PT95088B

PT95088B - Processo para a preparacao de zeaxantina e de composicoes que contem zeaxantina

Info

Publication number: PT95088B
Application number: PT95088A
Authority: PT
Inventors: Dennis L Gierhart
Original assignee: Applied Food Biotechnology
Priority date: 1989-08-30
Filing date: 1990-08-23
Publication date: 1997-10-31
Also published as: DE69030817T2; JPH11206339A; EP0534955B1; WO1991003571A1; JP2887848B2; EP0534955A1; JP3361064B2; KR927003840A; PT95088A; DE69030817D1; ES2104608T3; EP0534955A4; GR1000713B; US5427783A; DK0534955T3; US5308759A; GR900100566A; ATE153700T1; KR0148133B1; JPH05508532A

Description

ANTECEDENTES E RESUMO DA INVENÇÃO

A zeaxantina (3,3 -dihidroxi-θ-caroteno) é um carotenoide que dá a cor amarela aos cereais, gemas de ovo e à pele de aves domésticas. Pode ser usada como aditivo alimentar e como corante nas indústrias cosméticas e alimentares.

A zeaxantina pura e a massa celular, que contém os pigmentos fabricada de acordo com o processo descrito nesta invenção , podem ser usadas para colorir produtos alimentícios, assim como para colorir produtos cosméticos. A massa celular que contém pigmentos é particularmente adequada na coloração de pernas, bicos, pele, gordura, carne e gema de ovo de aves domésticas.

A zeaxantina é sintetizada biologicamente por muito.poucas espécies de bactérias do género piavobacterium. Com raras excepções, todas as espécies Flavobacterium podem ser convenientemente divididas em duas categorias: 1) Fortemente proteolíticas (digestão da gelatina, caseína e soro coagulado) e 2) não proteolíticas. A F. meningosepticum (biovar lia) e a E. indologenes (biovar Ilb) são sempre proteolíticas; outras flavobactérias não o são (IIc, Ile, Ilh, Ili, IIk-2). A F, multivorum é uma das três espécies agora pertencentes ao grupo CDC IIk-2 (não proteolíticas).

Para os avicultores, tem existido uma longa história de problemas com a estabilidade e disponibilidade biológica, particularmente com xantéfilos de cravo e alfafa. Muito trabalho cotinua na medição e melhoramento destas propriadades. A maior parte dos produtos de cravo tem que ser extraída com um dissolvente e saponificados, e podem exigir a presença de antioxidantes no processo de extracção (Marusich e Bauerfeind, Carotenoides como corantes e percursores da Vitamina A; ed., J. C. Bauerfeind, Academic Press, 1981). Estudos alimentares apresentados no Exemplo 6 comparam directamente uma quantidade conhecida de pigmento versus vários extractos derivados de cravos ;

Ds dados indicam que a composição da presente invenção é biologicamente disponível e estável, pigmenta mais rápido e é 2-3 vezes mais potente, na pigmentação, que os xantófilos de cravo. E conhecido que várias espécies de Flavobacterium, quando em certas condições e/ou usando um meio nutriente, são capazes de produzir zeaxantina (ver a secção de Literatura relevante) .

i

E também conhecido que maiores produções de zeaxantina podem ser obtidas com a cultura de um microrganismo do género Flavobaeterium em condições onde as quantidades de carbono e azoto presentes no meio de cultura, sejam mantidas em fluxo substancialmente constante. 0 meio nutriente destes processos requer glucose e outros nutrientes, ingredientes nutritivos que são relativamente caros e que requerem um longo período de cultura.

Por outro lado a presente invenção fornece um processo para preparar zeaxantina pelo cultivo de um microrganismo produtor de zeaxantina de Flavobacterium multivorum. Foi a primeira vez que estas espécies de Flavobacterium mostraram produzir pigmentos. Além disto, o meio nutritivo no qual o microrganismo é cultivado é um meio nutritivo relativamente barato. Por últim o período de cultivo é mais rápido e eficiente do que os dos métodos conhecidos.

Em conformidade, um objectivo desta invenção é fornecer um processo para a preparação de zeaxantina usando uma estirpe de Flavobacterium multivorum ou um respectivo mutante ou variante.0 processo desta invenção torna possível obter maiores quantidades de zeaxantina e maiores produções celulares Has

/.

células que contêm zeaxantina, em comparação com microorganismos e processos conhecidos.

Outro objectivo é fornecer um processo para produzir maiores rendimentos de pigmento zeaxantina disponível biologicamente.

Outro objectivo é fornecer um processo para produzir zeaxantina usando microorganis.mos que não sejam fastidiosos, cresçam rápidamente e não sejam patogénicos. Estes microorganismos são também capazes de usar meios nutrientes contendo diferentes fontes de carbono.

Outro objectivo é fornecer um meio nutriente económico e comer cialmente viável que optimize a quantidade de zeaxantina produ zida, forneça uma alta produção celular, uma alta produção de zeaxantina, e decresça o período de fermentação da produção de zeaxantina.

Outro objectivo é fornecer espécies bacteriológicas que produzam zeaxantina.

Outro objectivo é fornecer um microorganismo ainda não conheci do como produtor de zeaxantina.

Estes objectivos e outros vêm na seguinte descrição da invenção e nas reivindicações.

LITERATURA RELEVANTE

A patente U.S. 3.891.504 revela composições e um método de produzir zeaxantina. As duas espécies Fiavobacterium são identificadas como ATCC Nos. 21588 21081. Estas estirpes foram fer mentadas num meio nutriente que incluia glucose, triptona e um extracto de levedura, e foram sujeitas a um processo que inclui mudanças de temperatura e o uso de promotoreg pjcjmentatórios (metil-ésteres de. ácido láctico e de ácido palmítico).

As patentes U.S. 3.841.967; 3.951.742 e 3.951.743 revelam o uso de estirpes Fiavobacterium (identificadas como ATCC Nos. 21588, 21081 e 11947) num processo de produção de zeaxantina usando um método similar ao da produção do caroteno. 0 proces so envolve o crescimento do microorganismo num meio nutriente de glucose batch-feed, com a excepção de que a cultura é continuamente alimentada com nutrientes adicionais para manter constante a razão de carbono/azoto. Estas patentes também reve lam um processo de mutação para isolar estirpes de bactérias com alta produção de pigmentos. 0 processo usando este mutante produz grandes níveis de zeaxantina, mas não é economicamente aceitável.

A patente U.S. 4.026.949 revela a produção de intermediários opticamente activos, usados na produção de carotenoides como a zeaxantina; A bactéria usada neste processo é a Flavobactérium dehydrogenans.

DESCRIÇÃO ESPECIFICA DA INVENÇÃO

A presente invenção envolve a produção de zeaxantina usando jm microorganismo Flavobacterium multivorum até agora não coihecido como produtor deste pigmento. A invenção envolve o iso lamento de células de Flavobacterium multivorum e a cultura festas num meio nutriente ccm condições nas quais a zeaxantina 3 produzida em quantidades recuperáveis. As células microbiais iodem ser separadas do licor em fermentação e usadas em composições biomássicas.

