1; NO885560D0; DE367765T1; DE3883539T3; KR960014619B1; IE881151L; DK199887D0; EP0367765B1; FI894888A0

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår gjærcelle til-hørende arten Phaffia rhodozyma og en fremgangsmåte for produksjon av astaxanthin. Oppfinnelsen angår videre anvendelse av gjærcellen i kombinasjon med andre forbestanddeler som tilsetningsstoff til en dyreforblanding.

Det er kjent at den røde farve til kjøtt fra anadrom fisk, som laks eller sjøørret, skyldes røde pigmenter, som astaxanthin, som er tilstede i foret som fisken konsumerer. Under naturlige omgivelser får fisken sin røde farve fra kreps-dyr eller andre astaxanthin-holdige organismer, men når de oppdrettes i fiskeoppdrettsanlegg, har fisken ikke tilgang til disse naturlige pigmenteringskilder og får derfor ikke den tiltalende røde farve medmindre røde pigmenter tilføres med foret.

Astaxanthin isolert fra krepsdyravfall eller produsert syntetisk såvel som andre syntetiske røde pigmenter, som cantaxanthin, er således blitt anvendt som bestanddeler i fiskefor. Anvendelsen av cantaxanthin i forstoffer for dyr er imidlertid forbudt i visse land, og den syntetiske astaxanthinproduksjon såvel som fremgangsmåten for å isolere naturlig astaxanthin er forholdsvis kostbare og ofte også utsatt for sesongmessige variasjoner.

Andre naturlige astaxanthinkilder er kjente, blant disse gjæren Phaffia rhodozyma og visse mikroalger, som den éncellede gruppe av grønnalger Chlamydomonås nivalis [Gert Knutson et al., "Pigmentering av laks med astaxanthin fra mikroalger", Norsk Fiskeoppdrett nr. 3, s. 4 - 6, 55 (1980)]. Astaxanthinet produsert av disse organismer har vist seg å

gi anadrom fisk den ønskede rødfarve [Eric A. Johnson et al., "Phaffia rhodozyma as an astaxanthin source in salmonid diets", Aquaculture, 20, s. 123 - 135 (1980) og JP-A 57-206342], Imidlertid er anvendelse av gjærceller i store mengder som næring for fisken ikke ønskelig da dette for ikke er tilstrekkelig variert. På den annen side er mengden av astaxanthin produsert av organismene og tilstede i en næringsmessig akseptabel mengde av gjærceller ikke tilstrekkelig til å oppnå den

ønskede pigmentering, og isoleringen av astaxanthin fra gjær ved hjelp av de kjente metoder er forholdsvis kostbar ..

Dersom det imidlertid hadde vært mulig å oppnå en høyere astaxanthinproduksjon fra disse organismer, ville en lønnsom astaxanthinproduksjon som ikke er utsatt for sesongmessige betingelser, være mulig.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer gjærceller som inneholder astaxanthin i tilstrekkelig høye konsentrasjoner til å gjøre det mulig å anvende gjærcellene som, eller i, for for anadrom fisk og andre dyr for hvilke pigmentering av dyrekjøttet eller et produkt av dyret erønskelig. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for produksjon av astaxanthin fra de ovennevnte gjærceller med høye innhold av astaxanthin. Viktige sider ved oppfinnelsen er basert på en spesiell metode for å dyrke astaxanthinproduserende celler og/eller tilveiebringelsen av mutantstammer med forbedret inherent evne til å produsere astaxanthin.

En side ved den foreliggende oppfinnelse angår således en gjærcelle tilhørende arten Phaffia rhodozyma som er kjennetegnet ved at den, når den dyrkes under betingelser som omfatter en oxygenoverføringshastighet på minst 30 mmol/l/time på Difco YM-medium ved 20-22°C i 5 dager i 500 ml ristekolber med to skjermer inneholdende 50 ml av mediet og utsatt for kretsende risting ved 150 rpm, idet podestoffet er 100 ul av en fire dager gammel YM-kultur, produserer astaxanthin i en mengde av minst 600 ug pr. g gjærtørrstoff, bestemt ved HPLC-analyse under anvendelse av rent astaxanthin som en standard på en methanolekstrakt av gjæren tilberedt ved å utsette en suspensjon på 0,2 g gjærtørrstoff i 20 ml methanol for 5x1 minutters desintegrasjon i intervaller på et halvt minutt, idet desintegrasjonen utføres ved en temperatur av høyst 20°C i en glasskulemølle som inneholder 15 g glasskuler med en diameter av 0,4 mm, idet glasskulemøllen er forsynt med en kjølekappe med isvann, hvor gjærcellen er en gjærcelle som tilhører gjærcellen deponert under aksesjonsnummer CBS 225-87, en gjærcelle som tilhører gjærcellen deponert under aksesjonsnummer CBS 215-88, eller en gjærcelle avledet ved kjemisk mutagenisering fra villtypegjærceller deponert under akses jonsnumrene CBS 5905/ATCC 24202/UCD 67-210, CBS 5908/ATCC 24203/UCD 67-383, CBS 6938, CBS 6954, ATCC 24201/UCD 67-203, ATCC 24228/UCD 68-653C, ATCC 24229/UCD 67-202, ATCC 24230/UCD 67-385 og ATCC 24261/UCD 67-484, hvor gjærcellen har i det vesentlige den samme morfologi som stammene CBS 225-87 og CBS 215-88, og produserer astaxanthin i mengder som er minst av den samme størrelsesorden som for CBS 225-87 og CBS 215-88.

De ovenfor angitte vekstbetingelser og bestemmelsesbetingelser er gitt for å standardisere veksten og prøvnings-metodene slik at det oppnådde resultat vil gi til kjenne de inherente astaxanthinproduserende evner til den angjeldende gjær. Denne metode har ved flere forsøk utført av oppfinnerne vist seg å være en egnet og reproduserbar metode som er lett å utføre i praksis. Det bør bemerkes at bestemmelsesmetoden ikke er den samme som den som hittil er blitt anvendt i litteraturen, se f. eks. Eric A. Johnson et al., "Astaxanthin forma-tion by the yeast Phaffia rhodozyma", Journal of general microbiology 115, 1979, s. 173-183, er basert på absorpsjonen av en 1 % (vekt/volum) oppløsning i aceton i en 1 cm kuvette på 1600, mens den verdi som fås ved å måle astaxanthinstandarden fra Hoffmann-La Roche, er 2100. Denne verdi er basert på oppfinnernes egne målinger såvel som på informasjon som er gitt av Hoffmann-La Roche.

Dessuten måler den kjente bestemmelsesmetode det samlede pigmentinnhold i gjæren mens den ovennevnte standardmetode anvendt ved den foreliggende oppfinnelse utelukkende måler astaxanthininnholdet. Når verdiene oppnådd ved den standardiserte metode som angitt ovenfor, sammenlignes med verdiene angitt i litteraturen, bør det erindres at verdiene angitt i litteraturen vil være betraktelig høyere enn de sanne verdier oppnådd med den ovennevnte stadardiserte metode. Når som helst det foreliggende samlede pigmentinnhold sammenlignes med litteraturangivelsene, bør således en korreksjon for for-skjellen i ekstinksjonskoeffisienter gjøres ved å multiplisere det samlede pigmentinnhold angitt i litteraturen med 1600/ 2100.

Vekstbetingelsene angitt ovenfor er de som av oppfinnerne er blitt funnet å være reproduserbare og av betydning for bestemmelsen av den inherente astaxanthin- produserende evne. En mer detaljert forklaring av vekst- og bestemmelsesbetingelsene anvendt for å bestemme de inherente astaxanthinproduserende evner til gjærstammer er gitt i for-bindelse med eksemplene.

Gjærcellen i henhold til oppfinnelsen er som nevnt en gjærcelle som tilhører arten Phaffia rhodozyma.

For tiden er Phaffia rhodozyma den eneste kjente gjær som produserer astaxanthin. P. rhodozyma av den ville type isoleres fra løvtreeksudater, og et eksempel på en slik villtypestamme er deponert i American Type Culture Collection under deponeringsnummeret ATCC 24261.

Vegetative P. rhodozyma-celler danner spirer som heterobasidiomycetisk gjær. Clamydosporer utvikles ved spiring, men promycelium og riktig sporedannelse forekommer ikke. Chlamydosporene er forholdsvis store sfæriske celler med et større lipidinnhold enn de vegetative celler. Forsøk på å pare de forskjellige stammer i det håp å oppnå dikaryotisk mycelium og teliosporedannelse har ikke vært fremgangsrike.

P. rhodozyma ble derfor klassifisert innen slekten Deuteromycotina av klassen Blastomycetes (se M.W. Miller et al., "Phaffia, a new yeast genus in the deuteromycotina (Blastomycetes)", i International Journal of systematic bacteriology 26:2, 1976, s. 286 - 291).

Vegetative celler er ellipsoide (3,6 - 7,5) x (5,5 - 10,5) nm og er tilstede i flytende medium individuelt, i par og i enkelte tilfeller i korte kjeder eller små knipper. Intet riktig mycelium utvikles, men et rudimentært pseudomycelium kan være tilstede. Spiring forekommer flere ganger fra det samme punkt på cellen. P. rhodozyma har en sterk cellemembran sammensatt av flere lag, og kaps.lingsmateriale:-.bibringer overflaten et granulært utseende og forårsaker den ovennevnte sammenknipping.

En seksuell livssyklus er ikke blitt iakttatt. Under utviklingen av chlamydosporene blir vegetative celler dannet ved spiring. Disse celler kan ikke betraktes å være promycelia med sporer som beskrevet for Aessosporon (seJ.P. van der Walt, "The perfect and imperfect states of Sporobolomyces salminicolor", J. Microbiol. Serol. 36, .1970, s. 49 - 55). Clamydosporene kan ikke anses å være gonotokonter

(seksuelt segrerte sporer), og deres spirer kan ikke anses å være haploidgenerasjonen. Det har ikke vært mulig ved hjelp av nukleær flekkdannelse å påvise diploidisering på noe vekst-stadium. Transmisjonselektronmikrofotografier har bare vist én enkelt kjerne under alle vekstfaser (se M.W. Miller et al., op.cit.). P. rhodozyma er således sannsynligvis haploid, men dette er ikke blitt bevist.

Etter 2-4 ukers vekst på YM-agar (Difco Laboratories Incorporated, Difco manual: dehydrated culture media and reagents for microbiology, 10. utgave, Detroit 1984), er strengkulturene oransje til lakserosa avhengig av stammen.

P. rhodozyma har den spesielle egenskap at den ikke vokser ved temperaturer over 27° C. Den forgjærer D-glucose, maltose, sucrose og raffinose, mens D-galactose og melibiose ikke blir forgjæret. De mest vanlige carbonkilder er assimilert. Imidlertid er D-galactose, L-sorbose, melibiose, lactose, glycerol og sitrater ikke assimilert. Gjæren kan ikke vokse i vitaminfritt medium uten tilsetning av biotin (M.W. Miller et all, op.cit.). De mest vanlige nitrogenkilder er assimilierte, innbefattende urea. Kaliumnitrat og ethylamin er-ikke assimilert. Gjæren kan ikke vokse på 5 0 vekt% av en glucose-gjær-ekstraktagar og heller ikke på 10 vekt% natriumklorid-gjær-ekstraktagar. Syredannelsen fra gjæren på krittagar er svak, og det samme gjelder gelatinforvæskningen. Caseinhydrolyse, depolyttisk aktivitet og vekst i nærvær av 0,1 ug cykloheximid pr. ml er fraværende, mens gjæren er i stand til å syntetisere stivelseslignende forbindelser uavhengig av pH. Mol% G+C måles til 48,3 + 0,18 (se Miller et al., op. eit.).

Under vekst under carbohydrat- og/eller nitrogen-begrensede betingelser produserer P. rhodozyma trehalose som en carbohydratavsetning når den utsettes for fødesatsforgjæ-ringer. Dette er en helt ny iakttagelse gjort av oppfinnerne og er ikke hittil blitt rapportert.

P. rhodozyma produserer flere carotenoider av hvilke astaxanthin utgjør 83 - 87 %, |B-caroten 2 - 2,5 %, echinenon 2 - 4 % og f<p>nicoxanthin 5 - 7 %, i henhold til litteraturen.

I praksis har imidlertid forholdet mellom astaxanthin og samlet pigment produsert av P. rhodozyma vist seg å variere betraktelig avhengig av vekstbetingelsene for gjær cellene såvel som pigmentbestemmelsesmetoden og har i alminne-lighet vist seg å være innen området 50 -80%.

