NO300381B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en gjær med et forökt astaxanthininnhold, gjær med de identifiserende kjennetegn til Phaffia med ökt astaxanthininnhold, samt anvendelser av gjær erholdt ved fremgangsmåten - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Oppfinnelsen vedrører ett aspekt en fremgangsmåte for fremstilling av en gjær med et forøkt astaxanthininnhold. Ved et andre aspekt vedrører oppfinnelsen gjær med de identifiserende kjennetegn til Phaffia med økt astaxanthininnhold. Ved et tredje aspekt vedrører oppfinnelsen anvenddelser av en gjær erholdt ved fremgangsmåten, enten for fremstilling av astaxanthin eller i ødelagt form i for for å øke pigmenteringen hos laksefisker eller fjærkre.

. Oppfinnelsens bakgrunn

Det rødaktige karotenoidpigment astaxanthin finnes

i alminnelighet i naturen og vises tydelig frem av et stort antall dyr. Dyr som ikke er i stand til å syntetisere dette pigmentet, er avhengige av kostinntak av dette pigmentet eller en pigmentforløper.

Den røde hud- og kjøttfarge til naturlig forekommende laks og ørret skyldes hovedsakelig astaxanthin som vanligvis er til stede som et ubundet pigment i disse fiskene. I naturen forsyner marine zooplankton og nekton i kosten laks med deres karotenoidpigmenter.

På grunn av en mangel på kostastaxanthin er fisk oppdrettet i fiskefarmer eller utklekkingsanlegg, generelt lyse og mangler hud- og kjøttfargene som er karakteristiske for fisk som har vokst opp i sitt naturlige miljø. Hvorvidt karotenoidene er næringsmessig viktige i dyre- eller human-kosten, er ikke blitt bestemt, men pigmenter gjør visse matvarer attraktive. Det vil si at, ettersom fargen på en mat-vare ofte er en indikasjon på kvaliteten, er det en sterk forbrukerpreferanse for fisk med naturlig farge, selv om den lyse oppdrettsanleggproduserte fisk næringsmessig kan være identisk med de som har vokst opp i sitt naturlige miljø.

Det finnes også beviser for at astaxanthin eller dets forløper bidrar til den særegne smak av stekt laks.

Nylig økende bekymring over helserisikoer har resul-tert i et forbud mot forskjellige syntetiske fargestoffer som har et potensial for karsinogenisitet og/eller terato-genisitet. Gule og røde azofargestoffer som i stadig økende grad forbys til bruk i matvarer, erstattes med ikke-toksiske karotenoider. Karotenoidene er generelt ikke toksiske selv ved høye nivåer. Naturlig forekommende karotenoider er således det foretrukne pigment for farging av f.eks. laksefisker .

Tidligere er et stort antall undersøkelser blitt utført vedrørende karotenoidholdige krepsdyr eller bearbeid-ingsavfall fra krepsdyr i kosten til laksefisk. Den lyse farge til fisk produsert i fiskefarmer eller i utklekkingsanlegg, forbedres når fiskene fores med en kost supplert med store mengder tørkede, oppmalte hudskjelettrester fra krepsdyr. Krepsdyrskall har imidlertid svært lavt innhold av karotenoider og svært høyt innhold av mineraler, noe som uten grundig bearbeidelse for å forbedre kostholdskvali-teten, begrenser deres innlemmelse i laksefiskkost. Videre kan en tilfredsstillende farge utvikles på denne måte ved å f6re bare over lange tidsrom, og det er ønskelig, om ikke faktisk vesentlig i økonomisk henseende, å utvikle tilfredsstillende farger i løpet av svært korte tidsrom.

Det er kjent at astaxanthin per se kan tilsettes fiskefor for å forbedre fiskefarge. F.eks. beskrives i US patentskrift nr. 4.239.782 en fremgangsmåte for forbedring av fargen til fisk som omfatter å tilsette til fiske-foret et pigmenteringsmiddel slik som astaxanthin, og i tillegg begrensede mengder av hormonet testosteron, et hor-mon som virker som en katalysator i kombinasjon med et valgt pigmenteringsmiddel eller -midler, slik at fargen til fisken forsterkes.

De to viktigste kommersielle kildene for astaxanthin per se er ekstrakter fra krepsdyrskall og syntetiske kjemiske forbindelser. Det røde karotenoidpigment kan ekstraheres fra hudskjelettskallene fra krepsdyr og vev og gis, blandet med annet for i kostblandinger, til oppdrettsfisk, krepsdyr og visse fjærkre i store konsentrasjoner for å utvikle tilfredsstillende hud-, kjøtt-, ryggskjold- eller eggeplommepigmenteringer. Eksempler på fremgangsmåter for ekstraksjon av astaxanthin fra krepsdyrskall og -vevavfall er beskrevet f.eks. i US patentskrifter nr. 3.906.112 og 4.505.936.

I en artikkel i Journal of Food Science, volum 47

(1982), med tittelen "Extraction of Astaxanthin Pigment from Crawfish Waste Using a Soy Oil Process", er det beskrevet forskjellige ekstraksjonsteknikker. F.eks. oppmales helt krepsavfall, det fint oppdelte krepsavfall blandes med vann, pH reguleres med et alkali eller en syre, et enzym tilsettes til oppløsningen, og oppløsningen omrøres, oppvarmes og hydrolyseres. Etter hydrolyse ekstraheres astaxanthinet med olje, og den astaxanthin-anrikede olje utvinnes ved sentrifugering. Kostnaden av naturlige isolater av astaxanthin, spesielt fra krill og krepsskall, kan imidlertid beløpe seg til hva som helst fra 5.000 til 15.000 dollar pr. kilogram. En mindre kildeavhengig eller mer økonomisk fremgangsmåte for fremstilling av astaxanthin er åpenbart påkrevet.

Pigmentering av lakse- og ørretkjøtt er også blitt utført ved å bruke det syntetiske karotenoid kanthaxanthin som et foradditiv, men dette kjemikalium er ganske kostbart og er blitt rapportert å gi noe utilfredsstillende farge i laksefisker. Nyere arbeide innen kjemisk syntese av astaxanthin er eksemplifisert i US patentskrifter nr. 4.245.109, 4.283.559 og 4.585.885. Den nåværende pris for syntetisk astaxanthinpigment er omtrent 2.000 dollar pr. kg. Mange land forbyr imidlertid bruken av syntetiske karotenoider.

Astaxanthin er fortsatt en av de mest kostbare ingredienser som brukes i laksefor for merd-oppdrettet laks. Siden interessen for akvakultur, dvs. oppdrett av fisk, i den senere tid har eksplodert, har det kommersielle behov for en økonomisk astaxanthinkilde vokst proporsjonalt.

Pigmenteringen av eggeplommer hos fjærkre er også blitt undersøkt på grunn av den økonomiske viktighet av farge i kyllingeggplommer. Plommer med et høyt pigmentinnhold forlanges. Den vanligste pigmentkilde i kommersielle f6r har vært gul mais som gir de fremtredende egge-plommepigmentene kryptoxanthin, zeaxanthin og lutein. Slike korn med høyere energiinnhold som durra, hvete, ris og bygg, erstatter dessverre mais i kyllingkosten, med det med-følgende tap i pigmentering. Astaxanthin kan brukes som et fjærkreforsupplement for å øke plommepigmentering. Én fremgangsmåte som for tiden ikke anvendes kommersielt ved fremstilling av astaxanthin, er biosyntese, dvs. anvendelse av mikroorganismer for å syntetisere astaxanthin.

Som en mikrobiell kilde for astaxanthin er gjæren Phaffia rhodozyma kjent (Johnson, "Astaxanthin Production by the Yeast Phaffia rhodozyma and its use as a Pigment Source in Animal Feeding", Masters Thesis, University of California, Davis, 1976) . Gjær betraktes vanligvis å være et forstoff med høy næringsverdi og er ofte ønskelig i dyre-kost; tilleggsfordelen ved å inneholde astaxanthin tyder på at P. rhodozyma kan være et ideelt forsupplement for dyr som krever en kostkilde for dette pigmentet, f.eks. laksefisker, krepsdyr, eggleggende høner eller slike fugler som flamingoer.

