JPH05508532A - ゼアキサンチン及びゼアキサンチン含有組成物の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ゼアキサンチン及びゼアキサンチン含有組成物の製造本発明は、Ｆｌａｖｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ種の微生物を使用したゼアキサンチン（ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎ）の製造、Ｆ、ａ＋ｕｌｔｉｖｏｒｕｍを培養、及び醗酵 させるための栄養培地、Ｆ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍの細胞粒子を含む組成物、更 に本発明の微生物によって製造されるゼアキサンチンを含有する組成物に関する 。

発明の技術背景と要約 ゼアキサンチン（３，３’−ジヒドロキシ−β−カロチン）はとうもろこし、卵 黄、及び家禽の皮膚を黄色にする、カロチノイドである。それは飼料添加物とし て、更に化粧品及び食品産業において着色料として使用される。

本発明の方法に従って製造された精製ゼアキサンチン、及びその色素を含有した 細胞体は、食料品の着色、また同様に化粧品の着色に使用することができる。特 に、色素含有細胞体は家禽類の脚、（ちばし、皮膚、脂肪、肉及び卵黄の着色に 適している。

ゼアキサンチンは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する稀少の細菌種によ って、生物学的に合成される。このＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ　ｕｎ種は、稀な 例は別として、全てのものが便宜上２つの種類、すなわちｌ）強力なタンパク分 解性（ゼラチン、カゼイン及び凝固した血清を消化・分解する）を持つものと、 ２）非タンパク分解性のものに分類される。Ｆ、５ｅｎｉｎ　ｏｓｅ　ｔｉｃｕ ｍ（生物型［［ａ）、及びＦ。

ラボバクテリア（ＩＩｃ、　ｌｉｅ、　［Ｉｈ、　Ｉｌｉ及び［Ｉｋ−２）はタ ンパク分解性を持たない。ｐ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍは、現在ＣＤＣのＥｌｋ− ２グループ（非タンパク分解性）のものとして認識されている３種類のうちの一 つである。

家禽飼育・生産音速にとって、特にマリーゴールドやアルファルファから得られ るキサントフィル（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｓ）についての安定性及び生物学的 利用性に関する問題には、長い歴史がある。それらの性質を評価し、改良するた めに多くの仕事がなされている。はとんどのマリーゴールド生産物は溶媒で抽出 し、更にケン化しなくてはならないが、その抽出工程において抗酸化剤の添加を 必要とする（Ｍａｒｕｓｉｃｈ　ａｎｄ　Ｂａｕｅｒｆｅｉｎｄ、Ｃａｒａｔｅ ｎｏｉｄｓ　Ａｓ　Ｃｏ１ｏｒａｎｔｓ　ａｎｄ　Ｖｉｔａｌｌｉｎ　Ａ　Ｐｒ ｅｃｕｒｓｏｒｓ：　ｅｄ、、　Ｊ、Ｃ。

Ｂａｕｅｒｆｅｉｎｄ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８１）　ｏ実 施例６で示す食餌実験では直接、色素の既知量をマリーゴールドから数工程を経 て抽出された物と比較した。このデータから、本発明の組成物は生物学的に利用 性が高く、かつ安定なものであり、更に、色素精製物として比べて、マリーゴー ルドから得られるキサントフィルよりも着色速度が速く、かつ着色度が２〜３倍 強いものであることが示唆される。Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のうち規程 かのものが、ある培養条件で及び／またはある種の栄養培地を使用することによ って、ゼアキサンチンを生産することができると知られている（関連文献項参照 ）。

さらに、また培地中に含まれる炭素量と窒素量が、実質的に一定の比で保たれて いるような条件下で、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の培地として、グルコー スと他の栄養分が必要であるが、これらは比較的高価で経費がかかり、更に培養 に長い時間のかかる栄養成分である。

これに対し、本発明は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ のゼアキサンチン産生微生物を培養することによる、ゼアキサンチンの製造方法 を提供するものであり、この発明によって初めて、このＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ種が色素を生産することが示された。更に、その微生物を培養する栄養培 地は比較的低コストのものである。その上、公知方法と比べて培養時間が極めて 短く、より効率がよい。

従って、本発明の目的はＰｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕ ｍ株、またはそのミュータント（ｓｕｔａｏｔ）、もしくはバリアント（ｙａｒ ｉａｎｔ）を用いて、ゼアキサンチンを製造する方法を提供することである。本 発明の方法によると、公知微生物及び公知方法に劣らず、より大量のゼアキサン チンを得ること、及びゼアキサンチンを含有する細胞の細胞産生量を増加させる ことができる。

本発明のもう一つの目的は、生物学的に有用であるゼアキサンチン色素の生産量 を増す方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、培養させ易く、生長が速く、かつ非病原性の微生物 を用いてゼアキサンチンを製造する方法を提供することである。これらの微生物 はまた、多くの異なった炭素源を含む栄養培地を使用することができる。

本発明のもう一つの目的は、ゼアキサンチンの産生量を最大現にし、高い細胞産 生量、高いゼアキサンチンの産生量を与えさらにはゼアキサンチン生産に必要な 醗酵時間を短縮する経済的でかつ、商業的な栄養培地を提供することである。

別の目的は、ゼアキサンチンを生産する細菌を提供することである。

さらに別の目的は、今までゼアキサンチンを生産するとは知られていなかった微 生物を提供することである。

以上の目的及び他事項に関しては、以下の発明の説明、及び請求の範囲において 明らかにする。

関連文献 米国特許３．８９１．５０４号で、ゼアキサンチン製造のための組成物、及び方 法を開示している。２種類のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株はＡＴＣＣＮｏｓ 、２１５８８と２１０８１として同定されている。これらの菌株はグルコース、 トリプトン及び酵母エキスを含む栄養培地中で醗酵されたのち、培養温度変更や 色素促進剤（乳酸とパルミチン酸メチルエステル）を使用する工程へ導入された 。

米国特許３．８４１．９６７号、３．９５１．７４２号、及び３．９５１．７４ ３号では、βカロチン製造と類似の方法を用いたゼアキサンチンの製造方法とし て、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株（ＡＴＣＣＮｏｓ、２１５８８．２１０８ １と１１９４７）を使用することを開示されている。この方法は、培地中の炭素 ／窒素含量比を常に一定に保つために継続的に付加的な栄養分を与える以外は、 グルコースをバッチ供給した栄養培地中において、微生物を生長させることを特 徴とする。これらの特許明細書はまた、大量の色素を生産する細菌株を単離する ための変異方法を開示する。これらのミュータントを用いた方法は、ゼアキサン チンを高収率で製造することはできるが、経済的ではない。

