ES2216027T3

ES2216027T3 - Produccion de carotenoides fermentativos.

Info

Publication number: ES2216027T3
Application number: ES96108556T
Authority: ES
Inventors: Hans-Peter Hohmann; Luis Pasamontes; Michel Tessier; Adolphus Van Loon
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1995-06-09
Filing date: 1996-05-29
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2016-05-29
Also published as: US6613543B2; ATE262590T1; CN100554427C; JP4252632B2; EP0747483B1; DK0747483T3; EP0747483A2; CN1168828C; US6124113A; JPH0923888A; EP0747483A3; US6207409B1; DE69631924T2; CN1607253A; CN1141952A; DE69631924D1; US20020147371A1; US6087152A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA A UNA SECUENCIA DE ADN QUE COMPRENDE UNA O MAS SECUENCIAS DE ADN SELECCIONADA DEL GRUPO QUE SE COMPONE DE UNA SECUENCIA DE ADN LA CUAL CODIFICA A LA SINTASA GGPP DE FLAVOBACTERIUM SP.R1534 (CRTE), UNA SECUENCIA DE ADN LA CUAL CODIFICA LA SINTASA DE PREFITOENO DE FLAVOBACTERIUM SP.R1534 (CRTB), UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA LA DESATURASA DE FITOENO DE FLAVOBACTERIUM SP.R1534 (CRTL), UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA LA CICLASA DE LICOPENO DE FLAVOBACTERIUM SP.R1534 (CRTY) O UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA LA HIDROXILASA {BE}CAROTENO DE FLAVOBACTERIUM SP.R1534 (CRTZ) O SECUENCIAS DE ADN QUE SON SUSTANCIALMENTE HOMOLOGAS, VECTORES QUE COMPRENDEN DICHA SECUENCIAS DE ADN Y/O UNA SECUENCIA DE ADN QUE CODIFICA LA {BE}4OXIGENASA DE {BE}-CAROTENO DE CEPAS DE ALCALIGENES PC-1 (CRT W) O UNA SECUENCIA DE ADN QUE ES SUSTANCIALMENTE HOMOLOGA, CELULAS QUE SON TRANSFORMADAS POR TALES SECUENCIAS DE ADN Y/O VECTORES, UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE UN CAROTENOIDEODESEADO O UNA MEZCLA DE CAROTENOIDES CULTIVANDO TALES CELULAS TRANSFORMADAS Y UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION ALIMENTICIA O DE ALIMENTACION.

Description

Producción de carotenoides fermentativos.

Se han descrito más de 600 carotenoides diferentes de organismos carotenogénicos hallados entre las bacterias, levaduras, hongos y plantas. Actualmente tan sólo dos de ellos, el \beta-caroteno y la astaxantina se producen comercialmente en microorganismos y se usan en la industria alimentaria. El \beta-caroteno se obtiene de las algas y la astaxantina se produce en cepas de Pfaffia generadas por mutación clásica. No obstante, la fermentación en Pfaffia tiene el inconveniente de largos ciclos de fermentación y la recuperación de las algas es engorrosa. La producción de zeaxantina usando microorganismos del género Flavobacter se ha descrito en WO9103571 y US53891504. Por lo tanto es deseable el desarrollo de sistemas de producción que tengan una mejor aplicabilidad industrial, por ejemplo, que se puedan manipular en cantidades mayores y/o reducir los tiempos de fermentación. Dos de tales sistemas usando los genes biosintéticos de Erwinia herbicola y Erwinia uredovora ya se han descrito en WO 91/13078 y PE 393 690, respectivamente. Además, ya se han clonado, tres genes de la \beta-caroteno cetolasa (\beta-caroteno \beta-4-oxigenasa) de la bacteria marina Agrobacterium auranticum y cepa PC-1 de Alcaligenes (crtW) [Misawa, 1995, Biochem. Biophys. Res. Com. 209, 867-876] [Misawa, 1995, J.Bacteriology 177, 6575-6584] y a partir de la alga verde Haematococcus pluviales (bkt) [Lotan, 1995, FEBS Letters 364, 125-128] [Kajiwara, 1995, Plant Mol. Biol. 29, 343-352]. E. coli también lleva genes carotenogénicos (crtE, crtB, crtY y crtI) de E. herbicola [Hundle, 1994, MGG 245, 406-416] o de E. uredovora y complementados con el gen crtW de A. auranticum [Misawa, 1995] o el gen bkt de H. pluvialis [Lotan, 1995][Kajiwara, 1995] resultando en la acumulación de cantaxantina (\beta, \beta-caroteno-4,4'-diona), originada de la conversión del \beta-caroteno, vía el intermediario equinenona (\beta, \beta-caroteno-4-ona). La introducción de los genes anteriormente mencionados (crtW o bkt) en las células de E. coli hospedadoras además de los genes de biosíntesis de carotenoides mencionados anteriormente también el gen crtZ de E. uredovora [Kajiwara, 1995] [Misawa, 1995], resultan en ambos casos en la acumulación de astaxantina (3,3'-dihidroxi-\beta, \beta-caroteno-4,4'-diona). Los resultados obtenidos con el gen bkt, se encuentran en contraposición a la observación hecha por otros [Lotan, 1995], quienes usan la misma configuración experimental, pero introducen el gen bkt de H. pluvialis en un huésped E. coli que sintetiza zeaxantina (\beta, \beta-caroteno-3,3'-diol) que hospeda los genes de biosíntesis de carotenoides de E. herbicola, un congénere cercano de la cepa de E. uredovora mencionada anteriormente, no se observó producción de astaxantina.

No obstante, las combinaciones funcionalmente activas de los genes biosintetizadores de carotenoides de la presente invención con los genes crtW conocidos no se han mostrado hasta el momento y aún más considerablemente existe una necesidad de continuación en sistemas de fermentación aún más optimizados para aplicaciones industriales.

Es por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar una secuencia de DNA que comprenda una o más secuencias de DNA seleccionadas del grupo constituido por:

a) una secuencia de DNA que codifica por la GGPP sintasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtE) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga;

b) una secuencia de DNA que codifica por la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtB) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga;

c) una secuencia de DNA que codifica por la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtI) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga;

d) una secuencia de DNA que codifica por la licopeno ciclasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtY) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga;

e) una secuencia de DNA que codifica por la \beta-caroteno hidroxilasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtZ) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga;

También es un objeto de la presente invención proporcionar un vector que comprende tal secuencia de DNA, preferiblemente en forma de un vector de expresión. Además es un objeto de la presente invención proporcionar una célula que está transformada por tal secuencia de DNA o vector, preferiblemente que sea una célula procariótica y aún más preferiblemente que sea E. coli o una cepa de Bacillus. Tal célula transformada que es una célula eucariótica, preferiblemente una célula de levadura o una célula fúngica, es también objeto de la presente invención. Finalmente la presente invención concierne también a un procedimiento para la preparación de un carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides cultivando tal célula bajo condiciones apropiadas y aislando el carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides de tales células o del medio de cultivo y, en caso de que tan sólo se desee un carotenoide, separándolo mediante métodos conocidos en el campo de los otros carotenoides que también pueden estar presentes y un procedimiento para la preparación de una composición alimentaria caracterizada en que tras efectuar tal procedimiento, se añada el carotenoide, preferiblemente una mezcla de carotenoides al alimento.

Además, es objeto de la presente invención una secuencia de DNA que comprende las siguientes secuencias de DNA:

a) una secuencia de DNA que codifica por la GGPP sintasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtE) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga, y

b) una secuencia de DNA que codifica por la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtB) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga, y

c) una secuencia de DNA que codifica por la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtI) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga, y

También es objeto de la presente invención proporcionar un vector que comprende tal secuencia de DNA, preferiblemente en la forma de un vector de expresión. Además es un objeto de la presente invención proporcionar una célula que se transforma por tal secuencia de DNA o vector, preferiblemente que sea una célula procariota y más preferiblemente que sea E. coli o una cepa de Bacillus. Tal célula transformada que es una célula eucariótica, preferiblemente una célula de levadura o una célula fúngica, también es objeto de la presente invención. Finalmente la presente invención se refiere a un proceso para la preparación de un carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides mediante cultivo de una célula bajo condiciones apropiadas y aislando el carotenoide deseado o mezcla de carotenoides de tales células o medio de cultivo y, en caso de que sólo se desee un carotenoide separando a éste por métodos conocidos en el arte a partir de otros carotenoides que también pueden estar presentes, preferiblemente tal como un procedimiento para la preparación de licopeno y un procedimiento para la preparación de una composición alimentaria caracterizada en que tras efectuar tal procedimiento, el carotenoide, preferiblemente licopeno o una mezcla de carotenoides, preferiblemente una mezcla que comprenda licopeno se añada al alimento.

Además también es objeto de la presente invención una secuencia de DNA que comprende las siguientes secuencias de DNA:

d) una secuencia de DNA que codifica por la licopeno ciclasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtY) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga.

También es objeto de la presente invención proporcionar un vector que comprende tal secuencia de DNA, preferiblemente en la forma de un vector de expresión. Además es un objeto de la presente invención proporcionar una célula que se transforma por tal secuencia de DNA o vector, preferiblemente que sea una célula procariota y más preferiblemente que es E. coli o una cepa de Bacillus. Tal célula transformada que es una célula eucariótica, preferiblemente una célula de levadura o una célula fúngica, también es objeto de la presente invención. Finalmente la presente invención se refiere a un proceso para la preparación de un carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides mediante cultivo de una célula bajo condiciones apropiadas y aislando el carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides de tales células o medio de cultivo y, en caso de que sólo se desee un carotenoide separando a éste por métodos conocidos en el arte a partir de otros carotenoides que también pueden estar presentes, preferiblemente tal como un procedimiento para la preparación de \beta-caroteno y un procedimiento para la preparación de una composición alimentaria caracterizada en que tras efectuar tal procedimiento, un carotenoide, preferiblemente \beta-caroteno o una mezcla de carotenoides, preferiblemente una mezcla que comprende \beta-caroteno se añade al alimento.

Además una célula que está transformada por la secuencia de DNA mencionada anteriormente comprendiendo las subsecuencias a) a d) o el vector que comprende a ésta y una segunda secuencia de DNA que codifica por la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crt W) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga o un segundo vector que comprende una secuencia de DNA que codifica la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crt W) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga; y un procedimiento para la preparación del carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides cultivando tales células bajo condiciones apropiadas y aislando el carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides de tales células o del medio de cultivo y, en caso de que sólo se desee un carotenoide, separando a éste por métodos conocidos en el arte de los otros carotenoides que también pueden estar presentes, preferiblemente tal como un procedimiento para la preparación de equinenona y un procedimiento para elaborar una composición alimentaría caracterizada en que tras efectuar tal procedimiento el carotenoide, preferiblemente equinenona o una mezcla de carotenoides, preferiblemente una mezcla que comprende equinenona se añade al alimento.

Además es un objeto de la presente invención proporcionar una secuencia de DNA tal como se menciona anteriormente que comprende las subsecuencias a) a d) y una secuencia de DNA que codifica por la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crt W) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga y un vector que comprende tal secuencia de DNA, preferiblemente en la forma de un vector de expresión. Además es un objeto de la presente invención proporcionar una célula que se transforma por tal secuencia de DNA o vector, preferiblemente que es una célula procariótica y más preferiblemente que es E. coli o una cepa de Bacillus. Tal célula transformada que es una célula eucariótica, preferiblemente una célula de levadura o célula fúngica, es también objeto de la presente invención. Finalmente la presente invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de un carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides cultivando células bajo condiciones de cultivo apropiadas y aislando el carotenoide deseado o la mezcla de carotenoides de tales células del medio de cultivo y, en caso de que sólo se desee un carotenoide, separándolo por métodos conocidos en el arte de los otros carotenoides que pueden también estar presentes, especialmente tal como un procedimiento para la preparación de equinenona o cantaxantina y un procedimiento para la preparación de una composición alimentaria caracterizada en que tras efectuar tal procedimiento, el carotenoide, preferiblemente equinenona o cantaxantina o una mezcla de carotenoides, preferiblemente una mezcla que contenga equinenona o cantaxantina se añada al alimento.

Además también es objeto de la presente invención una secuencia de DNA que comprenda las siguientes secuencias de DNA:

e) una secuencia de DNA que por la \beta-caroteno hidroxilasa de Flavobacterium sp.R1534 (crtZ) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga.

También es objeto de la presente invención proporcionar un vector que comprende tal secuencia de DNA, preferiblemente en la forma de un vector de expresión. Además es un objeto de la presente invención proporcionar una célula que se transforma por tal secuencia de DNA o vector, preferiblemente que sea una célula procariota y más preferiblemente que es E. coli o una cepa de Bacillus. Tal célula transformada que es una célula eucariótica, preferiblemente una célula de levadura o una célula fúngica, también es objeto de la presente invención. Finalmente la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de un carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides mediante cultivo de células bajo condiciones apropiadas y aislando el carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides de tales células del medio de cultivo y, en caso de que sólo se desee un carotenoide separando a éste por métodos conocidos en el arte a partir de otros carotenoides que también pueden estar presentes, preferiblemente tal como un procedimiento para la preparación de zeaxantina y un procedimiento para la preparación de una composición alimentaria caracterizada en que tras efectuar tal procedimiento, un carotenoide, preferiblemente zeaxantina o una mezcla de carotenoides, preferiblemente una mezcla que comprenda zeaxantina se añada al alimento.