Alle hydroxylerte pigmenter, innbefattende astaxanthin, er blitt beskrevet som ubundne og ikke som estere eller andre derivater (Arthur G. Andrewes et al., "Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red-pigmented fermenting yeast", i Phytochemistry 15, 1976, s. 1003 - 1007). Det foreligger tre optiske isomere former av astaxanthin: (3S,3'S), (3R,3<*>R) og (3S,3R), idet hver foreligger i forskjellige trans- og cis-konfigurasjoner. Det er blitt rapportert at P. rhodozyma bare produserer (3R,3'R)-astaxanthin (Arthur G. Andrewes et al., "(3R,31 R)-astaxanthin from the yeast Phaffia rhodozyma", op. eit., s. 1009 - 1011). I den foreliggende sammenheng anvendes "astaxanthin" om såvel trans- som cis-konfigurasjoner av astaxanthin.

Pigmentet i de individuelle P. rhodozyma-csa.lér-:er ikte synlig når cellene studeres under et mikroskop, hvilket indi-kerer at pigmentet kan være dispergert gjennom hele cellen. Det er imidlertid også mulig at pigmentet er konsentrert i visse deler av cellene.

Astaxanthin er et oxydert carotenoid og tilhører derfor xanthophylgruppen. På lignende måte som andre carotenoider er astaxanthin sammensatt av åtte isoprenoidenheter. Ved biosyntetsen av astaxanthin som er catabolitt-hemmet,

blir isopentenylpyrofosfat dannet fra acetyl-CoA som illustrert nedenfor.

Ved tre prenyltransferase-reaksjoner danner isopentenylpyrofosfat geranyl-geranylpyrofosfat via geranylpyrofosfat og farnesylpyrofosfat som illustrert nedenfor.

Kondensasjon av to-molekylært geranyl-geranylpyrofosfat danner fytoen som via dehydrogeneringstrinn og ringdannelse danner astaxanthin fra (5-caroten. Den siste del av biosyntesen er ikke blitt utvetydig bestemt, men Andrewes et al. (op.cit.) har foreslått det metabolismeforløp som er vist nedenfor på

basis av pigmentsammensetningen i P. rhodozyma.

Enzymsystemet som omvandler geranyl-geranylpyrofosfat til astaxanthin er ikke kjent, og det er derfor ikke kjent hvorfor P. rhodozyma produserer (3R,31 R)-astaxanthin og hvor-vidt det forekommer noen reguleringstrinn under denne del av biosyntesen. på den annen side er omvandlingen av acetyl-CoA til isopentenylpyrofosfat i andre isoprenoid-produserende organismer enn P. rhodozyma og de enzymer som tar del, blitt beskrevet forholdsvis sterkt detaljert. Mindre er kjent an-gående de enzymer som omvandler isopentenylpyrofosfat til geranyl-geranylpyrofosfat (isopentenylpyrofosfat-isomerase og prenyltransferase (J.W. Porter, S.L. Spurgeon (eds.) "Biosynthesis of isoprenoid compounds", New York, 1981 - 1983).

Proteininnholdet i P. rhodozyma varierer fra 25 til 50 % gjærtørrstoff, avhengig av dyrkningsbetingelsene. Dette er et forholdsvis lavt proteininnhold. I motsetning hertil er lipidinnholdet ekstraordinært høyt (14 - 27 %). Det tas sikte på at nucleinsyren utgjør 8 % lignende som for andre gjær og at aminosyresammensetningen er lignende sammensetningen i andre kjente gjær, som Saccharomyces cerevisiae, og således har et meget lavt innhold av visse aminosyrer, f.eks. methio-nin og cystein (se Gerald Reed og Henry J. Peppler, Yeast Technology, 1973, s. 329, publisert av The AVI Publishing Company, Inc.). Dette og den samlede gjærsammensetning som omfatter en høy mengde av nucleinsyrer, gjør gjæren ubekvem for dyreernæringsformål når gjæren er den eneste næringskilde, som antydet ovenfor. Uten tilsetning av visse aminosyrer og andre næringskomponenter vil gjæren således ikke være en egnet hovedernæringskomponent for fisk eller andre dyr.

Den samlede mengde av astaxanthin som produseres av P. rhodozyma av den viste type når denne dyrkes under de normale kjente betingelser, er tilstrekkelig til å bibringe gjærcellen en rød farve, men den er ikke tilstrekkelig til å gjøre utvinning av astaxanthinet fra gjærcellene økonomisk lønnsom.

Ingen av de Phaffia rhodozyma arter som er beskrevet, i litteraturen har en inherent astaxanthin-produserende evne på over 300 pg pr. g gjærtørrstoff når de analyseres i overensstemmelse med de ovenstående standardmetoder, se Tabell 2 og Tabell 6 i eksemplene. I henhold til den foreliggende oppfin- neise har det imidlertid vist seg mulig å oppnå gjærceller som er inherent i stand til å produsere astaxanthin i en mengde av minst 450 ug pr. g gjærtørrstoff, som minst 600 ug pr. g gjær-tørrstof f, fortrinnsvis minst 700 ug pr. g gjærtørrstoff, mer foretrukket minst 1000 ug pr. g gjærtørrstoff, spesielt minst 1500 ug pr. g gjærtørrstoff, og mest foretrukket minst 2000 ug pr. g gjærtørrstoff, idet veksten og bestemmelsen utføres med de ovenfor angitte standardmetoder. Disse gjærceller er blitt produsert fra naturlig forekommende Phaffia rhodozyma ved mutagenisering. En gjærcelle som oppviser den høye inherente astaxanthin-produserende evne forklart ovenfor, kan fremstilles ved en metode som omfatter behandling av en gjærcelle med et mutagen og valg av en erholdt mutant som når den vokser under de ovenfor angitte betingelser, er i stand til å produsere astaxanthin i en mengde av minst 300 pg pr. g gjærtørr-stof f, bestemt ved den ovenfor angitt metode.

Mutageniseringen kan utføres som en enkelt mutagenisering, men det har vist seg fordelaktig å utføre' to eller flere på hverandre følgende mutageniseringer da det har vist seg at den inherente evne til å produsere astaxanthin kan for-bedres ved hjelp av hvert mutaniseringstrinn. Utgangsgjær-cellen som utsettes for mutagenisering, er normalt en gjærcelle som når den vokser under de ovenfor angitte betingelser, produserer astaxanthin i en mengde av mindre enn 300 ug pr. g gjærtørrstoff, bestemt med den ovenfor angitte metode, men det er klart at en normal kandidat for mutagéniseringsbehandlingen vil være en naturlig forekommende gjærcelle med så høy inherent astaxanthin-produksjon som mulig. Slike gjærceller er normalt gjærceller som tilhører slekten Phaffia, spesielt gjærceller

som tilhører arten Phaffia rhodozyma, som nevnt ovenfor.

Mutagéniseringsbehandlingen kan utføres under anvendelse av en hvilken som helst egnet mutagen (i den foreliggende sammenheng skal betegnelsen "mutagen" forstås i den vide for-stand som omfattende f.eks. ikke bare midler som har en mutagen virkning, men også behandling som har en mutagen virkning, som UV-bestråling). Eksempler på egnede mutagener er ethylmethan-sulfonat, UV-bestråling, N-methy1-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, nucleotidbaseanaloger, som bromuracil, og acridiner, men det tas sikte på at en hvilken som helst annen effektiv mutagen vil være égnet for behandlingen.

I overensstemmelse med vanlige mutageniseringsmetoder etterfølges mutageniseringen av et egnet valg av cellene som har den høyeste astaxanthin-produksjon. På grunn av den kjenns-gjerning at astaxanthin er et pigment kan dette valg utføres forholdsvis enkelt ved hjelp av normale visuelle midler, som enkel iakttagelse av enkeltkolonier. En alternativ metode er: å utføre analyser på kulturer fremstilt fra enkeltkolonier, dvs. ved anvendelse av de standardiserte dyrkningsbetingelser og bestemmelsesbetingelser som er forklart ovenfor.

To stammer produsert ved mutageniseringsmetoden iføl-ge oppfinnelsen og som oppviser en spesielt høy astaxanthin-produktivitet ble deponert 6. april 1987 hos Centraalbureau

>cul t ur e s

voor SchimmelT' Oosterstraat 1, Postbus 273, N:-3740 AG Baarn, Nederland (CBS) under aksesjonsnummerne henholdsvis 224-87 og 225-87, og én stamme som var et reisolat av CBS 225-87 (se eksempel 1) ble deponert 23. mars 1988 hos CBS under aksesjons-nummeret 215-88, og en side ved oppfinnelsen angår disse gjærstammer såvel som mutanter eller derivater av disse som i det vesentlige har bibeholdt eller forbedret disse stammers astaxanthin-produserende evne.

Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte for produksjon av astaxanthin, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av en gjærcelle ifølge krav 1 tilhørende arten Phaffia rhodozyma under aerobe betingelser i et medium som inneholder carbohydratkilder, assimilerbare kilder av nitrogen og fosfor, mikronæringsstoffer og biotin eller desthiobiotin ved en temperatur innen området 15-26 °C for å oppnå en biomasse som inneholder astaxanthin i en mengde av minst 600 pg pr. g gjær-tørrstof f, bestemt ved metoden angitt i krav 1, og eventuelt utførende ett eller flere av de følgende trinn i valgfri rekkefølge: - høsting av celler fra kulturen for å oppnå en gj ærkrem, - åpning av cellene, for eksempel sprengning av celleveggene ved hjelp av mekanisk, kjemisk og/eller enzymatisk behandling og/eller utsettelse av cellene for lydbehandling, autolyse, osmolyse og/eller plasmolyse, eventuelt med tilsetning av egnede midler, som tensider, syrer, baser, enzymer, autolyseforsterkende stoffer, osmo-lyserende midler som salter, og/eller plasmo-lyserende midler,

homogenisering av cellene for å oppnå et homo-genat,

tørking av cellene, cellefragmentene eller homogenatet, fortrinnsvis til et vanninnhold av høyst 12 vekt%, fortrinnsvis høyst 10 vekt%,

ekstrahering av astaxanthin fra cellene, cellefragmentene eller homogenatet.

Den ovenfor angitte astaxanthinmengde, 300 ug pr. g gjærtørrstoff, er høyere enn noen astaxanthinkonsentrasjon som er blitt rapportert i litteraturen. Selv om Johnson et al. henvist til ovenfor, rapporterer et astaxanthininnhold av 295 ug pr. g gjærtørrstoff, omfatter denne verdi ikke bare astaxanthininnholdet, men i virkeligheten det samlede pigmentinnhold i gjærcellen. Dette pigmentinnhold ble dessuten målt under anvendelse av en verdi for absorbansen av en 1 % (vekt% volum) oppløsning i aceton i 1 cm skål av 16 00 som er lavere enn den som ble målt av de foreliggende patentsøkere (2100), slik at den verdi som er rapportert av Johnson et al. svarer til høyst 295 x 1600/2100 =. 225 ug av samlet pigment (ikke bare astaxanthin) pr. g gjærtørrstoff. Dette pigmentinnhold fra litteraturen bør sammenlignes med det samlede pigmentinnhold i gjærstammene ifølge den foreliggende oppfinnelse som er 885 ug/g gjærtørrstoff for stammen CBS 224-87, 1176 ug/g gjærtørrstoff for stammen CBS 225-87, og ca. 1340 ug/g gjærtørrstoff for stammen CBS 215-88, eller enda høyere, f.eks. minst 2000 ug/g gjærtørrstoff.

Den høye astaxanthinkonsentrasjon i gjærcellene ifølge oppfinnelsen kan oppnås delvis ved anvendelse av spesielle dyrkningsbetingelser, som forklart nedenfor, og delvis ved å velge en gjærstamme med en høy inherent astaxanthinpro-duktivitet, fortrinnsvis en gjærstamme som omtalt ovenfor,

og det foretrekkes spesielt å kombinere de spesielle dyrk-

ningsbetingelser og anvendelsen av spesielle astaxanthin-produserende gjærstammer.

Dyrkningen blir fortrinnsvis utført som en fødesats-forgjæring under betingelser hvor i det vesentlige ingen alkohol blir dannet. Som nevnt ovenfor er kulturens temperatur innen området 15 - 26° C. Under 15° C er veksten tilbøyelig til å være for langsom til å være akseptabel for industriell produksjon, og over 26° C blir kulturens levedyktighet alvorlig forringet. Det foretrukne temperaturområde er 20 - 22° C.