米国特許４．０２６．９４９号では、ゼアキサンチンのようなカロチノイドの製 造において使用される光学活性な中間体の製造について開示している。この方法 で使用される細菌はＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉ本発明は、微生物、ＦＩａｖＯｂ ａＣｔｅｒｉｕｌｌ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍを使用するゼアキサンチンの製造に 関するものであり、今まで本微生物がこの色素を生産するということは知られて いなかった。本発明は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａ＋ｕｌｔｉｖｏｒｕ ｍ細胞の単離、及びゼアキサンチンが回収可能な置土産される条件で栄養培地中 で当該細胞を培養することに関する。微生物細胞は醗酵培養液から分離され、バ イオマス（ｂｉｏａ＋ａｓｓ）組成物として使用される。

又は細胞粒子を含む組成物、及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖ ｏｒｕｍによって製造されたゼアキサンチンを含む組成物に関するものは、ゼア キサンチンを生産するＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｊ　ｕｍｉｉかツｍｕｌｔｉｖｏ ｒｕｍ種に属する全ての微生物を包含し、それらの継代培養体（ミュータントと パリアト）及び実施例、又はＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ（１９８４年出版 ）に記載されている細菌株とは明確に区別できないもの全てを含む。以下に、ｐ 、ａ＋ｕｌｔｉｖｏｒｕｍの特徴を述べる。またする。本発明において、“ミュ ータンビなる語は、様々な手段によってＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌ ｔｉｖｏｒｕｍから生産されるミュータントを意味する。この手段とは、化学的 変異剤、紫外線照射、ファージ暴露などを含むが、これらに限定されるものでは ない。これらの方法及び物質は、当業者にはよく知られているものである。本特 許出願明細書に記載のミュータントは、Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆ ｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＣＡＳＭ　１９８１．１３章 ）に記載されているようなＮＴＧ　（ｎ−メチル−Ｎ−二トローＮ−ニトロソグ アニジン）による標準的な突然変異誘起、及び紫外線照射に付せられることによ って得られる。本発明において、“バリアント”なる語は、Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ 　Ｍａｎｕａｌ（１９８４年出版）に記載されているものに限定せず、Ｆｌａｖ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍのバリアント全てを意味する。こ こで用いる“バイオマス”なる語は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔ ｉｖｏｒｕａ＋の生細胞の醗酵後回収された、非生存のゼアキサンチン含有Ｆｌ ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｒａ　ｔａｕｌｔｉｖｏｒｕｍ細胞、未使用の培地ソリ ッドを含む残滓、及びこの物質から得られる粉末を意味する。前述のバイオマス は、またある種の公知添加物、保護剤及び乳化剤、更にはこの物質から得られる 安定化粉末を含んでいてもよい。バイオマスは、例えばデンプン、及び／または 残余醗酵粉末、及び／または一種もしくはそれ以上の粉を含む不活性キャリアー の中に加えてもよい。

Ｆ１ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕａ＋はスムーズに増殖し 、１日経過後のヒツジ血液寒天プレート上にｌ■１未満の平板な未着色のコロニ ーを形成する。プレート上のペニシリン、バンコマイシン及びポリミキシンのデ ィスクの周辺に阻害帯は見られない。

微生物は、強いオキシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性のグラム陰性桿菌であり、運 動性を持たず、強いスクロース陽性（多くの非醗酵細菌は、スクロース陰性であ る。）、更に常にマンニトール陰性及びエタノール陰性を示し、及び尿素陽性で ある。

本発明によるゼアキサンチンの製造は、ゼアキサンチンの製造に携わる当業者に は自明の慣例培養技術を使用して実施されつる。例えば米国特許３．８９１．５ ０４号、３．８４１．９６７号、３．９５１．７４２号及び３．９５１．７４３ 号に例示されている。簡単に述べると、公知方法でＦｌａｖｏｂａｅｔｅｒｉｕ ｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕ＋＋＋細胞を単離し、得られた黄色培養物を精製して、 細胞内でゼアキサンチンが生産される条件で固体栄養培地上、または液状の栄養 培養液中での培養に付す。細胞を有機溶媒で抽出し、得られたゼアキサンチンを 分光光度計及び高速液体クロマトグラフィーを使用して分析した。

しかし、本発明による、ゼアキサンチン製造の好適な方法は実施例２に示したも のである。

好ましくは、本発明の黄色Ｆｌａｖｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ微生物の単離、及び純 粋培養は次のように行われる。微生物の材料として使用する、泉（ｓｐｒｉｎｇ ）または他の天然源から得られた材料を生理食塩水中で懸濁する。画線培養物を ベトリ皿に塗布する。その後、寒天上で生長した黄色コロニーのカロチノイド含 有量を調べる。

Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍのコロニーは、細胞 をＢｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ（１９８４年出版）に掲載されている分類 学的記載とと比較することによって同定することができる。最後に本発明のＦｌ ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕａ＋微生物は、それらのゼア キサンチン含有量によって同定され〔分析学的手法、好適には高速液体クロマト グラフィーを用いて確認される。Ｆ、Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ、　Ｊ、Ｌｉｑｕ ｉｄアキサンチン産生微生物の検出方法は、高速液体クロマトグラフィーを用い た方法を含むが、必ずしもこれに限定されない。

他のＦ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ単離方法としては、当業者に公知で、かつ本発明 においての使用が適当であるものが挙げられる。Ｆ、ａ＋ｕ１ｔｉＶＯｒｕｌＤ はまたＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ及 び世界中の様々な公的、私的の寄託機関を通じて入手できる。

本発明の方法で使用された微生物は、従来方法で栄養培地中で培養することがで きる。微生物の培養において、同化吸収される炭素または窒素を含んだ多くの従 来の固体栄養培地（または、従来の液体栄養培地のいずれか）が使用される。“ 栄養培地”なる語は、微生物の生育に必須な同化物質を含む培養培地を意味する 。これらの物質は、後述するように、特に、容易に同化されつる炭素源と容易に 同化されうる窒素源及びミネラル塩類を含む。更に栄養培地は、後述するように 、適宜ビタミンといった色素形成促進剤、増殖因子、塩化ナトリウムといったあ る種の無機塩（このような培地中に通常台まれている物）、及び微量成分を含ん でいてもよい。