Pigmentutbyttet fra naturlig forekommende P. rhodozyma er imidlertid bare i størrelsesorden 200-600 ppm/tørr-vekt gjær etter 6 dagers dyrking. Som en kilde for astaxanthin per se, er naturlig forekommende P. rhodozyma utilstrekkelig. Forsøk med å supplere kosten til visse fisk, krepsdyr og fjærkre med naturlig forekommende P. rhodozyma var noe oppløftende. I praksis avsvekker imidlertid det store volumet av P. rhodozyma som må tilsettes som et f6rsupplement for å oppnå tilfredsstillende pigmenteringsnivåer, den kommersielle egnethet av naturlig forekommende P. rhodozyma som en pigmentkilde.

Oppsummering av oppfinnelsen

Følgelig er det et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en økonomisk fremgangsmåte for fremstilling av en gjær med forøkt astaxanthininnhold. Et annet formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe gjær med de identifiserende kjennetegn til Phaffia med økt astaxanthininnhold.

Det er således ved foreliggende oppfinnelse tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av en gjær med et for-økt astaxanthininnhold, kjennetegnet ved at en mikroorganisme av slekten Phaffia dyrkes i et næringsmedium som inneholder et antibiotikum, en inhibitor for cytokrom B, en inhibitor for terpenoidsyntesesporet eller en inhibitor for hovedrespirasjonssporet under en påvirkning som utJ-øser et sekundært re-spiras jonsspor (oxydativt), eller erholdt gjær dyrkes i nærvær av en inhibitor for hovedrespirasjonssporet og i nærvær av et middel eller under påvirkning av en miljømessig betingelse som utløser et sekundært respirasjonsspor (oxydativt), eller et alternativt oxydasesystem induseres ved hjelp av dyrking av gjæren i nærvær av en inhibitor for hovedrespirasjonssporet og i nærvær av et middel eller under påvirkning av en miljømessig betingelse som utløser et sekundært respirasjonsspor, idet mikroorganismen utsettes for mutagenese enten før, etter eller før og etter morfologisk utvelgelse.

Videre er det tilveiebrakt gjær med de identifiserende kjennetegn til Phaffia med økt astaxanthininnhold, kjennetegnet ved at gjæren er blitt erholdt ved minst ett trinn med morfologisk utvelgelse av naturlig forekommende Phaffia dyrket som angitt ved fremgangsmåten ifølge kravene 1-7, eller av en mutant av naturlig forekommende Phaffia dyrket som angitt ved fremgangsmåten ifølge kravene 1-7.

Endelig er det ved foreliggende oppfinnelse tilveiebrakt en anvendelse av en gjær erholdt ved fremgangsmåten ifølge krav 1 i ødelagt form i for til å øke pigmenteringen i kjøttet til laksefisker eller i huden, kjøttet eller eggeplom-men til fjærkre, samt en anvendelse av gjær erholdt ved fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstilling av astaxanthin ved at en mikroroganisme av slekten Phaffia dyrkes én eller flere ganger i et næringsmedium som inneholder et antibiotikum, en inhibitor for cytokrom B eller en inhibitor for terpenoidsyntesesporet, idet mikroorganismen utsettes for minst én mutasjon enten før eller etter en av dyrkingene i næringsmediet som inneholder et antibiotikum, en inhibitor for cytokrom B eller en inhibitor for terpenoidsyntesesporet, overlevende mikroorganismer som oppviser forøkt pigmentering, dyrkes, den dyrkede gjær innhøstes og astaxanthinet ekstraheres.

Nøkkeltrinnet i stammeutvikling er det morfologiske utvelgelsestrinn. Det er ingen grense for de mulige kom-binasjoner av rekkefølge og type av mutasjon og utvelgelse ved hjelp av antibiotikum, en inhibitor mot cytokrom B eller terpenoidinhibitor som P. rhodozyma kan underkastes innenfor foreliggende oppfinnelse. Nyere resultater bekrefter reproduserbarheten av denne teknikk.

Beslektede formål og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil bli tydeligere under henvisning til figurene

og den nærmere beskrivelse nedenunder.

Kort beskrivelse av figurene

Fremgangsmåten og apparatet ifølge foreliggende oppfinnelse vil bli beskrevet under henvisning til de ledsagende tegninger hvor: Figur 1 viser den kjemiske struktur og slektsskap mellom forskjellige pigmenter og mellomprodukter som finnes i P. rhodozyma. Figur 2 er et flytskjema som viser foretrukne rekke-følger for mutantisoleringer i P. rhodozyma. Figur 3 er et mikropiktografi som viser fremkomsten av avvekslende kolonier.

Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen

Under en ekspedisjon i 19 6 7 med det formål å under-søke gjærflora forbundet med trær på de største japanske øyene og i den nordvestlige delen av Stillehavet, ble en egenartet astaxanthin-syntetiserende organisme isolert fra slimutsondringer fra forskjellige bredbladede trær (Phaff

et al., "A comparative study of the yeast florae associated

with trees on the Japanese Islands and on the west coast of North America", Proe. IV: Ferment. Technol. Today, (1972), s. 759-774). Denne organisme, nå kjent som Phaffia rhodozyma, ble påvist å ha evne til å fremstille karotenoidpigmenter og fermentere flere sukkerarter.

Phaffia er blitt tildelt en slekt på grunn av dens enestående karakteristika som omfatter dens evne til å fermentere glucose og andre sukkere (sammenlignet med andre karotenoiddannende gjær som alle er strengt aerobe), dens syntese av astaxanthin som dens hovedkarotenoid, dens knopp-dannelsemåte, det at den har visse metabolske egenskaper slik som evne til å bruke urea som er mindre vanlig hos ascomycetes-gjær, og dens celleveggsammensetning. P. rhodozyma som er den eneste art innen denne slekt, reproduseres utelukkende ved knoppdannelse, og en undersøkelse av denne vegetative reproduksjonsmåte ved hjelp av scanning-elektronmikroskopi avslører at gjæren danner knopper gjentatte ganger fra den samme side, noe som fører til dannelsen av celleveggen med flere lag.

Andre kjennetegn for Phaffia omfatter dens dannelse av chlamydosporer, dens moll G+C-innhold på 48,3%, dens evne til å spalte urea ved hjelp av urease og dens åpen-bare mangel på et perfekt stadium. Dens egenskaper tyder på at gjæren har basidiomycetes-affinitet. Forsøk på å finne den seksuelle syklus til Phaffia har alle mislyktes.

Andrewes et al. fant, som rapportert i "Carotenoids of Phaffia rhodozyma, a red pigmented fermenting yeast", Phytochem., vol. 15, (1976), s. 1003-1007, at karotenoidene i P. rhodozyma er uvanlige. Pigmenter og pigmentmellom-produkter funnet av Andrewes i naturlig forekommende P. rhodozyma, er vist i figur 1 hvor (A) er echinenon, (B) er 3-hydroxyechinenon, (C) er fenicoxanthin og (D) er astaxanthin. Astaxanthin ble funnet å være hovedpigmentet syntetisert av denne gjæren; i den naturlig forekommende gjær utgjorde det omtrent 85% av karotenoidblandingen.

Selv om karotenoid i de fleste plante- og dyrekilder lett kan ekstraheres med vannblandbare oppløsningsmidler,

er gjærene godt kjent for den faste binding av pigmentene.

Astaxanthin er fast bundet til gjærcellen og lar seg ikke ekstrahere ved hjelp av lipidoppløsningsmidler med mindre strukturen til gjærcellen først endres.