Fermenteringen eller i det minste en del av denne blir normalt utført i et medium som omfatter egnede makro-

og mikronæringsstoffer for cellene, som melasse eller saccharose som en carbohydratkilde og nitrogenkilder som maisstøpe-lut, diammoniumsulfat, ammoniumfosfat, ammoniumhydroxyd eller urea, fosforkilder, ammoniufosfat og fosforsyre og tilsatte mikronæringsstof f er eller mineralsalter soin magnesiumsulf at, sinksulfat og biotin eller desthiobiotin. Melassen eller saccharosen blir fortrinnsvis tilført til mediumet adskilt fra de andre komponenter i overensstemmelse med vanlige metoder anvendt for gjærproduksjon. Når mediumet omfatter melasse,

har det vist seg at veksten av gjærcellene påvirkes av konsentrasjonen av sukker eller andre veksthemmende stoffer i dette i fermentoren. Denne virkning er ikke blitt iakttatt når mediumet omfatter maisstøpelut eller faststoffer. Det kan derfor vise seg fordelaktig å regulere gjæringen slik at konsentrasjonen av sukker (uttrykt som den samlede konsentrasjon av glucose og saccharose) i fermentoren er høyst 8 g/l, fortrinnsvis høyst 5 g/l, og mest foretrukket høyst 1 g/l.

Kulturen blir luftet under den samlede gjæring, dvs. at den får vokse under aerobe betingelser. Med uttrykket "aerobe betingelser" er ment at oxygentilførselen skal være tilstrekkelig til at i det vesentlige ingen oxygenbegrensning vil forekomme under gjæringen.

I henhold til en spesiell side ved oppfinnelsen som angitt ovenfor blir konsentrasjonen av astaxanthin i den oppnådde biomasse øket ved å utføre dyrkningen under valgte betingelser. Disse betingelser innbefatter en dyrkning som omfatter en vekstfase under betingelser som er i det vesentlige tilstrekkelige med hensyn til i det vesentlige alle vekstbe tingelser, og en påfølgende vekstbegrenset fase. Den vekstbegrensede fase blir fortrinnsvis opprettet ved å tilveiebringe betingelser hvor vekstmediumet under fortsatt lufting blir fratatt minst én vekstfaktor for å forsterke produksjonen av astaxanthin under den påfølgende fase.

Den vekstbegrensede fase skal forstås generelt å

bety den fase i hvilken hoveddelen av cellene har stanset å vokse. Denne fase forekommer selvfølgelig når mediumet blir fratatt minst én vekstfaktor, men den iakttas også under den siste del av perioden med carbohydrattilsetning når mengden av celler som er tilstede i fermentoren, er godt over fermen torens luftekapasitet.

Det vites ikke hvorfor den påfølgende vekstbegrensede fase har den overraskende virkning at den øker produksjonen av astaxanthin betraktelig (for eksempel fra 231 til 269 ug pr. g gjærtørrstoff som oppnådd i ett av eksemplene som følger), men det antas at forløperne for astaxanthin er blitt produsert under vekstfasen og at den påfølgende vekstbegrensende fase tilveiebringer betingelser som befordrer sluttproduksjonen av astaxanthin, eventuelt oxyderende betingelser ved det oxygen-overskudd som blir tilgjengelig når veksten er avsluttet. Iallfall synes det vesentlig at lufting fortsettes under den påfølgende vekstbegrensede fase. Varigheten av den vekstbegrensede fase er fortrinnsvis minst ca. 16 timer, som 16 - 24 timer, da kortere varigheter kan være tilbøyelige til å minske den ekstra virkning som er oppnåelig, mens det synes ikke å være noen vesentlig oppnåelig virkning ved å forlenge den vekstbegrensede fase til mer enn ca. 24 timer.

Uttrykt på funksjonell måte bør betingelsene for den vekstbegrensede fase tilpasses for å forsterke astaxanthin-produks jonen til minst 1,2 ganger produksjonen oppnådd uten den påfølgende fase, som minst 1,3 ganger produksjonen oppnådd uten den påfølgende fase, fortrinnsvis minst 1,4 ganger produksjonen oppnådd uten den påfølgende fase og mest foretrukket minst 1,5 ganger produksjonen oppnådd uten den påfølgende fase.

Selv om gjærcellen som utsettes for den spesielle dyrkning med den påfølgende vekstbegrensede fase kan være en astaxanthinproduserende gjærcelle av vild type hvis astaxanthin- produserende fase økes på grunn av det påfølgende vekstbegrensede trinn, som en villtypegjærcelle av slekten Phaffia, spesielt av arten Phaffia rhodozyma, foretrekkes det at gjærcellen som utsettes for dyrkning, er en gjærcelle med en inherent og forbedret evne til å produsere astaxanthin, typisk en gjærcelle oppnådd ved mutagenisering som forklart ovenfor. Med disse gjærceller med en inherent øket astaxanthinproduksjon kan konsentrasjonen-av astaxanthin i biomassen oppnådd når den spesielle dyrkningsmetode som omfatter en vekstbegrenset fase anvendes, være minst 600, fortrinnsvis minst 800, mer foretrukket minst 1000 ug pr. g gjærtørrstoff, spesielt minst 1500 ug pr. g gjærtørrstoff, f.eks. minst 2000 ug pr. g gjærtørrstoff, og mest foretrukket minst 3000 ug pr. g gjærtørrstoff, bestemt som angitt ovenfor.

Normalt, og som anvendt ovenfor, er det samlede pigmentinnhold . og astaxanthininnholdet i gjærcellene eller i gjærcelledelene angitt som ug/g gjærtørrstoff. Andre måter å angi det samlede pigment- og astaxanthininnhold på kan imidlertid vise seg å være bekvemme. Det kan f.eks. være nyttig å angi det samlede pigmentinnhold og astaxanthininnhold som ug/ml av den suspensjon i hvilken det er tilstede, f.eks. i vekstmediae-ne. Det vil derved ikke være nødvendig å bestemme vekten av gjærtørrstoff i gjærcellene fra hvilke astaxanthinet eller samlet pigment utvinnes. Under gjæringen eller dyrkningen av gjærcellene kan således astaxanthin- og/eller samlet pigmentinnhold i gjærcellene lett bestemmes.

Etter dyrkningen som beskrevet ovenfor for å oppnå gjærceller som har et høyt astaxanthininnhold, kan kulturen utsettes for de påfølgende behandlinger som er nevnt ovenfor, for å isolere gjærcellene og/eller kondisjonere disse for deres påfølgende anvendelse, som ved å bryte cellene, og/eller astaxanthin kan ekstraheres fra cellene.

De følgende viktige eksempler på disse behandlinger er mer detaljert omtalt: Cellene kan brytes ved å utsette cellene for et øket trykk for deretter å oppheve trykket.

Cellene kan utsettes for det økede trykk og opphevel-se av trykket ved passering gjennom et system som omfatter en ventilhomogenisator hvori det økede trykk bygges opp foran ventilhomogenisatoren. Ventilhomogenisatoren omfatter typisk en luftstråle gjennom hvilken cellesuspensjonen ledes under høyt trykk, og en obstruksjonsdel som strålen treffer i det vesentlige etter passering gjennom ventilen. Eksempler på cellebrytningsventiler er beskrevet i APV Gaulin Technical Bulletin Nr. 74, mars 1985 (APV Gaulin International SA, P.O. Box 58, 1200 AB Hilversum, Nederland), her inkorporert ved henvisning. Som et eksempel på en egnet cellebrytingshomoge-nisator kan en APV Gaulin MC4 homogenisator med en cellebrytningsventil av typen CR som beskrevet i den ovennevnte publi-kasjon, nevnes. Homogenisatoren er forbundet med en varmeveksler i hvilken suspensjonen som omfatter brutte celler pas-serer fra cellebrytningsventilen. Cellesuspensjonens trykk foran ventilen kan være f.eks. ca. 400 - 1200 bar, som f.eks. ca. 700 bar. Denne behandling kan for eksempel gjentas tre ganger med mellomliggende avkjøling av homogenatet i varme-veksleren.

Som forklart nedenfor er det nødvendig at cellene brytes eller behandles på annen måte når de skal anvendes i for da utnyttelsen av astaxanthininnholdet i høy grad er avhengig av at celleinnholdet er tilgjengelig for det angjeldende dyrs fordøyelsessystem. Således fåes i det vesentlige ingen pigmenteringsvirkning dersom fisken mates med for som inneholder ubrutte astaxanthinholdige celler.

De brutte gjærceller kan utsettes for ultrafiltrering eller fordampning for å konsentrere de brutte celler. Ultra-filtreringen kan f.eks. utføres i et laboratorieenhetssystem som er tilgjengelig fra De Danske Sukkerfabrikker, for eksempel et System 37 som omfatter tre filtreringsenheter med et samlet filtreringsareal på 0,88 m 2 av en ultrafiltreringsmembran av typen RC 70. En annen metode for å konsentrere de brutte celler er å utføre vakuumfordampning av vann fra cellesuspensjonen.

De brutte celler kan tørkes ved sprøytetørking eller trommeltørking. Før tørking blir bærere, som natriumcaseinat, antioxydasjonsmidler og/eller emulgeringsmidler fortrinnsvis tilsatt. Sprøytetørking kan utføres f.eks. ved å utsette en homogent dannet oppslemming av de brutte cellerbg eventuelt en bærer, som natriumcaseinat, fortrinnsvis i form av en van-dig oppløsning, for sprøytetørking. Sprøytetørkingen kan på egnet måte utføres ved å blande den vandige natriumcaseinat-oppløsning med gjæroppslemningen for å få en natriumcaseinat-konsentrasjon av ca. 2 - 10 % (vekt/volum). Den erholdte blanding får deretter henstå med omrøring i en nitrogenatmosfære før den pumpes inn i et sprøytetørketårn i hvilket den utsettes for tørking ved en temperatur av f.eks. 150 - 230° C, som ca. 180° C, for å minske vanninnholdet i gjærcellematerialet til f.eks. høyst 10 vekt%. Gjærcellematerialet blir deretter atomisert ved hjelp av et dusjhjul. Det pulveformige gjærmateriale som fåes fra sprøytetørkebehandlingen blir på egnet måte gjenvunnet ved hjelp av cyklon og eventuelt deretter siktet og pakket. Et eksempel på et egnet sprøytetørkeutstyr er et sprøytetårn av typen EAK-1 fra Anhydro. Som et alternativ kan de brutte gjærceller utsettes for trommeltørking, f.eks. i et lukket trommeltørkeutstyr ved en temperatur av 150 - 200° C.

Da astaxanthinet meget lett spaltes ved høyere temperaturer, er det viktig at de brutte gjærceller utsettes for høye temperaturer i så kort tid som mulig. Da dessuten astaxanthin er følsomt overfor oxygen, bør tørkingen fortrinnsvis utføres under ikke-oxyderende betingelser, for eksempel i en inert atmosfære, som vanndamp (som kan være vanndampen for-dampet fra gjærsuspensjonen), nitrogen og/eller carbondioxyd.

Før tørking blir de brutte celler eventuelt blandet med egnede emulgatorer, som sorbitanmonostearat, eller antioxydasjonsmidler, butylhydroxytoluen (BHT), butylhydroxyanisol (BHA), vitamin E, ascorbinsyre, (II)-sulfat- eller (Il)-fosfat-estere av ascorbinsyre eller ascorbylpalmi.tat.

Tørkede brutte celler er imidlertid øyeblikkelig nyttige som en bestanddel i dyrefor, som forklart nedenfor.

Astaxanthininnholdet i gjærcellen kan ekstraheres fra disse ved anvendelse av forskjellige ekstraksjonsmidler og ekstraksjonsmetoder for å sikre at en vesentlig samlet ekstraksjon av astaxanthinet fra gjærcellene oppnås. I de fleste tilfeller må ekstraksjonen utføres i brutt cellemate- materiale. Det brutte cellemateriale som kan være tørt eller vått, kan således ekstraheres med et organisk oppløsningsmiddel, som petroleumsether som er egnet å anvende i tilfellet av vått cellemateriale fordi petroleumsetheren danner en fase adskilt fra vannfasen. Andre egnede organiske oppløsningsmidler er aceton eller alkoholer, som methanol eller ethanol, ethere, ketoner og klorerte hydrocarboner. Ved ekstraksjonen blir astaxanthin oppløst i det organiske oppløsningsmiddel. Astaxanthinet kan oppnås ved å fjerne oppløsningsmidlet fra oppløsningen, som ved fordampning i et fordampningssystem med fallende film, før tørking. Imidlertid kan også et konsentrat av astaxanthin i det organiske oppløsningsmiddel være egnet for visse formål. Et konsentrat kan anvendes som sådant for produksjon av for eller mat eller konsentratet kan fortynnes og anvendes i den fortynnede tilstand ved fremstillingen av for eller mat, for eksempel ved impregnering av for- eller matbestanddeler med oppløsningen eller ved å anvende oppløs-ningen (eller konsentratet) for å farve matbestanddeler, som oljer eller fett.

