DK175123B1 - Pigmentproducerende mutant af gæren Phaffia rhodozyma og anvendelse af en sådan mutant som fodertilskud til salmonider eller fjerkræ - Google Patents

Description

i DK 175123 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte pigmentproducerende mutanter af gæren Phaffia rhodozyma samt anvendelse af sådanne mutanter på brudt form i foderet til salmonider eller fjerkræ, til opnåelse af forøget pig-5 mentering af kødet hos salmoniderne, henholdsvis af kødet, skindet eller æggeblommen hos/fra fjerkræet.

Det rødlige carotenoidpigment astaxanthin findes almindeligt i naturen og fremvises synligt af en række dyr. Dyr, der ikke er i stand til at syntetisere dette 10 pigment, er afhængige af fødeindtag af pigmentet eller en precursor for pigmentet.

Den røde farve på skindet og kødet af laks og ørreder i naturen skyldes hovedsagelig astaxanthin, der normalt findes som et ikke bundet pigment i disse 15 fisk. I naturen forsyner zooplankton og nekton fra havet i føden laks med deres carotenoidpigmenter.

på grund af en mangel på astaxanthin i foderet er fisk, der er vokset op på fiskefarme eller i udklækningsanstalter, sædvanligvis blege og mangler far-20 verne på skind og kød, der er karakteristiske for fisk, der er vokset op i deres naturlige omgivelser. Man har ikke bestemt, om carotenoiderne er ernæringsmæssigt værdifulde for mennesker eller dyr, men pigmenterne gør visse fødevarer tiltrækkende. Da farven på en fødevare 25 ofte er et tegn på dens kvalitet, er der en stærk forkærlighed hos forbrugerne for fisk med naturlige farver, selvom de blege opdrættede fisk ernæringsmæssigt kan være identiske med sådanne, der er vokset op i deres naturlige omgivelser. Der er også tegn på, at 30 astaxanthin eller dets precursor bidrager til den karakteristiske aroma hos ristet laks.

En voksende helbredsomsorg har ført til et forbud mod forskellige farvemidler, der kan være carcino-gene og/eller teratogene. Gule og røde azofarvestoffer, 35 der i voksende grad bliver forbudt til anvendelse i fødevarer, er ved at blive erstattet med ikke toksiske 2

^I\ I I V I fcW V I

carotenoider. Carotenoider er almindeligvis ikke toksiske selv ved et højt indhold. Således er naturligt forekommende carotenoider foretrukne pigmenter for farvning, f.eks. af salmonider.

5 Man har tidligere udført mange undersøgelser under anvendelse af skaldyr eller bearbejdet skaldyrsaf- *· fald med indhold af carotenoider til foder for salmonider. Den blege farve hos fisk, der er opdrættet på fiskefarme eller i udklækningsanstalter, bliver forbed-10 ret, når fiskene får et foder, der er suppleret med store mængder tørrede knuste exoskeletale skaldyrsrester. Imidlertid har skaldyrsskaller et meget lavt carotenoidindhold og et højt mineralindhold, der uden en grundig bearbejdning for at forbedre deres foder-15 værdi vil begrænse deres indførelse i foder til salmonider. Man kan derudover kun udvikle en tilfredsstillende farve, når man fodrer på denne måde i meget lang tid, og økonomisk set er det ønskværdigt, hvis ikke endog væsentligt, at udvikle tilfredsstillende farver 20 indenfor en meget kort tidsperiode.

Man ved, at selve astaxanthin kan sættes til fiskefoder for at forbedre farven af fisk. F.eks. beskriver US patentskrift nr. 4.239.782 en fremgangsmåde til forstærkning af farver hos fisk, hvorved man til fiske-25 foderet sætter et pigmenterende middel såsom astaxanthin og derudover begrænsede mængder af hormonet testosteron, idet dette hormon virker som en katalysator kombineret med et udvalgt pigmenterende middel eller midler til at forstærke farven hos fisk.

30 De to vigtigste kommercielle kilder til selve astaxanthin er ekstrakter af skaldyrsskaller og kemisk syntese. Det røde carotenoidpigment kan ekstraheres fra exoskeletale skaldyrsskaller og væv og indgives blandet med andet foder i foderpræparater til fisk, skaldyr og 35 visse former for fjerkræ under opdræt, i store koncentrationer til udvikling af tilfredsstillende pigmente- DK 175123 B1 3 ring på skindet, kødet, rygskoldet eller i æggeblommen. Eksempler på fremgangsmåder til ekstraktion af asta-xanthin fra skaldyrsskaller og affaldsvæv beskrives f.eks. i US patentskrifter nr. 3.906.112 (Anderson) og 5 4.505.936 (Meyers et al.).

·< I en artikel i Journal of Food Science, bind 47 (1982), s. 892, med titlen "Extraction of Astaxanthin Pigment from Crawfish Waste Using a Soy Oil Process" beskrives forskellige ekstraktionsfremgangsmåder.

10 F.eks. kan man knuse hele affaldskrebsdyr, blande de findelte affaldskrebsdyr med vand, tilpasse pH med et alkali eller med en syre, sætte et enzym til opløsningen og omrøre, opvarme og hydrolysere opløsningen.

Efter hydrolysen ekstraherer man astaxanthin med en 15 olie og udvinder den astaxanthinberigede olie ved centrifugering. Imidlertid er prisen for naturlige isola-ter af astaxanthin, især fra krill- og krebsskaller, et sted mellem 5000-15000 dollars pr. kg. Det er tydeligt, at man savner en mere økonomisk fremgangsmåde, der er 20 mindre afhængig af kilderne til produktion af astaxanthin.

Man har også opnået pigmentering af kødet hos laks og ørreder under anvendelse af det syntetiske carotenoid canthaxanthin som foderadditiv, men dette 25 stof er temmelig dyrt, og man har meddelt, at det giver en noget utilfredsstillende farve hos salmonider. Eksempler på nyere arbejde, hvad angår den kemiske syntese af astaxanthin, ses i US patentskrifterne nr. 4.245.109 (Mayer et al.), nr. 4.283.559 (Broger et al.) og nr.

30 4.585.885 (Bernhard et al.). Den nuværende pris på syntetisk astaxanthinpigment er omtrent 2000 dollars/kg. Imidlertid forbyder mange lande anvendelse af syntetiske carotenoider.

Astaxanthin er stadig et af de dyreste ingre-35 dienser, der benyttes i laksefoder til buriaks. Da interessen i akvakultur, dvs. fiskeopdræt, i de seneste DK 175123 B1 4 år nærmest er eksploderet, er den kommercielle efterspørgsel efter en økonomisk kilde for astaxanthin vokset tilsvarende.

Pigmenteringen af fugleæggeblommer er også ble-S vet undersøgt på grund af den økonomiske vigtighed af farve i hønseæggeblommer. Forbrugerne forlanger æggeblommer med et højt indhold af pigment. Den almindeligste kilde for pigment i kommercielt foder har været gul majs, der tilvejebringer de vigtigste æggeblommepigmen-10 ter cryptoxanthin, zeaxanthin og lutein. Desværre er korn med højere energiindhold såsom durra, hvede, ris og byg ved at erstatte majs som kyllingefoder med et tilsvarende tab i pigmentering. Astaxanthin kan benyttes som fjerkræfodertilskud for at forøge æggeblomme-15 pigmenteringen.

Man har ikke tidligere kommercielt anvendt biosyntese til produktion af astaxanthin, dvs. anvendt mikroorganismer til at syntetisere astaxanthin.