Em conformidade, a presente invenção é um processo para produzir zeaxantina usando Flavobacterium multivorum , e composições que incluam células de Flavobacterium multivorum ou partes de células, e composições que incluam zeaxantina produzida por Flavobacterium multivorum.

termo Flavobacterium multivorum, é suposto incluir todos os microorganismos do género Flavobacterium e espécies multivorum que produzam zeaxantina, incluindo as suas subculturas (mutantes ou variantes) e que não podem ser diferenciadas da(s) estirpe(s) de bactérias descritas nos exemplos ou no manual Bergey (Edição de 1984). As características da F. multivorum são fornecidas abaixo, e uma taxonómica da estirpe F. multivorum AFB-44 é fornecida no Exemplo 4. 0 termo mutantes quando usado aqui inclui mutantes produzidos por variados meios da F, multivorum, incluindo os, mas não limitado aos, agentes químicos mutagénicos, radiação ultravioleta, exposição à fagocitose e processos análogos. Estes processos são bem conhecidos a profissionais da ciência. Os mutantes descritos nesta patente foram sujeitos a mutagénesis padrão por NTG (n-metil-N-nitrosoguanidina) e a radiação ultravioleta, como descrito no Manual de métodos para bacteriologia geral; ASM 1981, capítulo 13. 0 termo variantes quando usado aqui, inclui variantes da F, multivorum incluindo mas não limitado às descritas no Manual Bergey (Edição de 1984) . o termo biomassa quando usado aqui incluí células F. multivorum não viáveis contendo zeaxantina, restos residuais, incluindo sólidos não usados do meio, recuperados da fermentação de células vivas de F. multivorum e pós derivados deste material. A citada biomassa pode também incluir certos aditivos bem conhecidos, protectores, emulsionadores e pós estabilizados derivados deste material.

A biomassa pode ser posta num transportador inerte contendo por exemplo, amido e/ou pé residual da fermentação e/ou uma r % -

αυ mais farinhas.

A F. multivorum cresce em colónias, moles e não-pigmentadas, de menos de 1 mm numa placa de 1 dia com agár de sangue de ovelha; a placa não mostra zonas de inibição à volta de discos de penicilina, vancomicina e polimixina. Os microorganismos são fortemente positivos à oxidase, à catálase, com bastonetes gram-negativos; sem mobilidade; fortemente positivos à sacarose (a maior parte das bactérias sem fermentação são negativas à sacarose); sempre negativos ao manitol e etanol; e positivos à ureia.

A produção de zeaxantina de acordo com a presente invenção pode ser feita usando técnicas de cultura convencionais bem conhecidas dos profissionais na arte de produzir zeaxantina. E de ver, por exemplo, as patentes U.S. 3.891.504; 3.841.967; 3.951.741 e 3.951.743. Para abreviar, as células de F. multivorum podem ser isoladas de uma maneira conhecida, as culturas amarelas podem ser purificadas e sujeitas a cultivo em meio nutriente sólido ou em soluções nutrientes líquidas sobre condições nas quais a zeaxantina é produzida intracelularmente.

A célula pode ser extraída com dissolventes orgânicos, e a zeaxantina analisada usando espectrofotometria e cromatografia líquida de alta pressão.

No entanto, de acordo com esta invenção, o processo preferido para produzir zeaxantina é apresentado no Exemplo 2.

De preferência, o isolamento e cultura pura dos microorganismos amarelos de Fiavobacterium desta invenção, é efectuada da seguinte maneira. Material de uma fonte ou outros produtos naturais usados como fonte de microorganismos, é suspensa em sole ção salina fisiológica. Culturas listradas foram postas em disc os de petri. Em seguida, as culturas amarelas em crescimento ágar são examinadas no teor em carotenoides de colónias de F. multivorum que podem ser identificadas por comparação destas células com as descrições taxonómicas do Manual Bergey (Edição de 1984) .

Finalmente, os microorganismos F. multivorum desta invenção são identificados pelo seu conteúdo em zeaxantina (confirmado por métodos analíticos, de preferência cromatografia líquida de alta performance; F. Quackenbush, J. Liquid Chromatografy, 10(4) pp. 643-653 (1987) e isolados. Métodos para determinar microorganismos produtores de zeaxantina incluem, embora não estando limitados a, cromatografia líquida de alta performance. Outros processos para isolar a F. multivorum são conhecidos dos profissionais na arte, e são adequados ao uso nesta invenção. Estirpes de F, multivorum também estão disponíveis através da American Type Culture Collection ou de outros depósitos públicos ou privados por todo o mundo.

Os microorganismos usados neste processo podem ser cultivados num meio nutriente da maneira convencional. Na cultura dos microorganismos, muitos meios nutritivos sólidos (ou qualquer solução de meio líquido convencional) que contenham carbono ou azoto assimilável, podem ser utilizados. 0 termo meio nutriente designa um meio de cultura contendo as substâncias assimiláveis necessárias para o crescimento dos microorganismo

Estas substâncias incluem, em particular, uma fonte de carbono pronto a ser assimilado, uma fonte de azoto pronto a ser utilizado e sais minerais como é dito abaixo. 0 meio nutriente pode também conter aditivos opcionais como vitaminas, promotores da formação de pigmentos, factores de crescimento, certos sais inorgânicos como o NaCl (que está convencionalmente presente nesses meios) e elementos vestigiais, como é dito

// _ ' / --Λ

abaixo .

No entanto, de acordo com a presente invenção, o meio preferido tem a seguinte composição (as percentagens são feitas em peso total do meio):

fonte de azoto fonte de carbono minerais Na₂ HP0₄

Fonte de gordura Factor(es) de crescimento enzima água o restante

Fontes de azoto pronto a ser assimilado incluem, mas não estão limitadas a numerosas substâncias de origem animal, vegetal e/ou microbial assim como compostos inorgânicos de azoto. Dentro das fontes preferidas de azoto pronto a ser assimilado estão a farinha de soja, farinha de peixe, farinha de carne, extracto de carne, peptona, licor de infusão de cereais, extracto de fermento, aminoácidos, sais de amónio (como o fosfa to de amónio ou sulfato de amónio) , e produtos da hidrólise de proteínas, em particular produtos obtidos pela hidrólise acídica ou enzimática de proteínas vegetais como de feijões de soja, soja ou proteínas de amendoim e/ou o produto da hidrólise da caseína chamada triptona. A fonte de azoto pode também conter um material preparado por hidrólise acídica ou enzimática da biomassa recuperada como um produto secundário da biosíntese de um pigmento carotenoide por cultura de uma bactéria do género Flavobacterium, em particular pela hidrólise da biomassa da Flavobacterium cultivada para a produção de zeaxantina e da qual o pigmento foi extraído.

& fonte mais utilizada de azoto assimilável é o licor de infusão de cereais, por causa do seu baixo custo e da presença de factores de crescimento favoráveis.