Además una secuencia de DNA mencionada anteriormente que comprende las subsecuencias a) a e) y además una secuencia de DNA que codifica por la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crt W) de una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga es un objeto de la presente invención y proporcionar un vector que comprenda tal secuencia de DNA, preferiblemente en forma de un vector de expresión. Además es un objeto de la presente invención proporcionar una célula que se transforma por tal secuencia de DNA o vector, preferiblemente que es una célula procariótica y aún más preferiblemente es E. coli o una cepa de Bacillus. Tal célula transformada que es una célula eucariota, preferiblemente una célula de levadura o célula fúngica, es también objeto de la presente invención. Finalmente la presente invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de un carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides cultivando tal célula bajo condiciones de cultivo apropiadas y asilando el carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides de tales células del medio de cultivo y, en caso de que sólo se desee un carotenoide, separando a éste por métodos conocidos en el arte de otros carotenoides que también pueden estar presentes, preferiblemente tal como un procedimiento para la preparación de zeaxantina, adinoxantina o astaxantina y un procedimiento para la preparación de una composición alimentaria caracterizada en que tras efectuar tal procedimiento, el carotenoide, preferiblemente zeaxantina, adinoxantina o astaxantina o una mezcla de carotenoides, preferiblemente una mezcla que contenga zeaxantina, adinoxantina o astaxantina se añada al alimento.

Además una célula que se transforma por la secuencia de DNA mencionada anteriormente comprende las subsecuencias a) a e) o un vector que comprenda tal secuencia de DNA y una segunda secuencia de DNA que codifica por la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crt W) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga o un segundo vector que comprende una secuencia de DNA que codifica por la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crt W) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga es también objeto de la presente invención y un procedimiento para la preparación de un carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides cultivando tales células bajo condiciones apropiadas y aislando el carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides de tales células o del medio de cultivo, y en caso de que sólo se desee un carotenoide separando éste por métodos conocidos en el arte de los otros carotenoides que también pueden estar presentes, preferiblemente tal procedimiento para la preparación de zeaxantina o adinoxantina y un procedimiento para la preparación de una composición alimentaria caracterizada en que tras efectuar tal procedimiento, el carotenoide, preferiblemente zeaxantina o adinoxantina o una mezcla de carotenoides, preferiblemente una mezcla que comprenda zeaxantina o adinoxantina se añada al alimento.

En este contexto se debería mencionar que la expresión "secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga" se refiere respecto la secuencia codificante de DNA crtE, a una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra más del 75% y más preferiblemente más del 90% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de crtE de Flavobacterium sp.1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtE de Flavobacterium sp.1534. En analogía respecto a crtB esto indica más del 70%, más preferiblemente más del 80% y más preferiblemente más del 90%; respecto a crtI éste indica más del 80% y más preferiblemente más del 90%; respecto a crtY éste indica más del 70% y más preferiblemente más del 80% y aún más preferiblemente más del 90%; respecto a crtZ éste indica más de un 70%, más preferiblemente más de un 80% y aún más preferiblemente más de un 90%; respecto a crtW éste indica más del 60%, más preferiblemente más del 70%, más preferiblemente más del 80% y aún más preferiblemente más del 90%. Las secuencias que son sustancialmente homólogas a crtW son conocidas, por ejemplo en forma de la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de Agrobacterium auranticum o de la alga verde Haematococous pluvialis
(bkt).

Las secuencias de DNA en forma de DNA genómico, cDNA o DNA sintético se pueden preparar tal como se conoce en el arte [ver por ejemplo Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989] o por ejemplo tal como se describe específicamente en los Ejemplos 1, 2 ó 7.

La clonación de las secuencias de DNA de la presente invención a partir de tal DNA genómico se puede efectuar, por ejemplo usando el método bien conocido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los principios de este método se esbozan por ejemplo en PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. (1990). PCR es un método in vitro para la producción de grandes cantidades de un DNA específico de longitud definida y una secuencia a partir de una mezcla de diferentes secuencias de DNA. Por lo tanto, PCR se basa en la amplificación enzimática de un fragmento de DNA específico de interés que está flanqueado por dos cebadores de oligonucleótidos que son específicos para esta secuencia y que se hibridan con la hebra opuesta de la secuencia diana. Los cebadores se orientan con sus extremos 3' apuntando uno hacia el otro. Ciclos repetitivos de desnaturalización por calor del molde, hibridación de los cebadores con sus secuencias complementarias y extensión de los cebadores hibridados con una DNA polimerasa resultan en la amplificación del segmento entre los cebadores de la PCR. Desde que el producto de extensión de cada cebador sirve como molde de otro, cada ciclo esencialmente duplica la cantidad de fragmentos de DNA producidos en el ciclo previo. Utilizando la Taq DNA polimerasa termoestable, aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus, se ha hecho posible evitar la desnaturalización de la polimerasa que necesitaría la adición de enzima tras cada ciclo de desnaturalización por calor. Este desarrollo ha llevado a la automatización de la PCR mediante una variedad de dispositivos de ciclo de temperaturas. Además, la especificidad de la reacción de amplificación ha aumentado permitiendo el uso de temperaturas más elevadas para la hibridación de los cebadores y la extensión. El aumento de la especificidad mejora el rendimiento total de los productos amplificados minimizando la competición de los fragmentos no-diana por el enzima y los cebadores. De este modo, la secuencia específica de interés es altamente amplificada y se puede separar fácilmente de las secuencias inespecíficas por métodos conocidos en al arte, por ejemplo por separación en un gel de agarosa y clonando por métodos conocidos en el arte usando vectores tal como los que se describen por ejemplo por Loteen and Graham en Nucleic Acids Res. 19, 1156 (1991), Kovalic et. al. en Nucleic Acid Res. 19, 4560 (1991), Marchuk et al. en Nucleic Acid Res. 19, 1154 (1991) o Mead et al. en Bio/Technology 9, 657-663 (1991).

Los cebadores de oligonucleótidos usados en el procedimiento de PCR se pueden preparar fácilmente tal como se conoce en el campo y se describe por ejemplo en Sambrook et al., s.a.

Las secuencias de DNA amplificadas se pueden usar para cribar genotecas de DNA por métodos conocidos en el campo (Sambrook et al., s.a.) o como se describe específicamente en los Ejemplos 1 y 2.

Una vez obtenidas las secuencias de DNA completas de la presente invención, se pueden usar como guía para definir nuevos cebadores de PCR para la clonación de secuencias de DNA sustancialmente homólogas de otras fuentes. Además éstas y sus secuencias de DNA homólogas se pueden integrar en vectores por métodos conocidos en el arte y descritos por ejemplo en Sambrook et al. (s.a.) para expresar o sobreexpresar el/los polipéptido(s) codificados en sistemas de huéspedes apropiados. No obstante, un entendido en el campo conoce también que las secuencias de DNA se pueden usar por si mismas para transformar los sistemas huésped apropiados de la invención para conseguir que sobreexpresen el polipéptido codificado. Los sistemas de huésped apropiados son por ejemplo bacterias como por ejemplo E. coli, bacilos, como por ejemplo Bacillus subtilis o cepas de Flavobacter. E. coli que se puede usar son cepas K12 de E. coli por ejemplo M15 [descrita como DZ 291 por Villarejo et al. en J. Bacteriol. 120, 466-474 (1974)], HB 101 [ATCC Nº 33694] o E. coli SG13009 [Gottesman et al., J. Bacteriol. 148, 265-273 (1981)]. Los sistemas huésped eucariotas apropiados son por ejemplo, hongos, tipo Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger [ATCC 9142] o levaduras, de tipo Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cerevisae o Pichia, tipo pastoris, todos disponibles en ATCC.

Los vectores apropiados que se pueden usar para la expresión en E. coli se mencionan, por ejemplo en Sambrook et al. [s.a.] o por Fiers et al. en Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium [Soc. Franc. de Microbiol., Paris (Durand et al., eds.), pp. 680-697 (1988)] o por Bujard et al. en Methods in Enzymology, eds. Wu y Grossmann, Academic Press, Inc. Vol. 155, 416-433 (1987) y Stüber et al. en Immunological Methods, eds. Lefkovits y Pernis, Academic Press, Inc., Vol.IV, 121-152 (1990). Los vectores que se pueden usar para la expresión en bacilos son conocidos en el arte y se describen, por ejemplo en PE 405 370, PE 635 572 Procd. Nat. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984) por Yansura y Henner, Meth.Enzym. 185, 199-228 (1990) o PE 207 459. Los vectores que se pueden usar para expresión en hongos se conocen en el arte y se describen por ejemplo en PE 420 358 y para levaduras en PE 183 070, PE 183 071, PE 248 227, PE 263 311.

Una vez tales secuencias de DNA se han expresado en una célula huésped apropiada en un medio apropiado los carotenoides se pueden aislar tanto a partir del medio en el caso de que se secreten al medio o del organismo huésped y, si desea separarse de los otros carotenoides si se da el caso de que se quiera aislar un carotenoide específico se puede hacer por métodos conocidos el arte (ver por ejemplo carotenoids Vol IA; Isolation and Analysis, G. Britton, S. Liaaen-Jensen, H. Pfander; 1995, Birkhäuser Verlag, Basilea).

Los carotenoides de la presente invención se pueden usar en un procedimiento para la preparación de alimentos. Un entendido en el arte está familiarizado con tal procedimiento. Tales compuestos alimentarios pueden además
comprender aditivos o componentes generalmente usados para tal propósito y conocidos en el estado del
arte.

Tras haber descrito en general la invención hasta aquí, las siguientes figuras y ejemplos intentan ilustrar detalles de la invención, sin limitar ésta de ningún modo.

Figura 1: La vía de biosíntesis para la formación de carotenoides de Flavobacterium sp. R1534 se ilustra explicando las actividades enzimáticas que están codificadas por secuencias de DNA de la presente invención.

Figura 2: Southern blot de DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 digerido con los enzimas de restricción mostrados en la parte superior de cada carril e hibridadas con la Sonda 46F. La flecha indica el fragmento de 2,4 kb Xhol/PstI aislado.

Figura 3: Southern blot del DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 digerido con ClaI o doblemente digerido con ClaI e HindIII. Los blots mostrados en el Panel A y B se hibridan con la sonda A o la sonda B, respectivamente (ver ejemplos). Ambos fragmentos ClaI/HindIII de 1,8 kb y 9,2 kb están indicados.

Figura 4: Southern blot del DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 digerido con los enzimas de restricción mostrados en la parte superior de cada carril e hibridado con la sonda C. El fragmento de 2,8 kb Sa1I/HindIII se muestra por la flecha.

Figura 5: Southern blot del DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 digerido con los enzimas de restricción mostrados en la parte superior de cada carril e hibridado con la sonda D. El fragmento BclI/SphI aislado de aproximadamente 3 kb se muestra por la flecha.

Figura 6: Mapa físico de la organización de la agrupación de biosíntesis de carotenoides en Flavobacterium sp. R1534, deducida de los clones genómicos obtenidos. La localización de las sondas usadas para el cribaje se muestran como barras en sus respectivos clones.

Figura 7: Secuencia de nucleótidos de la agrupación de biosíntesis de carotenoides de Flavobacterium sp. R1534 y sus regiones flanqueantes. La secuencia de nucleótidos está numerada desde el primer nucleótido mostrado (ver sitio BamHI de la Fig.6). Las secuencias de aminoácidos deducidas de los ORF (orf-5, orf-1, crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ y orf-16) se muestran con el código para aminoácidos de una única letra. La Flecha (\rightarrow) indica la dirección de la transcripción; los asteriscos, los codones de stop.

Figura 8: Secuencia de proteínas de la GGPP sintasa (crtE) de Flavobacterium sp. R1534 con un PM de 31331 Da.

Figura 9: Secuencia de proteínas de la prefitoeno sintasa (crtB) de Flavobacterium sp. R1534 con un PM de 32615 Da.

Figura 10: Secuencia de proteínas de la fitoeno desaturasa (crtI) de Flavobacterium sp. R1534 con un PM de 54411 Da.

Figura 11: Secuencia de proteínas de la licopeno ciclasa (crtY) de Flavobacterium sp. R1534 con un PM de 42368 Da.

Figura 12: Secuencia de proteínas de la \beta-caroteno hidroxilasa (crtZ) de Flavobacterium sp. R1534 con un PM de 19282 Da.

Figura 13: Plásmidos recombinantes que contienen delecciones de la agrupación de genes de biosíntesis de carotenoides de Flavobacterium sp. R1534.

Figura 14: Los cebadores usados para las reacciones de PCR. La secuencia subrayada es el sitio de reconocimiento del enzima de restricción indicado. Los pequeños capuchones indican los nucleótidos introducidos por mutagénesis. Las cajas muestran el RBS artificial que es reconocido por B. subtilis. Los pequeños capuchones en negrita muestran la localización de la adenina original creando el sitio de inicio de la traducción (ATG) del siguiente gen (ver operón original). Todos los ATG de los genes biosintéticos de carotenoides de Flavobacter deben ser destruidos para no interferir con el sitio de inicio de transcripción reconstruido. Las flechas indican el inicio y fin de los genes de carotenoides de Flavobacterium R1534 WT indicados.

Figura 15: Los enlazantes usados para las diferentes construcciones. La secuencia subrayada es el sitio de reconocimiento del enzima de restricción indicado. Los pequeños capuchones indican los nucleótidos introducidos por cebadores sintéticos. Las cajas muestran el RBS artificial que es reconocido en B. subtilis. La flecha indica el inicio y fin de los genes de carotenoides de Flavobacterium indicados.

Figura 16: Construcción de plásmidos pBIIHS(+)-clon59-2, pLyco y pZea4.

Figura 17: Construcción del plásmido p602CAR.

Figura 18: Construcción de los plásmidos pBIIKS(+)-CARVEG-E y p602 CARVEG-E.

Figura 19: Construcción de los plásmidos pHP13-2CARZYIB-EINV y pHP13-2PN25ZYIB-EINV.

Figura 20: Construcción del plásmido pXI12-ZYIB-EINVMUTRBS2C.

Figura 21: Análisis por Northern blot de la cepa BS1012::ZYIB-EINV4 de B. subtilis. Panel A: Representación esquemática de una integración recíproca del plásmido pXI12-ZYIB-EINV4 en el gen de la levan-sucrasa de B. subtilis. Panel B: Northern blot obtenido con la sonda A (fragmento de PCR que se obtuvo con CAR51 y CAR76 e hibrida con el extremo 3' de crtZ y el extremo 5' o crtY). Panel C: Northern blot obtenido con la sonda B (fragmento BamHI-Xhol aislado del plásmido pBIIKS(+)-crtE/2 e hibrida con la parte 5' del gen crtE).