しかし、本発明によると、好適な培地は以下の表に記した組成をもつ。

（％は全培地の重量を１００％として、重量％で示す）速やかに同化吸収される 窒素源として、無機窒素化合物だけでなく動物、植物および／または微生物由来 の多くの物質が例示されるが、これらに限定されない。容易に同化吸収される窒 素源としては、大豆粉、魚粉、肉粉、肉エキス、ペプトン、コーンステイープリ カー（ｃｏｒｎ　５ｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）　、酵母エキス、アミノ酸類、ア ンモニウム塩類（例えば、リン酸アンモニウムとか、硫酸アンモニウム）及び蛋 白質加水分解物が好ましい。蛋白質加水分解物としては、特に大豆、豆のような 植物性蛋白質、あるいはビーナツツ蛋白質の酸もしくは酵素加水分解物、及び／ またはトリプトンと呼ばれるカゼインの加水分解物が挙げられる。窒素源として はまた、Ｆｌａｖｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ属の細菌培養で得られるカロチノイド色 素の生合成過程で、副生成物として回収されるバイオマスを、酸もしくは酵素で 加水分解して得られる物質、ゼアキサンチンを製造するために培養されたＦｌａ ＶＯｂａＣｔｅｒｉｕｍのバイオマス、これから色素が抽出されるのであるが、 このバイオマスの加水分解物によって得られる物質を含んでよい。

同化吸収されつる窒素源として、低コストでかつ望ましい生育要素を含有してい る点から、コーンステイープリカーが最も好適である。

容易に同化吸収される炭素源としては、糖類及びそれらのポリマー、例えば澱粉 、デキストリン、サッカロース、マルトース、ラクトース、グルコース、及び糖 みつ等が例示され、さらに脂肪酸、及びグリセリン等といった多価アルコール等 が挙げられるが、これらに限定されない。好適な炭素源として、とうもろこし、 とうもろこし粉、米、ミロ（■１ｌｏ）、小麦、デンプン、ラクテート、アセテ ート及びグルコース飼料が挙げられる。

とうもろこし粉が、価格、粒子サイズ、及び培地に１〜７重量％の割合で加えて 使用されるという点から最も好ましい。当業者には、自明のことであるが、とう もろこし、とうもろこし粉、及びデンプンは、α−アミラーゼ（Ｔｅｒｍａａ＋ ｙｌ　１２０Ｌとして市販）といった澱粉溶解酵素で処理する必要がある。この 処理によって澱粉はデキストリンへと加水分解される。この処理を怠ると澱粉は 、加熱処理において固形の塊状になってしまう。しかし、過剰な酵素加水分解は 、収率を減少させることになり、また一方、加水分解をあまりしないのも、収率 を減少させ、醗酵時間を増加させる原因となる。

栄養培地はまた、培地に元から存在している、もしくは付加的に添加したミネラ ルまたは有機成分に起因する微量成分を含んでいてもよい。例えば、硫黄やりん は、栄養培地中に元から存在している無機または育種成分に起因しうるが、また は栄養培地中に特別に添加してもよい。もし、所望または必要なら、例えばビタ ミンといった生育促進剤または刺激剤を栄養培地に添加してもよい。好適なミネ ラルとしては、低濃度の硫酸第一鉄（それは細胞の生育を促進する）とリン酸二 ナトリウムである。

脂肪源としては、例えば石鹸原料、大豆油、ひまわり油及びオリーブ油などが例 示されが、これらのものに限定しない。好ましくは、石鹸原料である。

培養は、好適には培地にある種の生育因子、または生産促進添加物を加えて実施 される。好ましい生育因子は、酵母エキスである。

培養工程で使用される菌株は、公知方法に従うて、画線培養プレートから醗酵容 器に移すことができる。好適な方法は、斜面寒天培地及びガラス−フラスコ液培 養を用いた方法である。

本発明の方法によるゼアキサンチンを製造せしめる条件での微生物の培養は、い ずれの−膜力法を用いて実施してもよい。

本方法の好適な実施態様としては、培養は液体培地中で行うことが好ましい。こ の液内培養に関しては、通常に液内培養で用いられるいずれの条件を使用しても よい。好適には、培養温度を１０″Ｃ〜３５°Ｃに、培地のｐＨを約６．５〜８ ．０の範囲に設定し、およそ２４〜７２時間醗酵させるのが好ましい。本発明の 栄養培地を使用した培養の好適な条件は、培養温度が約２２°Ｃ〜３０℃、ｐＨ が約７．２、培養時開が約３０〜３６時間である。

培地のｐＨは６．５〜８．０に調整されるが、好ましくは、７．０〜７．５であ る。ｐ・Ｈの調整には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムもしくは水酸化アン モニウムの水溶液を使用するが、これらの物に限定されない。これらは当業者に は既知のものである。

本発明の方法では、色素の形成は、培養菌の増殖に比例して増加し、約３０〜３ ６時間の培養で最大量の色素が得られる。

培養時間完了後、醗酵培地中のゼアキサンチン含有量を測定する。このためには 、まず遠心分離によりバイオマスを栄養基質から分離し、細胞からゼアキサンチ ンを抽出する。その抽出液中に含まれるゼアキサンチン量は、同じ溶媒に溶かし た合成ゼアキサンチンの標準溶液と比較することによって、比色定量することが できる。

培養が終わると、醗酵ブロスを濃縮し、極性有機溶媒を用いて、または超臨界流 体抽出によって、ゼアキサンチンを細胞から抽出する。極性有機溶媒としては、 例えばアセトン、ヘキサン、またはクロロホルムといった塩素化溶媒が例示され るが、これらに限定されない。例えば、Ｆ、Ｆａｖａｔｉ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、 Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉ、　５３（５）：１５３２−１５３５（１９８８）参照のこと 。

あるいは、バイオマスを培地から、例えば遠心分離、デカンテーシヨンまたは濾 過等の方法を用いて分離してもよい。遠心分離法を使用するなら、培地中にベン トナイトと塩化カルシウムを添加することによって、細胞回収を増加することが できる（実施例２参照）。好ましくは、ベントナイトと塩化カルシウムとを醗酵 ブロス中に添加し、その後、全ての生細胞を殺すために加熱処理する方法である 。それからブロスを遠心し、ペースト状の細胞の塊と未使用の培地ソリッドを回 収する。得られた細胞ペーストは、使用し易い粘度にまで水を加えてスラリーと する。色素の分解を防止または減少させるために、このスラリーの中にＥＤＴＡ 　（約０．２％）　、ＢＨＡ　（約０．０５％）、Ｔｗｅｅｎ　（約０．１％） 、及び酢酸トコフェロール（約０．０１５％）を添加しても良い。（）内に表示 したパーセント値は、スラリー中の細胞重量に基づいたものである。その後スラ リーを、例えばガラスピーズを用いた破砕器または高圧ホモジナイザーを使用し て均一化し、後に使用するため、乾燥しておく。好ましい乾燥方法は、スプレー 乾燥である。