Den mest kvantitative metode for ekstraksjon omfatter mekanisk oppbrytning av gjærcellene, slik som i en fransk presse (Simpson et al., "Modified French press for the disruption of microorganisms", J. Bact., vol. 86, (1963), s. 1126-1127) eller i en Braun homogenisator (Bae et al., "The occurrence of plectaniaxanthin in Cryptococcus laurentii", Phytochem., vol. 10, (1970), s. 625-629), og så ekstrahere cellene med oppløsningsmidler. Disse metodene brukes rutinemessig for beregning av astaxanthinkonsentra-s jon.

Behovet for storskalautvinningen av astaxanthin førte til utviklingen av en enzymatisk ekstraksjonsfrem-gangsmåte. Ved fremgangsmåten ble det benyttet ekstra-cellulære lytiske enzymer produsert av bakterien Bacillus circulans WL-12 som delvis oppløste gjærcelleveggen og gjorde karotenoidpigmentene ekstraherbare med lipidoppløs-ningsmidler. Fullstendig ekstraksjon av astaxanthin fra varmedrepte P. rhodozyma-celler ble oppnådd etter dyrking av B. circulans WL-12 på disse gjærcellene i 26 timer og så ekstrahere gjær-bakterieblandingen med aceton.

Et bakteriefritt lytisk system som ga kvantitativ ekstraksjon av astaxanthin fra P. rhodozyma, ble erholdt ved å oppkonsentrere dyrkingsvæsken fra dyrkingen av B. circulans WL-12 på P. rhodozyma-celler. B. circulans WL-12 dyrkes fortrinnsvis på et medium som inneholder

P. rhodozyma-celler. Det lytiske system ble funnet å virke mest effektivt ved pH 6,5 og med lave konsentrasjoner av gjær.

Generelt har næring og miljø en virkning på karo-tenoidutbyttet i forskjellige karotenoidproduserende mikroorganismer. Forbedring av karotenoiddannelse i fermenter-inger i komplekse medier er det gitt en oversikt over i (Hanson, "Microbial production of pigments and vitamins",

i Microbial Technology, redigert av H.J. Peppler, Reinhold,

New York, (1967), s. 222-250).

Karotenoider er tetraterpener, og deres grunnleggende syntesespor er likt med syntesesporet til andre ter-penoider. Acetyl-CoA er den første forløper, og den første spesifikke terpenoidforbindelse er mevalonsyre (Schopfer et al., "Sur la biosynthése du 3-caroténe par Phycomyes cultivé sur un mileu contenant de 1 acétate de sodium comme unique source de carbone", Experientia, vol. 8, (1952),

s. 140). Isopentenylpyrofosfat er den grunnleggende for-løper hvorfra karotenoider avledes (se Goodwin, "Biosynthesis", Carotenoids, red. 0. Isler, Basel, Birkhauser,

(1971), s. 577-636; Britton, "Biosynthesis of Carotenoids",

i Chemistry and biochemistry of plant pigments, vol. 1,

(1976) , s. 262-327).

De fleste tidligere arbeider med P. rhodozyma er blitt gjort med typestammen nr. 67-210. Visuell undersøk-else av unge kolonier av flere ytterligere naturlige isolater (UCD-FST nr. 67-202, 67-203, 67-210, 67-383, 67-385

og 68-653C) indikerte at 67-210 og 67-385 (American Type Culture Collection, hhv. ATCC nr. 24202 og 24230) var de mest høypigmenterte stammer. Kvantitativ bestemmelse av astaxanthin-innhold i disse to stammene etter 5 dagers vekst i YM-næringsvæske indikerte at 67-385 inneholdt ca. 450 ug/g tørrgjær sammenlignet med ca. 295 ug/g i 67-210. 67-385 ble primært anvendt av oppfinnerne til stammeutvikling på grunn av dens høyere naturlige astaxanthin-innhold.

Som et resultat av en serie forsøk utformet for å bestemme de optimale dyrkingsbetingelser for vekst og pigmentering av P. rhodozyma, ble det funnet at astaxanthin-biosyntese oppsto maksimalt under den eksponensielle vekst-fase. Pigmentutbyttet i dyrkingsmediet ble funnet å være avhengig ikke bare av cellekonsentrasjon, men ble påvirket av dyrkingsbetingelsene. Den optimale pH for astaxanthinproduksjon ble funnet å være 5,0 i rystekolber. Ved de andre pH-verdiene som ble testet, forble imidlertid konsentrasjonen av astaxanthin i P. rhodozyma forholdsvis konstant.

Dyrkingstemperaturen ble funnet å påvirke veksthastigheten til P. rhodozyma, men ikke akkumuleringen av astaxanthin i gjærcellen. Virkningene av lys påvirket heller ikke karotenogenesen i P. rhodozyma, selv om cellene dyrket under høy lysstyrke syntes å ha en mer rødlig nyanse, noe som kan skyldes forskjellige konsentrasjoner av bestemte karotenoider.

Det ble funnet at en lav glucosekonsentrasjon og

høy lufttilførsel effektivt fremmet astaxanthinproduksjon med P. rhodozyma. Konsentrasjonen av astaxanthin i den røde gjær avtok betydelig dersom lufttilførselen var under 20 mmol/time eller glucosekonsentrasjonen var over 4% vekt/volum. Astaxanthin var imidlertid fortsatt det domin-erende pigment i gjær dyrket under begge disse betingelsene. Dersom virkningene av lav lufttilførsel og høy glucose-konsentras jon ble kombinert, ble imidlertid astaxanthin-konsentrasjonen i P. rhodozyma redusert til svært lave nivåer, og dannelsen av 3-zeakaroten oppsto. Under disse ugunstige betingelser ble igjen astaxanthin ikke effektivt dannet fra karotenene.

Ved dyrking på carbonforbindelser som undertrykket ethanolproduksjon i denne gjæren (f.eks. cellobiose), var utbyttene av astaxanthin forholdsvis høye. Dersom det ble dyrket på carbonkilder som antagelig fremmet ethanolproduksjon (f.eks. høyt innhold av glucose), var astaxanthin-utbyttene forholdsvis lave. Carbonforbindelser metabolisert via pentose-fosfat-sporet (f.eks. xylose), fremmet ikke karotenogenese effektivt.

Til tross for omfattende forsøk med optimaliseringer av næringsmedium og omgivelsesbetingelser på naturlig forekommende stammer av P. rhodozyma ble det ikke oppnådd noen dramatisk økning i pigmentinnhold. Oppfinnerne konkluderte med at manipulasjon av de ovenfor nevnte faktorer alene ikke kan være tilstrekkelig til å indusere økning i astaxanthin-innhold i P. rhodozyma til det omfang som er nødven-dig for å gjøre biosyntese kommersielt gjennomførbar.

Med det formål å isolere en ny genetisk mutant av

P. rhodozyma med evne til økt astaxanthinproduksjon, ble P. rhodozyma gjort til gjenstand for mutagenese. Resultatene var imidlertid ikke konsekvente, antagelig på grunn av til-feldigheten ved og den ikke-styrte natur av mutasjon.

F.eks. var forsøk på å isolere høypigmenterte varianter ikke vellykket etter screening av flere tusen kolonier etter UV-eksponering. De fleste UV-genererte mutanter var betydelig redusert med hensyn på astaxanthin-innhold og var svært lyse.

Muligheten for ytterligere fremskritt når det gjelder forbedring i astaxanthin-innhold i P. rhodozyma ved hjelp av vanlige mutasjonsteknikker synes å være begrenset. Dette skyldes at mikroorganismer har stramme genetiske regulator-kontroller over biosyntesen av sine cellulære bestanddeler slik at de er tilbøyelige til ikke å overprodusere unød-vendige cellebestanddeler. Ettersom biosyntesen av pigment, slik som astaxanthin, åpenbart er stramt regulert hos enhver bestemt stamme av gjærceller, er sjansene for å frembringe en levedyktig, ikke-arvelig genetisk endring for fremstilling av kolonier med evne til økt astaxanthinproduksjon,

ved ikke-styrt mutagenese, sannsynligvis svært små.