Figura 22: Representación esquemática de los sitios de integración de las tres cepas de Bacillus transformadas: BS1012::SFCO, BS1012::SFCOCAT1 y BA1012::SFCONEO1. La amplificación del operón de carotenoide de Flavobacterium sintético (SFCO) puede sólo obtenerse a partir de aquellas cepas con estructuras amplificables. La sonda A se usó para determinar el número de copias del SFCO integrado. El gen de resistencia a eritromicina (ermAM), el gen de resistencia a cloranfenicol (cat), el gen de resistencia a neomicina (neo), terminador del gen cryT de B. subtilis (cryT), el gen de la levan-sucrasa (sac-B 5' y sac-B 3'), secuencias del plásmido pXI12 (pXI12), promotor originado del sitio I del complejo promotor veg (Pvegl).

Figura 23: Construcción de los plásmidos pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO y pXI12-ZYIB-EINV4MUTRB
S2CCAT.

Figura 24: Secuencia completa de nucleótidos del plásmido pZea4.

Figura 25: Gen crtW sintético de Alcaligenes PC-1. La secuencia de proteínas traducida se muestra antes de la secuencia de DNA de doble cadena. Los doce oligonucleótidos (crtW1-crtW12) usados para la síntesis por PCR están subrayados.

Figura 26: Construcción del plásmido pBIIKS-crtEBIYZW. El fragmento HindIII-Pm1I de pALTER-Ex2-crtW, llevando el gen sintético crtW, se clonó en los sitios HindIII y MluI (romo). PvegI y Ptac son los promotores usados para la transcripción de los dos operones. El origen de replicación de ColE1 de este plásmidos es compatible con el origen p15A presente en las construcciones pALTER-Ex2.

Figura 27: Las inserciones relevantes en todos los plásmidos construidos en el Ejemplo 7. Los genes desorganizados se muestran por //. Sitios de restricción: S=SacI, X=Xbal, H=HindIII, N=NsiI, Hp=HpaI, Nd=Ndel.

Figura 28: Productos de reacción (carotenoides) obtenidos a partir de \beta-caroteno mediante el procedimiento de la presente invención.

Ejemplo 1 Materiales y métodos generales usados

Cepas bacterianas y plásmidos: Flavobacterium sp. R1534 WT (ATCC 21588) fue la fuente de DNA para clonar los genes. Las genotecas parciales de DNA de Flavobacterium sp. R1534 WT se construyeron en pBluescriptII+(KS) o (SK) vector (Stratagene, La Jolla, USA) y se transformaron en E. coli XL-1 blue (Stratagene) o JM109.

Medio y condiciones de crecimiento: E. coli transformado creció en caldo de Luria (LB) a 37ºC con 100 \mug de Ampicilina (Amp)/ml para la selección. Flavobacterium sp. R1534 WT creció a 27ºC en medio que contenía glucosa 1%, triptona 1% (Difco Laboratorios), extracto de levadura 1% (Difco), MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 0,5% y 3% NaCl.

Cribaje de colonias: El cribaje de los transformantes de E. coli se realizó por PCR de acuerdo con el método descrito por Zon et al. [Zon et al., BioTechniques 7, 696-698 (1989)] usando los siguientes cebadores:

Cebador #7: 5'-CCTGGATGACGTGCTGGAATATTCC-3'

Cebador #8: 5'-CAAGGCCCAGATCGCAGGCG-3'

DNA genómico: Un cultivo de 50 ml durante toda la noche de Flavobacterium sp. R1534 se centrifugó a 10.000 g durante 10 minutos. El sedimento se lavó brevemente con 10 ml de un tampón de lisis (50 mM EDTA, 0,1M NaCl pH7,5), se resuspendió en 4 ml del mismo tampón suplementado con 10 mg de lisozima y se incubó a 37ºC durante 15 minutos. Tras la adición de 0,3 ml de N-Lauroil sarcosina (20%) la incubación a 37ºC continuó durante otros 15 minutos antes de la extracción del DNA con fenol, fenol/cloroformo y cloroformo. El DNA precipitó en etanol a temperatura ambiente durante 20 minutos en presencia de 0,3 M acetato sódico (pH 5,2), seguido de centrifugación a 10.000 g durante 15 minutos. El sedimento se trató con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en 1 ml de TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).

Todo el DNA genómico usado en el análisis por Southern blot y experimentos de clonación se dializó contra H_{2}O durante 48 horas, usando bolsas coloidales (Sartorius, Alemania), precipitó en etanol en presencia de acetato sódico 0,3M y se resuspendió en H_{2}O.

Marcaje de sondas: Las sondas de DNA se marcaron con (\alpha-32P)dGTP (Amersham) por cebadura aleatoria de acuerdo con [Sambrook et al., s.a.].

Sondas usadas para cribar las mini-genotecas: La sonda 46F es un fragmento de 119 pb obtenido por PCR usando el cebador #7 y #8 y el DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 como molde. Esta sonda se propuso que era un fragmento del gen de la fitoeno sintasa de Flavobacterium sp. R1534 (crtB), desde que muestra una homología significativa con los genes de la fitoeno sintasa de otras especies (por ejemplo E. uredovora, E. herbicola). La sonda A es un fragmento BstXI-PstI de 184 pb originado desde el brazo derecho de la inserción del clon 85. La sonda B es un fragmento XhoI-NotI de 397 pb obtenido desde el extremo izquierdo de la inserción del clon 85. La sonda C es un fragmento BglII-PstI de 536 pb del extremo derecho de la inserción del clon 85. La sonda D es un fragmento KpnI-BstYI de 376 pb aislado de la inserción de clon 59. La localización de las sondas individuales se muestra en la figura 6.

Síntesis de oligonucleótido: Los oligonucleótidos usados para la reacción de PCR o para secuenciar se sintetizaron con un sintetizador de DNA 392 de Applied Biosystems.

Análisis por Southern blot: Para los experimentos de hibridación el DNA de Flavobacterium sp. R1534 (3 \mug) se digirió con los enzimas de restricción apropiados y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,75%. La transferencia a las membranas del blotting Zeta-Probe (BIO-RAD), se realizó tal como se describe [Sourthern, E.M., J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)]. La pre-hibridación y la hibridación fue en SDS 7%, BSA 1% (fracción V; Boheringer), Na_{2}HPO_{4} 0,5M, pH 7,2 a 65ºC. Tras la hibridación las membranas se lavaron dos veces durante 5 minutos en 2xSSC, 1% SDS a temperatura ambiente y dos veces durante 15 minutos en 0,1% SSC, 0,1% SDS a 65ºC.

Análisis de la secuencia de DNA: La secuencia se determinó por la técnica de terminación de cadena didesoxi [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)] usando el Kit Sequenase (United Status Biochemical). Ambas hebras se secuenciaron completamente y la secuencia se analizó usando el paquete de software de análisis de secuencia GCG (Versión 8.0) por Genetics Computer, Inc. [Devereux et al., Nucleic Acids. Res. 12, 387-395 (1984)].

Análisis de los carotenoides: E. coli XL-1 o células JM109 (200-400 ml) llevando diferentes construcciones de plásmido crecieron durante los tiempos indicados en el texto, normalmente 24 a 60 horas, en LB suplementado con 100 \mug de ampicilina/ml, en matraces en agitación a 37ºC y 220 rpm.

Los carotenoides presentes en los microorganismos se extrajeron con un volumen adecuado de acetona usando un homogeneizador con rotación (Polytron, Kinematica Ag, CH-Luzern). El homogenizado se filtró a través de un vidrio sinterizado de un filtro de succión en un matraz del culo redondo. El filtrado se evaporó por métodos de rotavapor a 50ºC usando el vacío por corriente de agua. Para la detección de la zeaxantina el residuo se disolvió en n-hexano/acetona (86:14) antes del análisis con HPLC de fase normal tal como se describe en [Weber, S. en Analytical Methods for Vitamins and Carotenoids en Feed, Keller, H.E., Editor, 83-85 (1988)]. Para la detección del \beta-caroteno y el licopeno, el extracto evaporado se disolvió en n-hexano/acetona (99:1) y se analizó por HPLC tal como se describe en [Hengartner et al., Helv. Chim. Acta 75, 1848-1865 (1992)].

Ejemplo 2 Clonación de los genes biosintéticos de carotenoides de Flavobacterium sp R1534

Para identificar y aislar fragmentos de DNA que llevan los genes de la vía de biosíntesis de carotenoides, usamos el fragmento de DNA 46F (ver métodos) para sondar un Southern blot que lleva DNA cromosomal de Flavobacterium sp. R1534 digerido con diferentes enzimas de restricción Fig.2. El fragmento XhoI/PstI de 2,4 kb hibridando a la sonda parece el más apropiado para empezar con él. El DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 se digirió con XhoI/PstI y se hizo correr en un gel de agarosa al 1%. De acuerdo con el marcador de DNA co-migrante, la región de alrededor de 2,4 kb se cortó del gel y se aisló el DNA. Una mini genoteca de XhoI/PstI de DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 se construyó en sitios XhoI-PstI de pBluescriptIISK(+). Cien transformantes XL1 de E. coli se cribaron a continuación por PCR con el cebador #7 y el cebador #8, los mismos cebadores previamente usados para obtener el fragmento de 119 pb (46F). Se encontró un transformante positivo, llamado clon 85. La secuenciación del inserto reveló secuencias no sólo homólogas con la fitoeno sintasa (crtB) sino también con la fitoeno desaturasa (crtI) de ambas especies de Erwinia, herbicola y uredovora. Las secuencias genómicas de mano derecha y mano izquierda del clon 85 se obtuvieron por el mismo procedimiento usando la sonda A y la sonda B. El DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 se digirió doblemente con ClaI e HindIII y se sometieron a análisis por Southern con la sonda A y la sonda B. Con la sonda A se identificó un fragmento ClaI/HindIII de aprox. 1,8 kb (Fig. 3A), se aisló y se subclonó en los sitios ClaI/HindIII de pBluescriptIIKS (+). El cribaje de los transformantes XL1 de E. coli con la sonda A dió 6 clones positivos. La inserción de uno de estos positivos, clon 43-3, se secuenció y mostró homología con el extremo N-terminal de los genes crtI y el extremo C-terminal de los genes crtY de ambas especies de Erwinia mencionadas anteriormente. Con la sonda B se detectó un fragmento ClaI/HindIII de aprox. 9,2 kb (Fig. 3B), se aisló y se subclonó en pBluescriptIIKS(+).

Un cribaje de los transformantes dió un clon positivo, clon 51. La secuenciación del 5' y 3' del inserto, reveló que sólo la región cercana al sitio HindIII mostró una homología relevante con los genes de la biosíntesis de carotenoides de las especies de Erwinia mencionadas anteriormente (por ejemplo gen crtB y gen crtE). La secuencia alrededor del sitio ClaI no mostró homología con genes conocidos de la vía de biosíntesis de carotenoides. Basándose en esta información y para facilitar la posterior secuenciación y trabajo de construcción, el fragmento BamHI/HindIII de 4,2 kb del clon 51 se subclonó en los sitios respectivos de pBlueScriptIIKS(+) resultando en un clon 2. La secuenciación del inserto de este clon confirmó la presencia de genes homólogos a los genes de Erwinia sp. crtB y crtE. Estos genes se localizaron en 1,8 kb del sitio HindIII. Los 2,4 kb restantes de este inserto no tenían homología con los genes de biosíntesis de carotenoides conocidos.

Las secuencias genómicas adicionales corriente abajo del sitio ClaI se detectaron usando la sonda C para hibridar el DNA genómico de Flavobacterium sp. R1534 digerido con cuatro enzimas de restricción diferentes (ver figura 4).

Un fragmento SalI/HindIII de 2,8 kb identificado por análisis Southern se aisló y se subclonó en los sitios HindIII/XhoI de pBluescriptIIKS (+). EL cribaje de los transformantes XL1 de E. coli con la sonda A dio un clon positivo llamado clon 59. El inserto de este clon confirmó la secuencia del clon 43-3 y contenía además secuencias homólogas al extremo N-terminal del gen crtY de otras licopeno ciclasas conocidas. Para obtener el gen crtZ ausente putativo, se construyó una genoteca de digestión parcial de Sau3AI de Flavobacterium sp. R1534 en el sitio BamHI de pBluescriptIIKS(+). El cribaje de esta genoteca con la sonda D dió varios clones positivos. Un transformante designado, clon 6a, tenía un inserto de 4,9 kb. La secuenciación del inserto reveló además de las secuencias ya conocidas codificantes por crtB, crtI y crtY también la pérdida del gen crtZ. El clon 7g se aisló de una mini genoteca llevando fragmentos BclI/SphI de R1534 (Fig.5) y se cribó con la sonda D. El tamaño del inserto del clon 7g es aproximadamente 3 kb.

Los seis insertos independientes de los clones descritos anteriormente que cubren aproximadamente 14 kb del genoma de Flavobacterium sp. R1534 se compilan en la Figura 6.

La secuencia determinada que se extiende del sitio BamHI (posición 1) al par de bases 8625 se muestra en la figura 7.