Fontes de carbono pronto a ser assimilado incluem mas não estão limitadas a açucares e seus polímeros, como os amidos, dextrina, sacarose, maltose, lactose, glucose e molasses; ácidos gordos e polialcoóis como a glicerina. As fontes preferidas de carbono incluem cereais, farinha de cereais, arroz, milho painço, trigo amido, lactato, acetato e glucose. A melhor é a farinha de cereais, por causa do seu preço, tamanho das suas partículas, e uso da cultura até níveis variando de 1-7% por peso médio total. Como é evidente para os técnicos, cereais, farinha de cereais e amido requerem um tratamento de liquefacção com uma enzima como a o< -amilase (disponível comercialmente como termamyl 120L), que hidrolisa o amido a dextrina. Sem este tratamento, o amido agregar-se-ia numa massa sólida quando aquecido. No entanto, uma hidrólise enzimática excessiva reduz os rendimentos, enquanto uma hidrólise insuficiente diminui os mesmos e aumenta o tempo de fermentação.

Os meios nutrientes também podem conter elementos vestigiais provenientes dos ingredientes orgânicos ou minerais. Por exemplo, o enxofre ou o fósforo podem provir destes ingredientes presentes no meio nutriente, ou então serem especificamente adicionados ao meio nutriente. Se desejado ou requerido podem também ser adicionados ao meio nutriente, agentes promotores do crescimento ou estimulantes como, por exemplo, as vitaminas. Os minerais preferidos têm baixos níveis de sulfato de ferro (melhora o crescimento celular) e de fosfato dissódico.

A fonte de gordura inclui, mas não está limitada a resíduos de sabão, óleo de feijões de soja, óleo de girassol e azeite;

G

A, os resíduos de sabão são os preferidos.

A cultura é, de preferência, feita empregando determinados factores de crescimento ou aditivos promotores do rendimento, no meio. 0 factor de crescimento preferido é o extracto de levedura.

As estirpes utilizáveis para o processo de cultivo podem ser introduzidas no recepiente de fermentação a partir da cultura listrada da placa, de acordo com métodos conhecidos. Os mé todos preferidos são os via cultura de ágar inclinado e a cul tura líquida frasco-vidro.

A cultura dos microorganismos sobre as condições que levam à formação de zeaxantina de acordo com o processo desta invenção pode ser feito de qualquer maneira convencional. Dado a melhor forma de executar este processo, a cultura faz-se em meio aquoso. Ao fazer esta cultura submersa, quaisquer condições convencionalmente usadas em culturas submersas, podem ser utilizadas. No processo preferido, a fermentação é feita a uma temperatura entre os 10 e os 35°C, numa gama de pH entre 6,5 e 8, e durante cerca de 24 a 72 horas. As condições preferidas para o processo de cultivo usando o meio nutriente da presente invenção são: a temperatura entre 22 e 30°C, um pH de cerca de 7,2 e um período de cultivo de cerca de 30-36 horas.

pH do meio de cultura é ajustado entre 6,5 e 8,0, preferencialmente entre 7,0 e 7,5. 0 ajuste de pH pode ser efectuado com substâncias incluindo mas não limitado a soluções aquosas de hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de amónio. Estas substâncias são bem conhecidas dos profissionais desta arte. No processo desta invenção, a formação do pigmento aumenta directamente com o crescimento da cultura, com um máximo de formação de pigmento, obtido em cerca de 30-36 horas.

Depois do tempo de cultura estar completo, o conteúdo em zeaxantina do meio de fermentação pode ser determinado. Para este fim, a biomassa é separada do substrato nutriente por centrifugação e a zeaxantina é extraída das células. 0 conteúdo em zeaxantina da solução extraída pode ser determinado calorimétricamente por comparação com soluções padrão de zeaxantina sintética no mesmo dissolvente.

No fim da cultura, o caldo de fermentação pode ser concentrado e a zeaxantina extraída das células usando um dissolvente orgânico polar, incluindo mas não limitado a acetona, hexano ou um dissolvente clorado como o clorofórmio, ou por extracção com um fluído supercrítico. Ver, por exemplo, F.Favati, et al. , J. Food Sei. 53(5): 1532-1535 (1968).

Alternativamente, a biomassa pode ser separada do meio de cultura, por exemplo por centrifugação, decantação ou filtração. Se for por centrifugação, a recuperação de células pode ser melhorada pela adição de bentonite e cloreto de Cálcio (ver Exemplo 2). No método preferido, a bentonite e o cloreto de Cálcio são adicionados ao caldo de fermentação, o qual é então aquecido para matar quaisquer células viáveis. 0 caldo é depois centrifugado para recuperar a pasta de células e sólidos não usados do meio. A pasta de células pode ser diluída em água para obtermos uma viscosidade aceitável. EDTA (cerca de 2%), BHA (cerca de .05%), Tween (cerca de .1%) e acetato de tocoferol(cerca de .015%) podem ser adicionados à diluição para prevenir ou reduzir a diminuição de pigmentos; A percentagem usada é baseada no peso celular da diluição. A diluição i ⁰jí Λ é então homogenizada (usando por exemplo ruptura das células com esferas de vidro ou um homogenizador de alta pressão) e seca para uso futuro. 0 método de secagem preferido é a secagem por spray.

A biomassa pode ser usada como aditivo nas rações de galinhas por exemplo, ou pode também ser extraído com um dissolvente orgânico polar, como foi dito acima.

A biomassa, que contém pigmento, pode ser utilizada com vantagem, em conformidade com esta invenção, para corar alimentos sem a necessidade de isolar o pigmento zeaxantina puro.

Por outro lado, a zeaxantina intracelular pode ser separada das células duma maneira convencional. Um dos métodos preferidos de separar ou extrair a zeaxantina, envolve uma secagem cuidadosa da massa celular; pulverização da massa celular já seca; digestão do material pulverizado com um dissolvente origânico inerte; filtração da solução e o isolamento da zeaxantina pura por eluição do resíduo da filtração com um dissolvente orgânico inerte. Cada passo individual deste método prejferido pode ser feito de uma maneira convencional. De acordo

Íom um método particularmente preferido de separar a zeaxanina, a massa celular é seca por secagem de spray. Os dissolentes orgânicos inertes incluem, mas não estão limitados, a lcanois baixos, de preferência o etanol; cetonas, de prefeência a acetona; ou a hidrocarbonetos de halogéneos, de referência o clorofórmio. Ainda particularmente preferido é o processo de apanhar o resíduo da evaporação em acetato de etilo, num alcanol baixo ou na mistura destes. Ainda particularmente preferido é filtrar a solução com sílica gel, óxido neutral de alumínio ou silicato de magnésio. Ainda preferível é eluir a zeaxantina com um hidrocarboneto clorado, particularmente o cloreto de metileno ou o dicloroetileno ou um di-

alquilo éter baixo, particularmente o éter dietílico. Alternativamente, o pó seco pode ser extraído fazendo extracção supercrítica _com CO2 gasoso sobre pressões altas.

pigmento formado pela Flavobacterium consiste até 95-99 por cento de zeaxantina. Testes mostram que a zeaxantina produzida por Flavobacterium é idêntica à zeaxantina isolada do Zea mais.

A restante massa celular, já quase sem pigmentos depois da extracção da zeaxantina, pode ser usada como fonte ideal de proteínas (aminoácidos essenciais como a metionina e lisina) e vitaminas (especialmente vitaminas do grupo B e, particular mente, a vitamina B^) para a criação de aves domésticas.