Ettersom screening av kolonier etter mutagenese

var forholdsvis mislykket, prøvde oppfinnerne å utvikle utvelgelsesfremgangsmåter for astaxanthin-overproduksjon. Fordi astaxanthindannelse reduseres ved høye konsentrasjoner av glucose, prøvde oppfinnerne 2-deoxyglucose som et selek-tivt middel for isolering av glucoseresistente stammer hvor katabolittundertrykkelsen kan være opphevet, og som igjen kan oppvise forøkt pigmentbiosyntese. Selv om noen stammer generert ved hjelp av denne selektive fremgangsmåte ble endret med hensyn på pigmentering, var mange svært ustabile, og ingen fikk økt astaxanthinkonsentrasjon mer enn to ganger over den naturlig forekommende opphavsstamme.

Inhibitorer for sterolbiosyntese inkludert keto-konazol og mikonazol, ble inkorporert i agar med gjær-maltekstrakt-medium, noe som resulterte i betydelig dreping av P. rhodozyma. Screening av flere tusen overlevende ga imidlertid ikke høypigmenterte gjærstammer. Flere andre forbindelser testet, inkludert nikotin (1 mM), imidazol

(4 mM), 2-methylimidazol (1 mM) og morfolin (10 mM), endret

ikke visuelt fargen til koloniene, men forstyrret veksten, noe som tyder på en endring i karotenoidsammensetning. Ettersom disse variantene imidlertid ikke fikk økt astaxanthin-innhold, ble det ikke utført noen ytterligere analyse vedrørende endringene i pigmentsammensetninger.

Oppfinnerne prøvde også å behandle P. rhodozyma med flere inhibitorer for elektrontransport, inkludert thenoyl-trifluoraceton (TTFA), antimycin A og natriumcyanid. Naturlig forekommende P. rhodozyma ble i det vesentlige drept ved lave konsentrasjoner av antimycin A og TTFA, men ble funnet å være forholdsvis ufølsom overfor cyanid og azid.

Som et resultat av grundige forsøk, delvis omtalt ovenfor, gjorde oppfinnerne en overraskende oppdagelse av en fremgangsmåte hvorved det kan fremstilles kolonier av P. rhodozyma som er kjennetegnet ved et høyt astaxanthin-innhold. P. rhodozyma fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er ikke-tilbakefallende, astaxanthinet er til stede i gjæren i en tilstrekkelig høy konsentrasjon til å være et mer effektivtkostf6r og pigment-supplement enn naturlig forekommende P. rhodozyma, og det kan erholdes kolonier av gjæren som er i stand til å produsere astaxanthin i tilstrekkelige mengder til å gjøre astaxanthinfermentering til en kommersielt mulig fremgangsmåte for fremstilling av astaxanthin.

Nærmere bestemt har oppfinnerne oppdaget at ved å underkaste en naturlig forekommende eller mutert stamme av P. rhodozyma dyrking i nærvær av en inhibitor for det metabolske spor, særlig en inhibitor for hoved-respirasjonssporet, i nærvær av en slik påvirkning som et middel eller en miljømessig betingelse som utløser et sekundært respirasjonsspor, eller morfologisk utvelgelse under anvendelse av et utvelgende middel, og særlig et antibiotikum, en inhibitor for cytokrom B eller en inhibitor for terpenoidsyntesespor som et utvelgende middel, finner det sted en styrt og spesifikk utvelgelse av høypigmentert P. rhodozyma. F.eks. ga utplating av den rosa gjær, P. rhodozyma, på agar som inneholder et antibiotikum, en inhibitor for cytokrom B eller en inhibitor for terpenoidsyntesespor, opphav til kolonier med uvanlig morfologi kjennetegnet ved en ikke-pigmentert nedre glatt overflate som utviklet høypigmenterte, vertikale papiller etter 1-2 måneder. Isolering og rensing av papillene etterfulgt av testing med hensyn på pigmentering i rystekolber viste at flere mutanter fikk økt astaxanthin-innholdet med 3 til 6 ganger sammenlignet med det naturlige opphavsisolat.

En av de utvalgte etterkommere (IGI-887JO, se

figur 2 og ledsagende tekst) ble karakterisert fysiologisk. Mutanten vokste saktere på forskjellige nitrogenkilder og hadde lavere celleutbytter på flere carbonkilder. Den opp-viste forøkte følsomheter overfor respirasjonsinhibitorene, slik som antimycin A og TTFA, men adskilte seg ikke fra det naturlige isolat når det gjelder følsomhet overfor cyanid eller azid. Den var mer følsom overfor dreping med hydrogenperoxyd. Analyse av karotenoidene ved tynnskikts-kromatografi viste to ukjente karotenoider som ikke er til stede i opphavet, samt en økt akkumulering av karotener og cis-astaxanthin.

Antibiotiske utvelgelsesmidler omfatter f.eks. ett eller flere av antimycin, tunicamycin og nystatin. Antimycin kan også klassifiseres som en elektrontransportinhibitor eller en inhibitor for cytokrom B. Andre inhibitorer for cytokrom B som øker pigmentering av utvalgt opphav, omfatter f.eks. 2-n-heptyl-4-hydroxy-kinolin-N-oxyd (HOQNO). Inhibitorer for terpenoidsyntesesporet omfatter f.eks. mevalonsyrelakton som generelt kan henvises til som en metabolsk inhibitor, og som er et eksempel på en sterolinhibitor.

Konsentrasjoner av utvelgelsesmidler, f.eks. antimycin, varierer fortrinnsvis fra 1 til 100 uM på plater med gjær-maltekstraktmedium (YM), mer foretrukket 30-80 uM, og er for generering av de mest utpregede kolonier, omtrent 50 uM.

Effekten av antibiotikumet, inhbitoren for cytokrom B eller inhibitoren for terpenoidsyntesesporet på

P. rhodozyma, er overraskende, og den spesifikke, underliggende mekanisme er ennå ikke blitt belyst. Det er overraskende at P. rhodozyma som underkastes utvelgelse ved hjelp av antibiotikum, inhibitor for cytokrom B eller inhibitor for terpenoidsyntesesporet, gir kolonier med høyere pigmentinnhold, mens forsøk utført med andre midler, slik som res-piras jonsinhibitorer inkludert KCN, rotenon, TTFA og andre, ikke synes å innvirke signifikant på pigmentering av P. rhodozyma på YM-plater eller på flytende vekstmedier.

Oppfinnerne har utviklet en hypotese som kan gi en mulig forklaring på effekten av antimycin på P. rhodozyma, men denne hypotese er spekulativ og bør ikke fortolkes til å gi omfanget av oppfinnelsen.

Oppfinnerne mistenker at ettersom ringlukking og hydroxylering kan avhenge av cytokrom P450 som oppstår i sterolsyntese, og ettersom en inhibitor for cytokrom B, slik som antimycin, reagerer med cytokrom B som er det samme cytokrom som reduserer cyt. P450, skyldes kanskje den økte pigmentering i antimycinmutantene den endrede cyt. P450-funksjon eller -aktivitet. Dessuten er dette molekylet kjent for å inaktivere glutaminsyntetase, og dette kan være grunnen til en observert nedsettelse av nitrogenkatabolisme. En ytterligere omtale av hypotesen kan finnes i An et al., "Isolation of Phaffia rhodozyma, Mutants with Increased Astaxanthin Content", Applied and Environmental Microbiology, januar 1989, s. 116-124, American Society for Microbiology.

Nyere resultater bekrefter at denne teknikken kan virke gjentatte ganger med P. rhodozyma.

De naturlig forekommende gjærceller eller gjærcellene som er utvalgt ved hjelp av antibiotikum, inhibitor for cytokrom B eller inhibitor for terpenoidsyntesesporet, kan i tillegg eksponeres mot et mutagen før, etter eller før og etter utvelgelse, eller i hvilket som helst ønsket antall eller kombinasjon av mutasjons- og utvelgelsestrinn, så lenge utvelgelsen ved hjelp av antibiotikum, inhibitor for cytokrom B eller terpenoidsyntesesporinhibitoren er tatt med i protokollen.