Regiones codificantes por la proteína putativa de la secuencia R1534 clonada

El análisis por ordenador usando el programa CodonPreference del paquete GCG, que reconoce las regiones codificantes por la proteína mediante la virtud de la similitud de su uso de codones con una tabla de frecuencia de codones dada, revelando ocho marcos de lectura abiertos (ORFs) codificando proteínas putativas; un ORF parcial de 1 a 1165 (ORF-5) codificante por un polipéptido mayor de 41382 Da; un ORF codificante por un polipéptido con un peso molecular de 40081 Da desde 1180 a 2352 (ORF-1); un ORF codificante por un polipéptido con un peso molecular de 31331 Da desde 2521 a 3405 (crtE); un ORF codificante por un polipéptido con un peso molecular de 32615 Da desde 4316 a 3408 (crtB); un ORF codificante por un polipéptido con un peso molecular de 54411 Da desde 5797 a 4316 (crtI); un ORF codificante por un polipéptido con un peso molecular de 42368 Da desde 6492 a 5797 (crtY); un ORF codificante por un polipéptido con un peso molecular de 19282 Da desde 7448 a 6942 (crtZ); y un ORF codificante por un polipéptido con un peso molecular de 19368 Da desde 8315 a 7770 (ORF-16); ORF-1 y crtE tienen la orientación transcripcional opuesta a los otros (Fig. 6). Los sitios de inicio de traducción de los ORF crtI, crtY y crtZ pueden determinarse claramente en base a las secuencias localizadas apropiadamente homólogas a Shine/Delgano (S/D) [Shine and Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 1342-1346 (1974)] secuencia de consenso AGG-6-9N-ATG (Fig.10) y la homología a las secuencias N-terminales de los respectivos enzimas de E. herbicola y E. uredovora. La traducción del ORF crtB podría empezar parcialmente a partir de tres codones estrechamente espaciados ATG (4316), ATG (4241) y ATG (4211). El primero, aún no teniendo la mejor secuencia S/D de los tres, da un producto traduccional con la mayor homología al extremo N-terminal de la proteína crtB de E. herbicola y E. uredovora, y por lo tanto el más probable sitio de inicio de la traducción. La traducción del ORF crtE podría empezar parcialmente desde cinco codones diferentes de inicio hallados en 150 pb: ATG (2389), ATG (2446), ATG (2473), ATG (2497) y ATG (2521). Creemos que basándonos en las siguientes observaciones, el ATG (2521) es el sitio de inicio de la traducción más probable de crtE: este codón de inicio ATG va precedido de la mejor secuencia de consenso S/D de todos los cinco sitios de inicio putativos mencionados; y la secuencia de aminoácidos N-terminal putativa de la proteína codificada tiene la mayor homología al extremo N-terminal de los enzimas crtE de E. herbicola y E. uredovora;

Características de los sitios de inicio traduccional crt y productos génicos

Los sitios de inicio traduccional de cinco genes de biosíntesis de carotenoides se muestran posteriormente y los posibles sitios de unión a los ribosomas están subrayados. Los genes crtZ, crtY, crtI y crtB se agrupan tan estrechamente que el codón de stop del anterior gen se superpone con el ATG del siguiente gen. Sólo tres de los cinco genes (crtI, crtY y crtZ) ajustan con el consenso de secuencias S7D óptimas. La secuencia TGA encajonada muestra el codón de stop del anterior gen.

1

Secuencias de aminoácidos de genes crt individuales de Flavobacterium sp. R1534

Todos los cinco ORF de Flavobacterium sp. R1534 con homología a los genes de biosíntesis de carotenoides conocidos de otras especies se agrupan en aproximadamente 5,2 kb de la secuencia (Fig.7).

GGDP sintasa (crtE)

La secuencia de aminoácidos (aa) de la geranilgeranil pirofosfato sintasa (producto génico crtE) consiste de 295 aa y se muestra en la figura 8. Este enzima condensa el farnesil pirofosfato y el isopentenil pirofosfato en 1'-4.

Fitoeno sintasa (crtB)

Este enzima cataliza dos pasos enzimáticos. Primero condensa en una reacción cabeza con cabeza dos geranilgeranil pirofosfatos (C20) dando el prefitoeno carotenoide C40. Segundo reconfigura el anillo ciclopropilo del prefitoeno a fitoeno. El aa 303 codificado por el gen crtB de Flavobacterium sp. R1534 se muestra en la figura 9.

Fitoeno desaturasa (crtI)

La fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp. R1534 consiste de 494 aa, mostrados en la figura 10, realizando como el enzima crtI de E. herbicola y E. uredovora, cuatro pasos de desaturación, convirtiendo el carotenoide no coloreado en licopeno de color rojo.

Licopeno ciclasa (crtY)

El producto génico crtY de Flavobacterium sp. R1534 es suficiente para introducir los anillos \beta-ionono en ambos lados del licopeno para obtener el \beta-caroteno. La licopeno ciclasa de Flavobacterium sp. R1534 consiste de 382 aa (Fig.11).

\beta-caroteno hidroxilasa (crtZ)

El producto génico de crtZ consiste de 169 aa (Fig.12) e hidroxila el \beta-caroteno a la xantofila zeaxantina.

Funciones enzimáticas putativas de los ORF (orf-1, orf-5 y orf-16)

El orf-1 tiene un nivel de aa superior al 40% de identidad a las acetoacetil-CoA tiolasas de diferentes organismos (por ejemplo Candida tropicalis, humana, rata). Este gen es por lo tanto más parecido a una acetoacetil-CoA tiolasa putativa (acetil-CoA acetiltransferasa), que condensa dos moléculas de acetil-CoA a Acetoacetil-CoA. La condensación de acetoacetil-CoA con un tercer acetil-CoA por la HMG-CoA sintasa forma \beta-hidroxi-\beta-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). Este compuesto es parte de la vía del mevalonato que produce además de los esteroles también numerosos tipos de isoprenoides con diversas funciones celulares. En bacterias y plantas, la vía isoprenoide es también capaz de sintetizar algunos productos únicos del tipo carotenoides, reguladores del crecimiento (por ejemplo en plantas giberelinas y ácido abcísico) y metabolitos secundarios del tipo fitoalexinas [Riou et al., Gene 148, 293-297 (1994)].

El orf-5 tiene una baja homología de aproximadamente 30%, a la secuencia de aminoácidos de policetido sintasas de diferentes estreptomicetos (por ejemplo S. violaceoruber, S. cinnamonensis). Estos enzimas que sintetizan antibióticos (policetido sintasas), se han clasificado en dos grupos. Las policetido sintasas de tipo I son proteínas grandes multifuncionales, mientras que las policetido sintasas de tipo II son complejos multiproteína compuestos de varias proteínas individuales implicadas en las subreacciones de la síntesis de policetidos [Bibb., et al. Gene 142, 31-39 (1994)].

La proteína putativa codificada por el orf-16 tiene a nivel de aa una identidad del 42% cuando se compara con la subunidad hidrogenasa soluble de Anabaena cilíndrica.

Asignación funcional de los ORF (crtE, crtB, crtI, crtY y crtZ) para actividades enzimáticas de la vía de biosíntesis de carotenoides

Se reveló la asignación bioquímica de los productos génicos de los diferentes ORF analizando la acumulación de carotenoides en cepas huésped de E. coli que se transformaron con variantes deleccionadas de la agrupación de genes Flavobacterium sp. y no expresando así todos los genes crt (Fig.13).

Se construyeron tres plásmidos diferentes: pLycp, p59-2 y pZea4. El plásmido p59-2 se obtuvo por subclonación del fragmento HindIII/BamHI del clon 2 en los sitios HindIII/BamHI del clon 59. p59-2 lleva los ORF de los genes crtE, crtB, crtI y crtY y deberían llevar a la producción de \beta-caroteno. pLyco se obtuvo seleccionando el fragmento KpnI/KpnI, codificado por aproximadamente la mitad (extremo N-terminal) del gen crtY, del plásmido p59-2. Las células E. coli transformadas con pLyco, y por lo tanto con un gen crtY no funcional truncado, deberían producir licopeno, el precursor de \beta-caroteno. pZea4 se construye por ligación del fragmento AscI-SpeI de p59-2, conteniendo crtE, crtB, crtI y la mayoría del gen crtY con el fragmento AscI/XbaI del clon 6a, conteniendo las secuencias para completar el gen crtY y crtZ. pZea4 [para ver la secuencia completa ver Fig. 24; nucleótidos 1 a 683 resulta de pBluescriptIIKS(+), nucleótidos 684 a 8961 del genoma de Flavobacterium R1534 WT, nucleótidos 8962 a 11233 de pBluescriptIIKS(+)] tiene por lo tanto todos los cinco ORF de la vía de biosíntesis de zeaxantina. El plásmido pZea4 se ha depositado el 25 de Mayo de 1995 en el DSm-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un Zellkulturen GMBH (Alemania) bajo el Nº de acceso DSM 10012. Las células de E. coli transformadas con este último plásmido deberían por lo tanto producir zeaxantina. Para la detección del carotenoide producido, los transformantes se hicieron crecer durante 48 horas en matraces en agitación y entonces se sometió a análisis de los carotenoides tal como se describe en la sección métodos. La Figura 13 resume las diferentes inserciones de los plásmidos descritos anteriormente, y el principal carotenoide detectado en las células.

Tal como se espera las células de E. coli que llevan pLyco producen licopeno, aquellas que llevan p59-2 producen \beta-caroteno (todas-E,9-Z,13-Z) y las células con la construcción pZea4 producen zeaxantina. Esto confirma que todos los genes necesarios de Flavobacterium sp. R1534 para la síntesis de zeaxantina o sus precursores (fitoeno, licopeno y \beta-caroteno) estaban clonados.

Ejemplo 3 Materiales y métodos usados para la expresión de los enzimas que sintetizan carotenoides

Cepas bacterianas y plásmidos: Los vectores pBluescriptIIKS (+) o (-) (Stratagene, La Jolla, USA) y pUC18 [Vieira & Messing, Gene 19, 259-268 (1982); Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)] se usaron para clonar en diferentes cepas de E. coli, tipo XL-1 blue (Stratagene), TG1 o JM109. En todas las transformaciones de B. subtilis, se usó la cepa 1012. Los plásmidos pHP13 [Haima et al., Mol. Gen. Genet. 209, 335-342 (1987)] y p602/22 [LeGrice, S.F.J. en Gene Expression Technology, Goeddel, D.V., Editor, 201-214 (1990)] son vectores lanzadera Gram (+)/(-) capaces de replicarse en células de B. subtilis y E. coli. El plásmido p205 contiene el promotor vegI clonado en el sitio SmaI de pUC18. El plásmido pXI12 es un vector de integración de la expresión constitutiva de los genes en B. subtilis [Haiker et al., en 7th Int. Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, 26 Junio - 1 Julio, 1994. Montreal, Québec, Canada (1994)]. El plásmido pBEST501 [Itaya et al., Nucleic Acids Res. 17 (11), 4410 (1989)] contiene el casete de genes de resistencia a la neomicina originado del plásmido pUB110 (entrada GenBank: M19465) de S. aureus [McKenzie et al., Plasmid 15, 93-103 (1986); McKenzie et al., Plasmid 17, 83-84 (1987)]. Este gen de la neomicina se ha mostrado que trabaja como marcador de la selección cuando está presente en una copia simple en el genoma de B. subtilis. El plásmido pC194 (ATCC 37034)(entrada GenBank: L08860) originada de S. aureus [Horinouchi and Weisblaum, J. Bacteriol. 150, 815-825 (1982)] y contiene el gen de la cloranfenicol
acetiltransferasa.

Medio y condiciones de crecimiento: E. coli creció en caldo de Luria (LB) a 37ºC con 100 \mug de ampicilina (Amp)/ml para la selección. Las células de B. subtilis crecieron en medio VY suplementado con eritromicina (1 \mug/ml), neomicina (5-180 \mug/ml) o cloranfenicol (10-80 \mug/ml).

Transformación: Las transformaciones de E. coli se hicieron por electroporación usando el dispositivo generador de impulsos Gene de BIO-RAD (Hercules, CA, USA) con los siguientes parámetros (200 \Omega, 250 \muFD, 2,5V). Las transformaciones de B. subtilis se hicieron básicamente de acuerdo con el procedimiento estándar del método 2.8 descrito por [Cutting y Vander Horn en Molecular Biological Methods for Bacillus, Harwood, C.R. y Cutting, S.M., Editor, John Wiley & Sons; Chichester, Inglaterra. 61-74 (1990)].

Cribaje de colonias: El cribaje de colonias se hizo tal como se describe por [Zon et al., s.a.].

Síntesis de oligonucleótidos: Los oligonucleótidos usados para las reacciones de PCR o para la secuenciación se sintetizaron con un sintetizador de DNA 392 de Applied Biosystems.

Reacciones de PCR: Las reacciones de PCR se realizaron usando tanto la UlTma DNA polimerasa (Perkin Elmer Cetus) o la Pfu Vent polimerasa (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 50 \mul de una reacción típica de PCR contienen: 100 ng de DNA molde, 10 pM de cada uno de los cebadores, todos los cuatro dNTP (conc. final 300 \muM), MgCl_{2} (cuando se usa la UlTma polimerasa; conc. final 2 mM), 1 x tampón de la reacción UlTma o 1x tampón Pfu (suministrado por el fabricante). Todos los componentes de la reacción con la excepción de la DNA polimerasa se incubaron a 95ºC durante 2 min. seguido de los ciclos indicados en la sección respectiva (ver posteriormente). En todas las reacciones se hizo un inicio caliente, añadiendo la polimerasa en la primera vuelta del ciclo durante el paso de elongación a 72ºC. Al final de la reacción de PCR se analizó una alícuota en gel de agarosa al 1%, antes de extraer una vez con fenol/cloroformo. El fragmento amplificado en la fase acuosa precipitó con 1/10 de una solución 3M de NaAcetato y dos volúmenes de etanol. Tras entrifugación durante 5 min. a 12000 rpm, el pellet se resuspendió en un volumen adecuado de H_{2}O, normalmente 40 \mul, antes de realizar la digestión conlos enzimas de restricción indicados. Tras la digestión la mezcla se separó en agarosa de bajo punto de fusión al 1%. El producto de PCR de tamaño esperado se escindió de la agarosa y se purificó usando el método de las cuentas de cristal (GENECLEAN KIT, Bio 101, Vista CA, USA) cuando los fragmentos eran superiores a 400 pb o directamente se prolongaba de gel cuando los fragmentos eran inferiores a 400 pb, tal como se describe por [Heery et al., TIBS 6 (6), 173 (1990)].