A presente invenção também inclui mutantes e variantes da F. multivorum tendo estes, essencialmente as mesmas caracteristi cas taxonomicas que a estirpe AFB-44 apresentada no Exemplo

4. Mutações podem ser induzidas por técnicas convencionais, como dito acima.

Todas as publicações mencionadas nesta especificação são indicadoras do nível daqueles que são peritos no domínio, ao qual esta invenção pertence. Todas as publicações são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação individual ou cada patente fosse específicamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência .

Embora a precedente invenção tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustrações e exemplos para melhor entendimento, é óbvio que certas mudanças podem ser praticadas den tro do espectro das reivindicações anexas.

EXEMPLOS

Exemplo _1. Isolamento da F. multivorum

Examinaram-se amostras do meio ambiente quanto ao seu conteúdo em bactérias pigmentadas de amarelo-alaranjado através de listras de amostras feitas directamente numa placa de Petri com meio de agár (2,0% agár, 0,02% caldo de soja tripticase, 0,02% de extracto de levedura e 0,25% de cloreto de sódio). As amostras foram ainda inoculadas com iluminação em sacos para enchimento em turbilhão cheios de água durante 3 dias à temperatura ambiente, como processo enriquecedor (com 0,5% de cloreto de sódio) prévio à listragem em agár. Estirpes pigmentadas de um certo número de colecções de culturas em todo o mundo foram mantidas em declives de agár de soja tripticase + 1% de estracto de levedura. A estirpe descrita, F. multivorum AFB-44 foi isolada de uma nascente de água fresca perto de High Ridge, Missouri.

Centenas de estirpes isoladas desta maneira ou obtidas de colecções de culturas, foram então inoculadas num caldo examinador de pigmentos (esterilizadas em autoclave a 121°C;

minutos):

Caldo de soja tripticase Piridoxina

Casitono

Fosfato dissódico

Caseínato de sódio Extracto de levedura Licor de infusão de cereais Metionina

Sulfato ferroso

1,0%

0,001%

0,25%

1,0%

0,25%

0,1%

0,ol%

Sulfato de	.. + + Mg	0,ol%
Sulfato de	.. ++ Mn	0,01%
Sulfato de	7 + + Zn	0,01%
Tiamina		0,01%
Glicerol		0,5%
pH		7,8

As cultura foram incubadas a 25°C (com iluminação) durante 72 horas ou até terem crescido o suficiente e foram colheitas por deposição com centrifugação (25,000 ref).

Elas foram desenvolvidas como quantidades de 50 ml em frascos de 300 ml com agitação de 250 rpm num incubador/agitador giratório. 0s depósitos foram congelados e depois extraídos com acetona. Os extractos centrifugados foram então secos, dissolvidos em hexano, postos num aparelho de cromatografia com alumina e foram submetidos ao método para xantófilos AOAC (Quackenbush et al., J. Assoe. Off. Anal. Chem. 56: 748-753 (1973)

Várias fracções foram recolhidas, particularmente dihidroxicarotenoides, e a sua absorção máxima foi encontrada com um espectrofotómetro de varrimento de Beckman.

De milhares de isolados iniciais, 12 tinham um espectro de absorção e um tempo de retenção cromatográfico similares aos atribuídos à zeaxantina. Estes isolados foram então desenvolvidos, extraídos e submetidos a autenticação por HPLC com fases invertidas por um perito de fora (Quackenbush F., J. Lig. Chrom. 10 (4): 643-653 (1988). Uma cultura produziu uma quantidade de zeaxantina relativamente pura como pigmento principal (95%) .

Esta cultura foi submetida, em segredo, a um estudo taxonómico

I em dois laboratórios independentes. Ambos os laboratórios concluíram que a cultura não era semelhante às anteriores bactérias descritas como produtoras de zeaxantina. A estirpe da cultura foi caracterizada como uma estirpe de Fiavobacterium nultivorum. Este foi o primeiro relato da produção de zeaxantina por estas espécies.

Exemplo 2. Cultivo de Flavobacterium multivorum

À cultura é mantida num tubo inclinado de placas numeradas de agár. Estes tubos foram inoculados e depois incubados a 30°C durante 24 horas. Alguns tubos funcionam como reserva, guardados num frigorifico, para uso como inoculador em meias líquidos .

I) meio líquido tinha a seguinte composição:

Licor de	infusão de cereais	7,0%
Farinha	de cereais	5,0%
FeS0₄		0,ool%
Resíduos	de sabão	1,0%
Extracto	de fermento	0,05%
Na₂HP0₄		1,0%
Termamil		0,01%
Agua		86,839%

100,00% [I meio nutriente foi ajustado a um pH de 7,6 usando hidróxido ile sódio concentrado (1 0N) . 0 meio foi então aquecido até cer ca de 85°C e assim foi mantido durante 30 minutos; isto peruite a passagem do amido a uma dextrina por hidrólise enzima'Lica. 0 meio aquecido foi então esterilizado a 121°C durante minutos. Depois de arrefecer, foi inoculado com um tubo (tubo de reserva como os preparados acima) ou com o caldo de uma cultura préviamente inoculada, com cerca de 24 horas. 0 nível de inoculado é de cerca de 5% V/V.

As condições de crescimento para o meio nutriente inoculado foram: uma temperatura de 30°C; um pH de 7,2; um tempo de 36 horas; a quantidade de inoculado foi de 5% em peso; e sobre arejamento contínuo. 0 arejamento é de 200 rpm num incubador agitante usando erlenmeyers de 300 ml com 30 ml de cultura, ou feito num fermentador agitado a 400 rpm, borbulhando ar com uma frequência que permita que o nível de hoxigénio dissol vido seja 50% do de saturação. Nesta experiência, a frequência era de cerca de .25 VVM.

Quando a fermentação já decorria há aproximadamente 12 horas adicionou-se lipase e glucoamilase (poucas quantidades, cerca de .03% em peso do meio, ou 30 unidades de lipase e 6 unidades de AG por litro do meio de fermentação.

Depois de se completar a fermentação, células de F. multivorum foram colheitas do meio, por centrifugação, depois da adição de .006 g/1 a .01 g/1 de bentonite e de .16 g/1 a .4 g/1 de CaCl^. 0 meio é então aquecido a 50°C para matar quaisquer células viáveis, depois o caldo é centrifugado para recuperar uma pasta grossa de células e sólidos do meio, não usados. A pasta celular é então redissolvida e é-lhe adicionado EDTA (.2%), acetato de tocoferol (.015%), BHA (.05%) e Tween 80 (.1%). A solução é então homogenizada e seca para uso futuro. Este produto sêco foi então usado para estudos elementares sm aves poedeiras e crias. A biomassa seca foi guardada à temperatura ambiente durante dois meses, para simular um teste de estabilidade em armazenamento.

LU ca

CO

Α(%) in o

O P *

CU ω

cu u

□ rd co c

o +5

CL

Ή ρ

i—I i—I i—I p E Ξ

I

O

E

vi

•rl

CO

CD

X

LO

o

CJ

N

•ri

vl

in

vd

o

*

vi

LO

O

vi

O

o

•rl

•ri

(0

X

X)

rd

(D

o

00

LO

*

o

O

o

a

O

o

ca

•rd

P

CD

O

P

rd

CO

CD

rd

\

X)

CD

X)

rd

CO

rd

E

N

·»

O

è?