Mutagener eller mutagene midler kan velges fra et stort antall forskjellige kjemikalier eller andre eksponer-ingsmidler, og er fortrinnsvis tilstrekkelig sterke til å forårsake produksjon av ikke-tilbakevendbare mutasjoner. Mutanter hvor ingen degenerering er blitt observert, er svært ønskelige for industrielle anvendelser. Sterke mutagener omfatter ethylmethansulfonat, nitrosoguanidin (Ki-me thyl-N-ni tr o-N-ni tro soguanidin) , salpetersyrling (selv om forholdsvis store mengder kan være påkrevet), ultrafiolett bestråling i betydelige mengder, røntgen og andre.

For tiden er nitrosoguanidin og UV foretrukket på grunn av deres lette tilgjengelighet, deres forholdsvis sterke mutagene natur og deres forholdsvis lette og sikre håndtering. Ethvert sterkt mutagen kan imidlertid anvendes, idet det anvendes mengder og eksponeringsteknikker som er tidligere kjente.

I noen tilfeller kan et svakt mutagen kombineres med et sterkt mutagen. Blant de svake mutagenene er 2-aminopurin, t-bromuracil, hydroxylamin, natriumbisulfitt og andre.

Rekkefølgen av mutasjoner og utvelgelser hvorved stammene som hittil har gitt høyest astaxanthinutbytte, er blitt fremstilt, er vist i figur 2. Under henvisning til figur 2 ble den naturlig forekommende opphavsstamme 6 7-385, erholdt fra American Type Culture Collection, ATCC nr. 24230, analysert til å inneholde 200-600 ug/g tørrvekt gjær etter 6 dagers dyrking. 67-385 ble underkastet antimycin-utvelgelse, og høyere pigmentert avkom, henvist til som IGI-887JO, ble erholdt. Den første mutantpapill dissekert fra grunnkolonien, inneholdt omtrent 700 ug samlet karotenoid/g gjær sammenlignet med opphavsstammen som hadde 300-400 ug/g. IGI-887JO ble analysert til å ha et astaxanthin-innhold på 960 ug/g tørrvekt av gjær etter 6 dagers dyrking. IGI-887J0 ble på nytt utplatet på YM-agar inneholdende 50 uM antimycin, og andre generasjon antimycin-kolonier ble valgt ut. En av disse ga 1200 ug/g^ og en annen ga 1450 ug/g- Det synes derfor som om antimycin A er et utmerket utvelgelsesmiddel for isolering av pigmenterte varianter av P. rhodozyma.

IGI-887J0 ble underkastet nitrosoguanidinmutasjon (NTG-mutasjon), og IGI-887J2 ble erholdt som produserte 1200-1500 ug samlede karotenoider/g gjær. IGI-887J2 ble ytterligere selektert med antimycin, hvorved man fikk IGI-887J1 som ble analysert til å ha et astaxanthin-innhold på 700-1100 ug/g tørrvekt gjær etter 6 dagers dyrking. En andre NTG-mutagenese ga IGI-887J3-avkom.

Etter rensing av kolonier av IGI-887J3 segregerte isolatene til hvite og pigmenterte kolonier. Den hvite revertant ble betegnet IGI-887J4. De lyse koloniene vokste svært dårlig på ammoniumsulfat ved 5 g/l, vokste litt bedre på høye nivåer av ammoniumsulfat (20 g/l), og på plater vokste de godt på glutamat eller glutamin. Disse resultatene tyder på at stammene svekkes progressivt i nitrogen-metabolisme, noe som begrenser veksthastigheten.

IGI-1287J1 ble isolert etter nitrosoguanidinmutasjon av IGI-887J4, den hvite segregant av IGI-1887J3. IGI-1287J1 ble analysert til å inneholde 900-1400 ug/g tørrvekt gjær etter 6 dagers dyrking. Denne stamme var også svekket i nitrogenmetabolismen. Det ble lagt merke til at stammene IGI-887J3 og IGI-1287J1 ikke vokser på ethanol, mens de tidligere mutantene gjør det.

IGI-2880B60 ble erholdt fra IGI-887J2 ved NTG-mutagenese og ble analysert til å inneholde 1700 ug/g tørr-vekt gjær etter 6 dagers dyrking.

Karakterisering av antimycinmutantene

Opphavsstammen (67-385), IGI-887JO, og IGI-887J2 hadde omtrent like utbytter av celler med ammonium, glutamat eller glutamin som nitrogenkilder. Analyse av veksthastig-heter viste imidlertid at seriene av stammer vokste progressivt saktere på disse nitrogenforbindelsene. Disse data tyder på at hastigheten eller virkningsfullheten av nitrogenutnyttelse var svekket i antimycinmutantene.

Opphavet og de to undersøkte mutanter hadde reduserte celleutbytter på fire carbonkilder testet, men var mer høy-pigmenterte. Antimycinmutantene fermenterte fortsatt glucose og hadde også betydelig ethanol-dehydrogenaseaktivitet. IGI-887J2 vokste imidlertid ikke lenger på ethanol og hadde reduserte celleutbytter på andre respirasjonssubstrater, inkludert succinat. De reduserte utbytter på energikildene og spesifisiteten av inhibering ved hjelp av antimycin for elektrontransports.jeden tydet på at respirasjon eller mito-kondrial funksjon i de pigmenterte mutanter var endret.

Mutantenes følsomhet overfor forskjellige respira-sjonsinhibitorer inkludert antimycin A, theonyltrifluor-acetin, natriumazid, hydrogenperoxyd og natriumcyanid, ble undersøkt. Disse inhibitorene påvirker forskjellige områder av respirasjonskjeden. Overraskende var de antimycin-induserte mutanter mer følsomme overfor antimycin A på YM-plater, og også i flytende medier. Opphavsstammen hadde omtrent 50% overlevelse ved 100 uM antimycin, sammenlignet med mutantene som ikke overlevde på ca. 60 uM. Konsentra-sjonene av antimycin som drepte 50% av populasjonene av IGI-887JO og IGI-887J2 på YM-agar, var omtrent hhv. 18 og 3 uM. Mutantene var mer følsomme i flytende medier og ble drept ved antimycinkonsentrasjoner nær 0,5 uM.

Disse resultatene viser klart at de pigmenterte papiller som oppsto på de lyse koloniene, faktisk var mer følsomme overfor legemidlet selv om de var isolert på plater som inneholdt antimycin. Den romlige adskillelse av papillene fra agaren letter tilsynelatende genereringen av de mer følsomme stammer.

Mutantene var også helt følsomme overfor andre res-piras jonsinhibitorer , inkludert TTFA og hydrogenperoxyd,

men var bare svakt mer følsomme overfor cyanid, og adskilte seg ikke i følsomhet overfor azid. Disse dataene understøtter den ovenfor nevnte hypotese om at de antimycin-isolerte stammer hadde en endret respirasjonskjede og tyder på at en skade kan oppstå i de tidlige områder av kjeden, nær cytokrom B.

For karotenoidsammensetning av mutanter vises det

til An et al., "isolation of Phaffia rhodozymaMutants with Increased Astaxanthin Content", Applied and Environmental Microbiology, januar 1989, s. 116-124, American Society for Microbiology.

Det er nødvendig å tilføre passende mengder nærings-stoffer og mineraler i formediene for å sikre korrekt mikro-organismevekst, maksimere cellenes assimilering av carbon-énergikilden i den mikrobielle omdannelsesprosess, og oppnå maksimale celleutbytter med maksimal celledensitet i fer-menter ingsmediet .