Man kender som mikrobiel kilde til astaxanthin 20 gæren Phaffia rhodozyma (Johnson, "Astaxanthin Production by the Yeast Phaffia rhodozyma and its use as a Pigment Source in Animal Feeding", magistergrad, University of California, Davis, 1976). Gær betragtes alment som et meget nærende foder og er ofte gavnlig i 25 dyrefoder; den yderligere fordel med astaxanthinind-hold tyder på, at rhodozyma kan være et ideelt fodertilskud til dyr, der kræver et tilskud i foderet af dette pigment, f.eks. salmonider, skaldyr, æglæggende høner eller fugle såsom flamingoer.

30 imidlertid er pigmentudbyttet af naturligt fore kommende P^ rhodozyma kun af størrelsesordenen 200-600 ppm/tørstofvægt af gær efter 6 dages vækst. Som en kilde for selve astaxanthin er naturligt forekommende P. rhodozyma utilstrækkelig. Forsøg med tilskud til fode-35 ret for visse fisk, skaldyr og fjerkræ med naturligt forekommende P^ rhodozyma virkede dog lovende. Imidlertid DK 175123 B1 5 er det store rumfang af rhodozyma, der må tilsættes som fodertilskud for at opnå tilfredsstillende niveauer af pigmentering en mangel ved den kommercielle egnethed af naturligt forekommende rhodo2yma som en pig-5 mentkilde.

I overensstemmelse hermed er det et mål for opfindelsen at tilvejebringe mutanter af Phaffia rhodozyma, der udmærker sig ved et højt astaxanthinindhold.

Det er et yderligere mål for opfindelsen at opnå 10 forbedring af astaxanthinindholdet af efterkommere afledt af · naturligt forekommende. P^_ rhodozyma, såsom stammerne ATCC 24230 eller ATCC 24202 deponeret hos ATCC.

Endelig er det et mål for opfindelsen at forbed-15 re astaxanthinindholdet af muterede stammer af gæren P. rhodozyma.

Disse og andre mål opfyldes af en pigmentproducerende mutant af gæren Phaffla rhodozyma ifølge opfindelsen, idet en sådan mutant er ejendommelig ved, at 20 den kan opnås ud fra naturligt forekommende Phaffla rhodozyma eller en mutant af naturligt forekommende Phaffia rhodozyma ved en eller flere morfologiske udvælgelser i et medium indeholdende et antibiotisk udvælgelsesmiddel eller en inhibitor for terpenoidsynte-25 sevejen, eventuelt kombineret med mutation af den fremkomne gærmutant med et muteringsmiddel, og at den producerer mere end 700 pg astaxanthin pr. g gærtørstof efter seks dages dyrkning i YM-medium, hvorved astaxanthinindholdet bestemmes ved måling af absorbansen 30 ved 474 nm under anvendelse af værdien 2100 for 1% (w/v) ekstintionskoefficienten i en centimeterkuvette.

Nøgletrinnet i udvælgelsen af stammer er trinnet med morfologisk udvælgelse. Der er ingen begrænsning på de mulige kombinationer af rækkefølge og type af muta-35 tion og antibiotisk udvælgelsesmiddel eller terpenoi-dinhibitor, som man kan underkaste P_^ rhodozyma inden- DK 175123 B1 6 for opfindelsen. Nyere resultater bekræfter reproducerbarheden af denne teknik.

Beslægtede mål og fordele ved opfindelsen vil ses mere tydeligt under reference til den detaljerede 5 beskrivelse og tegningerne på hvilke: fig. 1 viser den kemiske struktur og slægtsskabet mellem forskellige pigmenter og mellemprodukter, der findes i rhodozyma; fig. 2 er et procesdiagram, der viser foretrukne 10 sekvenser for isolering af mutanter af rhodozyma; og fig. 3 er en mikrofotografi, der viser udseendet af forskellige kolonier.

• Under en ekspedition i 1967 med det formål at 15 studere gærflora på træer i de vigtigste japanske øer og i det nordvestlige Stillehav isolerede man en særlig astaxanthinsyntetiserende organisme fra slimafsondringer fra forskellige bredbladede træer (Phaff et al., "A comparative study of the yeast florae asso-20 ciated with trees on the Japanese Islands and on the west coast of North America", Proc. IV: Ferment, Tech-nol. Today, (1972) side 759-774. Denne organisme, der nu kendes som Phaffia rhodozyma, fandtes at have evnen til at producere carotenoide pigmenter og fermentere 25 adskillige sukkerarter.

Phaffia er blevet tildelt en slægt på grund af dens unikke karakteristika, der inkluderer dens evne til at fermentere glucose og andre sukkerarter (sammenlignet med de andre carotenoiddannende gærarter, der 30 alle er strengt aerobiske), dens syntese af astaxan-thin som vigtigste carotenoid, dens knopskydningsfacon, dens besiddelse af visse metaboliske egenskaber såsom evnen til at benytte urinstof, som ikke er så almindelig hos sporedannende gærarter og dens cellevægs-35 sammensætning. P_;_ rhodozyma, den eneste species i denne slægt, reproducerer udelukkende ved knopskydning og en DK 175123 B1 7 undersøgelse af denne type vegetativ reproduktion ved scanning elektronmikroskopi viser, at gæren gentagne gange skyder knopper fra samme sted, hvilket fører til dannelse af mangelagscellevæggen.

5 Andre karakteristika for Phaffia inkluderer dens dannelse af chlamydosporer, dens mol% G+C indhold på 48,3%, dens evne til at spalte urinstof ved hjælp af urease og dens tilsyneladende mangel på en perfekt tilstand. Dens egenskaber tyder på, at gæren er af basi-10 diomycetisk affinitet. Alle forsøg på at finde en seksuel cyklus hos Phaffia er indtil nu mislykkedes.

Andrewes et al. fandt som meddelt i "Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red pigmented fermenting yeast", Phytochem. 15, (1976) side 1003-1007, at caro-15 tenoiderne fra rhodozyma var usædvanlige. Pigmenter og pigmentmellemprodukter fundet af Andrewes i naturligt forekommende rhodozyma ses i fig. 1, hvor (A) er echinenon, (B) er 3-hydroxyechinenon, (C) er pheni-coxanthin og (D) er astaxanthin. Man fandt, at asta-20 xanthin var det vigtigste pigment, der blev syntetiseret af denne gær; i naturligt forekommende gær omfattede det ca. 85% af carotenoidblandingen.

Selvom carotenoiderne fra de fleste plantekilder og dyrekilder let kan ekstraheres med vandblandbare op-25 løsningsmidler, er gærarterne velkendte for, at de holder kraftigt på deres pigmenter. Astaxanthin er fast fæstet i gærcellerne og kan ikke ekstraheres med lipide opløsningsmidler, uden at man først ændrer strukturen af gærcellen.

30 Den mest kvantitative ekstraktionsmetode invol verer, at man mekanisk bryder gærcellerne såsom i en fransk presse (Simpson et al., "Modified French press for the disruption of microorganisms", J. Bact., 86, (1963) side 1126-1127) eller i en Braun homogenisator 35 (Bae et al., "The occurrence of plectaniaxanthin in Cryptotococcus laurentii", phytochem., 10, (1070) side DK 175123 B1 8 625-629) og derefter ekstraherer cellerne med opløsningsmidler. Disse metoder benyttes rutinemæssigt til vurdering af astaxanthinkoncentration.