Astaxanthinet kan også ekstraheres fra gjærcellene ved anvendelse av carbondioxyder under overkritiske betingelser. Carbondioxydet kan eventuelt anvendes i kombinasjon med egnede

medførere, som organiske oppløsningsmidler, spesielt oppløs-ningsmidler av de ovennevnte typer, eller oppløsningsmidler, som kloroform eller acetonitril eller iseddik. Gjærcellene som utsettes for overkritisk ekstraksjon kan være våte eller tørre hele gjærceller eller brutte, f.eks. homogeniserte, gjærceller.

En foretrukken metode for å isolere hele astaxanthin-holdige celler fra kulturen er å filtrere gjærkremen, for eksempel på en filterpresse eller et roterende trommelfilter, for å oppnå en filterkake, f.eks. med et tørrstoffinnhold av ca. 25 - 35 %. Filterkaken kan deretter på egnet måte ekstruderes til strenger, for eksempel strenger med en diameter på ca.

0,5 - 2,0 mm, i en ekstruder utstyrt med en perforert plate, for å få strenger som består av gjærpartikler. Strengene

blir fortrinnsvis ekstrudert direkte inn i den varme luft i et fluidisert sjikt hvori de tørkes. Fordampningen i det

fluidiserte sjikt blir fortrinnsvis regulert slik at gjær-partiklenes temperatur holdes under 50° C, som ved 30 - 40° C, og prosessen er avsluttet når vanninnholdet er bragt ned til under 10 vekt%, fortrinnsvis under 8 %, som bestemt ved gjær-tørrstof f innholdet (metoden er beskrevet i eksemplene). Alternativt kan tørkingen utføres i en brettørker under de samme betingelser som i det fluidiserte sjikt. Det tørkede helcellemateriale kan deretter males i en omrørende kulemølle, som en Coball<®->mølle, hvoretter det utsettes for ekstraksjon.

I henhold til en spesiell metode kan det tørkede helcellemateriale, for eksempel oppnådd som beskrevet ovenfor, blandes med en oljeaktig fase, som en spisbar olje eller fett, som soyabønneolje eller fiskeolje, eller et annet organisk oppløsningsmiddel, som et oppløsningsmiddel av den ovenfor omtalte type. Temperaturen er fortrinnsvis innen området 20 - 30° C. Blandingen oppnådd fra cellematerialet og den oljeaktige fase eller det organiske oppløsningsmiddel kan males i en mølle, som en kulemølle, f.eks. en omrørende kule-mølle, som en Coball<®->mølle, for å bryte cellene og frigi astaxanthin fra cellene. Den erholdte suspensjon kan anvendes som sådan i for eller den oljeaktige fase som inneholder astaxanthinet, kan skilles fra cellerestene før anvendelse. Separeringen utføres egnet ved sentrifugering i en hurtig-løpende sentrifuge, det samme prinsipp som anvendes ved separering av bakterier fra vørter. En annen mulighet er selv-følgelig å blande brutt tørket cellemateriale oppnådd ved de ovenfor omtalte metoder med en oljeaktig fase på en lignende måte for å ekstrahere astaxanthinet over i den oljeaktige fase og å utføre separering som beskrevet ovenfor. Den oljeaktige fase kan anvendes for å farve for på samme måte som beskrevet ovenfor.

I motsetning til de mest vanlige ekstraksjonsmetoder som, som angitt ovenfor, må utføres på brutt cellemateriale, har det vist seg at iseddik fremgangsrikt kan anvendes for å ekstrahere astaxanthin fra hele, ubrutte gjærceller. I henhold til en side av den foreliggende oppfinnelse kan således astaxanthin ekstraheres fra hele gjærceller med et oppløsnings-middel som omfatter iseddik, idet ekstraksjonen fortrinnsvis utføres ved en temperatur over oppløsningsmidlets frysepunkt, f.eks. innen området 20 - 100° C, fortrinsnvis innen området 20 - 80° C, og mer foretrukket innen området 20 - 60° C. Det tas sikte på at det er mulig å oppnå en mer selektiv ekstraksjon av astaxanthin når ekstraksjonen utføres ved de lavere temperaturer da samtidig ekstraksjon av fett og andre ekstraherbare komponenter vil være begrenset ved disse lave temperaturer. Konsentrasjonen av iseddik i oppløsningsmidlet er fortrinnsvis innen området 5 - 100, 10 - 70. Ekstraksjonen med iseddik fører til en ekstraksjon av pigmentet i cellene på ca. 70 til 90 %, dvs. at i det vesentlige alt pigmentet og astaxanthininnholdet i gjærcellene gjenfinnes i iseddik-ekstrakten. I tillegg inneholder ekstrakten normalt ca. 30 - 35 % gjærtørrstoff. Det er egnet at gjæren som utsettes for ekstraksjonen med iseddik, er i form av tørket gjær, f.eks. gjær som er blitt filtrert og deretter ekstrudert inn i et fluidisert sjikt i hvilket den tørkes, da således behandlede gjærceller vil bli brutt under ekstraksjonsbehandling (medmindre ekstraksjonsbehandlingen omfatter kraftig mekanisk behandling av gjærcellene). Dette vil lette den påfølgende separering av ekstrakten som inneholder pigmentet, fra gjærcellene, sammenlignet med ekstraksjon av brutte eller homogeniserte celler som på grunn av deres forholdsvis små størrel-ser sammenlignet med ubrutte celler i stor grad er tilbøyelige til å blokkere porene i det anvendte filter. Iseddikekstrak-sjonen er illustrert i eksempel 9. Ekstraksjon av våte gjærceller med iseddik kan også vise seg nyttig.

Det ekstraherte astaxanthin såvel som det hele tør-kede cellemateriale blir fortrinnsvis holdt under oxygenunder-skuddsbetingelser for å beskytte astaxanthinet mot spaltning. De astaxanthinholdige gjærceller eller det ekstraherte astaxanthin blir således fortrinnsvis beskyttet ved hjelp av antioxydasjonsmidler, som butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxytoluen (BHT), vitamin E eller ascorbinsyre, (Il)-sulfat-eller (II)-fosfatestere av ascorbinsyre, eller ascorbylpalmitat og/eller emulgatorer, som monoglycerider eller sorbitanestere, og blir på egnet måte holdt under hermetiske betingelser.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av gjærceller ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, eller deler derav i kombinasjon med andre forbestanddeler, fortrinnsvis et dyrefor, som tilsetningsstoff til en dyreforblanding i en mengde av høyst 10 vekt% av den samlede dyreforblandings tørrstoff, fortrinnsvis høyst 5 % og mer foretrukket høyst 3 %, idet de andre bestanddeler fortrinnsvis er valgt fra protein- og carbohydratkilder, som fiskemel, myse, blodmel, vegetabilske mel, fett, som fiskeolje og vegetabilske oljer, vitaminer og mineraler. Gjærcellene eller gjærcelledelene eller astaxanthinet blir eventuelt blandet med emulgatorer som er i stand til å gjøre astaxanthinet dispergerbart i vann. I tillegg kan de astaxanthinholdige gjærceller eller gjærcelledeler beskyttes mot oxydasjon ved hjelp av de ovennevnte antioxydasjonsmidler og/eller emulgatorer, og/eller dyreforet kan pakkes i lufttette og eventuelt evakuerte beholdere.

De astaxanthinholdige tørkede gjærceller kan også pakkes som sådanne for anvendelse som en forbestanddel idet sluttforblandingen tilberedes på. bruksstedet, eller gjærcellene gis som sådanne til dyr som ellers fores med normale eller tilpassede forblandinger.

Gjærcellene eller gjærcelledelene blir egnet og normalt blandet med andre næringskomponenter som fortrinnsvis er valgt fra protein- og carbohydratkilder, fett eller oljer og mikronæringsstoffer, som vitaminer og mineraler. Som eksempler på proteinkilder kan casein, albumin, hvategluten, fiskemel, konsentrerte fiskerester (fiskelimmel og blodmel) nevnes. Som eksempler på carbohydratkilder kan gelatinert stivelse, ekstrudert hvete, melasse, vegetabilske mel og maisstivelse nevnes. Fettbestanddelene i foret kan for eksempel være fiskeolje og tran og/eller vegetabilske oljer, som maisolje. Mineralene kan være valgt f.eks. fra uorganiske eller enkle organiske forbindelser av calsium, fosfor, natrium kalium, klor, magne-sium, kobber, mangan, sink, cobolt og selen. Som eksempler på vitaminer kan vitamin B^2, pro lin, vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, thiamin, ascorbinsyre, riboflavin, pyridoxin, panthotensyre, niacin, biotin, cholin og inositol nevnes.

Oppfinnelsen angår også anvendelse av gjærceller ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, eller deler derav som tilsetningsstoff for mat.

Astaxanthinet kan anvendes i blanding med forbestanddelene beskrevet ovenfor og også i blanding med andre mat- eller næringskomponenter såvel som i blanding med andre farvemidler. Astaxanthin ekstrahert fra gjærceller er således velegnet alene eller i kombinasjon med andre farvemidler for anvendelse i spiselige oljer, smør, margarin, smult, majonaise, posteier, supper, snackprodukter, surimi-baserte produkter, desserter, iskrem, konfekt, bakte produkter og drikkevarer. Når astaxanthinet anvendes i mat som for det meste utgjøres av vann eller vannfaser, blir astaxanthinet fortrinnsvis blandet med en emulgator som omtalt ovenfor og som gjør astaxanthinet dispergerbart i vannfasen uten noen tilbøyelighet til å krystalli-sere og uten nødvendigheten av å tilsette en oljeaktig fase for å oppløse astaxanthinet.

Dyr kan fores for å oppnå en rødaktig pigmentering av deres kjøtt og/eller av produkter produsert ved en metode som omfatter administrering til dyrene av et for som inneholder gjærceller eller celledeler som inneholder astaxanthin i en mengde av minst 300 ug pr. g gjærtørrstoff, bestemt ved den ovenfor angitte metode, eller astaxanthin ekstrahert fra slike gjærceller eller celledeler.

Mengden av foret som inneholder astaxanthinet eller de astaxanthinholdige gjærceller eller celledeler administrert til dyrene, vil være avhengig av den angjeldende dyreart og av den pigmenteringsvirkning som det er ønsket å oppnå ved hjelp av astaxanthinet. Det er klart at det prinsipp som skal følges er at dyret skal ha en normal anbefalt daglig rasjon av makro-og mikronæringsstoffer og, i tillegg, astaxanthin i en form og i en mengde som vil føre til den ønskede pigmentering av det angjeldende dyrekjøtt eller dyreprodukt. I enkelte tilfeller vil den astaxanthinmengde som gis være avhengig av sesongen. Det vil således for eksempel normalt ikke være foretrukket å gi astaxanthin eller andre carotenoider til kuer for å få en pigmentering av smøret under sommersesongen da smørpigmente-ringen normalt betraktes som tilstrekkelig når kuene gresser. Også den mengde av foret som inneholder astaxanthinet eller

de astaxanthinholdige gjærceller eller celledeler og som gis til dyrene, kan i enkelte tilfeller være avhengig av sesongen. For eksempel er i tilfellet av fisk, som laks eller sjøørret, formengden som konsumeres av fisken under vintersesongen, således forholdsvis lav, hvilket står i motsetning til den mengde som konsumeres av fisken under sommersesongen. En egnet mengde for som gis til fisken, kan imidlertid være ca.

1,5 % av fiskekroppsvekten pr. dag, hvilket overensstemmer med de anbefalinger som er gitt av the California State Department of Fish and Game.

Når fjærkre fores med den ovenfor angitte metode for å pigmentere plommen i eggene produsert av fjærkreet og/eller fjærkreets kjøtt eller hud, kan foret utgjøres av vanlige fjær-kreforkomponenter, og et eksempel på dette er ett som fortrinnsvis utgjøres av protein- og carbohydratkilder, som soye-bønnemel, soyabønneprotein, cellulose, stivelse og fettkilder, som soyabønneolje, vitaminer, som en samlet vitaminblanding, og mineraler, som en blanding av de vanlige mineralkomponenter for fjærkre, såvel som calsiumkilder for eggeskallene, idet calsiumkildene fortrinnsvis er calsiumcarbonat og calsium-hydrogenfosfat. En liten mengde natriumklorid kan også være tilstede. Foret kan gis i en vanlig dose.