Oligos usados para la amplificación génica y la mutagénesis dirigida a un sitio

Todas las reacciones de PCR realizadas bajo la construcción de diferentes plásmidos se describen posteriormente. Todos los cebadores usados se resumen en la figura 14.

Cebadores #100 y #101 se usaron en una reacción de PCR para amplificar el gen crtE completo con un sitio de restricción SpeI y un sitio de unión ribosomal artificial (RBS) corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción de este gen. En el extremo 3' del fragmento amplificado, se introdujeron dos únicos sitios de restricción, un sitio AvrII y SmaI, para facilitar los posteriores pasos de clonación. La reacción de PCR se realizó con una UlTma polimerasa usando las siguientes condiciones para la amplificación: 5 ciclos con el perfil: 95ºC, 1 min/ 60ºC, 45 seg/ 72ºC, 1 min y 20 ciclos con el perfil 95ºC, 1 min./ 72ºC, 1 min. El plásmido pBIIKS(+)-clon2 sirvió como DNA molde. El producto de PCR final se digirió con SpeI y SmaI y se aisló usando el GENECLEAN KIT. El tamaño del fragmento fue aproximadamente 910 pb.

Los cebadores #104 y #105 se usaron en la reacción de PCR para amplificar el gen crtZ desde el inicio de la traducción hasta el sitio de restricción SalI, localizado en la secuencia codificante de este gen. En el extremo 5' del gen crtZ se introdujo un EcoRI, un RBS sintético y un sitio NdeI. Las condiciones de PCR fueron las descritas anteriormente. El plásmido pBIIKS(+)-clon 6a sirvió como DNA molde y el producto final de PCR se digirió con EcoRI y SalI. El aislamiento del fragmento de aproximadamente 480 pb se hizo con el GENECLEAN KIT.

Los cebadores MUT1 y MUT5 se usaron para amplificar el gen crtY completo. En el extremo 5', los últimos 23 nucleótidos del gen crtZ incluyendo el sitio SalI están presentes, seguidos de un RBS artificial precediendo al sitio de inicio de la traducción del gen crtY. El RBS artificialmente creado incluye un sitio de restricción PmlI. El extremo 3' del fragmento amplificado contiene 22 nucleótidos del gen crtI, precedido de un nuevo RBS artificialmente creado que contiene un sitio de restricción MunI. Las condiciones usadas para la reacción de PCR fueron las descritas anteriormente usando el mismo perfil de ciclación: 5 ciclos de 95ºC, 45 seg./ 60ºC, 45 seg./ 72ºC, 75 seg. seguido de 22 ciclos con el perfil: 95ºC, 45 seg./ 66ºC, 45 seg./ 72ºC, 75 seg. El plásmido pXI12-ZYIB-EINV4 sirvió como molde para la Pfu Vent polimerasa. El producto de PCR de 1225 pb se hizo romo y se clonó en el sitio SmaI de pUC18, usando el Sure-Clone Kit (Pharmacia) de acuerdo al fabricante.

Los cebadores MUT2 y MUT6 se usaron para amplificar el gen crtI completo. En el 5' los últimos 23 nucleótidos del gen crtY están presentes, seguidos de un RBS artificial que precede el sitio de inicio de la traducción del gen crtI. El nuevo RBS creado, incluye el sitio de restricción MunI. EL extremo 3' del fragmento amplificado contiene el RBS artificial corriente arriba del gen crtB incluyendo el sitio de restricción BamHI. Las condiciones usadas para la reacción de PCR fueron básicamente las descritas anteriormente incluyendo el siguiente perfil de ciclos: 5 vueltas a 95ºC, 30 seg./ 60ºC, 30 seg./ 72ºC, 75 seg., seguido de 25 ciclos con el perfil: 95ºC, 30 seg.,/ 66ºC, 30 seg./ 72ºC, 75 seg. El plásmido pXI12-ZYIB-EINV4 sirvió como molde para la Pfu Vent polimerasa. Para los demás pasos de clonación el producto de PCR de 1451 pb se digirió con MunI y BamHI.

Los cebadores MUT3 y CAR17 se usaron para amplificar el extremo N-terminal del gen crtB. En el 5' los últimos 28 nucleótidos del gen crtI estaban presentes seguidos de un RBS artificial, precediendo el sitio de inicio de la traducción del gen crtB. Este RBS nuevo creado, incluye un sitio de restricción BamHI. El fragmento amplificado, llamado PCR-F contiene también el sitio de restricción HindIII localizado en el extremo N-terminal del gen crtB. Las condiciones usadas para la reacción de PCR fueron como las descritas en cualquier sitio del texto, incluyendo el siguiente perfil de ciclos: 5 vueltas de 95ºC, 30 seg./ 58ºC, 30 seg./ 72ºC, 20 seg. seguido de 25 ciclos con el perfil: 95ºC, 30 seg./ 60ºC, 30 seg./ 72ºC, 20 seg. El plásmido pXI12-ZYIB-EINV4 sirvió como molde para la Pfu Vent polimerasa. El producto de PCR de aproximadamente 160 pb se digirió con BamHI e HindIII.

Oligos usados para amplificar el gen de resistencia al cloranfenicol (cat)

Los cebadores CAT3 y CAT4 se usaron para amplificar el gen de resistencia al cloranfenicol de pC194 (ATCC 37034) [Horinouchi and Weisblum, s.a.] un plásmido encontrado en S.aureus. Las condiciones usadas para la reacción de PCR eran tal como se describen previamente incluyendo el siguiente perfil de ciclos: 5 vueltas a 95ºC, 60 seg./ 50ºC, 60 seg./ 72ºC, 2 min. seguido de 20 ciclos con el perfil: 95ºC, 60 seg./ 60ºC, 60 seg./ 72ºC, 2 min. El plásmido pC198 sirvió como molde para la Pfu Vent polimerasa. El producto de PCR de aproximadamente 1050 pb se digirió con EcoRI y AatII.

Oligos usados para generar enlazantes: Los enlazantes se obtuvieron añadiendo 90 ng de cada uno de los dos cebadores correspondientes en un tubo Eppendorf. La mezcla se secó en un control de vacío rápido y el sedimento se resuspendió en 1x tampón de ligación (Boheringer, Mannheim, Alemania). La solución se incubó a 50ºC durante 3 min. Antes de enfriar a TA, para permitir a los cebadores hibridar correctamente. Los enlazantes ahora estaban listos para ser ligados en los sitios apropiados. Todos los oligos usados para generar enlazantes se muestran en la figura 15.

Los cebadores CS1 y CS2 se usaron para formar un enlazante que contenía los siguientes sitios de restricción HindIII, AflII, ScaI, XbaI, PmeI y EcoRI.

Los cebadores MUT7 y MUT8 se usaron para formar un enlazante conteniendo los sitios de restricción SalI, AvrII, PmlI, MluI, MunI, BamHI, SphI e HindIII.

Los cebadores MUT9 y MUT10 se usaron para introducir un RBS artificial corriente arriba de crtY.

Los cebadores MUT11 y MUT12 se usaron para introducir un RBS artificial corriente arriba de crtE.

Aislamiento de RNA: El RNA total se preparó a partir de B. subtilis en fase de crecimiento logarítmico de acuerdo con el método descrito por [Maes y Messens, Nucleic Acids Res. 20 (16), 4374 (1992)].

Análisis Northern Blot: Para los experimentos de hibridación hasta 30 \mug de RNA de B. subtilis se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% hecho en 1x MOPS y 0,66 M de formaldehído. La transferencia a membranas de blotting Zeta-Probe (BIO-RAD), la unión cruzada UV, la pre-hibridación e hibridación se hicieron tal como se describe en [Farell, J.R.E., RNA Methodologies. A laboratory Guide for isolation and characterization. San Diego, USA: Academic Press (1993)]. Las condiciones de lavado usadas fueron: 2 x 20 min en 2xSSPE / 0,1% SDS seguido de 1 x 20 min. En 0,1% SSPE / 0,1% SDS a 65ºC. Los Northern blots entonces se analizaron mediante un Phosphorimager (Molecular Dynamics) o por autoradiografía en películas de rayos X de Kodak.

Aislamiento del DNA genómico: El DNA genómico de B. subtilis se aisló de 25 ml de cultivos durante toda la noche de acuerdo con el procedimiento estándar del método 2.6 descrito por [13].

Análisis Southern blot: Para los experimentos de hibridación, DNA genómico de B. subtilis (3 \mug) se digirieron con los enzimas de restricción apropiados y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,75%. La transferencia a membranas de blotting Zeta-Probe (BIO-RAD), se hizo tal como se describe [Southern, E.M., s.a.]. La prehibridación e hibridación fue en 7% SDS, 1% BSA (fracción V; Boheringer), 0,5M Na_{2}HPO_{4}, pH 7,2 a 65ºC. Tras la hibridación las membranas se lavaron dos veces durante 5 minutos en 2x SSC, 1% SDS a temperatura ambiente y dos veces durante 15 minutos en 0,1% SSC, 0,1% SDS a 65ºC. Los Southern blot entonces se analizaron por un Phosphorimager (Molecular Dynamics) o por autoradografía en películas de rayos X de Kodak.

Análisis de la secuencia de DNA: La secuencia se determinó por la técnica de terminación de cadena didesoxi [Sanger et al., s.a.] usando el kit Sequenase Versión 1.0 (United Status Biochemical). Las secuencias de análisis se hicieron usando el paquete de software de análisis de secuencia GCG (Versión 8.0) por Genetics Computer, Inc. [Devereux et al., s.a.].

Amplificación génica en B. subtilis : Para amplificar el número de copias del SFCO en los transformantes de B. subtilis, se inoculó una colonia simple en 15 ml de medio VY suplementado con 1,5% de glucosa y 0,02 mg de cloranfenicol o neomicina/ml, dependiendo del gen de resistencia a antibióticos presente en la estructura amplificable (ver resultados y discusión). El próximo día 750 \mul de este cultivo se usaron para inocular 13 ml del medio VY conteniendo 1,5% de glucosa suplementado con (60, 80, 120 y 150 \mug/ml) para los mutantes cat resistentes, o 160 \mug/ml y 180 \mug/ml para los mutantes neomicina resistentes). Los cultivos se hicieron crecer durante toda la noche y al día siguiente 50 \mul de diferentes diluciones (1:20, 1:400, 1:8000, 1:160000) se pusieron en placas de agar VY con la concentración de antibióticos apropiada. Entonces se analizaron además grandes colonias simples para determinar el número de copias y la cantidad de carotenoides producida.

Análisis de los carotenoides: Los transformantes E. coli o B. subtilis (200-400 ml) crecieron durante los tiempos indicados en el texto, normalmente de 24 a 72 horas, en medio LB o medio VY, respectivamente, suplementado con antibióticos, en matraces de agitación a 37ºC y 220 rpm.

Los carotenoides producidos por los microorganismos se extrajeron con un volumen adecuado de acetona usando un homogenizador por rotación (Polytron, Kinematica AG, CH-Lucerna). El homogenado se filtró a través de vidrio sinterizado de un filtro de succión en un matraz de culo redondo. El filtrado se evaporó por métodos de rotavapor a 50ºC usando un vacío por corriente de agua. Para la detección de zeaxantina el residuo se disolvió en n-hexano/acetona (86:14) antes del análisis mediante HPLC de fase normal tal como se describe en [Weber, S., s.a.]. Para la detección del \beta-caroteno y el licopeno el extracto evaporado se disolvió en n-hexano/acetona (99:1) y se analizó por HPLC tal como se describe en Hengartner et al., s.a.].

Ejemplo 4 Producción de carotenoides en E. coli

La asignación bioquímica de los productos génicos de los diferentes marcos de lectura abiertos (ORF) del grupo de biosíntesis de carotenoides de Flavobacterium sp. se revelaron por análisis de la acumulación de carotenoides en cepas huésped de E. coli, transformadas con plásmidos que llevan delecciones del grupo de genes de Flavobacterium sp., y careciendo así de algunos de los productos del gen crt. Se han descrito ensayos funcionales similares en E. coli por otros autores [Misawa et al., s.a.; Perry et al., J. Bacteriol., 168, 607-612 (1986); Hundle, et al., Molecular and General Genetics 254 (4), 406-416 (1994)]. Se construyeron tres plásmidos diferentes pLyco, pBIIKS(+)-clon59-2 y pZea4 a partir de tres aislados genómicos pBIIKS(+)-clon2, pBIIKS(+)-clon59 y pBIIKS(+)-clon6a (ver figura 16).

El plásmido pBIIKS(+)-clon59-2 se obtuvo por subclonación del fragmento HindIII/BamHI de pBIIKS(+)-clon 2 en los sitios HindIII/BamHI de pBIIKS(+)-clon 59. El plásmido resultante pBIIKS(+)-clon 59-2 tiene el ORF completo del gen crtE, crtB, crtI y crtY y debería llevar a la producción de \beta-caroteno. pLyco se obtuvo por delección del fragmento KpnI/KpnI, codificante por aproximadamente la mitad (extremo N-terminal) del gen crtY, a partir del plásmido pBIIKS(+)-clon59-2. Las células de E. coli transformadas con Plyco, y por lo tanto con un gen crtY no funcional truncado, deberían producir licopeno, el precursor del \beta-caroteno. pZea4 se construyó por ligación del fragmento AscI-SpeI de pBIIKS(+)-clon59-2, conteniendo el crtE, crtB, crtI y la mayoría del gen crtY con el fragmento AscI/XbaI del clon 6a, contiendo el gen crtZ y las secuencias para completar el gen crtY truncado mencionado anteriormente. pZea4 tiene por lo tanto todos los cinco ORF de la vía de biosíntesis de la zeaxantina. Las células de E. coli transformadas con este último plásmido deberían por lo tanto producir zeaxantina. Para la detección del carotenoide producido, los transformantes se hicieron crecer durante 43 horas en matraces en agitación y se sometieron al análisis de carotenoides tal como se describe en la sección métodos. La figura 16 resume la construcción de los plásmidos descritos
anteriormente.