E

rd

•rl

ca

CD

LO

o

rd

X)

i—1

rd

in

rd

o

vi

LO

O

vi

O

o

•ri

ca

»o

•

P

o

00

LO

P

o

O

o

O

o

CD

P

CD

P

rd

XJ

CD

rd

CD

P

O

ico

X) co

CD

CM in

Ή

O

CO

XJ co

CJ c

P

LO

vi

o

vi

□

P

M

CD

•

1

»

1

P

XJ

O

'í

n

P

1

1 o

O

1

o

P

O

•rf

>

CD

P

O

2

3

XJ

èS

LO

00

CJ

‘rl

P

ia

00

□

c

_l

CD

1

•

1

•

1

1 1

1

P

o

CD

CM

1

o

P

1

o

1

1 1

1

o

P

o

CM

0)

•

>

P

o

CD

O

c

z:

CL

O

ta

CD

M

=c

I

1

1 1

1

E

_j

O

P

1

O

1

1 1

1

co

O

XJ

>

o

co

‘rl

co

O

LO

P

3

O

o

LO

P

z

r-.

CD

P

•

-

1

1 1

1

co

rf

P

vi

O

1

1 1

1

CL

_l

<

CD

P

CD

o

CD

CM

CO

JJ

P

0)

I—1

3

co

—

CD

•rf

•

CD

XJ

CO

E

CD

rl

co

P

CO

•rf

CO

N

rf

co

O

P

O

CD

•rf

E

P

o

O

P

t—1

CO

co

3

JZ

CD

0)

E

o_

i—I

i—1

O

P

CJ)

CM

CO

O

CD

co

P

CD

P

CD

c

XJ

co

CD

CJ)

CD

•rf

CD

•

/C0

(D

E

O

CO

CD

>

P

iCO

(D

CD

CO

CD

CO

ω

CD

P

CD

i—I

co

P

XJ

O

P

3

CD

co

O

rf

CL

CJ

CO

CD

P

CJ

P

z:

CD

CJ

E

rl

_c

c

P

CD

c

co

CD

3

co

1—1

o

‘O

X)

•rl

CD

P

CD

co

X

P

CM

•rl

a

CD

X)

-K

i—1

-x

CD

co

CO

P

a

o

P o

co

P

X i—I CJ CO

CD 1— LU

CD xj «tf p o o co o CJ) -rf

CO

J= c

•rf

P

CO

CJ)

CD >

O (D i—I □

P

CO

P

CD

CJ

CO

M· C O -rl CO E •sT co X -rl

-X

CD

CO p

rf

E •rf

E co o

CJ

CD

CO

O.

•rf

CD zCO < CD _l

O

CO

CD •rf

X)

CO

CD

CO □

O) rf

O

CD

CL

CD

XJ

CD

CO .Q

CO * XJ * CO CO

-X c XJ •X CO •x E •X a x 1=

Μ - £0 η'/ íl /?

ςχ’

Exemplo 3

A experiência seguinte foi feita no crescimento do nosso processo mento noutros meios descritos na tes.

para demonstrar as em contraste com o literatura técnica vantagens cresciem paten0s meios com as seguintes composições foram formulados, autoclavados , arrefecidos e inoculados com uma estirpe de F, mui tivorum, como já se indicou.

Os meios A, B e C são os meios descritos nas patentes referidas na secção de literatura relevante. Os meios D e E são os meios nutrientes da presente invenção.

Λ'.

Todos os pH foram ajustados a 7,5 e mantidos com verificação periódica. Só o meio C requereu ajustamentos significativos. Todos os meios foram autoclavados a 121°C durante 30 minutos exceptuando os D e E que foram adicionalmente mantidos a 8090°C, durante 30 minutos, antes da esterilização. Todos os meios, excepto o E e o F, foram inoculados com a estirpe AFB -44 a 5% Volume/Volume e incubados num agitador rotatório a 250 rpm durante 24 horas a 30°C e depois 24 horas a 26°C antes da colheita por centrifugação. 0 meio E (com o mutante) e o F foram inoculados separadamente com um mutante derivado da estirpe AFB-44, e neste caso o crescimento do mutante no meio E e F foi incubado a 30°C exectamente durante 32 horas.

Os resultados são apresentados na tabela seguinte:

Os conteúdos celulares foram calculados através de centrifuga ção a 20,ooo ref durante 10 minutos, decantação do sobrenadan te e secagem do amontoado resultante a 105°C durante 24 horas Os verdadeiros conteúdos celulares foram calculados, primeiro por centrifugação a 3,000 ref para remover produtos insolúveis da fermentação seguida de secagem destes; o peso seco destes insolúveis foi então deduzido do valor do conteúdo celular regular. A zeaxantina foi calculada pela extracção dos agregados celulares congelados em acetona e depois por leitura da D.O.^gQ dos extractos centrifugados num espectrofotómetro. Estas leituras foram depois multiplicadas por factores apropriados para os efeitos de diluição e do ceoficiente de extinção.

Adicionalmente, 0 meio D foi usado para cultivar outras estirpes de F. multivorum para mostrar que o meio nutriente desta invenção, também funciona com outras estirpes de F. mui tivorum, e para mostrar que este meio nutriente, leva a um me lhor conteúdo em zeaxantina.

meio D foi inoculado com estirpes K2361 ου K1180 (descritos no exemplo 4), e cultivado como 0 feito no exemplo 2. A K2361 produziu um conteúdo bruto celular de 25 g/1, um verdadeiro conteúdo celular de 13 g/1 e 11 ug/ml de zeaxantina. A K1180 produziu um conteúdo bruto celular de 24,5 g/1, um verdadeiro conteúdo celular de 12,5 g/1 e 4 ug/1 de zeaxantina. Os resul tados para ο K2361 mostram que 0 meio nutriente da presente invenção melhora 0 conteúdo celular e a quantidade de zeaxantina produzidos por algumas estirpes de F. multivorum. Os resultados para ο K1180 mostram que o meio nutriente, mais bara to, da presente invenção produz quase 0 mesmo conteúdo celular e quantidade de zeaxantina que outros meios nutrientes mais caros.

Os resultados destas experiências demonstram, com a estirpe AFB-44 da F. multivorum, que:

a) Os- meios D e E (a presente invenção) produzem conteúdos celulares e quantidades de zeaxantina, significativamente maiores que os meios A, B e C, descritos na literatura e patentes anteriores.

b) Embora os meios C e E tenham inicialmente os mesmos sólidos, o meio E fornece um melhor conteúdo celular e de pigmentos.

c) Ainda sendo, os meios A, B e C, muito caros relativamente aos D e E, os últimos produzem melhores conteúdos.

d) Usando mutantes da estirpe AFB-44 adaptados ao meio E, verificam-se grandes conteúdos celulares e pigmentatórios tão baixos como 32 h (i.e. crescimento mais rápido). Os mutantes AFB-44 no meio E deram os maiores conteúdos celulares e pigmentatórios até hoje estabelecidos.

e) Os resíduos de sabão podem ser substituídos por óleo vegetal, pois o conteúdo em zeaxantina mantém-se.