このバイオマスは、例えばこのまま鶏の飼料中への添加物として使用してもよい し、またはさらに、前述したように極性有機溶媒で抽出してもよい。

この色素含有バイオマスは、好都合なことに、純粋なゼアキサンチン色素を単離 する必要なく、本発明に従って食料品の着色料として刹用することができる。一 方、細胞内のゼアキサンチンは、常法により細胞から分離することができる。ゼ アキサンチンの好適な分離、抽出方法は、細胞体を注意深く乾燥し、その乾燥細 胞体を粉砕し、粉砕した物を不活性有機溶媒で消化し、その溶液を濾過し、濾過 残渣を不活性有機溶媒で溶離することによって純粋なゼアキサンチンを単離する ものである。この好適方法の個々のステップは常套方法を用いて行うことができ る。ゼアキサンチンの分離に関して特に好ましくは細胞体をスプレー乾燥法にて 乾燥する。不活性有機溶媒としては、低級アルコール、好ましくはエタノール、 ケトン、好ましくはアセトン、もしくはハロゲンを含んだ炭化水素、うち好まし くはクロロホルム等が例示されるが、これらに限定しない。さらに特に好ましく は、酢酸エチル、低級アルコールまたはそれらの混合液中に濃縮残渣をとりだす 方法がとられる。更に特に好適な濾過方法は、シリカゲル、中性酸化アルミニウ ムまたはケイ酸マグネシウムに通して、溶液を濾過する方法である。なおより好 ましくは、ゼアキサンチンを塩素化炭化水素、好ましくは塩化メチレン、ジクロ ロエチレン、またはジ低級アルキルエーテル、好ましくはジエチルエーテルを用 いて溶出することである。もしくは、乾燥粉末を高圧下、ＣＯ，ガスで超臨界抽 出法を使用して抽出してもよい。

ＦｌａＶＯｂａＣｔｉｒｉｕｍによって製造された色素は、９５〜９９％までが ゼアキサンチンから成っている。試験の結果により、ＦｌａｗＯｂａＣａｔｅｒ ｉｕａ＋が産生したゼアキサンチンが　ｚｅａ　５ａｙｓから単離されるゼアキ サンチンと同一の物であることが確認されている。

ゼアキサンチンを抽出した後に残った、はとんど色素を含まない細胞体のほとん どが、家禽を飼育するうえで理想的な蛋白質（メチオニンやリジン等の必須アミ ノ酸）及びビタミン（特にビタミンＢ群のもので、とりわけビタミンＢｌ！であ る）の供給源として使用することができる。

本発明はまた、実施例４で示すＡＦＢ−４４株と実質的に同じ分類学的性質を持 ち備えている、Ｌ　■ｕｌｔｉｖｏｒｕｍのミュータント及びバリアントを包含 するものである。ミューテーシジンは上述したように、常套技術を使用して行う ことができる。

この明細書に記した全ての刊行物は、本発明に関連の技術に精通している当業者 の技術水準を示すものである。ここに挙げた全ての文献は、各々の刊行物もしく は特許出願を明細書に開示するために、特にまた個々に記載したにしたに等しい 程度に開示されたものとする。

前述した本発明は、より明確に理解してもらうために、説明と例により、詳細に 述べてきたが、言うまでもなく、後述の請求の範囲に記載した範囲において、変 更、修正して行ってもよい。

実施例 実施例Ｉ　Ｐ、ｍｕＨｉｖｏｒｕｍの単離黄橙色色素生産菌を探すため、自然界 から得られた様々なサンプルを、そのままペトリ皿中の寒天培地（２，０％寒天 、０．０２％ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ大豆ブロス、０．０２％酵母エキス、及び０ ．２５％塩化ナトリウム）上に画線培養することによって、スクリーニングした 。その上、それらサンプルは、寒天に画線接種する前に一種の強化方法として、 水を満たしたウィールパック・バック（ｗｈｉｒｌ−ｐａｃｋ　ｂａｇｓ）の中 で照明下、室温で３日間インキュベートした（０，５％塩化ナトリウム存在下） 。世界中から集めた多くの培養菌収集物から得られた色素生産菌は、ｔｒｙｐｔ ｉｃａｓｅ大豆寒天と１％の酵母エキスから成る斜面培地上で維持した。本発明 に記載のＦ、■ｕｌｔｉｖｏｒｕａ＋菌株ＡＦＢ−４４は、ミズーリー州のハイ リッジ（Ｈｉｇｈ　Ｒｉｄｇｅ）近辺に湧き出る新鮮な水から単離されたもので ある。

この方法で単離された、または培養菌コレクションから得られる数百もの菌株は 、その後色素スクリーニング用ブロス（１２１℃で３０分間高圧滅菌されたもの ）に植菌した。

Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ大豆ブロス　１．０％ピリドキシン　０．００１％ カシトン　０．２５％ リン酸二ナトリウム　１．０％ カゼインナトリウム　０．２５％ 酵母エキス　０．２５％ コーンステイープリカー　０．１％ メチオニン　０．１％ 硫酸第一鉄　０．０１％ 硫酸マグネシウム　０．０１％ 硫酸マンガン　０．０１％ 硫酸亜鉛　０．０１％ チアミン　０．０１％ グリセロール　０．５％ 培養菌を、照明下２５℃で７２時間、もしくは菌が充分生育するまで培養し、２ ５．０００　ｒｃｆで遠心、ペレット化させることによって集菌した。それらは 、３００ｍ１容のディンプルフラスコ（底壁に窪みのあるフラスコ）に５０ｍ１ ずつ小分けして、回転式培養器／振盪器で２５Ｏｒｐｍにて振盪し、生長させた ものである。集菌し得られた沈澱物を凍結し、アセトン抽出した。その後、遠心 し、得られた抽出物を乾燥し、再びヘキサン中に浸漬し、アルミナクロマトグラ フ装置に付し、キサントフィル精製用のＡＯＡＣ法を用いて展開した［Ｑｕａｃ ｋｅｎｂｕｓｈら、Ｊ、Ａｓ５ｏｃ、　Ｏｆｆ、Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、５６：７ ４６−７５３（１９７３）１．である、様々なフラクション、特にジヒドロキシ カロチノイドを集め、その各フラクションについてベックマン社の走査分光光度 計で、それらの吸収極大値を測定した。

数千からなるスタート単離物から、ゼアキサンチンと類似の吸収スペクトラムを 持ち、かつ類似のクロマトグラフィー保持時間を持つ１２検体が見つかった。こ れらの単離物を更に生育、抽出して、ゼアキサンチンである確証を得るために、 外部の専門家に逆相ＨＰＬＣによる同定を依頼した［Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ　 Ｆ、、Ｊ。

Ｌｉｑ、　Ｃｈｒｏｍ、　１０（４）　：６４３−６５３（１９８８）　］。そ れらのうち一つの培養菌が、ゼアキサンチンを主な色素として比較的純度よく生 産していた（９５％）。

この培養菌は、分類学的評価をするため、内容を明らかにせずに、２つの別々の 研究所に提出し分析を依頼した。双方の研究所の結論は共に、この培養菌は、既 知のゼアキサンチン生産細菌とは異なるものであるということであった。この培 養菌株は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕ＠　ａ＋ｕｌｔｉｖｏｒｕｍ株であると 特徴づけられた。