Tal como se espera las células de E. coli portadoras de pLyco producen licopeno, aquellas que llevan pBIIKS(+)-clon59-2 producen \beta-caroteno (todos-E,9-Z,13-Z) y las células con la construcción pZea4 producen zeaxantina. Esto confirma que se han clonado los genes necesarios de Flavobacterium sp. R1534 para la síntesis de zeaxantina o sus precursores (fitoeno, licopeno y \beta-caroteno). Los niveles de producción obtenidos se muestran en la tabla 1.

TABLA 1

plásmido	huésped	zeaxantina	\beta-caroteno	licopeno
pLyco	E. coli JM109	ND	ND	0,05%
pBIIKS(+)-clon59-2	''	ND	0,03%	ND
pZea4	''	0,033%	0,0009%	ND

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{140mm} Contenido de carotenoides de los
transformantes de  E. coli , llevando los plámidos pLyco,
pBIIKS(+)-clon59-2 y pZea4, tras 43
horas de cultivo en matracres en agitación. Los valores indicados
muestran el contenido de carotenoides en % de la masa celular seca
total (200 ml). ND= No
detectable.\end{minipage} \cr}

Ejemplo 5 Producción de carotenoides en B. subtilis

En un primer intento de producir carotenoides en B. subtilis, clonamos los genes de biosíntesis de carotenoides de Flavobacterium en los vectores p602/22 lanzadera Gram (+)/(-), un derivado de p602/20 [LeGrice, S.F.J., s.a.]. El ensamblaje de la construcción final p602-CARVEG-E, empieza con una triple ligación de fragmentos PvuII-AvrII de pZea4 (del654-3028) y el fragmento AvrII-EcoRI del plásmido pBIIKS(+)-clon6a, en los sitios EcoRI y ScaI del vector p602/22. El plásmido pZea4 (del654-3028) se ha obtenido por digestión de pZea4 con SacI y EspI. El extremo protuberante y el deferido se hicieron romos con el enzima Klenow y se religaron. La construcción pZea4 (del654-3028) carece de la mayoría de la secuencia corriente arriba del gen crtE, que no es necesario para la biosíntesis de carotenoides. El plásmido p602-CAR tiene aproximadamente 6,7 kb de DNA de Flavobacterium T1534 genómico que contiene además todos los cinco genes de los carotenoides (aproximadamente 4,9 kb), el DNA genómico adicional de 1,2 kb, localizado corriente arriba del sitio de inicio traduccional crtZ y otros 200 pb, localizados corriente arriba del inicio transcripcional crtE. Los genes crtZ, crtY, crtI y crtB se clonaron corriente abajo del promotor P_{N25/0}, un derivado del promotor T5 del bacteriófago de E. coli regulable, fusionado a un elemento operador lac, que es funcional en B. subtilis [LeGrice, S.F.J., s.a.]. Es obvio que en la construcción p602CAR, la distancia de más de 1200 pb entre el promotor p_{N25/0} y el sitio de inicio transcripcional de crtZ no es óptimo y se mejorará en una etapa más tardía. Una representación de la construcción p602CAR se muestra en la figura 17. Para asegurar la transcripción del gen crtE en B. subtilis, el promotor vegI [Moran et al., Mol.Gen.Genet. 186, 339-346 (1982); LeGrice et al., Mol. Gen. Genet. 204, 229-236 (1986)] se introdujo corriente arriba en este gen, resultando en la construcción del plásmido p602-CARVEG-E. El promotor vegI, que se origina a partir del sitio I del promotor veg complejo descrito por [LeGrice et al., s.a.] ha demostrado ser funcional en E. coli [Moran et al., s.a.]. Para obtener esta nueva construcción, el plásmido p602CAR se digirió con SalI e HindIII, y el fragmento conteniendo el gen crtE completo y la mayoría de secuencia codificante por crtB, se subclonó en los sitios XhoI e HindIII del plásmido p205. El plásmido resultante p205CAR contiene el gen crtE justo corriente abajo del promotor PvegI. Para reconstituir el grupo de genes de carotenoides de Flavobacterium sp. se aislaron las siguientes tres piezas: fragmento PmeI/HindIII de p205CAR, el fragmento HindIII/XbaI y el fragmento EcoRI/HindIII de p602CAR y ligados en los sitios EcoRI y XbaI de pBluescriptIIKS(+), resultando en la construcción pBIIKS(+)-CARVEG-E. El aislamiento del fragmento EcoRI-XbaI de este último plásmido y la ligación en los sitios EcoRI y XbaI de p602/22 proporciona un plásmido similar al p602CAR pero teniendo el gen crtE conducido por el promotor PvegI. Todos los pasos de construcción para conseguir el plásmido p602CARVEG-E se representan en la figura 18. Las células TG1 de E. coli transformadas con este plásmido que sintetiza zeaxantina. En contraposición la cepa 1012 de B. subtilis transformada con las mismas construcciones no producía ningún carotenoide. El análisis de varios transformantes de B. subtilis zeaxantina negativos siempre revela, que los plásmidos transformados han padecido varias delecciones. Esta inestabilidad puede ser debida al gran tamaño de las construcciones.

Con el fin de obtener una construcción estable en B. subtilis, los genes de los carotenoides se clonaron en el pHP13 vector lanzadera Gram (+)/(-) construido por [Haima et al., s.a.]. Los problemas de estabilidad se creyó que se habían omitido por 1) reducir el tamaño del inserto clonado que lleva los genes de los carotenoides y 2) invertir la orientación del gen crtE y así tan sólo requiriendo un promotor para la expresión de todos los cinco genes, en lugar de dos, como en las construcciones previas. Además, la capacidad de las células transformadas por tal plásmido de llevar el operón de carotenoides de Flavobacterium sintético (SFCO), para producir carotenoides, contestaría la pregunta de si es factible un intento modular. La Figura 19 resume todos los pasos de construcción y plásmidos intermedios elaborados para conseguir la construcción final pHP13-2PNZYIB-EINV. Brevemente: Para facilitar las siguientes construcciones, se elaboró un vector pHP13-2, introduciendo un enlazante sintético obtenido con el cebador CS1 y CS2, entre los sitios HindIII y EcoRI del vector lanzadera pHP13. La construcción intermedia pHP13-2CARVEG-E se construyó por subclonación del fragmento AflII-XbaI de p602CARVEG-E en los sitios AflII y XbaI de pHP13-2. El próximo paso consiste en la inversión del gen crtE, eliminando el fragmento XbaI y AvrII que contiene el gen crtE original y reemplazando éste con el fragmento XbaI-AvrII del plásmido pBIIKS(+)-PCRRBScrtE. El plásmido resultante se llamó pHP13-2CARZYIB-EINV y representaba la primera construcción con un SFCO funcional. La construcción intermedia pBIIKS(+)- PCRRBScrtE mencionada anteriormente, se obtuvo por digestión del producto PCR generado con los cebadores #100 y #101 con SpeI y SmaI y ligando en los sitios SpeI y SmaI de pBluesriptIIKS(+). Con el fin de conseguir un inicio transcripcional de crtZ cercano al promotor P_{N25/0} se hizo una triple ligación con el fragmento BamHI-SalI de pHP13-2CARZYIB-EINV (contiene cuatro de los cinco genes de carotenoides), el fragmento BamHI-EcoRI del mismo plásmido contiene el promotor P_{N25/0} y el fragmento EcoRI-SalI de pBIIKS(+)-PCRRBScrtZ, con la mayoría del gen crtZ precedido de un RBS sintético. El plásmido pBIISK(+)-PCRRBScrtZ anteriormente mencionado se obtuvo por digestión del producto de PCR amplificado con los cebadores #104 y #105 con EcoRI y SalI y ligándose en los sitios EcoRI y SalI de pBluescriptIISK (+). En el vector resultante pHP13-2PN25ZYIB-EINV, el SFCO se conduce por el promotor T5 bacteriófago P_{N25/0}, que se debería expresar constitutivamente, debido a la ausencia de un represor lac funcional en la construcción [Peschke and Beuk, J. Mol. Biol. 186, 547-555 (1985)]. Las células TG1 de E. coli transformadas con esta construcción producían zeaxantina. Aunque, cuando este plásmido se transformó en B. subtilis, no se pudo detectar ninguna producción de carotenoides. El análisis de los plásmidos de estos transformantes mostró graves delecciones, apuntando hacia problemas de inestabilidad, de forma similar a las observaciones hechas con los plásmidos anteriormente mencionados.

Ejemplo 6 Construcciones de integración en los cromosomas

Debido a la inestabilidad observada con las construcciones previas, se decidió integrar los genes de la biosíntesis de carotenoides de Flavobacterium sp. en el genoma de B. subtilis usando el vector de integración/expresión pXI12. Este vector permite la expresión constitutiva de los operones totales tras la integración en el gen de la levan-sucrasa (sacB) del genoma de B. subtilis. La expresión constitutiva está conducida por el promotor vegI y resulta en una expresión a nivel medio. El plásmido pXI12-ZYIB-EINV4 conteniendo el operón de carotenoide de Flavobacterium sintético (SFCO) se construyó tal como sigue: el fragmento NdeI-HincII de pBIISK(+)-PCRRBScrtZ se clonó en los sitios NdeI y SmaI de pXI12 y el plásmido resultante se llamó pXI12-PCRcrtZ. En el próximo paso, el fragmento BstEII-PmeI de pHP13-2PN25ZYIB-EINV se ligó al fragmento BstEII-PmeI de pXI12-PCRcrtZ (ver figura 20). B. subtilis transformado con la construcción pXI12-ZYIB-EINV4 resultante puede integrar los genes CAR tanto vía una reacción de tipo Campbell o vía una recombinación recíproca. Un transformante, BS1012::ZYIB-EINV4, con una recombinación recíproca de los genes de biosíntesis de carotenoides en el gen de la levan-sucrasa se analizó (figura 21). Aunque esta cepa no sintetizó carotenoides, el análisis del RNA por Northern blots mostró la presencia de mRNA policistrónico específico de 5,4 kb y 4,2 kb cuando se hibridó con la sonda A (ver figura 21, panel B). Mientras que el mRNA mayor tenía el tamaño de mensaje esperado, el origen del mRNA más corto aún no está claro. La hibridación del mismo Northern blot con la sonda B sólo detectó el fragmento de mRNA mayor, apuntando hacia la terminación prematura de la transcripción al final del gen crtB. La presencia de una señal de terminación en esta localización tendrán sentido, desde que la organización del operón original en el genoma de Flavobacterium sp.R1534, los genes crtE y crtB están encarados uno hacia el otro. Con este planteamiento una señal de la terminación de la transcripción en el extremo 5' del crtB se haría sensible, con el fin de evitar la síntesis del RNA anti-sentido que podría interferir con el transcrito de mRNA del gen crtE. Desde que esta región ha cambiado considerablemente respecto a la situación de tipo salvaje, las secuencias que constituyen este terminador pueden también haber sido alterados resultando en un terminador "permeable". Los análisis por Western blot usando anti-suero contra los diferentes enzimas crt de la vía de los carotenoides, apunta hacia la posibilidad que los sitios de unión ribosomal puedan ser los responsables de la pérdida de la síntesis de los carotenoides. De entre los cinco genes introducidos sólo el producto de crtZ, la \beta-caroteno hidroxilasa era detectable. Este es el único gen precedido de un sitio RBS, originado del vector pXI12, conocido por ser funcional en B. subtilis. Las interacciones entre los pares de bases entre el mRNA de la secuencia de Shine-Dalgarno [Shine & Delgarno, s.a.] y el 16S rRNA, que permite al ribosoma seleccionar el sitio de iniciación adecuado, se ha propuesto por [McLaughlin et al., J.Biol.Chem. 256, 11283-11291 (1981)] por ser mucho más estable en organismos Gram-positivos (B. subtilis) que en organismos Gram negativos (E. coli). Con el fin de obtener complejos altamente estables se intercambiaron los sitios RBS del Flavobacterium sp. Gram negativo, precediendo cada uno de los genes crtY, crtI, crtB y crtE, con RBS sintéticos que se diseñaron de modo complementario al extremo 3' de 16 rRNA de B.subtilis (ver tabla 2). Este intercambio podría permitir una iniciación de la traducción efectiva de los diferentes genes de carotenoides en B. subtilis. La estrategia elegida para construir este pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C, conteniendo todos los cuatro sitios alterados se resume en la figura 20. Con el fin de facilitar los otros pasos de clonación en pBluescriptIIKS(+), se introdujeron sitios de restricción adicionales usando el enlazante obtenido con el cebador MUT7 y MUT8, clonados entre los sitios SalI e HindIII de dicho vector. La construcción nueva resultante pBIIKS(+)-LINKER78 tiene los siguientes sitios de restricción introducidos: AvrII, PmlI, MulI, MunI, BamHI y SphI. El intento general elegido para crear el RBS sintético corriente arriba de los diferentes genes de carotenoides, se hizo usando una combinación de mutagénesis basada en PCR, donde los genes se reconstruyeron usando cebadores definidos que llevaban los sitios RBS modificados, o usando enlazantes sintéticos que tienen tales secuencias. La reconstitución del RBS precediendo los genes crtI y crtB se hizo por amplificación del gen crtI con los cebadores MUT2 y MUT6 que incluyen los sitios RBS alterados apropiados. EL fragmento PCR-I obtenido se digirió con MunI y BamHI y se ligó en los sitios MunI y BamHI de pBIIKS(+)-LINKER78. La construcción intermedia resultante se llamó pBIIKS(+)-LINKER78PCRI. La reconstitución del RBS precediendo el gen crtB se hizo usando un pequeño fragmento de PCR obtenido con el cebador MUT3, teniendo el sitio RBS alterado corriente arriba de crtB, y el cebador CAR17. El fragmento de PCR-F amplificado se digirió con BamHI e HindIII y se subclonó en los sitios BamHI e HindIII de pBIIKS(+)-LINKER78, resultando en la construcción pBIIKS(+)-LINKER78PCRF. EL fragmento PCR-I se cortó de pBIIKS(+)-LINKER78PCRI con BamHI y SapI y se ligó en los sitios BamHI y SapI de pBIIKS(+)-LINKER78PCRF. El plásmido resultante pBIIKS(+)-LINKER78PCRFI tiene el fragmento PCR-I fusionado al fragmento PCR-F. Esta construcción cortada con SalI y PmlI y un enlazante sintético obtenido mediante hibridación del cebador MUT9 y MUT10 se introdujo. Este último paso se realizó para facilitar el reemplazo próximo de RBS de Flavobacterium original en la construcción anteriormente mencionada. El plásmido resultante se llamó pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIA. El ensamblaje de los RBS sintéticos que preceden los genes crtY y crtI se hizo por PCR, usando los cebadores MUT1 y MUT5. El fragmento PCR-G amplificado se hizo romo antes de clonarlo en el sitio SmeI de pUC18, resultando en la construcción pUC18-PCR-G. El próximo paso fue la clonación del fragmento PCR-G entre los fragmentos PCR-A y PCR-I. Con este propósito el PCR-G se aisló de pUC18-PCR-G digiriendo con MunI y PmlI y se ligó en los sitios MunI y PmlI de pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIA. Esta construcción contiene todos los cuatro fragmentos, PCR-F, PCR-I, PCR-G y PCR-A, ensamblado adyacente al otro y conteniendo tres de los cuatro sitios RBS artificiales (crtY, crtI y crtB). El intercambio de los RBS de Flavobacterium que preceden los genes crtY, crtI y crtB mediante unos sintéticos, se hizo por reemplazo del fragmento HindIII-SalI del plásmido pXI12-ZYIB-EINV4 con el fragmento HindIII-SalI del plásmido pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIGA. El plásmido resultante pXI12-ZYIB-EINV4 MUTRBSC se transformó a continuación en las células TG1 de E. coli y B. subtilis 1012. La producción de zeaxantina por estas células confirma que la PCR amplificó los genes que eran funcionales. La cepa de B. subtilis obtenida se llamó BS1012::SFCO1. El último RBS de Flavobacterium a ser intercambiado fue el que precedía el gen crtE. Éste se hizo usando un enlazante obtenido usando el cebador MUT11 y MUT12. El RBS de tipo salvaje se eliminó de pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS con NdeI y SpeI y se insertó el enlazante anteriormente mencionado. En la construcción pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C todos los RBS de Flavobacterium se habían reemplazado por RBS sintéticos de la secuencia consenso AAAGGAGG- 7-8 N -ATG (ver tabla 2). Las células TG1 de E. coli transformadas con esta construcción mostraron que también este último reemplazo de RBS no interfería