Exemplo £ Comparação com outros microorganismos Flavobacteriun

Um isolado de F. multivorum (AFB-44) foi taxonómicamente comparado a outras espécies de Flavobacterium: ATCC 21588 (ou 21 588L) e ATCC 11947 são descritos nas patentes U.S. 3.841.967;

3.951.742; e 3.951.743. 0 ATCC 21081 é revelado nas patentes U.S. 3.891.504 e 3.841.967.

De notar que as estirpes de patentes ATCC 21588 e 21081 não seriam classificadas no género Flavobacterium de acordo com o novo esquema taxonómico da edição de 1984 do Manual Bergey.

ATC Ν2 21081 é significativamente diferente da estirpe AFB-44 nos requisitos de temperatura para o crescimento e na sua necessidade absoluta de sal.

ATCC N2 21588 é significativamente diferente da F. multivorum em muitas normas de fermentação e utilização; é significativamente diferente no crescimento a 35°C, pois as estirpes da F. multivorum crescem bem, e na mobilidade em nitrato agár e no caldo da infusão, dado o ATCC 21588 não ser móvel. Além da ATCC 21588 ser sensível à penicilina e à vancomicina, enquanto a F. multivorum não, o ATCC 21588 é também negativo a LANA e pode produzir estruturas semelhantes a esporos; dois atributos não caracteristicos do género Flavobacterium trabalho taxonémico foi feito por um perito reconhecido, na classificação de bactérias pigmentadas. As suas conclusões de que a estirpe F. multivorum é significativamente diferente da ATCC 11947, 21081 ou 21588, foram apoiadas por uma conclusão semelhante do sreviço taxonémico microbial da Colecção de Culturas tipo Americana.

Acido de adonitol

L-arabinose celobiose etanol fructose galactose

Glucose inosotol lactose maltose manitol

N^g 21588

N2 AFB-44 + + + + +

+ +

-e 27/B

Acido de

N2 21588 melibiose rafinose ramnose sorbitol sacarose xilose

D-arabinose salicina trealose

N.D.

+

N- AFB-44

N.D.

+ +w + + +

+ +

Base de :

acetamida

Q -alanina alantoína arginina azelato citrato gelatina gluconato glicolato histidina itaconato malonato nicotinamida oxalato sacarato tartarato ureia

Catalase

Fluorescência

Crescimento a 42°C

N^g 21588

N^g AFB-44 +

+ +

+

Base de:

em cetrimida em Mac agár em MBMM-Ac

Hidrólise de:

Caseína

DNA esculina gelatina amido, Argo Tween 80 Indole teste de KOH teste de LANA Lisina (LDC) Mutilidade Nitrato-gás -nitrato teste de Zn Nitrato-gás Ornitina (ODC) Oxidase

Fenilalanina (PPA)

Sensível a:

N921588 N£

N9 21588 N£ +w

9_

N9 21588 penicilina (2U) polimixina B (300U) vancomicina

- 28 L·⁷ ' h L·' u

AFB-44 _*

AFB-44

-w +

+ +

+ |\|° AFB-44

ATCC #21081

AFB-44

Crescimento em:

TSA, RT	nulo	bom
TSA, 30°C	nulo	bom
PYEPO, RT	bom	nulo
PYEPO,* 30°C	nulo	nulo
* agár marinho

ATCC N⁹ 21081 é um bastonete gram-negativo e não móvel em suporte molhado. As suas caracteristicas de crescimento não são as do género Flavobacterium, como presentemente definido por Holmes et al., no Manual de 1984 de Bergey, mas são compatíveis com alguma da taxonomia da secção II de Weeks, Flavobacterium no Manual bergey de 1974. Tem necessidade absoluta de NaCl e não pode crescer a 30°C.

Exemplo £ - Comparação de estirpes de F. multivorum

A estirpe original AFB-44, depois de isolada como descrito, foi identificada como uma bactéria produtora de zeaxantina. Depois de comparações iniciais com estirpes Flavobacterium conhecidas, foi determinado que era diferente de todas e que deveria ser classificada como F. multivorum. Durante o extensivo processo inicial de varrimento, esta foi a única estirpe de Flavobacterium que pode ser identificada como produtora de zeaxantina. Isto incluiu colecções inteiras de grupos Flavobacteriumium/Citófaga de cinco colecções públicas de todo o mundo. Concluímos que a bactéria pigmentada produtora de zeaxantina é muito rara. Depois de identificarmos o nosso organismo, foi decidido que se deveriam testar outras estirpes de F. multivorum. As estirpes de F. multivorum disponíveis na

30, colecção do departamento de Microbiologia-UCLA, N2 K-1213, K-1204, K-1180, K-2361 e K-2303 foram comparadas com a estirpe AFB-44 como se mostra. As estirpes foram desenvolvidas em declives PCA e inoculadas num meio líquido, crescendo a 30°C durante 24 horas e a 24°C durante 48 horas num agitador recíproco em frascos agitados, antes da colheita por centrifugação. Nesta experiência a iluminação foi também utilizada. As amostras foram extraídas com acetona dos agregados gelados e o extracto foi seco sobre N^ gasoso, dissolvido em hexano e aplicado numa coluna de alumina (neutra). Razões crescentes de Acetona/hexano foram usadas para o fraccionamento; espectro fotómetros foram usados para verificar a máxima absorção de cada fracção. Obtiveram-se os seguintes resultados:

31-,

I I

•μ	Ο		ο	04		1--
X	(0		Γχ	C0	00	μ	Γ-»	Γ-.
'to	μ		μ	μ		C	3·	μ
Ε	μ
	X		·*.	»				·»
Ο	CD		Ή	<Μ	CM		04	OJ
1C0			LO	LO	ΙΟ	η	IX)	IX)
ο>	0)					C	μ	μ
μ	ο
ο	Ό		»»	*	tH		»·	·»
Μ		ω		LO			Ο	o
XI	(0	Ο	(Μ	CM	04	Ό	CO	ro
	Ε	μ	sr		μ	C	μ	μ

ω

			tu
	Lf)	Ή		Ό
LO	04	O	to	•rl
•				O
O	O	O	rx	C

tu

-P ο

μ co ο

I

C0 ι—I

Ή

X

Ο (Η + + + Ο + +

-α c +

Η χ ω •Η Ο μ μ

μ		to c		tn CU
o		rl		•a
Ο-	rd	E		•rl
Χ	O	to		O
04	CO	•rl	X	C
-Z	Z2	μ-	CL	tu μ o μ to o

ι

CD ι—I

Η

X ο

μ μ

Η + + +ΧΙ + +

X C

Ο c ω ο ο

Ε ·Ό zeaxantina 429, 452, 477 ω

ο μ

ω tu c

è?		à?		μ	o
o	o	o	LO		X)
		•		o	μ
Ή		μ	O	ICO	to
				L»	o
				O	o
				to	μ
		O		μ	μ
		μ			•rl

c χ tu Ε μ cu ω

4-1 Ο ω

ο •Η ω

μ tu c □)