Behovet for udvinding i stor skala af astaxan-5 thin førte til udvikling af en enzymatisk metode til ekstraktion. Ved metoden benytter man ekstracellulære lytiske enzymer produceret af bakterien Bacillus clr-culans WL-12, der delvis fordøjede gærcellevæggen og gjorde carotenoidpigmenterne ekstraherbare med lipide 10 opløsningsmidler. Man kunne opnå en fuldstændig ekstraktion af astaxanthin fra varmedræbte rhodozyma celler efter at have dyrke circulans WL-12 på disse gærceller i 26 timer og derefter ekstrahere blandingen af gær og bakterier med acetone.

15 Et bakteriefrit lytisk system, der gav en kvan titativ ekstraktion af astaxanthin fra rhodozyma, kunne opnås ved indkoncentrering af kultururten fra væksten af circulans WL-12 på rhodozyma celler.

Man dyrker foretrukket circulans WL-12 på et medium, 20 der indeholder P^ rhodozyma celler. Man fandt, at det lytiske system virkede mest effektivt ved pH 6,5 og ved lave gærkoncentrationer.

Almindeligvis har ernæring og omgivelser en indflydelse på udbyttet af carotenoider fra forskellige 25 carotenoidproducerende mikroorganismer. En oversigt over forstærkning af carotenoiddannelse ved fermentationer i komplekse medier findes hos Hanson, "Microbial production of pigments and vitamins", i Microbial Technology, udgivet af H.J. Peppier, Reinhold, New 30 York(1967) side 222-250.

Carotenoider er tetraterpener, og deres grundlæggende syntesevej minder om, hvad man finder hos andre terpenoider. Acetyl CoA er den første precursor, og den første specifikke terpenoidforbindelse er mevalon-35 syre (Schopfer et al., "Sur la biosynthese du β-carote-ne par Phycomyes cultivé sur un mileu contenant de DK 175123 B1 9 1'acetate de sodium comme unique source de carbone", Experientia 8, (1952) side 140). Den fundamentale precursor fra hvilken carotenoider afledes, er isopente-nylpyrophosphat (se Goodwin, "Biosynthesis", Caroten-5 oids, udgivet af 0. Isler, Basel, Birkhauser, (1971) side 577-636; Britton, "Biosynthesis of Carotenoids", i Chemistry and biochemistry af plant pigments, Vol. 1, (1976) side 262-327) .

De fleste tidligere arbejder med rhodo2yma er 10 blevet foretaget med stammen af type nr. 67-210. Visuel undersøgelse af unge kolonier fra adskillige yderligere naturligt forekommende isolater (UCD-FST- nr. 67-202, 67-203, 67-210, 67-383, 67-385 og 68-653C) tydede på, at 67-210 og 67-385 (American Type Culture Collection 15 henholdsvis nr. ATCC 24202 og ATCC 24230) var de mest pigmenterede stammer. Kvantitativ bestemmelse af asta-xanthinindholdet i disse to stammer efter 5 dages vækst i YM urt tydede på, at 67-385 indeholdt ca. 450 pg/g tør gær sammenlignet med ca. 295 pg/g i 67-210.

20 vi har hovedsagelig benyttet 67-385 til stammeforbed-ringer på grund af dennes højere naturlige astaxanthin-indhold.

Som et resultat af en række eksperimenter til bestemmelse af de bedste dyrkningsbetingelser for vækst 25 og pigmentering af rhodozyma fandt man (se Johnson et al., J. Gen. Microbiology 115 (1979), s. 173-183), at biosyntesen af astaxanthin foregik maksimalt under den eksponentielle vækstfase. Man fandt, at pigmentudbyttet i vækstmediet ikke udelukkende var afhængigt af 30 cellekoncentrationen, men var påvirket af dyrkningsbetingelserne. Man fandt, at det optimale pH for asta-xanthinproduktion var 5,0 i rystekolber, ved andre afprøvede pH værdier forblev koncentrationen af astaxanthin i P^ rhodozyma imidlertid temmelig konstant.

35 Man fandt af dyrkningstemperaturen påvirkede væksthastigheden for P^ rhodozyma, men ikke akkumule- 10 bl ringen af astaxanthin i gærcellerne. Lys påvirkede heller ikke carotenogenesen i rhodozyma, selvom celler dyrket under kraftig lysintensitet syntes at være mere rødlige, hvilket eventuelt kan skyldes forskellige kon-5 centrationer af specielle carotenoider.

Man fandt, at en lav glucosekoncentration og en kraftig tilførsel af luft effektivt fremmede astaxan-thinproduktion af P^ rhodozyma ♦ Koncentrationen af astaxanthin i den røde gær faldt betydeligt, hvis luft-10 tilførslen var under 20 mmol/time, eller hvis glucose-koncentrationen var over ca. 4% w/v. Imidlertid var astaxanthin stadig det dominerende pigment, hvis man dyrkede gæren under en af disse betingelser. Hvis man imidlertid kombinerede virkningen af høj glucosekoncen-15 tration og lav lufttilførsel, faldt koncentrationen af astaxanthin i rhodozyma til overordentlig lave niveauer, og der forekom en dannelse af β-zeacaroten.

Under disse ugunstige betingelser dannedes astaxanthin ikke effektivt ud fra carotenerne.

20 Når denne gær blev dyrket på carbonforbindelser, der undertrykker ethanolproduktion {f.eks. cellobiose) var udbyttet af astaxanthin temmeligt højt. Hvis den blev dyrket på carbonkilder, der antageligt fremmede ethanolproduktionen (f.eks. et stort indhold af gluco-25 se) var udbytterne af astaxanthin temmeligt lave. Carbonforbindelser, der metaboliseres via pentosephosphat-vejen (f.eks. xylose), fremmede ikke en effektiv caro-tenogenese.

Trods mange eksperimenter vedrørende optimering 30 af dyrkningsmedium og ydre betingelser for naturligt forekommende stammer af rhodozyma, kunne man ikke herved opnå en voldsom vækst i pigmentindholdet. Heraf sluttede man, at manipulering af disse faktorer alene eventuelt ikke er tilstrækkeligt til at inducere en 35 vækst i astaxanthinindhold af p^ rhodozyma i en grad, så biosyntesen bliver kommercielt tiltrækkende.

DK 175123 B1 11

Til opnåelse af isolering af en ny genetisk mutant af rhodozyma, der var i stand til forøget astaxanthinproduktion, underkastede man P. rhodozyma mutagenese. Imidlertid var resultaterne herfra for-5 virrende, sandsynligvis på grund af den tilfældige og ikke formålsrettede art af mutationerne. F.eks. var forsøg på at isolere meget pigmenterede varianter ikke heldige selv efter gennemsøgning af mange tusinde kolonier efter bestråling med ultraviolet lys. De fleste 10 af de uv-dannede mutanter havde et betydelig reduceret astaxanthinindhold og var meget blege.

Mulighederne for yderligere fremskridt, hvad angår forbedring af astaxanthinindholdet i P. rhodozyma ved konventionelle mutagenesefremgangsmåder synes at 15 være begrænsede. Dette skyldes, at mikroorganismer besidder en stram genetisk regulerende kontrol over biosyntesen af deres cellekomponenter, hvorfor de har en tendens til ikke at overproducere unødvendigt indhold i cellerne. Da biosyntesen af pigment såsom astaxan-20 thin tilsyneladende er stramt reguleret i en hvilken som helst kendt stamme af gærceller, er chancen for at producere en levedygtig arvelig genetisk ændring til frembringelse af kolonier, der er i stand til forøget astaxanthinproduktion ved ikke dirigeret mutagenese, 25 sandsynligvis meget lav.