本発明はこの菌株でゼアキサンチンが生産されることを示した初めての報告であ る。

実施例２　Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｗの培養培養菌 は、プレートカウントアガー（Ｐｌａｔｅ　Ｃｏｕｎｔ　Ａｇａｒ）の傾斜チュ ーブ上で保育する。これらの斜面培養菌は植菌後、３０°Ｃにて２４時間培養し たものである。これらの保存用斜面培養菌は、液体培地への接種菌として使用す るため、冷蔵保存しておく。

液体培地の組成は以下の通りである。

コーンステイープリカー　７．０％ とうもろこし粉　５．０％ ＦｅＳＯ４０，００１％ 石鹸原料　１．０％ 酵母エキス　０．０５％ ＮａｔＨＰＯａ　ｏ、　１％ Ｔｅｒａｉａｎｙｌ　１２０Ｌ　０．１％水　８６．８３９％ ｔｏｏ、　ｏｏ％ この栄養培地は、濃（ＩＯＮ）水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７，６に調整した 。その後、培地を約８５℃で３０分間加熱し、澱粉をデキストリンに酵素的に加 水分解した。加熱処理した培地を更に１２１℃にて、３０分間滅菌した。冷却後 この培地に、上述した保存斜面培養菌から、或いは約２４時間前に植菌されたブ ロス培養液から植菌した。その植菌量は約５　Ｖ／Ｖ％である。

植菌された栄養培養液の生育条件は、培養温度が３０°Ｃ，ｐＨ７，２、培養時 間が３６時間、植薗量は５重量％で、更に連続的に通気をすることである。通気 は、溶解酸素量を常に５０％飽和濃度に維持するために充分な割合で空気をバブ リングさせながら、培養液３０ｍ１に対して３００ｍ１容のディンプルエルレン マイヤーフラスコを使用して振盪培養器で２０Ｏｒｐｍにて振盪することによっ て、または醗酵器内で４０Ｏｒｐｍにて攪拌することによって行われる。本実験 では空気供給速度を約０．２５ＶＶＭに設定した。

醗酵およそ１２時間後、培養液中にリパーゼとグルコアミラーゼを添加した（い ずれも少量で、培養液に対し約０．０３重量％、又は醗酵培養液ＩＬに対し、３ ０リパ一ゼ単位及び６ＡＧ単位）。

醗酵完了後、醗酵培養液に０．００８ｇ／ｌ〜０．０１ｇ／ｌのベントナイト及 び０．１６ｇ／ｌ〜０．４ｇ／ｌの塩化力）ｔｉ’／ウムを添加した後、遠心分 離し、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ細胞を培地から分 離、集菌した。それから、全ての生細胞を段すため、培養液を５０℃に加熱し、 さらに遠心して一塊の濃厚なペースト状細胞と未使用の培地ソリッドを回収した 。その後、細胞ペーストを再びスラリーにし、それにＥＤＴＡ　（０゜２％）、 酢酸トコフェロール（０，０１５％’）　、ＢＨＡ　（０゜０５％）及びＴｗｅ ｅｎ８０　（０，１％）を添加した。そして、スラーリーを均一化、ホモシネ− ジョンとし、今後の使用のために乾燥しておく。この乾燥物は、産卵鶏と食肉用 部用の食餌研究に使用した。さらに、その乾燥バイオマスを、保存安定試験に使 用するため、室温で２力月間保存した。

実施例３ 以下の実験は、文献や特許書類に記載の他の培地上での細胞生長に比べ、本発明 の方法が極めて優れ、宵月であることを示したものである。

以下の組成からなる培地を、記述した方法で、配合調製後高圧滅菌後、冷却させ たのち、ｐ、ｍｕｘｔｉｖｏｒｕｍ種を植菌する。

培地Ａ、Ｂ及びＣは、関連文献項に挙げた特許に記載されている培地である。培 地りとＥが本発明の栄養培地である。

培地のｐＨを全て７．５に調整し、定期的にチェックすることによってそのｐＨ 値を維持する。このｐＨ調整はただ培地Ｃにとって重要なものである。高圧滅菌 の直前にあらかじめ８０〜９０℃で３０分間加熱しておく培地りとＥ以外は、全 ての培地をそのまま１２１”Ｃで３０分間高圧滅菌した。培地ＥとＦ以外の全て の培地に、ＡＦＢ−４４株を５　ｖ／ｖ％植菌し、回転振盪器で２５Ｏｒｐｍに て、３０℃で２４時間、その後２６℃で２４時間培養し、遠心処理により集菌し た。培地Ｅ（ミュータント用）と培地Ｆには、ＡＦＢ−４４株から誘起されたミ ュータントを別々に植菌し、このケースでは、３０℃でちょうど３２時間培養し ミュータントを生育させた。以下の表にこれらの結果を示す。

細胞の生産量は、２０．０００ｒｃｆで１０分間遠心後、上滑をデカンテーショ ンし、得られたベレットを１０５℃で２４時間乾燥することによって計算した。

実際の細胞量は、醗酵液中の不溶解物を除去するために、まず培養液を３．００ ０ｒｃｆで遠心し得られたベレットを乾燥し、このベレットの乾燥重量を、通常 の細胞生産量から差し引くことによって計算した。ゼアキサンチン量は、凍結細 胞ベレットをアセトン抽出したのち、遠心分離し得られた抽出液のＯ、Ｄ　、　 ４　ｓ　ｍ値を、分光光度計で測定してめた。得られたこれらの実験値は、その 後吸光係数や希釈度に対する適当な係数で乗じることによって、実際のゼアキサ ンチン量をめた。

さらに、培地りを、他のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ 株を培養するために使用して、他のｐ、ｍｕｌｔｉＶＯｒｕａｔ株が本発明の栄 養培地でうまく育つかどうかを調べた。その結果、その栄養培地がゼアキサンチ ンの生産量を改善せしめることが示された。

培地りに、菌株に２３６１またはに１１８０（実施例４に記載）を植菌し、実施 例２に従って培養した。Ｋ２３６１は粗細胞産生量として２５ｇ／Ｉ、真の細胞 産生量として１３ｇ／ｌ及び１１μ／ｍｌ量のゼアキサンチンを生産した。Ｋ１ １８０は粗細胞産生量として２４．５ｇ／ｌ、真の細胞産生量として１２．５ｇ ／ｌ及び４μ／ｍｌ量のゼアキサンチンを生産した。Ｋ２３６１から得られる結 果は、本発明の栄養培地が細胞産生量、及びＦ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍのある菌 株によって生産されるゼアキサンチン量を改善することを示すものである。Ｋ１ １８０から得られる結果は、本発明のより安価な栄養培地によって、高価な栄養 培地を使用した場合と同じ、細胞産生量とゼアキサンチン量が生じることを示し ている。