Oppfinnelsen er videre illustrert i de følgende eksempler:

MATERIALER OG METODER

Opprettholdelse av kulturer

Kulturer av Phaffia rhodozyma opprettholdes på to måter:

1) På agarskråsubstrater (YM-agar). Skråsubstratene inkuberes i en uke ved 20° C og holdes ved 4° C i 1 måned, dyrkes på ny i YM-kraft, før nye skråsub-strater lages. 2) Frysekonserveres ved -8° C. Fra fryseflasker eller agarskråsubstrater blir stammene podet i 50 ml YM- kraft i 250 ml rystekolbe. Rystekolben blir inkubert på en kretsrystemaskin (150 rpm) ved 20° C i 4-5 dager. Gjærcellene får bunnavsette ,

og væsken blir dekantert. Sedimentet blandes med glycerol til en konsentrasjon av 20 %, innføres i fryseflasker og lagres i en dypfryser ved -80° C.

Bestemmelse av gjærtørrstoffinnhold

5 ml av en gjærcellekultur sentrifugeres i et veid

Sarsted-rør (som er blitt tørket til konstant vekt ved 110° C) ved 10 000 x g i 5 minutter og vaskes to ganger i demineralisert vann. Væsken blir fjernet ved dekantering, og vekten av røret med cellene måles etter tørking til konstant vekt ved 110° C, hvilket gir vekten av gjærcellene (Y g). Gjærtørr-stof f innholdet (GTSI) blir deretter beregnet som:

Det angitte innhold er middelverdien av to bestemmelser .

Fotospektrometrisk analyse for bestemmelse av samlet pigment

Det samlede pigmentinnhold i en methanolekstrakt bestemmes fotospektrometrisk ved hjelp av °<9>Beer1 s lov som beskrevet i B.H. Davies, "Carotenoids", i T.W. Goodwin (ed.), Chemistry and Biochemistry of plant pigments, New York, 1976, Vol. 2, s. 149. Fotospektrometeret anvendt er et Shimadzu UV synlig registrerende fotospektrometer UV 260. Pigmentinnholdet beregnes ved anvendelse av formlene 1, la,

2, 2a nedenfor og ekstinksjonskoeffisientene i Tabell 1 nedenfor.

Pigmentekstråksjon og -analyse - Metode 1

Ca. 30 ml av gjærkulturen ble overført til Sarsteds-rør og sentrifugert i 5 minutter ved 10 000 x g. Gjærcellene ble vasket i demineralisert vann og suspendert i ca. 20 ml methanol. Til en glasskulemølle av typen "Bead Beater"

(Biospec Products Inc., USA) i hvilken rotoren var dekket med glasskuler med en diameter av 0,4 mm (ca. 15 g glasskuler), ble methanolsuspensjonen tilsatt slik at den inntok det gjenværende frie kulemøllevolum. Desintegrasjonsbehandling ble utført ved å kjøre møllen 5 ganger i 1 minutt med mellomrom på 30 sekunder, idet isvann ble holdt i kjølekappen for å sikre at temperaturen under desintegrasjonsbehandlingen ble holdt under 20° C. Umiddelbart etter desintegrasjonsbehandlingen ble en del av homogenatet overført til Sarstedt-rør, og gjær-tørrstof f et ble bestemt som beskrevet ovenfor, men uten sentrifugering. En kjent mengde (b g) av homogenatet ble over-ført til en 10 ml målekolbe, og oppløsningsmiddel ble tilsatt for å gi 10 ml. Absorbans ble målt i denne oppløsning.

Det samlede pigmentinnhold i ug pr. g gjærtørrstoff bestemmes av:

E = absorpsjon ved ^■ma]csi det anvendte oppløsningsmiddel i en 1 cm skål

Elcm = absorkans av 1 % (vekt/volum) oppløsning i 1 cm skål b = g ekstrakt

D = mg gjærtørrstoff/g ekstrakt

Pigmentekstraksjon og -analyse - Metode 2

Den på forhånd bestemte mengde av gjærkulturen (a ml) ble overført til Sarsteds-rør og sentrifugert i 5 minutter ved 10 000 x g. Gjærcellene ble vasket i demineralisert vann og suspendert i ca. 20 ml methanol. Til en glasskulemølle av typen "Bead Beater" (Biospec Products Inc., USA) i hvilken rotoren var dekket med glasskuler med en diameter av 0,4 mm (ca. 15 g glasskuler), ble methanolsuspensjonen tilsatt for å innta det gjenværende frie kulemøllevolum. Desintegrasjonsbehandling ble utført ved kjøring av møllen 5 ganger i 1 minutt i mellomrom på 30 sekunder, idet isvann ble holdt i kjølekapper for å sikre at temperaturen under desintegrasjonsbehandlingen ble holdt under 20° C. Umiddelbart etter desintegrasjonsbehandlingen ble væsken overført til en 50 ml målekolbe. Glass-kulene vaskes i møllen med 4 x 8 ml methanol. Fraksjonene oppsamles og blandes og methanol tilsettes for å gi 50 ml.Methanolekstrakten filtreres før pigmentanalyse. Gjærtørr-stof f et i kulturen bestemmes som beskrevet ovenfor.

Det samlede pigmentinnhold pr. ml prøve bestemmes av:

X' = ug pigment/ml i prøve

a = volum av prøve i ml

E = absorpsjon ved ^^g f°r oppløsningsmidlet anvendt i en 1 cm skål

1%

Elcm = absorbans for 1 % (vekt/volum) oppløsning i en 1 cm

skål

Det samlede pigmentinnhold pr. g gjærtørrstoff bestemmes av

Y = ug pigment/g gjærtørrstoff

GTSI = g gjærtørrstoff/l dyrkningskraft

HPLC-analyse for bestemmelse av astaxanthin - Metode 1 HPLC-data:

Utstyr:

Kolonner: LKB Ultropac Precolumn, Lichrosorb RP 18 7 um,

4x30 mm.

LKB Ultropac Column, Lichrosorb RP 18 5 um, 4x250 mm.

Detektor: LKB 2151 variabel bølgelengdemonitor Integrator: Waters 740 Data Module.

Kontroller: LKB 2152 HPLC kontroller.

Pumper: LKB 2150 HPLC pumper.

Autoprøvetager: LKB 2157 autoprøvetager med variabel krets. Manuell inj.: Rheodyne 20 ul krets.

0 ppløsningsmidler:

A: 860 ml acetonitril + 100 ml vann + 40 ml maursyre.

B: 960 ml ethylacetat + 40 ml maursyre.

Alle oppløsningsmidler var av HPLC kvalitet.

Strøm: 1,0 ml/min.

Gradienter:0-100 % B 20 minutter, lineær gradient.

100-0 % B 10 minutter, lineær gradient.

Detektor: 471 nm

Temperatur:Omgivelsestemperatur.

Standardoppløsning: 5 mg rent astaxanthin (sm.p. 220 - 222°C, absorbans for 1 % volum/vekt acetonoppløsning i en 1 cm skål 2100) levert av Hoffmann-La Roche (heretter betegnet som astaxanthinstandarden) veies ut og oppløses i- 500 ml aceton.

For HPLC-analysen blir 20 ul av den angjeldende prøve injisert i HPLC-kromatografen.

HPLC-analyse for bestemmelse av astaxanthin - Metode 2 HPLC-data:

Utstyr:

Kolonner: Supelco forkolonne

Supelco LC 18 - DB, partikkelstørrelse 5 u kolonnedimensjoner 4,6 x 250 cm

Detektor: LKB 2151 variabel bølgelengdemonitor Integrator: Waters 740 Data Module

Kontroller:LKB 2152 HPLC kontroller

Pumper: LKB 2150 HPLC pumper.

Autoprøvetager: LKB 2157 autoprøvetager med variabel krets.

Manuell inj.: Rheodyne 20 ul krets

Oppløsningsmidler:

A: 400 ml tetrahydrofuran

400 ml methanol

200 ml 0,02 M glycinbuffer pH = 2,6

B: 10 00 ml tetrahydrofuran

Alle oppløsningsmidler, bortsett fra bufferen, er av HPLC-kvalitet. Bufferen blir sterilfiltrert

gjennom et 0,22 um filter før bruk.

Detektor: 480 nm

Temperatur: værelsetemperatur

Gradienter og strøm:

Standardoppløsning: 5 mg astaxanthinstandard veies ut og opp-løses i 500 ml tetrahydrofuran.

For HPLC-analyseen blir 20 ul av den angjeldende prøve injisert i HPLC-kromatografen.

Sarstedt-rør

Polypropylensentrifugerør forsynt med en polypropylenkork av typen 55533 levert av Hounisens Laboratory, Århus, Danmark.

Kjemikalier

Anvendte kjemikalier i laboratoriemålestokk var av analyse-kvalitet.

Kjemikalier anvendt for fermenteringer var av matvarekvalitet.

Glucose- og saccharosekonsentrasjonene ble analysert ved anvendelse av sett (bestillingsnummer 139041) fra Boehringer Mannheim.

Medium for rystekolbedyrkninger og agarplater

YM ("Yeast Morphology")-medium levert av Difco Laboratories Incorporated (Difco Manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology, 10. utgave, Detroit, 1984).

Fryseampuller

Polypropylenrør med et volum på 2,0 ml av typen 363401 levert av Technunc, Roskilde, Danmark.

Eksempel 1

Mutagenisering

1 hvert tilfelle ble mutagéniseringsbehandlingen utført for å oppnå en overlevelsesgrad på 1 - 5 % for den behandlede kultur. Egnede mutanter ble valgt ved visuelt å sammenligne intensiteten til mutantenes rødfarve når de ble belagt som enkeltkolonier på agarplatene.

UV-bestråling

En akkurat uklar fire dagers gammel kultur av ATCC 24261 vokst i YM-medium ved 20 - 22° C ble fortynnet i en 0,9 % NaCl-oppløsning til konsentrasjoner av henholdsvis 10 10 ' , 10 ,10 ' og 10 , og 0,3 ml av hver av disse for-tynninger ble belagt på agarplater for å oppnå agarplater inneholdende 100 - 300 kolonier. Platene ble deretter utsatt for ultrafiolett bestråling ved 254 nm i 30 sekunder med en avstand av 20 cm fra bestrålingskilden (Vilbert Lourmat VL 30 LC) og fikk deretter vokse ved 20 - 22° C i 10 dager, hvoretter de erholdte koloniers farve ble sammenlignet.

EMS (ethyl-methan-sulfonat)-behandling

2 x 15 ml av en fire dagers gammel kultur av ATCC 24261 vokst i YM-medium på et rystebrett ved en temperatur av 20 - 22° C ble sentrifugert i 15 minutter ved 1250 x g i en sentrifuge av typen MSE Major, og pelleten ble suspendert i 2 x 15 ml steril 0,9 % NaCl-oppløsning i 200 ml sentrifuge-ringsrør. Én av cellesuspensjonene ble anvendt som en kontroll. Til den annen cellesuspensjon ble 1 g EMS (Serva 28755) tilsatt. Etter behandling i 30 minutter ved 20° C ble 150 ml kald steril 0,9 % NaCl-oppløsning tilsatt. Gjærcellene ble vasket to ganger i sterilt 0,9 % NaCl og suspendert i 0,9 % NaCl. Gjærcellesuspensjonen ble deretter fortynnet og belagt på agarplater på samme måte som beskrevet ovenfor for UV-behandlingen. Én av de isolerte mutanter ble deponert hos CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures) 6. april 1987 under aksesjonsnummer 224-87.

Behandling med N-methyl-N<1->nitro-N-nitrosoguanidin

Ca. 25 mg N-methyl-N<1->nitro-N-nitrosoguanidin (Aldrich Chemie BDR) ble tilsatt til en 10 ml tarert målesylinder forsynt med en glasskork. Vann ble tilført for å oppnå et samlet volum på 10 ml, og N-methyl-N<1->nitro-N-nitroso-guanidinet ble oppløst i dette ved rysting. 10 x 1 ml forhånds-oppløsning ble erholdt fra denne oppløsning. 2 x 20 ml av en fire dagers gammel kultur av CBS 224-87 (mutanten oppnådd ved den ovenstående EMS-behandling) vokst i YM-medium på et rystebrett ved 20 - 22° C ble overført til Sarstedt-tør og utsatt for to sentrifugeringsrunder. Pelleten ble suspendert i 1,5 ml 0,9 % steril NaCl-oppløsning, og 1 ml av den ovenfor fremstilte forhåndsoppløsning ble tilsatt.

Etter inkubasjon i 1 time ved 20 - 22° C ble gjærcellene vasket 5 ganger i 10 ml kald steril 0,9 % NaCl-oppløsning, hvorved N-methyl-N<1->nitro-N-nitrosoguanidinet ble fjernet. Gjærcellene ble deretter fortynnet og belagt på agarplater på samme måte som beskrevet ovenfor for UV-behandlingen. Én av de isolerte mutanter ble deponert hos CBS 6. april 1987 under aksesjonsnummer 22 5-87.