Det bør bemærkes, at international patentansøgning nr. W088/08025 angiver stammer af P^ rhodozyma med forøget astaxanthinproduktion, idet disse stammer er opnået ud fra naturligt forekommende stammer ved muta-30 genese med ethylmethansulfonat og/eller nitrosoguani-din. Denne patentansøgning blev dog først alment tilgængelig efter prioritetsdatoen for den herværende ansøgning.

Da gennemsøgning af kolonier efter mutagenese 35 ikke medførte nogen større succes, prøvede man at udvikle udvælgelsesprocedurer for overproduktion af asta-

Ul\ I («I I *-\J O I

12 xanthin. Da dannelse af astaxanthin undertrykkes af høje koncentrationer af glucose, prøvede man 2-desoxy-glycose som selektivt middel til isolering af glucose-resistente stammer, der kunne være katabolit-antiunder-5 trykte og derefter opvise en forstærket biosyntese af pigment. Skønt visse stammer, der blev frembragt ved denne udvælgelsesfremgangsmåde, opviste en ændret pigmentering, var mange af disse overordentligt ustabile, og ingen havde en større forøgelse i astaxanthinkoncen-10 tration end til det dobbelte af, hvad man fandt hos den naturligt forekommende udgangsstamme.

Man forsøgte at inkorporere en inhibitorer for sterolbiosyntese, deriblandt ketoconazol og miconazol, i maltekstraktmedium gæragar, hvilket førte til en 15 tydelig aflivning af P. rhodozyma. Imidlertid fandt man ved gennemsøgning af adskillige tusinde overlevende ikke stærkt pigmenterede gærstammer. Adskillige andre afprøvede forbindelser inkluderende nicotin (1 mM), imidazol (4 mM), 2-methylimidazol (1 mM) og morpholin 20 (10 mM) ændrede synligt farven af kolonierne, men hæmmede ikke væksten, hvilket var et tegn på ændring i sammensætning af carotenoiderne. Da disse varianter imidlertid ikke havde forøget astaxanthinindhold, gennemførte man ikke nogen yderligere analyse over ændrin-25 gen i pigmentsammensætningerne.

Man forsøgte også at behandle P. rhodozyma med adskillige inhibitorer for elektrontransport, deriblandt thenoyltrifluoracetone (TTFA), antimycin A og natriumcyanid. Naturligt forekommende P. rhodozyma 30 blev i det væsentlige dræbt af lave koncentrationer af antimycin A og TTFA, men man fandt, at den var temmelig ufølsom overfor cyanid og azid.

Som et resultat af grundige forsøg, hvoraf en del er diskuteret ovenfor, har man som ovenfor nævnt 35 overraskende opdaget, at man kan producere kolonier af mutanter af P. rhodozyma, idet disse kolonier udmærker DK 175123 B1 13 sig ved højt astaxanthlnindhold, P. rhodozyma gærmutan-ter ifølge opfindelsen er ikke reverterende, astaxan-thin findes i gæren i en tilstrækkelig høj koncentration, så denne kan være et mere effektivt foder og pig-5 menttilskud end naturligt forekommende P. rhodozyma, og man kan opnå kolonier af gæren, der er i stand til at producere astaxanthin i tilstrækkelige mængder til at gøre astaxanthinfermentering en kommerciel tiltalende proces til fremstilling af astaxanthin.

10 I overensstemmelse hermed angår opfindelsen an vendelse af en gærmutant ifølge opfindelsen på brudt form i foderet til salmonider eller fjerkræ, til opnåelse af forøget pigmentering af kødet hos salmonider-ne, henholdsvis af kødet, skindet eller æggeblommen 15 hos/fra fjerkræet.

Mere detaljeret opdagede man, at hvis man underkaster en naturligt forekommende eller muteret stamme af P. rhodozyma en morfologisk udvælgelse under anvendelse af et udvælgelsesmiddel og især et antibiotikum, 20 en cytochrom B inhibitor eller en inhibitor for terpe-noidsyntesevejen som udvælgelsesmiddel, finder en di- rekte og specifik udvælgelse af stærkt pigmenteret P. rhodozyma sted. F.eks. førte udplatning af den pinkfarvede gær P. rhodozyma på agar med indhold af et anti-25 biotikum, en cytochrom B inhibitor eller en inhibitor for terpenoidsyntesevejen til kolonier med usædvanlig morfologi, der var ejendommelige ved en ikke pigmenteret lavere glat overflade, der efter 1-2 måneder udviklede stærkt pigmenterede vertikale papiller. Isolering 30 og rensning af papillerne fulgt af afprøvning for pigmentering i rystekolber demonstrerede, at adskillige mutanter havde et 3-6 gange forøget astaxanthlnindhold i forhold til det oprindelige naturligt forekommende isolat.

35 Et af det udvalgte afkom (mutanten IGI-887J0 ifølge opfindelsen; se fig. 2 og ledsagende tekst) blev DK 175123 B1 14 karakteriseret fysiologisk. Mutanten voksede langsommere på diverse nitrogenkilder og havde lavere celleudbytter på adskillige carbonkilder. Den viste forøget følsomhed overfor respirationsinhibitorer såsom antimy-5 cin A og TTFA, men afveg ikke fra det naturlige isolat, hvad angår følsomhed overfor cyanid og azid. Den var mere følsom overfor aflivning med hydrogenperoxid.

Analyse af carotenoiderne ved tyndtlagschromatografi viste to ukendte carotenoider, der ikke fandtes i ud-10 gangsgæren, såvel som en forøget akkumulering af caro-tener og cis-astaxanthin.

Antibiotiske udvælgelsesmidler inkluderer f.eks. en eller flere af antimycin, tunicamycin og nystatin. Antimycin kan endvidere klassificeres som en inhibitor 15 for elektrontransport eller for cytochrom B. Andre cytochrom B inhibitorer, der forstærker pigmenteringen af udvalgt afkom, inkluderer f.eks. 2-n-heptyl-4-hy-droxyquinolin-N-oxid (HOQNO). Inhibitorer for terpe-noidsyntesevejen inkluderer f.eks. mevalonsyrelacton, 20 der alment kan betegnes som en metabolismeinhibitor og som er et eksempel på en sterolinhibitor.

Koncentrationerne af udvælgelsesmidler, f.eks. antimycin, ligger foretrukket i området 1-100 ym på maltekstrakt gærmedium (YM) plader, mere foretrukket 25 30-80 yM, og mest foretrukket til dannelse af de klareste kolonier, ca. 50 yM.

virkningen af antibiotisk udvælgelsesmiddel, f.eks. cytochrom B inhibitor, eller inhibitor for ter-penoidsyntesevejen på P. rhodozyma er overraskende, og 30 den detaljerede underliggende mekanisme derfor mangler endnu opklaring. Det er overraskende, at P. rhodozyma, når den underkastes en udvælgelse med antibiotisk udvælgelsesmiddel eller inhibitor for terpenoidsynteseve-jen, producerer kolonier med højere pigmentindhold, når 35 eksperimenter udført med andre midler såsom respirationsinhibitorer, deriblandt KCN, rotenon, TTFA og an- DK 175123 B1 15 det, ikke i det væsentlige synes at påvirke pigmenteringen af P. rhodozyma på YM plader eller i væskeformige vækstmedier.