これらの実験結果から、ｐ、＋ｎｕｌｔｉＶＯｒｕｍのＡＦＢ−４４株について 、以下のことが示唆される。

ａ）培地りとＥ（本発明品）は、先願の特許文献に記載の培地Ａ、Ｂ及びＣより も、極めて大量の細胞産生量とゼアキサンチン産生量を生じせしめる。

ｂ）培地ＣとＥは始めは殆ど同じ固形物質を有するものであるが、培地Ｅの方が より多くの細胞と色素を生産する。

Ｃ）培地Ａ、Ｂ及びＣは、培地りとＥに比べ非常に高価であるが、生産量は培地 ＤＳＥが優れている。

ｄ　）　ＡＦＢ−４４株のミュータントを培地Ｅで培養することにより、３２時 間という短い培養時間で、極めて大量の細胞と色素を生産された（言い換えると 、より生長が速い）。培地Ｅ中で、ＡＦＢ−４４ミユ一タント株は、今まで確立 された方法の中で最も高収量の細胞と色素を生産した。

ｅ）石鹸原料は植物油に代用され、同等量のゼアキサンチンを生産することがで きる。

実施例４　他のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｓ微生物との比較５８８Ｌ）とＡ ＴＣＣ１１９４７については米国特許３．８４１．９６７号３．９５１．７４２ 号及び３．９５１．７４３号に開示されている。ＡＴＣＣ２１０８１に関しては 米国特許３．８９１．５０４号と３．８４１．９６７号に開示されている。この 特許出願されている菌株、ＡＴＣＣ２１５８８と２１０８１は１９８４年出版Ｏ ８ｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌに記載されている新分類一覧表によると、Ｆ ｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に類別されないのに気付（であろう。

ＡＴＣＣＮｏ、２１０８１は、生長温度要求性と塩の絶対要求性において、ＡＦ Ｂ−４４株と明らかに異なっている。

ＡＴＣＣＮｏ、２１５８８は、醗酵及び利用様式の多くの点で、Ｆ、ｍｕｌｔｉ ＶＯｒＵｍと全く異なっている。Ｆ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ株は、３５℃のｍｏ ｔｉｌｉｔｙ−ｎｉｔｒａｔｅ　ａｇａｒ及びインフユージョンブロスノ中で良 く生長するのに対し、ＡＴＣＣ２１５８８は生長しない。その上、ＡＴＣＣ２１ ５８８はペニシリン、バンコマイシン感受性であるのに対して、ｐ、ｍｕｌｔｉ Ｖｏｒｕｍはそうではない。ＡＴＣＣ２１５８８はまたＬＡＮＡ陰性であり、構 造的に胞子類似物を生産することができた。この２つの特徴はＦｌａｖｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ属にはみられないものである。

分類学的な評価は、色素含有細菌の分類学に熟知した専門家によって実施された 。これによると、Ｆ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ菌株はＡＴＣＣ１１９４７，２１０ ８１または２１５８８と明らかに異なるという結果が得られ、この判断は、Ａ＠ ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎの微生物分類 サービスからの同じ結論によって支持された。

フルクトース　＋　＋ ガラクトース　＋　＋ メリビオース　Ｎ、　Ｄ、　Ｎ、　Ｄ。

ソルビタール　＋Ｗ トレハロース　＋　＋ シトレート十− ゼラチン　− フルオレッセンス　− ４２℃での生長　− Ｏｎ　ｃｅｔｒｉａ＋ｉｄｅ　− 加水分解　ｏｆ　Ｎｏ、　２１５８８　Ｎｏ、　ＡＦＢ−４４カゼイン　− ＤＮＡ　−−” た微生物を同定後、更に別のＦ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ株類を調査すべきあると 、調べた。Ｆ、ａ＋ｕｌｔｉｖｏｒｕａ＋株は、ＵＣＬＡ−フィクロバイオロジ ー・デパートメント・コレクション（ＵＣＬＡ−ＭｆｅｒｏｂｉｏｌｏｇｙＤｅ ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手でき、菌株番号はに−１２ １３、Ｋ−１２０４、Ｋ−１１８０、Ｋ−２３６１、Ｋ−２３０３であり、以下 の方法でＡＦＢ−４４株と比較した。それらの菌株はまずＰＣＡ斜面斜面上地上 育させ、そしてディンプルフラスコ中の液体培地に植菌後、往復振盪させながら ３０℃で２４時間、さらに２４°Ｃで４８時間生長させた。その後、遠心分離に よって集画した。この培養実験は、また、照明下で行った。サンプルは凍結ベレ ットからアセトンで抽出し、この抽出液を窒素気流下で乾燥し、再びヘキサン中 に浸漬し、アルミナ（中性）カラムクロマトグラフィーに付した。アセトン／ヘ キサン比を増加させることによって、溶出・分画を行い、各分画液の吸収極大値 を走査分光光度計で測定、検出した。以下に結果を示した。

この実験データから次のことがいえる。

ａ）意外なことに、他のＦ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ株もゼアキサンチンを生産す る。

ｂ）全てのＦ、ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ株が、十分量の色素を生産するようである （しかし、本実験ではに−２３０３は十分量の色素を生産しなかった。すなわち 、弱い色素生産菌で、ゼアキサンチンの生産も見られなかった）。

ｃ　）　ＡＦＢ−４４のワイルドタイプの菌株は他の菌株よりも、より大量の色 素を生産し、更にそのゼアキサンチン／全カロチノイド比も大きかった。

ｄ）カラムクロマトグラフィーの結果から、全ての菌株（Ｋ−２３０３は除く） により生産されるジヒドロキシカロチノイドが、主なゼアキサンチンであるよう である。

ｅ）公に入手できるｐ、ｌ１ｕ１ｔｉｖｏｒｕａ＋株はゼアキサンチンを生産す る。

ｆ）今まで知られていないＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋に属する群が、細胞 組成物である一般色素としてゼアキサンチンを持っている。

実施例６ 以下の食餌研究はバイオマス組成物が、色素材料となっている現在の商品と比べ て、生物学的利用性、安定性、さらに着色能力の点で優れていることを示すもの である。

実施例２で示したように調整し、２ｙ月間室温で保存しておいたバイオマス組成 物を食肉用の鶏に飼料として与え、マリーゴールドの花の、安定化したケン化抽 出物と比較した。規定飼料は以下の通りである。