Sammensetningen av fermentet kan variere over et stort område, avhengig delvis av gjærstammen, det anvendte substrat og innholdet av mineraler i fermentet (dvs. væske pluss celler). I tabellen nedenfor er minimaene, de brede og de for tiden foretrukne områder for konsentrasjoner av forskjellige grunnstoffer i fermentet angitt, idet konsentrasjonen er uttrykt som konsentrasjonen av grunnstoffet selv om det erkjennes at alt eller en del av hvert grunnstoff kan være til stede i form at et oppløselig ion, eller i slike tilfeller som P, i en kombinert form av en eller annen type, slik som fosfat. Mengden av hvert grunnstoff uttrykkes i gram eller milligram pr. liter ferment (vann-fase, inkludert celler):

Måten som foreliggende oppfinnelse skal utføres på, og ytterligere trekk og fordeler ved foreliggende oppfinnelse, vil fremgå av de illustrerende eksempler nedenunder. Eksemplene er gitt for det formål å fremme en forståelse av prinsippene ifølge oppfinnelsen. Selv om betingelsene og språket i eksemplene er spesifikke, vil det ikke desto mindre forstås at ingen begrensning av oppfinnelsens omfang derved er ment, idet slike endringer og ytterligere modifi-kasjoner og anvendelser av grunnprinsippene ifølge foreliggende oppfinnelse slik de der er illustrert, er tenkt utført slik det normalt ville oppstå for en person med gjennom-snittlige kunnskaper innen den teknikk som oppfinnelsen ved-rører.

I eksemplene er naturlig forekommende stammer erholdt fra den offisielle deponeringsinstitusjon, American Type Culture Collection i Rockville, Maryland, og er gitt ATCC nr. 24230 og 24202. ATCC-betegnelsene gjenspeiler at to skråagarkulturer av hver stamme er blitt deponert ved den offisielle deponeringsinstitusjon.

Mutagenese

Eksempel 1: Ultrafiolett mutagenese

Stamme IGI 2880B60 ble mutagenisert med ultrafiolett lys fra en mikrobedrepende UV-lampe i en avstand på 30,5 cm fra en saltsuspensjon av celler i 1 minutt (95,3% drept), 3 minutter (99,4% drept) og 5 minutter (99,99% drept). Mutageniserte celler ble holdt i mørket i 1 time etter mutagen-eseperioden og platet ut på gjær-maltekstraktmedium (YM) ved flere fortynninger. Platene ble inkubert ved 20°C. Mørkerød-orange kolonier ble isolert på grunnlag av observerte pigmenteringsforskjeller og streket ut til skråkulturer.

Eksempel 2: Nitrosoguanidinmutagenese

Stamme 1287J1 ble dyrket i YM i 48 timer. Celler

ble pelletert ved sentrifugering, supernatanten kastet og cellene på nytt oppslemmet i 0,1 M citratbuffer, pH 5,0. Cellene ble behandlet med 100 ug/ml nitrosoguanidin (NTG) i 25 minutter ved værelsetemperatur uten rysting. Suspen-sjonene ble sentrifugert, supernatanten dekontaminert og cellene vasket tre ganger med 0,1 M kaliumfosfatbuffer,

pH 7,0. Pellet ble oppslemmet i fosfatbuffer og fortynnet i kolber som inneholdt 20 ml YM, og rystet over natten.

Cellene ble platet ut på YM og inkubert ved 20°C. Kolonier ble isolert på grunnlag av observerte pigmenteringsforskjeller, idet koloniene som var kjennetegnet ved mørkerød-aktig orange farge observert under et dissekeringsmikroskop, ble valgt ut og streket ut til skråkulturer. Tre dager gamle skråkulturer ble brukt til å inokulere YM-kolber. 1 ml YM-medium ble brukt til å oppslemme innholdene i skrå-kulturen, og hele denne suspensjonen ble tilsatt til 250 ml kolbe inneholdende 20 ml YM og rystet i 6 dager ved 20 C.

Morfologisk utvelgelse

Eksempel 3; Antimycinbehandling

Eksponensielt voksende gjærceller av stamme ATCC 24230, enten NTG-mutageniserte som beskrevet under trinn l(a) ovenfor, eller ikke-mutageniserte, ble platet ut på YM-medium inneholdende 50 um antimycin A (en blanding av anti-myciner A1 og A^, Sigma katalog nr. 2006) og inkubert ved 20 C inntil en koloni vokste opp. Veksten tok omtrent 1 måned. Etter to ytterligere uker med inkubasjon fremkom et rødt sentrum i kolonien som hadde et utseende av speilegg. Dette røde senter ble isolert til YM-medium.

Eksempel 4: Tunicamycinbehandling

Tunicamycinmutanter ble valgt ut ved å plate ut en log-fase-kultur av stamme ATCC 24202 (naturlig forekommende) på en gradientplate av GYE-agar med 5 ug/ml tunicamycin. Kolonier som vokste opp på disse platene, ble streket ut på GYE-agarplater inneholdende 5 og 8 ug/ml tunicamycin. Kolonier som vokste opp på disse sekundærplatene, ble analysert med hensyn på pigment. Kontroll var 270 ug/g sammenlignet med 610 ug/g for 8 ug/ml tunicamycinresistent mutant.

Eksempel 5: Nystatinbehandling

Nystatinmutanter ble isolert ved å inokulere log-fase-YM-kulturer av stamme ATCC 24202 i YM-kolber inneholdende 3 og 5 ug/ml nystatin. Etter 48 timer ble disse selektive kulturene platet ut på antibiotikumplater inneholdende YM-agar med nystatin (3 og 5 ug/ml). Erholdte kolonier ble analysert med hensyn på pigment. Kontroll var 270 ug/g sammenlignet med 400 ug/g for mutanten med høyest nystatin-konsentrasjon.

Eksempel 6: Mevalonsyrebehandlinq

Stamme ATCC 24202 ble mutagenisert med NTG til 50% overlevelse og platet ut på YM-medium. Kolonier ble til-feldig platet ut på YM-agar inneholdende 5 mM.mevalonsyrelakton. Alle disse koloniene ble deretter overført til medium inneholdende først 10 og så 25 mM mevalonsyrelakton. Koloniene som vokste opp på 25 mM mevalonsyrelakton, ble analysert med hensyn på pigment. Kontroll var 275 ug/g sammenlignet med 540 ug/g for 25 mM mevalonsyrelakton-resistent mutant.

Karotenoidekstraksjon og - analyse

Kolonier kan analyseres med hensyn på pigmentinnhold på følgende måte.

Etter innhøsting fra 30 ml dyrkingsmedium vaskes cellene i vann og oppslemmes på nytt i 30 ml vann. Den optiske densitet måles for å bestemme vekst. Omtrent 13 ml av suspensjonen brytes opp med 0,5 mm glasskuler i 3-4 minutter under avkjøling i en "Bead Beater". Etter oppbrytning helles kule/celle-blandingen over i et begerglass og ekstraheres 5 ganger med 10 ml aliquoter aceton. Acetonekstraktene slås sammen og sentrifugeres ved 15.000 rpm i 45 minutter. Den klare acetonsupernatant helles bort fra cellepelleten; dersom pelleten inneholder gjenværende pigment, oppmales den manuelt med en glasshomogenisator og ekstraheres ytterligere med aceton.