Man har udviklet en hypotese, der kan give en 5 mulig forklaring på virkningen af antimycin på P. rho-dozytna.

Man har mistanke om, at siden ringslutning og hydroxylering kan afhænge af cytochrom P450, der forekommer i sterolsyntese, og siden en cytochrom B inhibi-10 tor såsom antimycin reagerer med cytochrom B, der er det samme cytochrom, der reducerer cyt. P450, kan den forøgede pigmentering af antimycinmutanterne måske skyldes en ændret cyt. P450 funktion eller aktivitet.

Man ved endvidere, at dette molekyle inaktiverer glut-15 aminsyntetase, og dette kan være grunden til den observerede langsommere nitrogenkatabolisme. En yderligere diskussion af denne hypotese kan findes i An et al., "Isolation of Mutants of Phaffia rhodozyma with increased quantities of Astaxanthin", til en væsentligt 20 grad forfattet af en af opfinderne. Applied and Environmental Microbiology, 55 (1989), 116124.

Nyere forsøg bekræfter, at denne teknik kan benyttes flere gange med P. rhodozyma.

De naturligt forekommende gærceller, der er ud-25 valgt med et antibiotisk eller en inhibitor for terpe-noidsyntesevejen, kan yderligere udsættes for mutagen før, efter, eller både før og efter udvælgelse eller et hvilket som helst ønsket antal eller kombinationer af mutationer og udvælgelser, sålænge der herved er inklu-30 deret et antibiotisk udvælgelsesmiddel eller en inhibitor for terpenoidsyntesevejen ved udvælgelsen.

Mutagener eller mutageniske midler kan vælges blandt en række kemiske forbindelser eller blandt andre påvirkninger, og de er foretrukket kraftige nok til at 35 føre til produktion af ikke revertable mutationer. Mutanter, hvori man ikke har observeret degeneration.

DK 175123 B1 16 er meget ønskede til industrielt brug. Kraftige mutagener inkluderer ethylmethansulfonat, nitrosoguanidin (N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin), salpetersyrling (skønt man herved skal benytte temmelig store mængder), 5 ultraviolet bestråling i betydeligt omfang, røntgenbestråling og andet.

I øjeblikket foretrækkes nitrosoguanidin og UV-bestråling på grund af den nemme tilgængelighed, den temmelige kraftige mutagene natur, og idet håndteringen 10 af disse er temmelig let og sikker. Imidlertid kan man benytte et hvilket som helst kraftigt mutagen, idet man benytter mængder og fremgangsmåder til påvirkning ifølge kendt teknik.

I visse tilfælde kan man kombinere et svagt mu-15 tagen med et kraftigt mutagen. Blandt de svage mutagener kan nævnes 2-aminopurin, t-bromuracil, hydroxyl-amin, natriumbisulfit og andre.

Den rækkefølge af mutationer og udvælgelser, hvorved man har opnået stammer med højeste udbytte af 20 astaxanthin indtil nu, ses i fig. 2. Idet vi refererer til fig. 2, fandt man ved analyse, at den naturligt forekommende udgangsgær 67-385 opnået fra American Type Culture Collection som ATTC nr. 24230 indeholdt 200-600 yg astaxanthin/g gærtørstof efter 6 dages vækst. Man 25 underkastede 67-385 antimycinudvægelse og opnåede et højere pigmenteret afkom betegnet IGI-887J0. Den første mutante papillus, der blev skåret fra den basale koloni, indeholdt ca. 700 yg totalt carotenoid/g gær, hvorimod udgangsstammen indeholdt 300-400 yg/g. Man analy-30 serede, at IGI-887J0 havde et astaxanthinindhold på 960 yg/g gærtørstof efter 6 dages vækst. Man genudplattede IGI887J0 på YM agar med indhold af 50 yM antimycin og udvalgte anden generations antimycinkolonier. En af disse producerede 1200 yg/g og en anden producerede 35 1450 yg/g. Det ses således, at antimycin A er et udmærket udvælgelsesmiddel til isolering af pigmenterede va- DK 175123 B1 17 rianter af P. rhodozyma.

IGI-887JO blev underkastet nitrosoguanidin (NTG) mutation til opnåelse af IGI-887J2, der producerede 1200-1500 yg totale carotenoider/g gær. IGI-887J2 blev ------ 5 yderligere udvalgt med antimycin til opnåelse af IGI- 887 Jl, der ved analyse viste sig at have et astaxan-thinindhold på 700-1100 yg/g gærtørstof efter 6 dages vækst. En anden NTG mutagenese producerede IGI-887J3 som afkom.

10 Ved rensning af kolonierne fra IGI-887J3 delte isolatet sig i hvide og pigmenterede kolonier. Den hvide revertant blev betegnet IGI-887J4. Disse blege kolonier voksede meget dårligt på ammoniumsulfat ved 5 g/1, voksede lidt bedre på høje indhold af ammoniumsulfat 15 (20 g/1) og voksede på plader godt på glutamat eller glutamin. Disse resultater tyder på, at stammerne efterhånden får hæmmet nitrogenmetabolismen, hvilket begrænser væksthastigheden.

IGI-1287Jl blev isoleret efter mutation med ni-20 trosoguanidin af IGI-887J4, den hvide udskillelse af IGI-887J3. Ved analyse viste IGI-1287J1 sig at indeholde 900-1400 yg/g gærtørstof efter 6 dages vækst.

Denne stamme havde også en hæmmet nitrogenmetabolisme.

Man bemærkede, at stammerne IGI-287J3 og IGI-1287J1 ik-25 ke vokser på ethanol, hvorimod tidligere mutanter gør.

IGI-2280B60 kunne opnås fra IGI-887J2 ved mutagenese med NTG og viste sig ved analyse at indeholde 1700 yg/g gærtørstof efter 6 dages vækst.

30 Karakterisering af antimycinmutanterne.

Udgangsstammen (67-385) og de omhandlede gærmutanter IGI-887JO og IGI-887J2 havde omtrent samme celleudbytter med ammoniumglutamat eller glutamin som ni-35 trogenkilder. Imidlertid viste analyse af væksthastigheder, at serien af stammer voksede langsommere og 18 UK Ί 75123 Bl langsommere på disse nitrogenforbindelser. Disse data tydede på, at hastigheden eller effektiviteten af nitrogenudnyttelse var hæmmet i antimycinmutanterne.

Udgangsstammen og de to omhandlede mutanter hav-5 de reducerede cellebytter på fire afprøvede carbonkil-der, men var kraftigere pigmenteret. Antimycinmutanterne fermenterede stadigvæk glucose og havde også en tydelig ethanoldehydrogenaseaktivitet. Imidlertid voksede IGI-887J2 ikke længere på ethanol og havde redu-10 cerede celleudbytter på andre respiratoriske substrater, deriblandt succinat. De reducerede udbytter på energikilderne og den specifikke inhibition forårsaget af antimycin, hvad angår elektrontransportkæden, tydede på, at den respiratoriske funktion eller den mitokon-15 triske funktion var ændret i de pigmenterede mutanter.

Man undersøgte følsomheden af mutanterne for forskellige respirationsinhibitorer inkluderende antimycin A, theonyltrifluoracetin, natriumazid, hydrogen-peroxid og natriumcyanid. Disse inhibitorer påvirker 20 forskellige områder af respirationskæden. Overraskende var de antimycininducerede mutanter mere følsomme overfor antimycin A på YM plader og også i væskemedier. Udgangsstammen havde ca. 50% overlevelse ved 100 yM antimycin sammenlignet med mutanterne, der ikke over-25 levede over ca. 60 yM. Den koncentration af antimycin, der aflivede 50% af populationerne af IGI-887J0 og IGI-887J2 på YM agar, var henholdsvis ca. 18 og 3 yM. Mutanterne var mere følsomme i væskemedier og blev aflivet ved antimycinkoncentrationer nær ved 0,5 yM.