材料　はじめ　生長（小麦） 小麦　４５．３２　６１．４６ とうもろこし　１０．００　１０．００大豆食　３１．３５　１４．３２ 家禽食　２．４０　６．００ 家禽脂肪　７．２８　５．３１ リメストン（Ｌｉａ＋ｅｓｔｏｎｅ）１．２４　１．０３Ｄｅｃａ１．　ｐｈｏ ｓ、　１．４４　０．９６塩　０．４０　０．３０ コリン　０．２０　０．２０ トレースミネラル　０．１０　０．１０ビタミンプレミックス０．０５　０．０ ５リジン　０．１２ ＤＬ−メチオニン　０．１８　０．１０コツシディオスタット０．０５　０．０ ５（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｔａｔ） 栄養分 蛋白質、＄　２３．００　１９．００ エネルギー（Ｋｃａｌ／Ｉｂ）　１４５０　１４５０カルシウム、％　１．００ 　０．９０ 全ｐｈｏｓ、％　０．７０　０．６５ ＴＳＡＡ、％　０．９３　０．７５ リジン、％　１．２６　１．００ 結果 ６週問　６週間　６週間 色スコア０平絢生体重量　食餌変化 （ｇｒａｎｔｓ） （色素無添加）　２．０　１５９１　１．８５マリーゴールド　抽出 ２５ｐｐａ＋　キすントフィル　６．７　１５４９　１．９０バイオ７ス　組成 物からの １０ρｐＨゼアキサンチン　７．１　１５４１　１．８７バイオ７ス　組成物か らの ２５ｐｐｌ　ゼ了キすンチン　９−３　１５５０　１．８４０　ロック色彩層［ Ｒｏｃｈｅ　ｃｏｌｏｒ　ｆａｎ　（ｓｈａｎｋ　ｃｏｌｏｒ　５ｃｏｒｅｓ） ］を使用して５人の評価人が主観的に評価採点した。

１８同様な結果（強さ）が他の２つの主のマリーゴールド抽出物からも得られた 。

以上の結果から、鶏に有害な影響は認められなかった。更に、バイオマス組成物 から得られる牛サントフィル１０ｐｐｍは生物学的に有用であり、自然界で安定 化、作られた最良のキサントフィル天然材料市販品、マリーゴールド抽出物から 得られるキサントフィル２５ｐｐｍと同等の効果があった。このキサントフィル は、改善された色素形成を示し、かつ着色がより早いため生物学的に有用である に違いない。この結果から、微生物由来の色素組成物が、高価な抽出、ケン化処 理をしなくても、意外にも極めて安定性が高く、生物学的に有用であることがい える。さらに、成長データにおいて、有害な影響は見られないことを付記する。