De kombinerte acetonekstrakter slås sammen i en skilletrakt, og omtrent 10 ml petrolether tilsettes, samt noen få ml av en oppløsning av mettet NaCl for å hjelpe til å bryte emulsjonen. Petrolekstrakten samles opp, og aceton-sjiktet ekstraheres på nytt. Petrolekstraktene slås sammen og filtreres gjennom glassull for å fjerne lipidkuler og annet partikkelstoff. Absorbansspektrumet måles (absor-bansmaksimumet for transastaxanthin i petrolether er 474 nm). Den samlede karotenoidblanding beregnes under anvendelse av den 1% ekstinksjonskoeffisient = 2100 ved hjelp av formelen:

Det kan analyseres med hensyn på de enkelte karotenoidene ved hjelp av tynnsjiktskromatografi (TLC) og elektron-absorpsjonsspektra. For å fremstille karotenoidekstrakter for analyse tørkes petroletherekstrakter over vannfri Na2S0^ og oppkonsentreres ved inndamping i en strøm av nitrogen. Disse kromatograferes ved hjelp av TLC på silicagelplater ("Silicagel 60", 5 x 20 cm, 0,25 mm tykke) under anvendelse av 20% aceton/80% petrolether. Etter fremkalling skrapes båndene av og elueres i aceton gjennom en Pasteur-pipette plugget med glassull. Absorbansmaksima, r^-verdier og kokromatografi med standarder benyttes til identifikasjon av pigmentene. Synlige absorpsjonsspektra tas opp i aceton eller petrolether på et Gilford respons-spektrofotometer, og konsentrasjoner av karotenoider beregnes under anvendelse av de bestemte absorpsjonskoeffisienter som er angitt av Davies, Carotenoids, s. 38-165, i Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, vol. 2f T.W. Goodwin (red.), Academic Press, London (1976).

Fermentering i laboratorieskala

Eksempel 7

Fremstillingen av astaxanthin i en 10-liters labora-toriefermentor illustreres ved hjelp av følgende fremgangsmåte :

20 ml nedfryst Phaffia rhodozyma stamme IGI-887J1

(se figur 1 og ledsagende tekst) ble brukt til å inokulere 300 ml av et medium omfattende 3% glucose, 1% gjærekstrakt og 0,1% kaseinhydrolysat. Mediet ble sterilisert ved 121°C og 15 psi i ca. 20 minutter før det ble inokulert. Det inokulerte medium ble rystet i ca. 48 timer ved en temperatur på 20°C på en rotasjonsryster med et slag på 2,5 cm ved en hastighet på 250 rpm. Den 300 ml celledyrkningsvæske ble brukt til å inokulere en 5-liters inokulasjonsfermentor

inneholdende 3 liter sterilisert inokulasjonsmedium med den følgende sammensetning pr. liter:

Vitaminblandingen besto av de følgende bestanddeler:

Sporelementblandingen besto av de følgende bestanddeler :

Etter inokulasjon ble en 70% cereloseoppløsning til-ført inkrementelt til fermentoren, spesifikk veksthastighet for cellene ble holdt ved ca. u=0,15. Fermentoren ble holdt ved en temperatur på 20 °C. pH ble regulert til 5 med 8 N KOH. Omrøring skjedde ved en hastighet på 900 rpm og lufting ved en hastighet på 1,5 v/v/m. Da OD (optisk tetthet) var ca 30, ble 1 1 av dyrkningsvæsken brukt til å inokulere en 15-liters fermentor inneholdende 10 1 produksjonsmedium.

Sammensetningen av produksjonsmediet var den samme som inokulasjonsmediet, bortsett fra at: (1) ammoniumsulfat ble økt til 16 g/l, og (2) 1 g/l mononatriumglutamat og 5 g/l maisstøpevæske ble tilsatt. Fermentortemperaturen ble holdt ved 20°C, og pH ble holdt ved 5 med 8 N KOH. Omrøring og lufting skjedde ved hhv. en hastighet på 900 rpm og 1,5 v/v/m. Cirka 2 1 70 % cellulose ble tilført i trinnvis økende mengder til fermentoren, spesifikk veksthastighet for cellene ble holdt under 0,15. Ved slutten av fermentasjonen (ca. 60 timer) inneholdt cellene ca. 1100 ug/g astaxanthin.

Qppskaleringsfermentasjon

Eksempel 8

Produksjonen av astaxanthin i en pilotanleggsmåle-stokk er illustrert ved den følgende fremgangsmåte. 20 ml nedfryst P. rhodozyma stamme IGI 188JB1 (se figur 1 og ledsagende tekst) ble brukt til å inokulere 300 ml dyrkningsmedium, idet sammensetningen av mediet og dyrknings-betingelsene var de samme som beskrevet i eksempel 1. Etter 48 timer ble 300 ml celledyrkningsvæske brukt til å inokulere den første inokulasjonsfermentor inneholdende 3 1 av et sterilisert, første inokulasjonsmedium med den følgende sammensetning pr. liter: 90 g sterilisert cellulose ble aseptisk tilsatt fermentoren etter inokulasjon. Fermentoren ble holdt ved 21°C, Ph ble regulert til 5 med 8 N KOH. Omrøring ble innstilt på 900 rpm og lufting på 1,5 v/v/m. Etter at oppstartingscellulosen var oppbrukt, ble en sterilisert 70 % celluloseoppløs-ning tilført ved økende mengder til fermentoren. Den spesifikke veksthastighet for cellene ble regulert til ca. 0,1. Da celleveksten nådde en OD på ca. 20, ble de 3 litrene celledyrkningsvæske brukt til å inokulere en 30-liters fermentor inneholdende 20 1 sterilisert, andretrinns inokulasjonsmedium.

Sammensetningen av andretrinns inokulasjonsmedium var den samme som førstetrinns inokulasjonsmediet. Dyrknings-betingelsene var også de samme, bortsett fra en saktere,

300 rpm omrøringshastighet. Etter at oppstartingscellulosen var oppbrukt, ble en sterilisert oppløsning av 70 % cellulose og 7 % ammoniumsulfat tilført ved økende mengder til fermentoren inntil en OD på ca. 30 var nådd. Den spesifikke veksthastighet for cellene ble regulert til ca. 0,1. Den andre inokulasjonen ble brukt til å inokulere en 250-liters fermentor inneholdende 170 1 sterilisert produksjonsmedium.

Bortsett fra en høyere konsentrasjon av maisstøpe-væske (12 g/l) var sammensetningen av produksjonsmediet den samme som førstetrinns inokulasjonsmedium. Temperaturen ble holdt ved 21°C, pH ble regulert til 5 med 8N KOH.

Lufting ved 250 l/min. i de første 15 timer ble økt til

300 l/min. Omrøring ved 150 rpm i de første 15 timer ble økt til 200 rpm. En sterilisert oppløsning av 70% cerelose, 7% ammoniumsulfat ble tilført inkrementelt til fermentoren. Spesifikk veksthastighet for cellene ble regulert til ca. 0,1. Etter at 30 kg cerelose var tilført fermentoren, ble cellene innhøstet. Cellene inneholdt ca. 1000 ug/g astaxanthin.

Forøkning av astaxanthin- biosyntese

Det er også funnet at når antimycin eller en annen inhibitor for hovedrespirasjonskjeden tilsettes til celler av Phaffia rhodozyma, og cellene eksponeres mot lys, forøkes astaxanthin-innholdet i gjæren betydelig. Den underliggende mekanisme for dette fenomen er ikke forstått, men det kan oppstilles en hypotese om at når hovedrespirasjonssporet inhiberes, virker lys som en av utløserne for et sekundært respirasjonsspor (oxydativt), noe som har en nettoeffekt ved i betydelig grad å stimulere produksjonen av astaxanthin. Foreliggende oppfinnelse omfatter således fremgangsmåter for økning av astaxanthin- eller annet karotenoidinnhold i gjær, omfattende dyrking av gjæren i nærvær av en stoffskifteinhibitor samtidig som det induseres et sekundært respirasjonsspor. Det sekundære respirasjonsspor kan induseres ved hjelp av slike påvirkningsmidler som lys, visse miljømessige betingelser, slik som de som er kjent for å forårsake stress, næringsmidler, etc. Foreliggende oppfinnelse er imidlertid ikke begrenset til hypotesen ovenfor.

Det vil ses ut fra forsøkene som er omtalt nedenunder, at forøkt astaxanthin-biosyntese kan induseres ved hjelp av den ovenfor nevnte kombinasjon av respirasjonskjede-inhibitor med initiering av den sekundære respirasjons-kanal.