Fornyet isolering

CBS 225-87 er blitt utsatt for isolering som beskrevet som følger. Fra en frysetørket ampulle suspenderes gjærceller i YM-medium og inkuberes i 5 dager ved 20 - 22° C. Kulturen belegges på YM-plater og inkuberes i 10 dager ved 20 - 22° C, og nye kolonier blir isolert. Én av koloniene ble deponert hos CBS 23. mars 1988 under aksesjonsnummer 215-88.

Eksempel 2

Bestemmelse av astaxanthininnholdet i Phaffia rhodozyma-stammer av vill type og i mutanter fremstilt i eksempel 1.

Gjærcelledyrkningen og astaxanthinbestemmelsen beskrevet i det foreliggende eksempel utgjør på den ene side de betingelsr under hvilke gjærcellene får vokse og på den annen side de betingelser under hvilke astaxanthin bestemmes ved patentsøkerens ovennevnte standardmetode for bestemmelse av en gjær stammes inherente astaxanthinproduserende evne. Disse er de samme standardbetingelser som det er vist til i kravene.

Rystekolbedyrkning

100 ul av en 4 dagers gammel kultur av ATCC 24261 vokst i YM-medium på et rystebrett ved 20 - 22° C ble podet i 50 ml YM-medium inneholdt i en 500 ml rystekolbe med 2 skjermer. Kulturen ble utsatt for vekst på et rystebrett med kretsende rysting ved 150 rpm i 5 dager ved 20 - 2 2° C og ved en oxygen-overføringshastighet på 30 mmol/l/time, hvorved en densitiet på gjærkulturen på 0,6 % ble oppnådd.

Pigmentanalyse

Astaxanthininnholdet i ekstrakten ble identifisert vea hjelp av de følgende tre metoder. 1. En aceton-, methanol- og ethanolekstrakt som alle var blitt fremstilt som beskrevet for methanolekstrakttilberedningen ovenfor, ble utsatt for fotospektrometrisk skanning, og A maj, cs-verdiene angitt i Tabell 1 ble oppnådd. 2. Til en halvdel av en 10 ml ethanolekstrakt, fremstilt på samme måte som ovenfor, ble ca. 50 mg kaliumborhydrid tilsatt for å redusere astaxanthinet, og blandingen ble omrørt i 30 minutter. Absorpsjonene for ekstrakten og for den kaliumbor-hydridbehandlede prøve ble målt med varierende bølgelengder på fotospektrometeret. Det frie astaxanthin viste en bred topp ved 480 nm, og det reduserte astaxanthin viste to topper ved 450 og 476 nm overensstemmende med de verdier som er angitt i

litteraturen.

3. Oppholdstiden for de astaxanthinholdige ekstrakter i HPLCunder standardbetingelser som definert ovenfor ble sammenlignet med oppholdstiden for standardoppløsningen definert ovenfor, dvs. at toppene for den astaxanthinholdige prøve ifølge oppfinnelsen i HPLC under standardbetingelser ble sammenlignet med toppene for standardopplsøningen i HPLC. Oppholdstidene ble funnet å være identiske.

Mutantstamme ifølge oppfinnelsen (CBS 225-87) såvel som alle kjente deponerte astaxanthinproduserende P. rhodozyma-stammer fikk vokse og ble analysert på samme måte som ovenfor. Det samlede pigmentinnhold og astaxanthininnholdet i stammene er angitt i Tabell 2 nedenfor.

Samlet pigmentanalyse ble utført i overensstemmelse med metode: pigmentekstraksjon og analyse - Metode 1. Astaxanthin ble analysert i overensstemmelse med HPLC-analyser for bestemmelse av astaxanthin - Metode 1.

Verdiene er midlet av 4 uavhengige målinger. Det vil bemerkes at mutantstammene ifølge oppfinnelsen viser et betraktelig øket astaxanthininnhold..

Eksempel 3

Fermentering

Fermenteringene ble utført som fødesats-fermenteringer under carbohydratbegrensning i omhyggelig vaskede og ste-riliserte 4 m 3 fermentorer av boblekolonnetypen med et sta-sjonært luftingssystem bestående av perforerte luftledninger. Fementatorene var forsynt med pH-elektroder, innløp for pH-reguleringsmidler og skumundertrykkende midler og alkohol-detektorer for å måle alkohol i den uttømte luft. Fermen-torenes kapper var termostatstyrt.

Utgangsvørteren hadde følgende sammensetning: 20 g/l melasse, 0,6 g/l diammoniumsulfat, 0,8 g/l diammoniumhydrogenfosfat og 0,125 g/l magnesiumsulfat som sammen ble kokt opp i fermentatoren i 30 minutter sammen med en egnet mengde vann

(30 1 i den 100 1 forplantningsfermentator og 2000 1 i den

4 m 3 produksjonsfermentator) før den angjeldende fermentator ble podet. Mediumet som ble innmatet i fermentatoren for føde-satsfermenteringen var tatt fra to forskjellige forråd, dvs.

et kjemisk forråd bestående av 10 kg diammoniumsulfat, 5,6 kg diammoniumhydrogenfosfat og 80 1 vann, og et melasseforråd besåtende av 450 kg melasse og 1000 1 vann som var blitt autoklavbehandlet. 0,1 mg desthiobiotin og 1,6 kg magnesiumsulfat ble tilsatt direkte til fermentatoren før resten av mediumet ble tilført. Alle kjemikalier var matvare kvalitet. Melassen var roemelasse fra De Danske Sukkerfabrikker.

Luftingen under fermenteringen var 8,4 m 3/minutt. Contraspum 210 (Zschimmer & Schwartz) ble anvendt som det skumundertrykkende middel, og svovelsyre ble anvendt som det pH-regulerende middel.

Gjærceller av stammen ATCC 24261 ble formert ved

at de ble overført fra et skråsubstrat til et prøverør med en diameter på 2 cm og inneholdende 5 ml YM-medium i hvilket cellene ble dyrket i 4 dager på et rystebrett under tilstrekkelig lufting ved en temperatur av 20 - 22° C, hvoretter kulturen

ble overført til 2 1 Erlenmeyer-kolber inneholdende 1 liter YM-medium. Etter inkubasjon i 3 dager på et rystebrett og under tilstrekkelig lufting ved en temperatur på 20 - 22° C ble 1 liter av kulturen overført til en 100 1 fermentator inneholdende 30 1 utgangsvørter. Kulturen ble utsatt for satsvekst ved 20 - 22° C inntil et gjærtørrstoffinnhold på 1 g/l ble oppnådd. Deretter ble næringsmiddeltilførselen påbegynt, og fødesatsfermenteringen ble utført ved 20 - 22° C. Etter 2 dagers vekst ble 30 1 av kulturen overført under sterile betingelser ved hjelp av en peristaltisk pumpe til fermentatoren på 4 m 3 som inneholdt 2000 1 utgangsvørter. Kulturen ble utsatt for satsvekst ved 20 - 22° C inntil et gjærtørr-stof f innhold på 1 g/l ble oppnådd i kulturen. Dereetter ble melassetilførselen igangsatt og fortsatt i 38 timer hvoretter melasseforrådet var uttømt. Kjemikaliene ble tilført propor-sjonalt med melassen i løpet av de første 24 timer. Fødesats-fermenteringen ble utført ved en temperatur av 20 - 22° C. Melassemengden i melasse forrådet ble regulert slik at et gjærtørrstoffinnhold på ikke over ca. 4 % ville bli oppnådd i den fermenterte vørter.

Melassetilførselen til fermentatoren under fødesats-fermenteringen ble regulert ved hjelp av oppnåelse av en spe-sifikk veksthastighet for gjærcellene på \ i = 0,15 time og ble ytterligere regulert i overensstemmelse med ethanolkonsen-trasjonen i vørteren som bør være lavere enn 0,1 vol%. Etha-nolkonsentrasjonen ble således hyppig målt, og når den ble funnet å være for høy, ble melassetilførselshastigheten senket inntil et akseptabelt ethanolinnhold igjen ble oppnådd.

Luftingen av den fermenterte vørter ble fortsatt i

16 timer ved 20 - 22° C uten noe næringsstofftilførsel. Gjærcellenes sammensetning såvel som det samlede pigmentinnhold og astaxanthininnholdet ble målt på tidspunktet 0, dvs. like før næringsstofftilførselen til fermentatoren på 4 m 3 ble påbegynt, etter 3 8 timer da fermenteringen og veksten hadde opphørt, og etter 16 timers lufting av den fermenterte vørter. Det samlede pigmentinnhold og astaxanthininnholdet ble bestemt som beskrevet i eksempel 2, og gjærcellenes sammensetning ble bestemt ved hjelp av vanlige metoder. Det samlede nitrogeninnhold ble bestemt ved hjelp av Kjeldahl-analyse, trehaloseinnholdet ble bestemt som beskrevet i Journ. Am. Chem. Soc. 72, 1950, s. 2059, og fosforsyreinnholdet ble bestemt som beskrevet i Water and Waste-water, American Public Health Association, Inc., s. 199 (1960). Ethanolanalyse ble utført ved Boidin's metode for bestemmelse av små alkoholmengder (se Annal, de la brasserie et de la distillerie, 1924-25, s. 177). Resultatene er angitt i Tabell 3 nedenfor.

Samlet pigmentanalyse ble utført i overensstemmelse med metode 1. Astaxanthinanalyse ved HPLC ble utført i overensstemmelse med metode 1.

Eksempel 4

På lignende måte som forsøket beskrevet i eksempel 3 ble matede satsfermenteringer med stammen ATCC 24261 utført idet de eneste forskjeller var at utgangsvørtervolumet var 1000 1, podestoffet i 4 m 3 fermentoren var 6 x 1 1 av ATCC 24261 som var blitt formert som angitt ovenfor, og det kjemiske forråd besto av 0,5 kg diammoniumsulfat, 2,8 kg diammoniumhydrogenfosfat og 80 1 vann, og melasseforrådet besto, av 250 kg melasse og 1000 1 vann. Under den matede satsfermentering ble næringsstoffet tilført til fermentoren i de første 65 timer, hvoretter næringsstofftilførselen ble avsluttet og kulturen utsatt for lufting i 72 timer.

Resultatene er angitt i Tabell 4 nedenfor.

Eksempel 5

Forsøk med mutantstammen CBS 225-87 ifølge oppfinnelsen ble utført på samme måte som beskrevet i eksempel 4 med et utgangsvørtervolum på 1000 1, idet podestoffet var 6x11 CBS 225-87 som var blitt formert ved metoden beskrevet i eksempel 3, og med et kjemisk forråd bestående av 5 kg diam-moniumsulf at , 2,8 kg diammoniumhydrogenfosfat og 89 1 vann. Ingen alkohol ble dannet under den matede satsfermentering,

og næringsstoffet ble tilført mellom timer 0-57, hvoretter kulturen ble utsatt for lufting under næringsstofftilførsel. Gjærcellesammensetningen ved time 80 var 6,5 % nitrogen i gjærtørrstoff, 2,5 % fosforpentoxyd i gjærtørrstoff og 6,6 % trehalose i gjærtørrstoff. Det samlede pigment, astaxanthinet og gjærtørrstoffet ble bestemt under den matede satsfermentering og ga, de verdier som er angitt i Tabell 5 nedenfor:

Det totale pigment- og astaxanthininnhold i ug/ml er blitt beregnet ut fra det analyserte gjærtørrstoffinnhold og pg/g-verdier for totalt pigment og astaxanthin.

Kksempel 6

Pigment- og astaxanthininnholdet i CBS 215-8 8 og

P. rhodozyma mutant-stammer DBT 406 og DBT 403, villtype-stammene CBS 5 905 og ATCC 24261 ble bestemt.

Rystekolbedyrkninger

Fra et agarskråsubstrat ble gjærceller podet i YM-medium og inkubert i 2 dager ved 20 - 22° C. 1 ml av kulturen ble podet i 50 ml YM-medium inneholdt i 250 ml rystekolber med 4 skjermer. Kulturen ble utsatt for vekst på et rystebrett med kretsende rysting ved 150 rpm i 5 dager ved 20 - 22° C.

Kvantitative bestemmelser av samlet pigment ble utført i overensstemmelse med metode 2. Astaxanthinbestemmel-ser ble utført i overensstemtitielse med metode 2.