補正書の写しくｌＷ訳文）提出書（特許法第１８４条の８）工Ｊｆ、：４＊□１ □９ａ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｏｖｐｒｕｍ微生物、そのミュー タント、あるいはバリアントを、少なくとも１種類の同化吸収され得る炭素源と 少なくとも１種類の同化吸収され得る窒素源を含む栄養培地中で培養することよ りなる、ゼアキサンチン含有組成物の製造方法。 ２．Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍがＡＦＢ−４４株、 そのミュータント、あるいはバリアントである請求の範囲１記載の方法。 ３．Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ、そのミュータント 、あるいはバリアントが、下記の分類学的性質を持つもの請求の範囲１記載の方 法； ペニシリン非感受性、バンコマイシン非感受性、ポリミキシン非感受性；強いオ キシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性、グラム陰性桿菌；非運動性；強いスクロース 陽性、マンニトール陰性；エタノール陰性；尿素陽性；及びタンパク非分解性。 ４．少なくとも４０ｇ／ｌ量のゼアキサンチン含有細胞を生産する請求の範囲１ 記載の生産方法。 ５．栄養培地がコーンスティブリカーまたは他の同化吸収され侍る窒素源液、及 び酵素処理した炭素原を含有する請求の範囲１の方法。 ６．酵素がα−アミラーゼである請求の範囲５記載の方法。 ７．培地中のグルコース量が約０．０３５重量％未満である請求の範囲１記載の 方法。 ８．同化吸収され得る炭素源が、とうもろこし、米、ミロ（ｍｉ１０）、小麦、 麦芽デキストリン、小麦粉及びデンプン、更にこれら穀類由来のデンプン、及び グルコースから成る群から選択される請求の範囲１記載の方法。 ９．同化吸収され得る窒素源が、コーンスティプリカー、加水分解されたカゼイ ン、加水分解された大豆、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニア 、酵母エキス、蛋白質加水分解物及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイオマス の加水分解物から成る群から選択される請求の範囲１記載の方法。 １０．培養工程が、温度約１６〜約３８℃、ｐＨ約６．０〜約８．５、培養時間 的２４〜約７２時間で実施される請求の範囲１記載の方法。 １１．当該方法が約３２時間内で実質的に完了する請求の範囲１０記載の生産方 法。 １２．栄養培地が水溶液である請求の範囲１記載の方法。 １３．培養が、約２２〜約３４℃で実施される請求の範囲１記載の方法。 １４．培養が、ｐＨ約６．５〜約８．０で実施される請求の範囲１０記載の方法 。 １５．培養が、約２４〜約７２時間で実施される請求の範囲１記載の方法。 １６．当該方法が、約３２時間内で実質上完了する請求の範囲１記載の方法。 １７．培養中、栄養培地に、更に酵素を添加することを含む請求の範囲１記載の 方法。 １８．当該酵素がグルコアミラーゼ、リパーゼまたはそれらの混合物である、請 求の範囲１７記載の方法。 １９．当該栄養培地に色素形成促進剤を添加することによる請求の範囲１記載の 方法。 ２０．同化吸収され得る炭素源及び同化吸収され得る窒素源を含む栄養培地で、 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｍｒｕｍ微生物を培養してゼアキサ ンチン含有細胞体を生成することよりなるゼアキサンチンの製造方法。 ２１．更にゼアキサンチン含有細胞体から、ゼアキサンチンを分離する工程から なる請求の範囲２０記載の方法。 ２２．微生物を水性培地中、約２２〜約３４℃で培養する請求の範囲２０記載の 方法。 ２３．当該細胞体からゼアキサンチンを分離し；当該細胞体を不活性有機溶媒で 消化してゼアキサンチンを溶解させ；ゼアキサンチンから溶媒を除去することに よる請求の範囲２０記載の方法。 ２４．有機溶媒を数発させることによってゼアキサンチンから除去する請求の範 囲２３記載の方法。 ２５．栄養培地が、約１〜約７重量％の同化吸収され得る炭素源、及び約３〜約 １０重量％の同化吸収され得る窒素源を含有したものである請求の範囲１記載の 方法。 ２６．培養ステップに続いて、ゼアキサンチンを微生物細胞から溶媒抽出する請 求の範囲請求項１記載の方法。 ２７．以下の工程からなるゼアキサンチン製造方法。 同化吸収され得る窒素源、同化吸収され得る炭素源、ミネラル、脂肪源、および 生長因子から成る栄養培地で、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏ ｒｕｍ細胞を醗酵させ、醗酵液を生成する；この醗酵液から、細胞を細胞ペース トとして分離する。 このペーストをスラリー化する； このペーストをホモジネーションにする；さらに、このペーストを乾燥する。 ２８．当該ペーストを保護剤と乳化剤の存在下でスラリー化する請求の範囲２７ 記載の方法。 ２９．保護剤が抗酸化剤、キレート剤またはそれらの混合物である請求の範囲２ ８記載の方法。 ３０．請求の範囲１の方法に従って調製された組成物。 ３１．請求の範囲２７の方法に従って調製された組成物。 ３２．以下の工程からなるキサントフィルの製造方法。 同化吸収され得る窒素源、同化吸収され得る炭素源、ミネラル、脂肪源、及び生 長因子から成る栄養培地でＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕ ｍ微生物細胞を醗酵させ、醗酵液を生成する。 ３３．更に、当該醗酵液から当該細胞を細胞ペーストとして分離する； このペーストをスラリー化する； このペーストをホモジネーションにする；さらに、このペーストを乾燥する； 請求項３３記載の方法。 ３４．当該ペーストを保護剤と乳化剤の存在下でスラリー化する請求の範囲３２ 記載の方法。 ３５．保護剤が抗酸化剤、キレート剤またはそれらの混合物である請求の範囲３ ４記載の方法。 ３６．同化吸収され得る炭素源が、酵素処理されたものである請求の範囲３２記 載の方法。 ３７．同化吸収され得る炭素源が、とうもろこし、米、麦芽、小麦、麦芽デキス トリン、小麦粉及びデンプン、これら穀類由来のデンプン、及びグルコースから 成る群から選択されるものであり、かつ同化吸収され得る窒素源が、コーンステ ィプリカー、加水分解されたカゼイン、加水分解された大豆、リン酸アンモニウ ム、硫酸アンモニウム、アンモニア、酵母エキス、蛋白質加水分解物及びＦｌａ ｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイオマスの加水分解物から成る群から選択される請求 の範囲１記載の方法。 ３８．同化吸収され得る炭素原及び同化吸収され得る窒素源を含む栄養培地で、 Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ微生物を培養して ゼアキサンチン含有細胞体を生成することよりなるゼアキサンチン含有組成物の 製造方法。 ３９．更にゼアキサンチン含有細胞体から、ゼアキサンチンを分離する工程を含 む請求の範囲３８記載の方法。 ４０．Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｍがＡＦＢ−４４株、 またはそのバリアント、もしくはミュータントである請求の範囲記載の方法。 ４１．Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ、そのバリアント 、もしくはミュータントが、下記分類学的性質を持つものである請求の範囲３９ 記載の方法。 ペニシリン非感受性、バンコマイシン非感受性、ポリミキシン非感受性；強いオ キシダーゼ陽性、カタラーゼ陽性、グラム陰性桿菌；非運動性；強いスクロース 陽性、マンニトール陰性；エタノール陰性；尿素陽性；及びタンパク非分解性。 ４２．少なくとも４０ｇ／ｌ量のゼアキサンチン含有細胞を生産する請求の範囲 ３９記載の方法。 ４３．栄養培地が、コーンスティプリカーまたは他の同化吸収され得る窒素源液 、及び酵素処理した炭素源を含有している請求の範囲３９記載の方法。 ４４．酸素がα−アミラーゼである請求の範囲４３記載の方法。 ４５．培地中のグルコース量が約０．０３５重量％未満である請求の範囲３９記 載の方法。 ４６．同化吸収され得る炭素源が、とうもろこし、米、麦芽、小麦、麦芽デキス トリン、小麦粉及びデンプン、これら穀類由来のデンプン、及びグルコースから 成る群から選択される請求の範囲４３記載の方法。 ４７．同化吸収され得る窒素源が、コーンスティプリカー、加水分解されたカゼ イン、加水分解された大豆、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、アンモニ ア、酵母エキス、蛋白質加水分解物及びＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイオマ スの加水分界物から成る群から選択される請求の範囲３９記載の方法。 ４８．培養が、温度約３６〜約３８℃、ｐＨ約６．０〜約８．５、培養時間約２ ４〜約７２時間で実施される請求の範囲３９記載の方法。 ４９．培養が約３２時間内で事実上完了する請求の範囲４８記載の方法。 ５０．栄養培地が水溶液である請求の範囲３９記載の方法。 ５１．培養が、温度約２２〜約３４℃で実施される請求の範囲３９記載の方法。 ５２．培養が、ｐＨ約６．５〜約８．０で実施される請求の範囲３９記載の方法 。 ５３．培養が、約２４〜約７２時間で実施される請求の範囲３９記載の方法。 ５４．培養が約３２時間内で実質上完了する請求の範囲３９記載の方法。 ５５．培養中、栄養培地に、更に酸素を添加することを含む請求の範囲３９記載 の方法。 ５６．当該酵素が、グルコアミラーゼ、リパーゼまたはそれらの混合物である請 求の範囲３９記載の方法。 ５７．栄養培地に色素形成促進剤を添加することによる請求の範囲３９記載の方 法。 ５８．請求の範囲３２の方法に従って調製した組成物。 ５９．Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｄｔｉｖｏｒｕｍ細胞の醗酵液か ら回収された、ゼアキサンチンを含有するＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｕｍ 　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍの死細胞、残滓及び未使用の固形栄養培地からなる、組 成物。 ６０．更に、少なくとも１種類の保護剤を含有する請求の範囲５９に記載の組成 物。 ６１．更に、少なくとも１種類の保護剤及び少なくとも１種類の乳化剤を含有す る請求の範囲５９に記載の組成物。 ６２．当該組成物が飼料組成物である請求の範囲５９に記載の組成物。 ６３．当該組成物が家禽用飼料成物である請求の範囲５９に記載の組成物。 ６４．当該組成物がサケ用飼料組成物である請求の範囲５９に記載の組成物。 ６５．当該組成物が食品着色料組成物である請求の範囲５９に記載の組成物。 ６６．ゼアキサンチン含有Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕ ｍ細胞と栄養培地から成る組成物。 ６７．ゼアキサンチン含有Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｕｌｔｉｖｏｒｕ ｍ細胞から成る群の少なくとも１つのものと、栄養培地から成る組成物。 ６８．当該組成物が飼料組成物である請求の範囲６７に記載の組成物。 ６９，当該組成物が家禽用飼料組成物である請求の範囲６７に記載の組成物。 ７０．更に少なくとも１つの保護剤を含む請求の範囲６７に記載の組成物。