30 Disse resultater viser tydeligt, at de pigmen terede papiller, der voksede ud fra de blege kolonier i virkeligheden var mere følsomme overfor medikamentet, selvom de var isoleret på plader med indhold af antimycin. Tilsyneladende gjorde den rumlige adskillelse 35 af papillerne fra agaren, dannelsen af de mere følsomme stammer lettere.

19 DK 175123 B1

Mutanterne var også ganske følsomme overfor andre respirationsinhibitorer, deriblandt TTFA og hydro-genperoxid, men var kun en smule mere følsomme overfor cyanid og havde ingen forskel i følsomhed overfor azid.

5 Disse data understøttede den ovennævnte hypotese, at de antimycinisolerede stammer havde en ændret respiratorisk kæde og gav støtte for en formodning om, at en beskadigelse kan findes i tidlige områder af kæden nærved cytochrom B.

10 Hvad angår carotenoidsammensætningen af mutan terne, se An et al., "Isolation of Phaffia rhodozyma Mutants with increased Astaxanthin Content", Applied and Environmental Microbiology, 55 (1989), 116-124, i en væsentlig grad forfattet af en af opfinderne.

15 Det er nødvendigt at tilføre passende mængder næringsmidler og mineraler til dyrkningsmediet for at opnå en ordentlig vækst af mikroorganismen, for at maksimere assimilering af carbonenergikæden af cellerne under den mikrobielle omdannelsesproces og for at opnå 20 højst muligt celleudbytte med en maksimal celledensitet i fermenteringsmediet.

Sammensætningen af fermenteringen kan variere bredt, dels afhængig af gærstammen, dels af det anvendte substrat samt af mineralindholdet i fermenteringen 25 (dvs. væske plus celler). Nedenfor i tabellen ses minimum, et bredt område og det for tiden foretrukne område for koncentrationer af forskellige grundstoffer i fermenteringen, idet koncentrationen udtrykkes som af grundstoffet, selvom naturligvis en del af eller alt af 30 hvert grundstof kan være til stede som en opløselig ion eller i tilfælde som P i en kombineret form af en eller anden type såsom et phosphat. Mængden af hvert grundstof er udtrykt i g eller mg pr. 1 fermentering (vandig fase, inkluderende cellerne): 35 DK 175123 B1 20 Vægt af grundstoffer pr. 1 fermentering Element Minimum Bredt område Foretrukket område p 0,2 g 0,2-5 g 0,4-2 g 5 K 0,1 g 0,1-3 g 0,1.0.7 g

Mg 0,15 g 0,15-3 g 0,3-1,2 g

Ca 0,06 g 0,06-1,6 g 0,08-0,β g S 0,1 g 0,1-8 g 0,2-5 g

Fe 0,5 mg 0,5-30 mg 0,6-20 mg 10 zn 2 mg 2-100 mg 3-40 mg

Cu 0,6 mg 0,6-16 mg 1-10 mg

Mn 0,6 mg 0,6-20 mg 0,9-8 mg

Opfindelsen belyses nærmere af følgende illu-15 strerende eksempler.

I eksemplerne er naturligt forekommende stammer opnået fra det officielle deponeringssted, nemlig American Type Culture Collection i Rockville, Maryland og er betegnet ATCC nr. 24230 og 24202. ATCC betegnel-20 serne viser, at to skråstivnede agarkulturer af hver stamme er deponeret på det officielle deponeringssted.

Mutaqenese 25 Eksempel 1

Ultraviolet mutaqenese

Man mutageniserede stammen IGI-2880B60 med ultraviolet lys fra en germicid UV lampe anbragt 30 cm 30 fra en saltvandssuspension af celler, i 1 minut (95,3% aflivelse), 3 minutter (99,4% aflivelse) og 5 minutter (99,99% aflivelse). Man holdt mutageniserede celler i mørke i en 1 time efter mutagenesen og udplattede dem på maltekstrakt gærmedium (YM) med adskillige fortyn-35 dinger. Pladerne blev inkuberet ved 20°C. Man isolerede mørk rødorange kolonier på basis af observerede for- DK 175123 B1 21 skelle i pigmemtering og udstrøg dem på skråstivnet substrat.

Eksempel 2 5

Nitrosoquanidin mutaqenese

Man dyrkede stamme 1287J1 i YM i 48 - timer. Cellerne blev udcentrifugeret, man. bortkastede supernatan-ten og suspenderede cellerne igen i 0,1 M citratpuffer.

10 pH 5,0. Derefter behandlede man cellerne med 100 pg/ml nitrosoguanidin (NTG) i 25 minutter ved stuetemperatur uden omrystning. Suspensionerne blev centrifugeret, man dekontaminerede supernatanten og vaskede cellerne tre gange med 0,1 M kaliumphosphatpuffer, pH 7,0. Centrifu-15 gebundfaldet blev suspenderet i phosphatpuffer, fortyndet i kolber med indhold af 20 ml YM og holdt under omrystning natten over. Derefter blev cellerne udplat-tet på YM og inkuberet ved 20°C. Kolonierne blev isoleret baseret på observerede forskelle i pigmentering, 20 idet man udvalgte kolonier, der var mørk rødligorange ved undersøgelse under dissektionsmikroskop, og udstrøg dem på skråstivnet substrat. Man benyttede tre dage gamle udstrygninger til at inokulere YM kolber. Herved benyttede man 1 ml YM medium til at suspendere indhol-25 det af skråkulturen, og man satte hele denne suspension til 250 ml kolber med indhold af 20 ml YM og holdt 0 indholdet under omrystning i 6 dage ved 20 C.

Morfologisk udvælgelse 30

Eksempel 3

Antimycinbehandllnq

Man udplattede eksponentielt voksende gærceller 35 af stamme ATCC 24230, enten NTG mutageniseret som beskrevet under trin 1(a) ovenfor eller ikke mutagenise- 22 DK 175123 B1 ret, på YM medium af indhold af 50 yM antimycin A (en blanding af antimycinerne Αχ og a3; sigma katalog nr.

2006) og inkuberede ved 20 C, indtil en koloni voksede.

Væksten varede ca. en måned. Efter to yderligere ugers 5 inkubering fremkom et rødt centrum i kolonien, hvorved denne kom til at ligne et spejlæg. Dette røde center blev isoleret i YM medium.

Eksempel 4 10

Behandling med tunicamycin

Man udvalgte tunicamycinmutanter, idet man ud-plattede en kultur i logaritmisk fase af stamme ATCC 24202 (naturlig forekommende) på en gradientplade af 15 GYE agar med 5 yg/ml tunicamycin. Kolonier, der voksede på disse plader, blev udstrøget på GYE agarplader med indhold af 5 og 8 yg/ml tunicamycin. Kolonier, der voksede på disse sekundære plader, blev analyseret for pigment. Kontrollen indeholdt 270 yg/g sammenlignet med 20 610 yg/g for 8 yg/ml tunicamycinresistent mutant.