Eksempel på beregninger (for CBS 215-88) :

Det samlede pigment i methanolekstrakten ble bestemt ved fotospektrometrisk analyse. Absorpsjonen av 50 ml ekstrakten minus absorpsjon av methanol ble målt til E = 1,189. Prøvens volum var 29 ml. Det samlede pigmentinnhold i gjær-ekstrakten beregnet ved hjelp av formel (2) var som følger:

Gjærtørrstoffet ble bestemt til 6,7 g/l. Det samlede pigmentinnhold pr. g gjærtørrstoff bestemmes ved hjelp av formel (2a) som følger:

Konsentrasjonen av astaxanthin i methanolen ble bestemt ved HPLC-analyse til 6,4 ug/ml svarende til:

Alle stammer fikk vokse og ble analysert på samme måte som beskrevet ovenfor. Det samlede pigment- og astaxanthininnhold i stammen er angitt i Tabell 6.

Eksempel 7

Matet satsfermentering av mutantstammen CBS 215-88 ifølge oppfinnelsen ble utført under anvendelse av mais-støpefaststoff og sucrose som carbohydratkilder i den samme 4 m 3 fermentor som beskrevet i eksempel 3. Utgangsvørteren bestående av ble sterilisert ved pH 4,6 ved injisering av damp ved 95 Ci 1 time og etter avkjøling til 22° C ble 6x1 CBS 215-88 formert som angitt ovenfor tilsatt som podestoff. Etter 35 timers lufting (4,2 m 3/minutt) ble tilførsel av sucroseopp-lsøning (0,30 g/l) påbegynt. Tilsetningsmengden var 2,3 1/ time. Lufting ble øket til 8,4 m 3/minutt og pH-kontrollinn-retningen startet (innstillingspunkt 4,0). Da sucrosekonsen-trasjonen i mediumet hadde avtatt til ca. 1 g/l etter 28 timer, ble sucrosetilførselen øket til 7,3 l/time og holdt ved denne tilførselsmengde i 24 timer. Deretter ble sucrosetilførselen avsluttet, og luftingshastigheten ble minsket til 4,2 / minutt og fortsatt i 72 timer. Det samlede pigment og astaxanthin ble bestemt under den matede satsfermentering under oppnåelse av de verdier som er angitt i Tabell 7.

Gjærcellene ble separert fra mediumet ved hjelp av sentrifugering i en De Laval 0A5M sentrifuge og vasket med vann to ganger. Gjæren ble separert fra gjærkremen ved hjelp av filtrering i et FILTROX-filter, type VARIOX 40/40 cm, og filterkaken med 26,3 % tørrstoff ble ekstrudert gjennom en 1 mm sikt i et hvirvelsjiktlaboratoriumtørkeapparat (GLATT, Haltingen-Binzen Bd.) og tørket ved 30° C i 90 minutter. Den tørkede gjær (91,6 % tørrstoff) inneholdt

1360 ug samlet pigment/g gjærtørrstoff

og

1080 pg astaxanthin/g gjærstoffer

Eksempel 8

Nedstrømsbearbeiding

Gjærceller oppnådd ved metoden ifølge eksempel 3 ble isolert fra den fermenterte vørter ved sentrifugering i en De Laval 0A5M sentrifuge. Cellene ble vasket to ganger med vann, og en gjærkrem med 13 % gjærstoff ble oppnådd. Gjær-kremens pH ble regulert til 4,0 ved tilsetning av svovelsyre, og natriumbenzoat ble tilsatt inntil en konsentrasjon av 0,2 %

(vekt/volum) i gjærkremen. Under behandlingen av de isolerte gjærceller var disse under et nitrogendekke for å hindre vesentlig oxydasjon av astaxanthinet i gjærcellene, og temperaturen ble holdt ved ca. 10° C.

Gjærkremen ble utsatt for tre passeringer gjennom et system bestående av en APV-Gaulin MC4-homogenisator forsynt med en cellebrytningsventil og en varmeveksler, hvor gjærkremen ble utsatt for nedbrytning ved et trykk av 700 bar, hvorved temperaturen øket med 10 - 15° C, og påfølgende avkjøling i varme-veksleren for å få en temperatur på 15° C. Gjærkremen ble sirkulert i systemet i en mengde av 250 l/h.

Astaxanthininnholdet i de sønderdelte celler ble bestemt som følger: 0,5 ml homogenisert gjærkrem ble veid ut og overført til et Sarsted-rør og ristet med 5 ml aceton. Prøven ble sentrifugert, overført til en 10 ml målesylinder og vasket tre ganger med aceton med mellomliggende sentrifugerin-ger og kvantitative overføringer. Det samlede pigmentinnhold ble bestemt ved hjelp av metode 1, og astaxanthininnholdet ble bestemt ved hjelp av HPLC-metode 1, og innholdet ble relatert til det samlede tørrstoffinnhold i prøven hvilket ble bestemt ved hjelp av metoden forklart i Materialer og Metoder ovenfor. Ved å sammenligne det ekstraherbare astaxanthininnhold i gjærkremen homogenisert i overensstemmelse med det foreliggende eksempel, med innholdet i gjærkremen bestemt ved hjelp av metode 1 hvor cellene ble fullstendig sønderdelt, ble sønder-delingsgraden i det foreliggende eksempel bestemt til over 90 % av de samlede celler.

Til de således sønderdelte celler, hvilke celler var dekket med nitrogen, ble 7 % natriumcaseinat tilsatt ved en temperatur av ca. 45° C under omrøring. Gjaercellehomogenatet i blanding med natriumcaseinat ble deretter utsatt for forstøv-ningstørking i et sprøytetårn av typen Anhydro i hvilket inn-løpstemperaturen var 180° C. Gjærcellemassen ble atomisert ved anvendelse av et sprøytehjul, og temperaturen for luften som ble sluppet ut av sprøytetårnet, var en temperatur av ca.

90° C. Det erholdte gjærpulver ble gjenvunnet ved anvendelse av en syklon. Vanninnholdet i gjærpulveret var mindre enn 10 vekt%.

Eksempel 9

Ekstraksjon av samlet pigment med iseddik

20 g av ikke-sprengte Phaffia rhodozyma gjærceller (som var blitt filtrert og deretter ekstrudert inn i et fluidisert sjikt i hvilket de var blitt tørket) med et tørrstoff-innhold av 95 % og inneholder 523 pg astaxanthin/g gjærtørr-stoff ble innført i en kolonne med en lengde på 12 cm og en innvendig diameter på 2,4 cm. Kolonnen var forsynt med en kappe i hvilken vann med en temperatur av 75° C ble sirkulert. Ved bunnen av kolonnen var en liten mengde syrevasket sand (et sandfilter) anordnet på et bomullslag. Gjærcellene ble ekstrahert med 5 x 100 ml iseddik med en temperatur av 75° C, og mengden av astaxanthin i hver av ekstraktene såvel som i det ekstraherte gjærcellemateriale (innbefattende ca. 100 ml iseddik som var igjen i kolonnen) ble bestemt. Det ekstraherte gjærcellemateriale var blitt inndampet til tørrhet (hvilket ga 16,16 g materiale) før astaxanthinbestemmelsn ble utført. Resultatene er angitt i Tabell 8 nedenfor.

Således ble 77,9 % (8143,6/10460 x 100 %) av astaxanthininnholdet i gjærcellene frigitt ved ekstraksjonen.

Eksemoel 10

Sprengning av gjærceller ved homogenisering i en kulemølle

Phaffia rhodozyma gjærceller som var blitt tørket i et fluidisert sjikt og som ble funnet å inneholde 336 ug astaxanthin/g gjærtørrstoff, ble suspendert i soyabønneolje i en konsentrasjon av 40 % (vekt/vekt). Suspensjonen ble pumpet til en kulemølle (CoBall<®>- Mill, type MSZ-12) inneholdende zirkoniumkuler (0,1 - 1,5 mm) og med en kulefylling på 70 - 75 %. Rotorhastigheten var 13 m/sek. Prøver ble tatt etter hver kjøring, og astaxanthininnholdet i prøvene ble analysert påHPLC. Temperaturen i kulemøllen ble holdt ved 40 - 50° C.

På lignende måte ble en suspensjon av de ovenstående tørkede gjærceller i 75 % vann behandlet i kulemøllen. Ved denne behandling var rotorhastigheten 15 m/sek.

Resultatene er angitt i Tabell 8 i hvilken astaxanthininnholdet er angitt som ug/g gjærtørrstoff.

Til sammenligning ble bare 23 pg astaxanthin/g gjærstoff funnet da det tørkede gjær ble behandlet med soyabønne-olje eller vann uten samtidig homogenisering.

Ved forsøket er det vist at ca. 3 kjøringer i kule-møllen er tilstrekkelig til å oppnå i det vesentlige fullstendig sprengning av gjærcellen.

Eksemne] 11

Foring av fisk

Fiskefor med forskjellige astaxanthininnhold ble fremstilt. Fiskeforet var laget av det kommersielle fiskefor Ecoline 16 fra Dansk Ørredfoder, Brande, Danmark, som er en blanding av fiskemel, soyamel, fiskeolje, ekstrudert hvete, lecitin og vitaminer i form av en forhåndsblanding. Forskjellige mengder av astaxanthin ble tilsatt til dette for. Astaxanthinet var blitt oppnådd fra P. rhodozyma gjærceller som hadde fått vokse på samme måte som beskrevet i eksempel 3 og som var blitt forstøvningstørket. De forstøvningstørkede gjærceller ble fremstilt fra 2 8 kg homogenisert gjærkrem som var blitt blandet med 0,475 kg natriumcaseinat oppølst i 2,7 kg vann ved ca. 50° C. 0,06 8 kg GRINDTEK MOR 5 0 inneholdende 2 g ascorbylpalmitat og 1 g tocoferoler fra soyabønner ble emulgert i natriumcaseinatopplsønihgen. Natriumcaseinatoppløsningen (inneholdende antioxydasjonsmidler) ble blandet med den homogeniserte gjærkrem, og blandingen ble forstøvningstørket som beskrevet i eksempel 8. Det forstøvningstørkede produkt (92,6 % tørrstoff) inneholdt ca. 674 ug astaxanthin/g gjærtørrstoff. Det forstøvningstørkede produkt ble tilsatt til det kommersielle fiskefor for å oppnå de varierende konsentrasjoner av astaxanthin i fiskeforet (for A-D) som fremgår av Tabell 10 nedenfor.

Et fiskefor inneholdende syntetisk astaxanthin (for E) ble anvendt som en kontroll. Foret E inneholdt syntetisk astaxanthin i en mengde svarende til 40 ppm.

Forene A-E hadde følgende sammensetning:

Ga. 60 regnbueørreter hver med en vekt på ca. 400 g ble anvendt for forsøkene med hvert av fiskeforet A-E. Fisken ble holdt i bur og matet vilkårlig. Vannet hadde en temperatur innen området 2,5 - 14° C med de lavere temperaturer i den siste del av fiskeforingsforsøket.

Ekstraksjon av astaxanthin fra fisk i Utstyret som ble anvendt, er utstyr som er vanlig anvendt for laboratorieforsøk.

En regnbueørret uten skinn ble skåret i stykker, og

15 g kjøtt ble veid ut i et sentrifugalrør (100 ml). 15 ml tetrahydrofuran ble tilsatt som ekstraksjonsmiddel. Kjøttet ble videre oppdelt i en ULTRATURAX-blander og deretter sentrifugert. Tetrahydrofuranekstrakten ble overført til en 5 0 ml

målekolbe. Resten ble vasket med 10 ml tetrahydrofuran i 2 -

3 minutter på et lydbad og sentrifugert, og tetrahydrofuran-fasen ble overført til målekolben til hvilken ytterligere tetrahydrofuran ble tilsatt opp til 50 ml. 10 ml av de 50 ml ble utsatt for fordampning under et nitrogendekke ved en temperatur på 40° C. Fordampningsresten ble på ny oppløst i 1 ml mobil fase og filtrert gjennom et 0,45 um filtei før ytterligere analyse.

HPLC-analyse

Kolonne: Lichrosorb RP-18, 5 um, 250 x 4,6 Mobil fase: 40 ml maursyre

60 ml vann

384 ml ethylacetat

516 ml acetonitril

Strøm: 10 ml/min.

Injisering: 20 ul Loop, Rheodyne 7120

Pumpe: Waters 510

Detektor: Waters 481, UV-fotospektrometer, 471 nm Integrator: Waters 740

Bestemmelse av fiskens farve

Fiskekjøttets farve ble bestemt ved hjelp av L<*>a<*>b<*->farvebestemmelsesmetoden ved anvendelse av et Minolta Chroma Meter II. L<*->verdien betegner lyskomponenten, a<*->verdien (varierende fra -60 til +60) angir grønn/rødkomponenten (de negative verdier angir grønnkomponenten og de positive verdier angir rødkomponenten), og b<*->verdien (varierende fra -60 til +60) angir blå/gulkomponenten av farven. Bare a<*->verdien er angitt i Tabell 11.