\newpage

TABLA 2

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  mRNA  \+  \hskip1cm   secuencia de
nucleótidos \cr  crtZ \+  \hskip1cm 
 AAAGGAGG GUUUCAU AUG AGC\cr  crtY \+  \hskip1cm 
 AAAGGAGG ACACGUG AUG AGC\cr  crtI \+  \hskip1cm 
 AAAGGAGG CAAUUGAG AUG AGU\cr  crtB \+
 \hskip1cm   AAAGGAGG AUCCAAUC AUG ACC\cr  crtE
\+  \hskip1cm   AAAGGAGG GUUUCUU AUG ACG\cr 
 B. subtilis  \+  \hskip1cm  16S rRNA
 \hskip0,5cm  3'  -  UC UUUCCUCC ACUAG\cr 
 E. coli  \+  \hskip1cm  16S rRNA
 \hskip0,5cm  
3'  -  AUUCCUCCACUAG\cr}

Tabla 2

Las secuencias de nucleótidos de los sitios de unión a los ribosomas sintéticos en las construcciones pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C, pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT y pXI12-ZYIB-EINV4 MUTRBS2CNEO. Los nucleótidos de la secuencia de Shine-Dalgarno que preceden los genes de carotenoides individuales que son complementarios a los extremos 3' del 16S rRNA de B. subtilis se muestran en negrita. Los extremos 3' del 16S rRNA de E. coli se muestran también como comparación. El AUG subrayado es el sitio de inicio de la traducción del gen mencionado.

con la capacidad de producir zeaxantina. Todas las regiones que contenían los RBS sintéticos nuevamente introducidos se confirmaron por secuenciación. Las células de B. subtilis se transformaron con el plásmido pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2 y un transformante había integrado el SFCO por recombinación recíproca, en el gen de la levan-sucrasa del cromosoma, se seleccionó. Esta cepa se llamó BS1012::SFCO2. El análisis de la producción de carotenoides de esta cepa mostró que las cantidades de zeaxantina producidas eran aproximadamente el 40% de la zeaxantina producida por las células de E. coli transformadas con el plásmido usado para conseguir el transformante de B. subtilis. Similar fue la observación cuando se comparaba la cepa BS1012::SFCO1 con su contrapartida de E. coli (30%). Aunque las células de E. coli tienen 18 veces más genes de carotenoides, la producción de carotenoides es tan sólo un factor 2-3 veces mayor. Más drástica fue la diferencia observada en los contenidos de carotenoides, entre las células de E. coli llevando la construcción pZea4 en alrededor de 200 copias y el E. coli llevando el plásmido pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C en 18 copias. El primer transformante produjo 48x más zeaxantina que el último. Esta diferencia vista no se puede atribuir sólo a las apenas 11 veces que los genes de la biosíntesis de carotenoides están presentes en esos transformantes. Contribuir a esta diferencia es probablemente también la realización subóptima de los nuevos SFCO construidos, en que los genes sobrelapados del operón de Flavobacterium de tipo salvaje se separaron para introducir RBS sintéticos. Esto podía haber resultado en una eficiencia de traducción menor del operón sintético reconstruido (por ejemplo debido a la eliminación de los efectos de acoplamiento traduccional putativos, presentes en el operón de tipo salvaje).

Con el fin de aumentar la producción de carotenoides, se hicieron dos nuevas construcciones, pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO y pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT, que tras la integración del SFCO en el sitio de la levansucrasa del cromosoma, generaba cepas con una estructura amplificable tal como se describe por [Janniere et al., Gene 40, 47-55 (1985)]. El plásmido pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO se ha depositado el 25 de Mayo de 1995 en el DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (Alemania) bajo el número de acceso Nº DSM 10013. Tales estructuras amplificables, cuando se unían a un marcador de resistencia (por ejemplo, cloranfenicol, neomicina, tetraciclina), se pueden amplificar a 20-50 copias por cromosoma. La estructura amplificable consiste del SFCO, el gen de resistencia y la secuencia pXI12, flanqueada por repeticiones directas del gen sac-B 3' (ver figura 22). Se pueden obtener nuevas cepas con elevados números del SFCO seleccionando los transformantes con un alto nivel de resistencia al antibiótico. Para construir el plásmido pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO, el gen de resistencia a la neomicina se aisló del plásmido pBEST501 con PstI y SmaI y se subclonó en los sitios PstI y EcoO1091 del vector pUC18. La construcción resultante se llamó pUC18-Neo. Para conseguir la construcción final, el fragmento PmeI-AatII del plásmido pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C se reemplazó con el fragmento SmaI-AatII de pUC18-Neo, conteniendo el gen de resistencia a la neomicina. El plásmido pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT se obtuvo tal como sigue: el gen de resistencia al cloranfenicol de pC194 se aisló por PCR usando el par de cebadores cat3 y cat4. El fragmento se digirió con EcoRI y AatII y se subclonó en los sitios EcoRI y AatII de pUC18. El plásmido resultante se llamó pUC18-CAT. El vector resultante se obtuvo por reemplazo del fragmento PmeI-AatII de pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C con el fragmento EcoRI-AatII de pUC18-CAT, portando el gen de resistencia al cloranfenicol. La Figura 23 resume los diferentes pasos para obtener las construcciones anteriormente mencionadas. Ambos plásmidos se transformaron en la cepa 1012 de B. subtilis, y los transformantes resultantes de una integración de tipo Campbell se seleccionaron. Dos cepas BS1012::SFCONEO1 y BS1012::SFCOCAT1 se eligieron para otra amplificación. Las colonias individuales de ambas cepas se amplificaron independientemente haciéndolas crecer en diferentes concentraciones de antibióticos tal como se describe en la sección de métodos. Para la cepa que lleva el gen cat, las concentraciones de cloranfenicol fueron de 60, 80, 120 y 150 \mug/ml. Para la cepa que lleva el gen neo, las concentraciones de neomicina fueron de 160 y 180 \mug/ml. En ambas cepas sólo se obtuvieron las cepas con menor amplificación del SFCO. En cepas hermanas generadas a partir de la cepa BS1012::SFCONEO1, la resistencia a elevadas concentraciones de neomicina correlacionaba con el aumento en el número de SFCO en el cromosoma y con altos niveles de carotenoides producidos por estas células. Un resultado diferente se obtuvo con cepas hermanas obtenidas de la cepa BS1012::SFCOCAT1. En estas cepas un aumento de hasta 150 \mug de cloranfenicol/ml resultó, tal como se esperaba, en un mayor número de copias SFCO en el cromosoma.

Ejemplo 7 Construcción de plásmidos conteniendo CrtW y uso para producción de carotenoides

Síntesis de genes basándose en la reacción en cadena de la polimerasa. La secuencia de nucleótidos del gen crtW artificial, codificando por la \beta-caroteno \beta-4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes, se obtuvo por traducción reversa de la secuencia de aminoácidos descrita en [Misawa, 1995], usando el programa BackTranslate del Paquete de Análisis de Secuencias GCG Wisconsin, Versión 8.0 (Genetics Computer Group, Madison, WI, USA) y una tabla de referencia de frecuencia de codones de E. coli (suministrado por el Bach Translate Program). El gen sintético constituido de 726 nucleótidos se construyó básicamente de acuerdo con el método descrito por [Ye, 1992]. La secuencia de los 12 oligonucleótidos (crtW1-crtW12) requerida para la síntesis se muestra en la Figura 25. Brevemente, Los oligonucleótidos grandes se diseñaron para tener sobrelapamientos cortos de 15-20 bases, sirviendo como cebadores para la extensión de los oligonucleótidos. Tras cuatro ciclos, unas pocas copias de la longitud total de un gen podrían estar presentes que entonces se amplifican por los dos oligonucleótidos terminales crtW15 y crtW26. Las secuencias para estos dos oligonucleótidos cortos son para el cebador adelantado crtW15 (5'-TATATCTAGAcatatgTCCGGTCGTAAA CCGG-3') y para el cebador reverso crtW26 (5'-TATAgaattccacgtgTCAAGCACGACCACCGGTTTTACG-3'), donde las secuencias emparejadas al DNA molde están subrayadas. Las letras minúsculas introducen los sitios de restricción (NdeI para el cebador directo y EcoRI y PmlI para el cebador reverso) para la última clonación en el vector de expresión pALTER-Ex2.

Reacción en cadena de la polimerasa. Todos los doce oligonucleótidos largos (crtW1-crtW12; 7 nm cada uno) y ambos cebadores terminales (crtW15 y crtW26; 0,1 mM cada uno) se mezclaron y se añadieron a una mezcla de PCR que contiene Expand™ polimerasa de alta fidelidad (Boheringer, Mannheim) (3,5 unidades) y dNTP (100 mM cada uno). La reacción de PCR se hizo correr durante 30 ciclos con el siguiente perfil: 94ºC durante 1 min, 50ºC durante 2 min y 72ºC durante 3 min. La reacción de PCR se separó en gel de agarosa al 1%, y se escindió la banda de aproximadamente 700 pb y se purificó usando el método de cuentas de cristal (Geneclean Kit, Bio101, Vista, CA, USA). El fragmento se clonó a continuación en el sitio SmaI del plásmido pUC18, usando el Sure-Clone kit (Pharmacia, Uppsala, Suecia). La secuencia del gen sintético crtW resultante se verificó por secuenciación con el Sequenase Kit Versión 1.0 (United Status Biochemical, Cleveland, OH, USA). EL gen crtW construido por este método se encontró que tenía errores mínimos, que a continuación se corregían por mutagénesis dirigida a un sitio.

Construcción de plásmidos. El plásmido pBIIKS(+)-CARVEG-E (ver también Ejemplo 5) (Figura 26) contiene los genes de biosíntesis de carotenoides (crtE, crtB, crtY, crtI y crtZ) de la bacteria gram (-) Flavobacterium sp. cepa R1534 WT (ATCC 21588) [Pasamontes, 1995 #732] clonado en el vector pBluescript II KS(+) modificado (Stratagene, La Jolla, USA) llevando el sitio I del promotor veg de B. subtilis [LeGrice, 1986 #806]. Este promotor constitutivo ha demostrado ser funcional en E. coli. Los transformantes de la cepa de E. coli TG1 llevando el plásmido pBIIKS(+)-CARVEG-E sintetizan zeaxantina. El plásmido pALTER-Ex2-crtW se construyó por clonación del fragmento restringido NdeI-EcoRI del gen sintético crtW en los correspondientes sitios del plásmido pALTER-Ex2 (Promega, Madison, WI). El plásmido pALTER-Ex2 es un plásmido de pocas copias con el origen p15a de replicación, que permite a éste mantenerse con los vectores ColE1 en el mismo huésped. El plásmido pBIIKS-crtEBIYZW (Figura 26) se obtuvo por clonación del fragmento HindIII-PmlI de pALTER-Ex2-crtW en el HindIII y el extremo romo hecho en el sitio MluI obtenido por llenado con una reacción con enzima klenow, tal como se describe en algún sitio en [Sambrook, 1989 #505]. La inactivación del gen crtZ se hizo por delección de un fragmento NsiI-NsiI de 285 pb, seguido de una reacción de llenado y religación, resultando en un plásmido pBIIKS-crtEBIY[\DeltaZ]W. EL plásmido pBIIKS-crtEBIY[\DeltaZW] con los genes no funcionales crtW y crtZ, se construyó por digestión del plásmido pBIIKS-crtEBIY[\DeltaZW] con NdeI y HpaI, y a continuación auto-religación del plásmido tras llenado en los sitios con enzima klenow. E.coli transformado con este plásmido tenía color amarillo-naranja debido a la acumulación de \beta-caroteno. El plásmido pBIIKS-crtEBIY[\DeltaW] tenia el gen crtW truncado obtenido por delección del fragmento NdeI-HpaI en el plásmido pBIIKS-crtEBIYZW tal como se representa anteriormente. Los plásmidos pALTER-Ex2-crtEBIY[\DeltaZW] y pALTER-Ex2-crtEBIYZ[\DeltaW], se obtuvieron por aislamiento del fragmento BamHI-XbaI de pBIIKS-crtEBIY[\DeltaZW] y pBIIKS-crtEBIYZ[\DeltaW], respectivamente y clonando éstos en los sitios BamHI y XbaI de pALTER-Ex2. El plásmido pBIIKS-crtW se construyó por digestión de pBIIKS-crtEBIYZW con NsiI y SacI, y auto-religando el plásmido tras prolongar los extremos del DNA con el enzima Klenow. La Figura 27 compila las inserciones relevantes en todos los plásmidos usados en este papel.