Eksempel 5

Behandling med nystatin 25 Man isolerede nystatinmutanter ved at inokulere YM kulturer i logaritmisk fase af stamme ATCC 24202 i YM kolber med indhold af 3 og 5 yg/ml nystatin. Efter 48 timer udplattede man disse udvælgelseskulturer på antibiotiske plader med indhold af YM agar med nystatin 30 (3 og 5 yg/ml). De opnåede kolonier blev analyseret for pigment. Kontrollen indeholdt 280 yg/g sammenlignet med 400 pg/g for nystatinmutanten med det højeste indhold.

35

DK 175123 B1 I

23 I

Eksempel 6 I

Behandling med mevalonsyre I

Man mutageniserede stamme ATCC 24202 med NTG til I

5 50% overlevelse og udplattede på YM medium. Man udplat- I

tede kolonierne tilfældigt på YM agar med indhold af 5 I

mM mevalonsyrelacton. Alle disse kolonier blev derefter I

overført til et medium, der først indeholdt 10 og de- I

refter 25 mM mevalonsyrelacton. Kolonier, der voksede I

10 på 25 mM mevalonsyrelacton, blev analyseret for pigment. I

I Kontrollen indeholdt 275 pg/g sammenlignet med 540 pg/g I

I for en mutant, der var resistent for 25 mM mevalonsyre- I

I lacton. I

I 15 Carotenoid ekstraktion og analyse I

I Man kan analysere kolonier for pigmentindhold på I

I følgende måde. I

I Efter indhøstning fra 30 ml dyrkningsmedium va- I

I sker man cellerne med vand og udsuspenderer dem i 30 ml I

I 20 vand. Den optiske densitet måles for at bestemme I væksten. Omtrent 13 ml af suspensionen brydes med 0,5 I mm glasperler i 3-4 minutter under afkøling i en Bead I Beater (Bio Spec Products, Bartlesville, OK). Efter I brud udhælder man blandingen af glasperler og celler i I 25 et bæger og ekstraherer den 5 gange med 10 ml portioner I af acetone. Acetoneekstrakterne samlet og centrifugeres I ved 15.000 o/m i 45 minutter. Den klare acetonesuperna- I tant hældes fra cellebundfaldet; hvis bundfaldet inde- I holder rester af pigment, knuses det manuelt med en I 30 glashomogenisator og ekstraheres igen med acetone.

I De kombinerede acetoneekstrakter anbringes i en I skilletragt, og man tilsætter ca. 10 ml petroleumsether I samt nogle få ml af en mættet NaCl opløsning for at I bryde emulsionen. Man samler petroleumsetherekstrakter- I 35 ne og ekstraherer igen acetonelaget. Petroleumsether- I ekstrakterne samles og filtreres gennem glasuld for at DK 175123 B1 24 fjerne lipid-småkugler og andre partikler. Man optager absorbansspektret (maksimalt absorbans af transasta-xanthin i petroleumsether er 474 nm). Den totale caro-tenoidsammensætning beregnes under anvendelse af 1% ek-5 stinktionskoefficient = 2100 ved hjælp af formlen:

Total carotenoid (pg/g gær) = (ml petroleumsether) (absorbans 474 nm) (100) (21) (tørstofvægt af gær, g) 10

Man kan analysere for enkelte carotenoider ved tyndtlagskromatografi (TLC) og elektroniske absorptionsspektre. Til fremstilling af carotenoidekstrakter til analyse tørrer man petroleumsetherekstrakter over 15 vandfri Na2S04 og indkoncentrerer ved fordampning i en nitrogenstrøm. Disse kromatograferes ved TLC på silica-gelplader (silicagel 60, 5 x 20 dm, 0,25 mm tykkelse, E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland) under anvendelse af 20% acetone/80% petroleumsether. Efter fremkaldelse ud-20 skraber man båndene og eluerer dem i acetone gennem en pasteurpipette lukket med glasuld. Man benytter absor-bansmaksima, Rf-værdier og cokromatografi med standarder til identificering af pigmenterne. Synlige absorptionsspektre optages i acetone eller petroleumsether på 25 et Gilford Response spektrofotometer, og man beregner koncentrationer af carotenoider under anvendelse af de specifikke absorptionskoefficienter, der ses hos Davies, Carotenoids, side 38-165 i Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, bind 2, T.W. Goodwin 30 (editor), Academic Press, London (1976).

DK 175123 B1 I

25 I

Fermentering i laboratorieskala I

Eksempel 7 I

Dyrkning af en pigmentproducerende mutant i en I

5 10 1 laboratoriefermenteringsbeholder illustreres af I

følgende fremgangsmåde: I

Man benyttede 20 ml frosset Phaffia rhodozyma I

stamme IGI-887J1 (en efterkommer af en omhandlet stam- I

me, se fig. 1 og ledsagende tekst) til at inokulere 300 I

10 ml af et medium omfattende 3% glucose, 1% gærekstrakt I

og 0,1% caseinhydrolysat. Mediet blev steriliseret ved I

121 C og 15 psi i ca. 20 minutter før inokuleringen.

Man rystede det inokulerede medium i ca. 48 timer ved I

en temperatur på 20 C på en roterende ryster med 2,5 cm

15 slaglængde og en rotationshastighed på 250 o/m. Man be- I

nyttede de 300 ml celleurt til at inokulere en 5 1 po- I

defermenteringsbeholder med indhold af 3 1 steriliseret I

podemedium med følgende sammensætning pr. 1: I

20 Ammoniumsulfat 5,0 g I

Kaliumphosphat,monobasisk 1,5 g I

Magnesiumsulfat,heptahydrat 1,5 g. I

Calciumchlorid,dihydrat 0,1 g I

Gæresktrakt 6,0 g I

25 Vitaminblanding 2 ml I

Blanding af sporelementer 1 ml I

Vitaminblandingen bestod af følgende ingredien- I ser: I . 30 DK 175123 B1 26

Biotin 0,08 g

Inositol 5,00 g

Thiamin 5,00 g

Calciumpantothenat 2,00 g 5 Pyroxidin,HCl 2,25 g

Vand, q.s. til opnåelse af 1 1

Blandingen af sporelementer består af følgende ingredienser: 10 1) FeCl3,gH20 3 g 2) Na2Mo04,2H20 2 g 3) ZnS04,7H20 8 g

MnS04,H20 3 g 15 CuS04,5H20 6 g

Vand, q.s. op til 1 1

Efter inokuleringen førte man i små portioner en 70% cereloseopløsning til fermenteringsbeholderen, idet 20 man holdt den specifikke væksthastighed af cellerne ved ca. u=0,15. Man holdt fermenteringsbeholderen på en 0 temperatur på 20 C og kontrollerede pH til en værdi på 5 med 8N KOH. Omrøringen var 900 o/m og beluftningen var på 1,5 v/v/m. Når ODggQ {optisk densitet) havde nå-25 et en værdi på ca. 30, benyttede man 1 1 af urten til at inokulere en 15 1 fermenteringsbeholder med indhold af 10 1 produktionsmedium.

Sammensætningen af produktionsmediet var den samme som podemediet, idet dog: (1) man forøgede ind- 30 holdet af ammoniumsulfat til 16 g/1, og (2) man tilsatte 1 g/1 mononatriumglutamat og 5 g/1 majsstøbevæske. Temperaturen i fermenteringsbeholderen blev holdt ved 20°C, og man opretholdt en pH værdi på 5 med 8N KOH. Omrøring og beluftning var henholdsvis 900 o/m og 1,5 35 v/v/m. Man førte i små portioner ca. 2 1 70% cerelose til gæringsbeholderen, idet man holdt den specifikke DK 175123 B1 27 væksthastighed for cellerne under 0,15. Ved afslutningen af fermenteringen (efter c. 60 timer) indeholdt cellerne ca. 1100 yg/g astaxanthin.