	μ	tu E CJ)	rd E	00 LO	σ> μ	ro 04	μ cn	μ ro	D ro μ
to	O
tu	c	μ		•μ	CD				•
tn	o	o			D	+	+	+	>	+	+
o	μ	to	μ
o	CL	μ	O
D	rl	μ	GO
1—1	μ	X	O)
ω	1-	LLI	ΞΣ			O	'ί-	ro	ro	μ	μ
						00	ο	μ	o	ro	μ
						rd	04	04	ro	ro	1
						rd	μ	μ	04	04	m
						1	ι	ι	1	1	X
						iZ	-Ζ	-Z	-Z	iZ	<

Os dados demonstram que:

a) surpreendentemente, outras estirpes de F. multivorum produzem zeaxantina

b) Parece que todas as estirpes de F. multivorum produzem uma quantidade quantificavel de pigmento (embora nesta experiência o K-2303 não ter produzido pigmento quantificável, i.e., é um pigmentador fraco e logo a produção de zeaxantina não pode ser determinada).

c) A estirpe selvagem de AFB-44 produz mais pigmento e uma melhor razão de carotenoides zeaxantina/total, que as outras estirpes.

d) Cromatografia em coluna mostra que o carotenoide dihidroxilado produzido por todas as estirpes (excepto pela K-2303) parece ser maioritariamente zeaxantina.

e) A estirpe F, multivorum disponível comercialmente produz zeaxantina.

f) Que um grupo, até agora desconhecido, de Flavobacterium partilha uma propensão à produção de zeaxantina como um pigmento comum da sua composição celular.

Exemplo 6. - Estudos alimentares demonstram maior disponibilidade biológica, estabilidade e poder pigmentatório da composição da biomassa relativamente a fontes correntes, comercialnente utilizadas, de pigmentos.

A composição da biomassa, que foi preparada de acordo com o η -_Ο33 ζ-7

Exemplo 2, e que foi guardada à temperatura ambiente durante

dois meses, foi dada a pintos e comparada a extractos de flor de cravo, esterelizados e saponifiçados.A dieta básica era a seguinte:
Ingredientes	Arranque	Desenvolvedor (trigo,
trigo	45,32	61,46
cereal	10,00	10,00
Meai de feijão
de soja	31,35	14,32
Meai de aves do-
mestiças	2,40	_; 6,00
gordura de aves
domésticas	7,28	5,31
pedra calcárea	1,24	1,03
Decai. Fos.	1,44	,96
Sal	,40	,30
Colino	,20	.20
Mineral vestigial	,10	,10
Premix de vitaminas	,05	,05
Lisina	—	,12
DL-metionina	,18	,10
Cocidiostato	,05	,05
Nutrientes
Proteínas,%	23,00	19,00
Energia (Kcal/lb)	1450	1450
Cálcio, %	1,00	,90
Fos. tota, %	,70	,65
TSAA, %	,93	,75
Lisina, %	1,26	1,00

RESULTADOS.

grau de coloração às 6 semanas peso vivo médio às 6 semanas ( gramas) conversãode alimento às 6 semanas

CONTROLE (não foi adicionado nenhum pigmento 2,0 1591 1,85 ppm de xantófilos de extracto de cravo

6,7 1549 1,90 ppm de zeaxantina adicionada da biomassa

COMPOSIÇÃO ppm adicionadas da composição da biomassa * Grau dado por 5 juizes, subjectivamente, usando um conjunto de cores Roche (grau de cor das pernas) ** Resultados similares (potência) foram obtidos com dois outro extractos de cravo como referência

Os resultados não mostram qualquer efeito prejudicial nas galinhas e mostram que 10 ppm de xantófilina da composição da biomassa, estava biologicamente disponível e era igual a 25 ppm de xantófilina de estracto de cravo, a fonte natural de xantófilina melhor estabilizada e executada comercialmente, xantófilo tem que estar biologicamente disponível para apre- 35 ο

,^ζ// sentar melhor e mais rápida pigmentação. Os resultados denotam uma composição microbial em pigmento que, surpreendentemente, tem boa estabilidade e disponibilidade biológica sem ter a necessidade de processos, caros, de extracção e saponificação. Além disso, não foram detectados efeitos negativos nos dados de crescimento.

Claims

REIVINDICAÇÕES da fórmula caracterizado pelo facto de compreender a operação que consiste em realizar a cultura de um microorganismo Flavobacterium multivorum num meio nutritivo que contém uma fonte de carbono assimilável e uma fonte de azoto assimilável, para se produzir uma massa de células contendo zeaxantina.
2§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender a separação da zeaxantina da citada massa de células contendo zeaxantina.
3§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se cultivar o referido microorganismo num meio nutritivo aquoso, a uma temperatura compreendida entre cerca de 22°C e cerca de 34°C.
4§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo acto de se separar a zeaxantina da referida massa de células digerindo a citada massa de células com um dissolvente orgânico inerte para dissolver a zeaxantina; e separando o referido dissolvente da zeaxantina.
5- - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de se separar o dissolvente da zeaxantina por evapo ração .
6§ - Processo para a preparação de zeaxantina, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em fermentarem-se as células de Flavobacterium multivorum num meio nutritivo que compreende uma fonte de azoto assimilável, uma fonte de carbono assimilável, sais minerais, uma fonte de gordura, e factores de crescimento, a fim de se formar um líquido de fermentação;

separarem-se as mencionadas células do líquido de fermentação a fim de se formar uma pasta de células; suspender-se a referida pasta;

homogeneizar-se a referida pasta; e secar-se a referida pasta.
7- - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se suspender a mencionada pasta celular em agentes protectores com um agente emulsionante.

83 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de os citados agentes protectores serem agentes antioxidantes, agentes quelantes e suas misturas.

ga _ Processo para a preparação de composições contendo zeaxantina, caracterizado pelo facto de se efectuar a cultura de um microorganismo Flavobacterium Multivorum, ou respeetivos mutantes e variantes num meio nutritivo contendo pelo menos uma fonte de carbono assimilável e pelo menos uma fonte de azot assimilável.

103 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido Flavobacterium multivorum ser a estirpe AFB-44 ou um respectivo mutante ou variante.

113 Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto do referido Flavobacterium multivorum, ou o seu

--38 mutante ου variante, possuir as seguintes características toxonámicas :

é sensível à penicilina, insensível à vancomicina e insensível à polimixina; bastonetes fortemente positivos à oxidase, positivos à catálise e gram-negativo; sem mobilidade; fortemente positivo à sacarose;negativo ao manitol; negativo ao etanol: positivo à ureia; e não proteolítico.
12§ - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de originar pelo menos 40 g/1 de células contendo zeaxantina .
13- - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o mencionado meio nutritivo conter uma infusão de cereal ou um outro licor fonte de azoto assimilável e uma fonte de carbono tratado com enzimas.
14§ _ Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a referida enzima ser alfa-amilase.
15^ã - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o nível de glucose no referido meio ser inferior a cerca de 0,035% em peso.
16^ã - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a citada fonte de carbono assimilável ser escolhida do grupo formado por milho, arroz, milho painço, trigo, maltodextrina, farinhas e amidos e amidos derivados dos citados cereais e glucose.
17- - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a referida fonte de azoto assimilável ser escolhida do grupo formado por líquido de infusão de cereais, caseína hidrolisada, soja hidrolisada, fosfato de amónio e sulfato de amónio, amónia, extracto de levedura, um hidrolisado de proteínas e um hidrolisado de biomassa de Flavobacterium.
18§ - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a citada operação de cultura se efectuar a uma temperatura compreendida entre cerca de 16°C e 38°C, aproximadamente, a um valor de pH compreendido dentro do intervalo de 6,0 ou 8,5 aproximadamente, e durante cerca de 24 até cerca de 72 horas.