Análisis de los carotenoides. Los transformantes TG-1 de E. coli llevando las diferentes construcciones de plásmidos se hicieron crecer durante 20 horas en medio de caldo de Luria suplementado con antibióticos (ampicilina 100 \mug/ml, tetraciclina 12,5 \mug/ml) en frascos en agitación a 37ºC y 220 rpm. Los carotenoides se extrajeron de las células con acetona. La acetona se eliminó al vacío y el residuo se redisolvió en tolueno. Las soluciones coloreadas se sometieron a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que se realizó en un instrumento Hewlett-Packard serie 1050. Los carotenoides se separaron en una columna de sílice Nucleosil Si - 100, 200 x 4 mm, 3 m. El sistema de disolventes incluía dos disolventes: hexano (A) y hexano/THF, 1:1 (B). Un gradiente lineal se aplicó corriendo desde 13 a 50% (B) en 15 minutos. La tasa de flujo fue 1,5 ml/min. Los picos se detectaron a 450 nm por un detector de array de foto diodo. Los pigmentos carotenoides individuales se identificaron por su espectro de absorción y los tiempos de retención típicos en comparación con muestras de referencia de carotenoides químicamente puros, preparados por síntesis química y caracterizados por RMN, MS y espectro UV. El análisis por HPLC de los pigmentos aislados de las células E. coli transformadas con el plásmido pBIIKS-crtEBIYZW, llevando además de los genes de biosíntesis de los carotenoides de Flavobacterium sp., cepa R1534, también el gen crtW codificante por la \beta-caroteno cetolasa de Alcaligenes PC-1 [Misawa, 1995 #670] dio los siguientes picos principales identificados como: \beta-criptoxantina, astaxantina, adinoxantina y zeaxantina, basándose en los tiempos de retención y en la comparación de los espectros de absorción para muestras de referencia dadas de carotenoides químicamente puros. La cantidad relativa (porcentaje de área) del pigmento acumulado en el transformante de E. coli llevando pBIIKS-crtEBIYZW se muestra en la Tabla 3 ["CRX": criptoxantina, "ASX": astaxantina; "ADX": adinoxantina; "ZXN": zeaxantina; "ECM": equinenona; "MECH": 3-hidroxiequinenona, "CXN": cantaxantina]. EL \Sigma de las áreas de los picos de todos los carotenoides identificados se definió como 100%. Los números mostrados en la Tabla 3 representan el valor promedio de cuatro cultivos independientes para cada transformante. En contraposición a los resultados anteriormente mencionados, los transformantes de E. coli que llevan los mismos genes en dos plásmidos se llaman, pBIIKS-crtEBIYZ[\DeltaW] y pALTER-Ex2-crtW, mostrando una gota drástica de adonixantina y una completa carencia de pigmentos de astaxantina (Tabla 3), mientras que la cantidad relativa de zeaxantina (%) había aumentado. Los niveles de equinenona, hidroxiequinenona y cantaxantina permanecieron sin cambios en comparación con los transformantes que llevan todos los genes crt en el mismo plásmido (pNIIKS-crtEBIYZ\DeltaW). El plásmido pBIIKS-crtEBIYZ[\DeltaW] es un plásmido de elevado número de copias llevando los genes funcionales de crtE, crtB, crtY, crtI, crtZ de Flavobacterium sp. cepa R1534 y una versión no funcional, truncada del gen crtW, mientras que la copia funcional del gen crtW se localiza en el plásmido de bajo número de copias pALTER-Ex2-crtW. Para analizar el efecto de la sobre-expresión del gen crtW respecto al gen crtZ. Las células de E. coli se co-transformaron con el plásmido pBIIKS-crtW llevando el gen crtW en el plásmido de alto número de copias pBIIKS-crtW y la construcción de bajo número de copias pALTER-Ex2-crtEBIYZ[\DeltaW], codificando los genes crt de Flavobacterium. El análisis de los pigmentos de estos transformantes por HPLC monitoriza la presencia de \beta-caroteno, criptoxantina, astaxantina, adonixantina, zeaxantina, 3-hidroxiequina-nona y trazas minúsculas de equinenona y cantaxantina (Tabla 3).

Los transformantes que llevan el gen crtW en el plásmido de bajo número de copias pALTER-Ex2-crtW y los genes crtE, crtB, crtY y crtI en el plásmido de alto número de copias pBIIKS-crtEBIY[\DeltaZW] expresó tan sólo cantidades menores de cantaxantina (6%) pero altos niveles de equinenona (94%), mientras que las células que llevan el gen crtW en el plásmido de elevado número de copias pBIIKS-crtW y los otros genes crt en la construcción de bajo número de copias pALTER-Ex2-crtEBIY[\DeltaZW], tenía 78,6% y 21,4% de equinenona y cantaxantina, respectivamente (Tabla 3).

TABLA 3

plásmidos	CRX	ASX	ADX	ZXN	ECH	HECH	CXN
pBIIKS-crtEBIYZW	1,1	2,0	44,2	52,4	<1	<1	<1
pBIIKS-crtEBIY[\DeltaW]	2,2	-	25,4	72,4	<1	<1	<1
+ pALTER-Ex2-crtW
pBIIKS-crtEBIY[\DeltaZ]W	-	-	-	-	66,5	-	33,5
pBIIKS-crtEBIY[\DeltaZW]	-	-	-	-	94	-	6
+ pBIIKS-crtW

Claims

1. Una secuencia de DNA que consiste de una o más secuencias de DNA seleccionadas del grupo constituido por:

a) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 2 que codifica la GGPP sintasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 1 (crtE), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más del 75% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la GGPP sintasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtE de Flavobacterium sp. R1534;

b) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 4 que codifica la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 3 (crtB), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más del 70% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtB de Flavobacterium sp R1534;

c) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 6 que codifica la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC Nº: 5 (crtI), o una secuencia de DNA codificando una secuencia de aminoácidos que muestra más del 80% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtI de Flavobacterium sp R1534;

d) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 8 que codifica la licopeno ciclasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 7 (crtY), o una secuencia de DNA codificando por una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 70% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la licopeno ciclasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por la crtY de Flavobacterium sp
R1534;

e) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 10 que codifica la \beta-caroteno hidroxilasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 9 (crtZ), o una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 70% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la \beta-caroteno hidroxilasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtZ de Flavobacterium sp R1534.

2. Una secuencia de DNA tal como se reivindica en la reivindicación 1 constituida por las siguientes secuencias de DNA:

a) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 2 que codifica la GGPP sintasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 1 (crtE), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 75% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la GGPP sintasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática codificada por crtE de Flavobacterium sp R1534, y

b) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 4 que codifica la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 3 (crtB), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 70% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que la del enzima codificado por la crtB de Flavobacterium sp R1534, y

c) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 6 que codifica la fitoeno destaurasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 5 (crtI), o una secuencia de DNA que codifica por una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 80% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtI de Flavobacterium sp R1534.

3. Una secuencia de DNA tal como la que se reivindica en la reivindicación 1 constituida por las siguientes secuencias de DNA:

a) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 2 que codifica la GGPP sintasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 1 (crtE), o una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 75% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la GGPP sintasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtE de Flavobacterium sp R1534, y

b) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 4 que codifica la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 3 (crtB), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 70% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtB de Flavobacterium sp R1534, y

c) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 6 que codifica la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 5 (crtI), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 80% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtI de Flavobacterium sp R1534, y

d) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 8 que codifica la licopeno ciclasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 7 (crtY), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 70% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la licopeno ciclasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtY de Flavobacterium sp R1534.

4. Una secuencia de DNA tal como se reivindica en la reivindicación 1 constituida por las siguientes secuencias de DNA:

a) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 2 que codifica la GGPP sintasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 1 (crtE), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 75% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la GGPP sintasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtE de Flavobacterium sp R1534, y

b) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 4 que codifica la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 3 (crtB), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más del 70% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la prefitoeno sintasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtB de Flavobacterium sp
R1534, y

c) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 6 que codifica la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 5 (crtI), o una secuencia de DNA codificante por una secuencia de aminoácidos que muestra más del 80% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la fitoeno desaturasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática que el enzima codificado por crtI de Flavobacterium sp R1534, y

d) una secuencia de DNA tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 8 que codifica la licopeno ciclasa de Flavobacterium sp R1534 tal como se ilustra en la ID de SEC. Nº: 7 (crtY), o una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos que muestra más de un 70% de aminoácidos idénticos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la licopeno ciclasa de Flavobacterium sp R1534 y es la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que muestra el mismo tipo de actividad enzimática codificada por crtY de Flavobacterium sp R1534, y

5. Una secuencia de DNA tal como se reivindica en la reivindicación 4 constituida, además de por las secuencias de DNA especificadas en la reivindicación 4, por una secuencia de DNA que codifica la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crtW) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga.

6. Una secuencia de DNA tal como se reivindica en la reivindicación 3 constituida, además de por las secuencias de DNA especificadas en la reivindicación 3, por una secuencia de DNA que codifica la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crtW) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga.

7. Un vector comprendiendo la secuencia de DNA de la reivindicación 1.

8. Un vector comprendiendo la secuencia de DNA de la reivindicación 2.

9. Un vector comprendiendo la secuencia de DNA de la reivindicación 3.

10. Un vector comprendiendo la secuencia de DNA de la reivindicación 4.

11. Un vector comprendiendo la secuencia de DNA de la reivindicación 5.

12. Un vector comprendiendo la secuencia de DNA de la reivindicación 6.

13. Una célula que se transforma mediante la secuencia de DNA de la reivindicación 1 o el vector de la reivindicación 7.

14. Una célula que se transforma mediante la secuencia de DNA de la reivindicación 2 o el vector de la reivindicación 8.

15. Una célula que se transforma mediante la secuencia de DNA de la reivindicación 3 o el vector de la reivindicación 9.

16. Una célula que se transforma mediante la secuencia de DNA de la reivindicación 4 o el vector de la reivindicación 10.

17. Una célula que se transforma mediante la secuencia de DNA de la reivindicación 5 o el vector de la reivindicación 11.

18. Una célula que se transforma mediante la secuencia de DNA de la reivindicación 6 o el vector de la reivindicación 12.

19. Una célula que se transforma por una secuencia de DNA de la reivindicación 4 o el vector de la reivindicación 10 y una segunda secuencia de DNA que codifica la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crtW) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga o un segundo vector que comprende una secuencia de DNA que codifica la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crtW) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga.

20. Una célula que se transforma mediante la secuencia de DNA de la reivindicación 3 o el vector de la reivindicación 9 y una segunda secuencia de DNA que codifica la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crtW) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga o un segundo vector que comprende una secuencia de DNA que codifica la \beta-caroteno \beta4-oxigenasa de la cepa PC-1 de Alcaligenes (crtW) o una secuencia de DNA que es sustancialmente homóloga.

21. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20 que es una célula procariota.

22. La célula de la reivindicación 21 que es E. coli.

23. La célula de la reivindicación 21 que es una cepa de Bacillus.

24. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20 que es una célula eucariota.

25. La célula de la reivindicación 24 que es una célula de levadura.

26. La célula de la reivindicación 24 que es una célula fúngica.

27. Un procedimiento para la preparación de un carotenoide deseado o una mezcla de carotenoides mediante cultivo celular tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20 bajo las condiciones de cultivo apropiadas y aislando el carotenoide deseado o la mezcla de carotenoides de tales células o del medio de cultivo y, en caso de que sólo se desee un carotenoide separándolo por métodos conocidos en el arte de los otros carotenoides que también pueden estar presentes.

28. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 27 para la preparación de licopeno mediante cultivo de una célula tal como se reivindica en la reivindicación 14.

29. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 27 para la preparación de \beta-caroteno mediante cultivo de una célula tal como se reivindica en la reivindicación 15.

30. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 27 para la preparación de equinenona mediante cultivo de células tal como se reivindica en la reivindicación 18 ó 20.

31. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 27 para la preparación de cantaxantina mediante cultivo de células tal como se reivindica en la reivindicación 18.

32. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 27 para la preparación de zeaxantina mediante cultivo de células tal como se reivindica en la reivindicación 17 ó 19.

33. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 27 para la preparación de adonixantina mediante cultivo de células tal como se reivindica en la reivindicación 17 ó 19.

34. Un procedimiento tal como se reivindica en la reivindicación 27 para la preparación de astaxantina mediante cultivo de células tal como se reivindica en la reivindicación 17.

35. Un procedimiento para la preparación de una composición alimentaria caracterizada en que tras haber efectuado un procedimiento tal como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 34, se añaden carotenoides o una mezcla de carotenoides al alimento.