5 Fermentering i større skala

Eksempel β

Dyrkning af en pigmentproducerende mutant i pilot plant skala illustreres ved følgende procedure.

10 Man benyttede 20 ml frossen rhodozyma stamme IGI 188JB1 (se fig. 1 og ledsagende tekst) til at in-okulere 300 ml vækstmedium, idet sammensætningen af mediet og dyrkningsbetingelserne var de samme som i eksempel l. Efter 48 timers forløb benyttede man de 300 ml 15 celleurt til at inokulere den første podefermenteringsbeholder, der indeholdt 3 1 af et steriliseret første podemedium med følgende sammensætning pr. liter:

Ammoniumsulfat 4 g 20 Kaliumphosphat,monobasisk 1,5 g

Magnesiumsulfat,heptahydrat 1,5 g

Calciumchlorid,dihydrat 0,1 g Gærekstrakt 4,0 g

Majsstøbevæske 10,0 g 25 Vitaminblanding* 2 ml

Sporelementblanding* 1 ml * som i eksempel 1.

Man satte aseptisk 90 g steriliseret cerelose 30 til fermenteringsbeholderen efter inokulering. Fermenteringsbeholderen blev holdt ved 21°C, pH blev kontrolleret til en værdi på 5 med 8N XOH, omrøringen var 900 o/m og beluftningen var 1,5 v/v/m. Efter at den oprindelige cerelose var brugt op, tilførte man i små por-35 tioner en steriliseret 70% cereloseopløsning til fermenteringsbeholderen. Man holdt den specifikke vækst- 28

I f V IfrV W I

rate af cellerne kontrolleret ved ca. 0,1. ved en cellevækst svarende til en OD på ca. 20 benyttede man de 3 1 celleurt til at inokulere en 30 1 fermenteringsbeholder med indhold af 20 1 steriliseret 2. trins podeme-5 dium.

Sammensætning af 2. trins podemedium var den samme som 1. trins podemedium. Dyrkningsbetingelserne var også de samme, idet man dog benyttede en langsommere omrøring, 300 o/m. Efter opbrug af den oprindelige 10 cerelose førte man i små portioner en steriliseret opløsning af 70% cerelose og 7% ammoniumsulfat til fermenteringsbeholderen, indtil man nåede en værdi for OD på ca. 30. Den specifikke vækstrate fra cellerne blev kontrolleret til ca. 0,1. Den anden podning blev benyt-15 tet til at inokulere en 250 1 fermenteringsbeholder med indhold af 170 1 steriliseret produktionsmedium.

Bortset fra en højere koncentration af majsstøbevæske (12 g/1) var sammensætningen af produktionsmediet det samme som i podemediet i første trin. Tem-

O

20 peraturen blev holdt ved 21 C, og pH blev holdt på 5 ved hjælp af 8N KOH. Man forøgede beluftningen på 250 1/min. i de første 15 timer til 300 1/min. En omrøring på 150 o/m i de første 15 timer blev forøget til 200 o/m. Man tilførte i små portioner en steriliseret op-25 løsning af 70% cerelose, 7% ammoniumsulfat til fermenteringsbeholderen og kontrollerede den specifikke vækstrate af cellen til ca. 0,1. Efter tilførsel af 30 kg cerelose til fermenteringsbeholderen indhøstede man cellerne. Cellerne indeholdt ca. 1000 pg/g astaxanthin.

30

Phaffia som foder og som plgmentkilde

Man kan sprænge eller bryde de indhøstede celler under anvendelse af mekanisme eller enzymatiske midler eller af en kombination deraf og ifølge opfindelsen be-35 nytte dem i foder til salmonider etc. som en del af den totale ernæring. For at forøge stabiliteten af astaxan- DK 175123 B1 29 thin i de sprængte eller brudte gærceller mod varme og luft er det foretrukket at tilvejebringe en beskyttende matrix eller et overtræk, som normalt benyttes indenfor foder, f.eks. en naturlig gummiart.

5 Eksempler, hvori P. rhodozyma benyttes som fo dersupplement for regnbueørreder (Salmo qairdnerl), amerikanske hummere, Coturnix vagtler og æglæggende høns, diskuteres i en afhandling af en af opfinderne Johnson, benævnt "Astaxanthin Production by the Animal 10 Feeding", magistergrad, University of Calfornia, Davis (1976).

Som en konsekvens af det højere astaxanthinind-hold pr. enhed celler på tørstofbasis af gæren ifølge opfindelsen, kan man i væsentlig grad reducere mængden 15 af gær, der skal anvendes for at inducere pigmente-ring.

Claims (5)

1. Pigmentproducerende mutant af gæren Phaffia 5 rhodozyma, kendetegnet ved, at den kan opnås ud fra naturligt forekommende Phaffia rhodozyma eller en mutant af naturligt forekommende Phaffia rhodozyma ved en eller flere morfologiske udvælgelser i et medium indeholdende et antibiotisk udvælgelsesmiddel eller en 10 inhibitor for terpenoidsyntesevejen, eventuelt kombineret med mutation af den fremkomne gærmutant med et mu-teringsmiddel, og at den producerer mere end 700 ug astaxanthin pr. g gærtørstof efter seks dages dyrkning i YM-medium, hvorved astaxanthinindholdet bestemmes ved 15 måling af absorbansen ved 474 nm under anvendelse af værdien 2100 for 1% (w/v) ekstintionskoefficienten i en centimeterkuvette.

2. Gærmutant ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den er IGI-8870JO, der i forhold til na- 20 turligt forekommende Phaffia rhodozyma har en forøget pigmentering, vokser langsommere på nitrogenkilderne ammoniumglutamat og glutamin, har en forøget følsomhed mod respirationsinhibitoren antimycin, idet LDjq for antimycin på YM agar er ca. 18 μΜ, men kun ringe forø- 25 get eller uændret følsomhed mod cyanid og azid, og at den kan fremstilles ved antimycinudvælgelse af naturligt forekommende Phaffia rhodozyma ATCC 24230.

3. Gærmutant ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den er IGI-887J2, der i forhold til na- 30 turligt forekommende Phaffia rhodozyma har en forøget pigmentering, vokser langsommere på nitrogenkilderne ammoniumglutamat og glutamin, ikke vokser på ethanol, har en forøget følsomhed mod respirationsinhibitoren antimycin, idet LD50 for antimycin på YM agar er ca. 3 35 μΜ, men kun ringe forøget eller uændret følsomhed mod cyanid og azid, og at den kan fremstilles ved nitroso- DK 175123 B1 31 guanidinmutation af gærmutanten ifølge krav 2.

4. Gærmutant ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at den under betingelser som defineret i krav 1 producerer mere end 900 yg astaxanthin/g gærtør- 5 stof, foretrukket mere end 1100 yg astaxanthin/g gærtørstof, mere foretrukket mere end 1400 yg astaxanthin/g gærtørstof og især mere end 1700 yg astaxanthin/g gærtørstof.

5. Anvendelse af en gærmutant ifølge krav. 1-4 på 10 brudt form i foderet til salmonider eller fjerkræ, til opnåelse af forøget pigmentering af kødet hos salmoni-derne, henholdsvis af kødet, skindet eller æggeblommen hos/fra fjerkræet. 15