193 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto do mencionado processo se completar substancialmente ao fim de cerca de 32 horas.

203 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido meio nutriente ser uma solução aquosa.

213 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a referida cultura se realizar a uma temperatura compreendida entre 32°C e cerca de 34°C.

223 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a citada cultura se efectuar a um pH compreendido entre cerca de 6,5 e cerca de 8,0.

233 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de a mencionada cultura se realizar durante cerca de 24 a cerca de 72 horas.

243 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o citado processo ser substancialmente compleAi tado em cerca de 32 horas.

25§ - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de compreender ainda a adição de enzimas ao citado meio nutritivo durante a realização da cultura.

26^ã - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto da referida enzima ser glucoamilase, lipase ou suas misturas.

27§ - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se adicionar um agente promotor da formação de pigmento adicionado ao mencionado meio nutritivo.

28- - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o citado meio nutritivo conter entre cerca de 1% em peso até cerca de 7% em peso de uma fonte de carbono ass| milável e entre cerca de 3% em peso e cerca de 10% em peso de uma fonte de azoto assimilável.

29§ - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de, a seguir à operação de cultura, se extrair a zeaxantina a partir das células do microorganismo com dissolvente .

30§ - Processo para a preparação de uma substância xantofilo, caracterizado pelo facto de compreender a operação que consiste em se fermentarem as células de um microorganismo Flavobacterium multivorum num meio nutritivo que compreende uma fonte de azoto assimilável e uma fonte de carbono assimilável, sais minerais, uma fonte de gordura e factores de crescimento para formar um licor de fermentação.

31^ã - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de, as referidas células serem separadas do citado licor de fermentação para formarem uma pasta de células; suspender-se a referida pasta;

homogeneizar-se a pasta; e secar-se a referida pasta.

32ã _ Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto da mencionada pasta de células ser suspensa em agentes protectores e num emulsionante.

33^ - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de os citados agentes protectores serem agentes antioxidantes, agentes quelantes ou suas misturas.

34§ - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de a referida fonte de carbono assimila'vel ser tratada com enzimas.

35^ã - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto da citada fonte de carbono assimilável ser escolhida do grupo formado por milho, arroz, milho painço, trigo, maltodextrina, farinhas e amidos, amidos derivados dos dos citados cereais e glicose; e a referida fonte de azoto assimilável ser escolhida do grupo constituído por líquido de infusão de cereais, caseína hidrolisada, soja hidrolisada, fos fato de amónio e sulfato de amónio, amónia, extracto de levedura, um hidrolizado de proteína e um hidrolizado de biomassa d^e Flavobacterium.

36- - Processo para a preparação de uma composição contendo zeaxantina, caracterizado pelo facto de compreender a cultura de um microorganismo, Flavobacterium multivorum num meio / />

- ⁴W f/ 7> λnutritivo que contém uma fonte de carbono assimilável e uma fonte de azoto assimilável para produzir uma massa celular contendo zeaxantina

37^ã - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo facto de compreender a separação da zeaxantina da citada massa celular contendo zeaxantina.

38^ã - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo facto do referido Flavobacterium multivorum ser a estirpe AFB-44 ou um seu mutante ou variante.

392 - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo facto de 0 referido Flavobacterium multivorum ou uma respectiva mutação ou variação possuir as seguintes características taxonómicas:

é insensível à penicilina, à vancomicinae à polimixina; bastonetes fortemente positivos à oxidase, positivos à catálise, e gram-negativos; sem mobilidade; fortemente positivos à sacarose; negativa ao manitol; e negativa ao etanol; positiva à ureia; e não proteolítica.

40§- Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de originar pelo menos 40g/l de células contendo zeaxantina.

41θ - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de 0 mencionado meio nutritivo conter uma infusão de cereais ou um outro licor que seja fonte de azoto assi milável e uma fonte de carbono tratado com enzimas.

42§ _ Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto da referida enzima ser alfa-amilase.

43§ - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de o nível de glucose no referido meio nutritivo ser inferior a cerca de 0,035% em peso.

44- _ Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de a citada fonte de carbono assimilável ser escolhida do grupo formado por milho, arroz, milho painço, trr go, maltodextrina, farinhas e amidos, e amidos derivados dos citados cereais e glucose.

45^ã - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto da referida fonte de azoto assimilável ser escolhida no grupo formado por líquido de infusão de cereais, caseína hidrolisada, feijões de soja hidrolisados, fosfato de amónio e sulfato de amónio, amónia, extracto de levedura, um hidrolisado de proteínas e um hidrolisado de biomassa de Flavobacterium

46§ - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de se efectuar a citada operação de cultura a uma temperatura compreendida entre 36°C e 38°C, aproximadamente, a um valor de pH compreendido entre 6,0 e 8,5 aproximadamente, e durante cerca de 24 até cerca de 72 horas.

47§ - Processo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de se completar 0 mencionado processo substancialmente em cerca de 32 horas.

48 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto do referido meio nutriente ser uma solução aquosa.

49§ - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do pelo facto de se realizar a referida cultura a uma temperatura compreendida no intervalo entre 22°C e cerca de 34°C.

50§ - Processo de acordo com do pelo facto de se efectuar preendido entre cerca de 6,5

515 - Processo de acordo com do pelo facto de se realizar período de tempo entre cerca a reivindicação 37, caracteriza a citada cultura a um pH come cerca de 8,0.

a reivindicação 37, caracteriza a mencionada cultura durante um de 24 a cerca de 72 horas.

525 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza do pelo facto de se completar o citado processo substancialmente em cerca de 32 horas.

535 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de compreender ainda a adição de enzimas ao citado meio nutritivo durante a cultura.

54a _ Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de a referida enzima ser glucoamilase, lipase ou suas misturas.

555 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de se adicionar um promotor da formação de pigmento aos mencionados meios nutritivos.

56§ _ Processo para a preparação de composições, nomeadamente composições alimentares de aves de capoeira, caracterizado pelo facto de, como ingrediente, se empregarem células de

Fiavobacterium multivorum não viáveis contendo zeaxantina, fragmentos residuais dessas células e sólidos do meio nutriti vo não utilizados recuperados da fermentação de células de

Flavobacterium multivorum.

57- - Processo de acordo com a reivindicação 56, caracteriza do pelo facto de se adicionar pelo menos um agente protector.

58§ - Processo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo facto de se adicionar pelo menos um agente protector e pelo menos um agente emulsionante.

Lisboa, 23 de Agosto de 1990