Regnbueørretkjøtt uten skinn ble homogenisert i et blandeapparat under oppnåelse av en homogen masse som ble lagt i en liten petriskål (med en høyde på 1 cm og en diameter på 3,5 cm) slik at det inntok det samlede volum av denne. Overflaten av massen i petriskålen ble jevnet ut og dekket med en glassplate og var deretter klar for analyse.

I den nedenstående Tabell 11 er dataene for fiske-foringsforsøket angitt:

Resultatene viser at astaxanthinet i hvert av fiske-forene A - E er blitt absorbert av fisken og at fiskekjøttet får en økende rødpigmentering med økende mengder av astaxanthin i foret (for A-D) og med økende foringstid (som iakttatt ved a<*->verdien (som angir farvens rødkomponent)).

De ovenstående resultater antyder videre at nærværet av astaxanthin i foret ikke påvirker fiskens vekst.

Fisken ble også utsatt for visuell undersøkelse og ble generelt funnet å ha en tiltalende rød farve. Etter 43 dagers foring ble i det vesentlige ingen forskjell iakttatt i pigmenteringen av fiskefor med for D og E (inneholdende henholdsvis ca. 40 ppm astaxanthin produsert i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse og 40 ppm syntetisk astaxanthin). Etter 72 dagers foring ble i det vesentlige

i

I

ingen forskjell iakttatt i pigmenteringen av fisk foret med for C, D og E (inneholdende henholdsvis ca. 20 ppm astaxanthin produsert i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse, 40 ppm astaxanthin produsert i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse og 40 ppm syntetisk astaxanthin).

Eksemoel 12

Fiskepostei

En fiskepostei (lakselignende) i hvilken astaxanthin anvendes for å gi rødfarven, kan fremstilles i henhold til den følgende oppskrift:

Astaxanthinet ble dispergert i oljefasen. Grindsted Protein 177, stivelse og andre tørre bestanddeler ble blandet, og fisken ble tilsatt til en kolloidmølle. Deretter ble oljefasen, de tørre bestanddeler og vann tilsatt, og bearbeiding ble fortsatt i kolloidmøllen i ca. 10 minutter. Posteien ble fylt i bokser og utastt for varmebehandling.

Rød marinade

En rød marinade med en tiltalgende rød farve kan fremtilles ved hjelp av vanlige metoder ut fra de følgende bestanddeler:

Claims

1. Gjærcelle tilhørende arten Phaffia rhodozyma,karakterisert vedat den, når den dyrkes under betingelser som omfatter en oxygenoverføringshastighet på minst 30 mmol/l/time på Difco YM-medium ved 20-22°C i 5 dager i 500 ml ristekolber med to skjermer inneholdende 50 ml av mediet og utsatt for kretsende risting ved 150 rpm, idet podestoffet er 100 pl av en fire dager gammel YM-kultur, produserer astaxanthin i en mengde av minst 600 ug pr. g gjær-tørrstof f, bestemt ved HPLC-analyse under anvendelse av rent astaxanthin som en standard på en methanolekstrakt av gjæren tilberedt ved å utsette en suspensjon på 0,2 g gjærtørrstoff i 20 ml methanol for 5x1 minutters desintegrasjon i intervaller på et halvt minutt, idet desintegrasjonen utføres ved en temperatur av høyst 20°C i en glasskulemølle som inneholder 15 g glasskuler med en diameter av 0,4 mm, idet glasskule-møllen er forsynt med en kjølekappe med isvann, hvor gjærcellen er en gjærcelle som tilhører gjærcellen deponert under aksesjonsnummer CBS 225-87, en gjærcelle som tilhører gjærcellen deponert under aksesjonsnummer CBS 215-88, eller en gjærcelle avledet ved kjemisk mutagenisering fra villtypegjærceller deponert under aksesjonsnumrene CBS 5905/ATCC 24202/UCD 67-210, CBS 5908/ATCC 24203/UCD 67-383, CBS 6938, CBS 6954, ATCC 24201/UCD 67-203, ATCC 24228/UCD 68-653C, ATCC 24229/UCD 67-202, ATCC 24230/UCD 67-385 og ATCC 24261/UCD 67-484, hvor gjærcellen har i det vesentlige den samme morfologi som stammene CBS 225-87 og CBS 215-88, og produserer astaxanthin i mengder som er minst av den samme størrelsesorden som for CBS 225-87 og CBS 215-88.

2. Gjærcelle ifølge krav 1, karakterisert vedat når den dyrkes under betingelsene angitt i krav 1, produserer den astaxanthin i en mengde av minst 700 pg pr. g gjærtørrstoff, fortrinnsvis minst 1000 pg pr. g gjærtørrstoff, mer foretrukket minst 1500 pg pr. g gjærtørrstoff, og spesielt minst 2000 pg pr. g gjærtørr-stof f, bestemt ved metoden angitt i krav 1.

3. Gjærcelle ifølge krav 1 eller 2,karakterisert vedat den er en mutant.

4. Fremgangsmåte for produksjon av astaxanthin,karakterisert vedat den omfatter dyrking av en gjærcelle ifølge krav 1 tilhørende arten Phaffia rhodozyma under aerobe betingelser i et medium som inneholder carbohydratkilder, assimilerbare kilder av nitrogen og fosfor, mikronæringsstoffer og biotin eller desthiobiotin ved en temperatur innen området 15-26 °C for å oppnå en biomasse som inneholder astaxanthin i en mengde av minst 600 pg pr. g gjær-tørrstof f, bestemt ved metoden angitt i krav 1, og eventuelt utførende ett eller flere av de følgende trinn i valgfri rekkefølge: høsting av celler fra kulturen for å oppnå en gjærkrem, åpning av cellene, for eksempel sprengning av celleveggene ved hjelp av mekanisk, kjemisk og/eller enzymatisk behandling og/eller utsettelse av cellene for lydbehandling, autolyse, osmolyse og/eller plasmolyse, eventuelt med tilsetning av egnede midler, som tensider, syrer, baser, enzymer, autolyseforsterkende stoffer, osmo-lyserende midler som salter, og/eller plasmo-lyserende midler, homogenisering av cellene for å oppnå et homo- genat, tørking av cellene, cellefragmentene eller homo genatet, fortrinnsvis til et vanninnhold av høyst 12 vekt%, fortrinnsvis høyst 10 vekt%, ekstrahering av astaxanthin fra cellene, celle fragmentene eller homogenatet.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat dyrkingen utføres som en næringssatsfermentering under betingelser hvor i det vesentlige ingen alkohol blir dannet, og eventuelt hvor den samlede konsentrasjon av glucose og saccarose er høyst 8 g/l, fortrinnsvis 5 g/l, og mest foretrukket 1 g/l, fortrinnsvis ved en temperatur av 20-22 °C, idet fermenteringen eller en del av denne utføres i et medium som omfatter melasse og/eller saccarose og nitrogenkilder, som diammoniumsulfat, ammoniumfosfat, ammoniumhydroxyd eller urea, fosforkilder, som ammoniumfosfat og fosforsyre, og tilsatte mikronæringsstoffer eller mineralsalter, som magnesiumsulfat, sinksulfat og biotin eller desthiobiotin, idet melassen eventuelt tilføres til mediet atskilt fra de andre komponenter.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5,karakterisert vedat dyrkingen omfatter en vekstfase under betingelser som er i det vesentlige tilstrekkelige med hensyn til i det vesentlige samtlige vekstbetingelser, og en påfølgende vekstbegrenset fase under betingelser hvor dyrkingsmediet under fortsatt lufting befris for minst én vekstfaktor for å forsterke produksjonen av astaxanthin under den påfølgende fase, idet den påfølgende vekstbegrensede fase fortrinnsvis har en varighet på minst 16 timer, som 16-24 timer, idet den påfølgende vekstbegrensede fase fortrinnsvis er tilpasset for å forsterke astaxanthinproduksjonen til minst 1,2 ganger produksjonen oppnådd uten den påfølgende fase, fortrinnsvis til minst 1,3, som 1,4, og mer foretrukket 1,5, ganger produksjonen oppnådd uten den påfølgende fase, idet den påfølgende vekstbegrensede fase fortrinnsvis utføres i det vesentlige uten noen tilsetning av noe næringsstoff eller mikronæringsstoff til mediet.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat konsentrasjonen av astaxanthin i den oppnådde biomasse er minst 600 pg pr. g gjærtørrstoff, fortrinnsvis 700 pg pr. g gjærtørrstoff, bestemt ved metoden angitt i krav 1.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 4-7, karakterisert vedat konsentrasjonen av astaxanthin i den oppnådde biomasse er minst 800 pg pr. g gjærtørrstoff, fortrinnsvis minst 1000 pg pr. g gjærtørrstoff, mer foretrukket minst 1500 pg pr. g gjærtørrstoff, spesielt minst 2000 ug pr. g gjærtørrstoff, og mest foretrukket minst 3000 pg pr. g gjærtørrstoff, bestemt ved metoden angitt i krav 1.

9. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 4-8, karakterisert vedat gjærcellene, etter dyrkingen og den valgfrie påfølgende vekstbegrensede fase, utsettes for én eller flere av de følgende behandlinger: sprengning av cellene ved å utsette cellene for et øket trykk, for deretter å oppheve trykket, og på-følgende utsettelse av de sprengte celler for ultrafiltrering eller fordampning for å konsentrere de sprengte gjærceller, sprengning av cellene ved å utsette cellene for et øket trykk, for deretter å oppheve trykket, og på-følgende forstøvningstørking eller trommeltørking av de sprengte celler, filtrering for å få en filterkake som deretter ekstruderes, hvoretter ekstrudatet tørkes, for eksempel i et fluidisert sjikt eller ved brett-tørking, blanding av helt celletørket materiale som er blitt tørket i et fluidisert sjikt eller ved brett-tørking, med en oljeaktig fase, som spise-olje eller fett, og maling av blandingen i en mølle, som en omrørende kulemølle, for å sprenge cellene og frigjøre astaxanthin over i den oljeaktige fase, ekstraksjon av sprengte celler, fortrinnsvis homo genisert med organiske oppløsningsmidler, som petroleumsether, aceton eller en alkohol som methanol, ethanol eller isopropanol, for å oppnå astaxanthin oppløst i det organiske oppløsnings-middel, og deretter eventuelt fjernelse av opp-løsningsmidlet, som ved fordampning, ekstrahering av hele celler med et oppløsnings- middel som omfatter iseddik for å oppnå astaxanthin inneholdt i det iseddikholdige oppløsnings- middel, superkritisk ekstrahering av sprengte eller hele våte eller tørre celler med carbondioxyd, eventuelt i kombinasjon med organiske oppløsnings-midler, f.eks. av den ovennevnte type, idet behandlingen fortrinnsvis utføres under oxygen-begrensede betingelser, som i en inert atmosfære, idet den inerte atmosfære opprettes f.eks. ved hjelp av vanndamp og/eller ved hjelp av nitrogen og/eller carbondioxyd.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat ekstraksjonen av de hele gjærceller og det iseddikholdige oppløsningsmiddel ut-føres ved en temperatur over oppløsningsmidlets frysepunkt, f.eks. innen området 20-100 °C, fortrinnsvis innen området 20-80 °C, og mer foretrukket innen området 20-60 °C, og/eller hvor det hele cellemateriale og/eller det ekstraherte astaxanthin beskyttes ved hjelp av antioxydasjonsmidler, som butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxytoluen (BHT), vitamin E, ascorbinsyre eller (II)-sulfat- eller (II)-fosfatestere av ascorbinsyre, og/eller emulgatorer, som monoglycerider eller sorbitanestere.

11. Anvendelse av gjærceller ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3 eller deler derav i kombinasjon med andre forbestanddeler, fortrinnsvis et dyrefor, som tilsetningsstoff til en dyreforblanding i en mengde av høyst 10 vekt% av den samlede dyreforblandings tørrstoff, fortrinnsvis høyst 5 % og mer foretrukket høyst 3 %, idet de andre bestanddeler fortrinnsvis er valgt fra protein- og carbohydratkilder, som fiskemel, myse, blodmel, vegetabilske mel, fett, som fiskeolje og vegetabilske oljer, vitaminer og mineraler.

12. Anvendelse ifølge krav 11 i en dyreforblanding for foring av fisk, spesielt laks eller sjøørret, kuer, for å pigmentere deres smør, eller fjærkre, for å pigmentere deres eggeplommer.

13. Anvendelse av gjærceller ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, eller deler derav som tilsetningsstoff for mat.