Eksempel 9

Stammer av P. rhodozyma som ble brukt, var det naturlige isolat UCD-FST-67-385 (Phaff et al., 1972; Miller et al., 1976), mutant Ant-1-4 brukt ovenfor, og stamme 18-13-6, en astaxanthinforøkt mutant erholdt ved hjelp av fremgangsmåter med ethylmethansulfonatmutagenese (EMS-mutagenese) (isolert på YM-agar). De ble dyrket i gjærekstrakt/ maltekstrakt/pepton/glucose-medium (YM-medium) som tidligere beskrevet (An et al., 1989) i en temperaturregulert inkubator/ryster ("Environ-Shaker" modell 3597) . Vekst ble bestemt ved hjelp av den optiske densitet (660 nm) til en vasket cellesuspensjon; 1 mg tørr cellevekt pr. ml svarer til en O.D. på 1,35.

Lys ble levert ved hjelp av to "Sylvania 20" watt "Coolwhite" fluorescerende rør holdt 20-40 cm fra medium-overflåtene i kolbene. Kolbene ble inokulert med omtrent

2 6 10 -10 celler aktivt voksende gjær. For mørkekontroller ble kolbene innpakket i aluminiumsfolie. Når uoppløselige kjemikalier var tatt med i mediene, ble de først oppløst i en liten mengde ethanol (0,3% sluttkonsentrasjon), noe som ikke påvirket gjærvekst eller pigmentering.

Karotenoidekstraksjon og - analyse

P. rhodozyma ble dyrket i 5 dager før ekstraksjon. Gjær ble innhøstet fra væskemedier ved sentrifugering. Gjærcellene ble oppslemmet i destillert vann, vasket i vann og ekstrahert og analysert med hensyn på karotenoider ved hjelp av tynnsjiktskromatografi og absorpsjonsspektroskopi som tidligere beskrevet (An et al., 1989).

Induksjon av sekundært respirasjonsspor øker karotenoid-produksjon

Innflytelsen av to 20 watt fluorescerende pærer plassert 20 cm fra overflaten av P. rhodozyma naturlig isolat, UCD-FST-67-385, og dets antimycin-følsomme mutanter, Ant 1-4 og 18-13-6, ble undersøkt.

Separate kulturer ble dyrket under betingelser med (a) totalt mørke i 30 timer (heretter "mørke"), (b) totalt mørke sammen med 0,2 uM antimycin (antimycin innført ved inokulasjon) (heretter "mørke/antimycin") og under betingelser (c) og (d) som var identiske med (a) og (b), bortsett fra eksponering av kulturene mot lys fra omtrent 30 timer inn i forsøket og inntil omtrent 60 timer inn i forsøket (heretter "lys" og "lys/antimycin").

Ekstraksjon av pigmentene og karakterisering indikerte at pigmentene var kvalitativt like i sammensetning, bortsett fra at mer cis-astaxanthin og lavere karoten-konsentrasjoner ble funnet å være til stede i celler dyrket i lys.

Analyse av gjær viste at karotenoidinnholdet i lys/antimycin p. rhodozyma UCD-FST-6 7-3 85 økte to ganger i forhold til hvilken som helst av mørke-, mørke/antimycin-eller lys-kulturene av dette naturlige isolat (tabell 1). Tabell 2 viser at mutant 18-13-6 som er antimycinfølsom, ga to ganger økning i karotenoidinnhold i antimycin/lys sammenlignet med lys-kulturen.

Som det ses av resultatene ovenfor, påvirkes vekst

og karotenoiddannelse hos naturlig og astaxanthinforøkt P. rhodozyma klart ved hjelp av lys. Det naturlige isolat, UCD-FST-67-385, og dets antimycinfølsomme mutanter ant-1-4

og 18-13-6, vokste alle bedre og hadde forøkt pigmentering i mørket, men ble påvirket av lys på forskjellig måte.

Phaffia som nærings- og pigmentkilde

De innhøstede celler kan ødelegges eller brytes opp ved å bruke mekaniske eller enzymatiske midler eller en kombinasjon derav, og tilføres laksefisker etc, som en del av en total næringsrik kost. For å øke stabiliteten av astaxanthin i den ødelagte eller oppbrutte gjær mot varme og luft, er det foretrukket å tilveiebringe et beskyttende belegg eller en beskyttende matriks, slik det vanligvis tilveiebringes innen næringsmiddelteknikken, f.eks. en naturgummi.

Eksempler hvor P. rhodozyma brukes som et nærings-supplement for regnbueørret (Salmo gairdneri), amerikanske hummere, vaktler og eggleggende høns, er omtalt i en avhandling av oppfinneren Johnson med tittel "Astaxanthin Production by the Yeast Phaffia rhodozyma and Its Use As a Pigment Source in Animal Feeding", Master's Thesis, University of California, Davis (1976).

Som en følge av det høyere astaxanthin-innhold pr.

enhet celler på tørrbasis i gjæren som oppnås ifølge foreliggende oppfinnelse, kan mengden av gjær som anvendes for å indusere pigmentering, reduseres betydelig.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en gjær med et forøkt astaxanthininnhold, karakterisert ved at en mikroorganisme av slekten Phaffia dyrkes i et næringsmedium som inneholder et antibiotikum, en inhibitor for cytokrom B, en inhibitor for terpenoidsyntesesporet eller en inhibitor for hovedrespirasjonssporet under en påvirkning som utløser et sekundært res-piras jonsspor (oxydativt), eller erholdt gjær dyrkes i nærvær av en inhibitor for hovedrespirasjonssporet og i nærvær av et middel eller under påvirkning av en miljømessig betingelse som utløser et sekundært respirasjonsspor (oxydativt), eller et alternativt oxydasesystem induseres ved hjelp av dyrking av gjæren i nærvær av en inhibitor for hovedrespirasjonssporet og i nærvær av et middel eller under påvirkning av en miljømessig betingelse som utløser et sekundært respirasjonsspor, idet mikroorganismen utsettes for mutagenese enten før, etter eller før og etter morfologisk utvelgelse.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antibiotikumet er valgt fra gruppen bestående av antimycin, tunicamycin og nystatin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at inhibitoren for cytokrom B er valgt fra gruppen bestående av antimycin og 2-n-heptyl-4-hydroxy-kinolin-N-oxyd.

4. Fremgangsmåte som i krav 1, karakterisert ved at inhibitoren for terpenoidsyntesesporet er mevalonsyrelakton.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av antibiotikum eller inhibitor for terpenoidsyntesesporet i mediet er mellom 1 og 100 uM.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at astaxanthinet i inn-høstet gjær er 1 000 ppm eller mer basert på tørrvekt av gjærceller.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at inhibitoren for hovedrespirasjonssporet er antimycin.

8. Gjær med de identifiserende kjennetegn til Phaffia med økt astaxanthininnhold, karakterisert ved at gjæren er blitt erholdt ved minst ett trinn med morfologisk utvelgelse av naturlig forekommende Phaffia dyrket som angitt ved fremgangsmåten i-følge kravene 1-7 eller av en mutant av naturlig forekommende Phaffia dyrket som angitt ved fremgangsmåten ifølge kravene 1-7.

9. Anvendelse av en gjær erholdt ved fremgangsmåten ifølge krav 1 i ødelagt form i for til å øke pigmenteringen i kjøttet til laksefisker eller i huden, kjøttet eller egge-plommen til fjærkre.

10. Anvendelse av gjær erholdt ved fremgangsmåten ifølge krav 1 for fremstilling av astaxanthin ved at en mikroorgan isme av slekten Phaffia dyrkes én eller flere ganger i et næringsmedium som inneholder et antibiotikum, en inhibitor for cytokrom B eller en inhibitor for terpenoidsyntesesporet, idet mikroorganismen utsettes for minst én mutasjon enten før eller etter en av dyrkingene i næringsmediet som inneholder et antibiotikum, en inhibitor for cytokrom B eller en inhibitor for terpenoidsyntesesporet, overlevende mikroorganismer som oppviser forøkt pigmentering, dyrkes, den dyrkede gjær innhøstes og astaxanthinet ekstraheres.