CN1141952A - 类胡萝卜素发酵生产法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及类胡萝卜素的发酵生产方法。本发明提供了编码黄杆菌素R1534种类胡萝卜素生物合成酶途径中酶的DNA顺序，含有该DNA顺序的载体，以及由该DNA顺序和/或该载体转化的细胞，并提供了用这些细胞发酵生产类胡萝卜素的方法。

Description

类胡萝卜素发酵生产法
迄今为止，已报道过有600种以上不同的类胡萝卜素是从细菌、酵母、真菌和植物中发现的。能产生胡萝卜素的生物体，但目前仅有其中两种。β-胡萝卜素和虾黄素已在工业上以微生物生产并用于食品和饲料工业。β-胡萝卜素是从藻类获取的，而虾黄素是由采用传统突变技术产生的Pfaffia菌株生产的。但是，Pfaffia发酵存在发酵周期长的缺点，而从藻类回收则很麻烦。因此，人们希望开发各种有较好工业应用价值的生产体系，例如可加以控制提高产率，和/或缩短发酵时间。WO 91/13078和EP 393690已分别介绍过使用生物合成基因型草生欧文氏杆菌(Erwinia herbicola)和噬夏孢欧文氏杆菌(Erwinia uredovora)的两种这样的体系。而且，已克隆过海生细菌土壤杆菌金黄菌(Agrobacterium aurantiacum)和产碱杆菌(Alcaligenes)菌株PC-1(crtW)[Misawa 1995，Biochem.Biophys.Res.Com.209 867-876][Misawa，1995，Bacteriology177，6575-6584]，和来自绿藻血红球菌Pluvialis(Haematococ-cus pluvialis)(bkt)[Lotan，1995 FEBS Letters 364，125-128][Kajiwara，1995，Plant Mol.Biol.29 343-352]的三种β-胡萝卜素酮酶基因(β-胡萝卜素β-4-加氧酶)。携带E.herbicola[Hundle.1994，MGG 245，406-416]或E.uredovora产胡萝卜素基因(crtE，crtB，crtY和crtI)，并与A.aurantiacum[Misawa，1995]的crtW基因或H.pluvialis[Lotan，1995][Kajiwara，1995]的bkt基因互补的大肠杆菌(E.Coli)，导致了鸡油菌黄质(canthaxan-thin)(β，β-胡萝卜素-4，4′-二酮)的积聚，该物质源自以中间体海胆烯酮(β，β-胡萝卜素-4-酮)进行的β-胡萝卜素转换。将上述基因(crtW或bkt)分别导入到除宿有上述类胡萝卜素生物合成基因，还宿有E.uredovora crtZ基因[kajiwara，1995][Misawa，1995]的E.coli细胞中，结果两种情况下均引起虾黄素(3，3′-二羟基-β，β-胡萝卜素-4，4′-二酮)积聚。以bkt基因所得结果与其它人(Lotan 1995)所作研究形成鲜明对比，Latan使用的是相同实验方案，不同的是，他将H.pluvialis bkt基因导入可合成玉米黄质(β，β-胡萝卜素-3，3′-二醇)，宿有E.herbicola(一种与上述E.uredovora密切相关的菌株)的类胡萝卜素生物合成基因的E.coli宿主中，结果未发现有虾黄素产生。
然而，迄今为止，并未发现本发明的类胡萝卜素生物合成基因与已知crtW基因有功能活性结合作用，更重要的是需要继续探索更为优化的发酵体系，供工业生产应用。
因此本发明的目的是提供含有一种或多种选自下述一类DNA顺序的DNA顺序：
a)编码黄杆菌属R1534种(Flavobacterium SP.R 1534)的GGPP合成酶的DNA顺序(crtE)，或基本上与其同源的DNA顺序；
b)编码黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素前体(prephytoene)合成酶的DNA顺序(crtB)，或基本上与其同源的DNA顺序；
c)编码黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素脱氢酶的DNA顺序(crtI)，或基本上与其同源的DNA顺序；
d)编码黄杆菌属R1534种的蕃茄红素环化酶的DNA顺序(crtY)，或基本上与其同源的DNA顺序；
e)编码黄杆菌属R1534种的β-胡萝卜素羟化酶的DNA顺序(crtZ)，或基本上与其同源的DNA顺序。
本发明的目的也提供含此类DNA顺序的载体，优选表达型载体。此外，本发明的目的还提供由此类DNA顺序或载体转化的细胞，优选原核细胞，更优选E.Coli(大肠杆菌)或Bacillus(芽胞杆菌)菌株。属真核细胞的此种转化细胞(优选酵母细胞或真菌细胞)也属本发明的目的。最后，本发明也涉及在适宜的培养条件下，培养此类细胞、制备所需类胡萝卜素及类胡萝卜素混合物的方法，及从此类细胞或培养基中分离出所需类胡萝卜素及其混合物的方法，而如果只有一种类胡萝卜素是所需时，则可用本领域已知技术，将其与可能存在的其它类胡萝卜素分离开。本发明还提供其特征在于将此种方法所得类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物加入食品或饲料中，配制食品或饲料组合物的方法。
此外，含下述DNA顺序的DNA顺序是本发明的目的：
a)编码黄杆菌属R1534种的GGPP含酶的DNA顺序(crtE)，或基本上与其同源的DNA顺序；和
b)编码黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素前体合酶的DNA顺序(crtB)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
c)编码黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素脱氢酶的DNA顺序(crtI)或基本上与其同源的DNA顺序。
本发明的目的也提供包含此类DNA顺序的载体，优选表达型载体。此外，本发明的目的还提供由此类DNA顺序或载体转化的细胞，优选原核细胞，更优选E.coli或Bacillus菌株。属真核细胞的此类转化细胞(优选酵母细胞或真菌细胞)也是本发明的目的。最后，本发明也涉及在适宜的培养条件下，培养此类细胞，制备所需类胡萝卜素及类胡萝卜素混合物的方法及从此类细胞或培养基中分离出所需类胡萝卜素及类胡萝卜素混合物的方法，而如果只有一种类胡萝卜素是所期望的，则可用本领域已知方法将其与可能存在的其它类胡萝卜素分开。优选此种方法用于制备蕃茄红素，并优选该方法用于制备食品及饲料组合物，其特征在于将此种方法所得类胡萝卜素，优选蕃茄红素或类胡萝卜素混合物，优选含蕃茄红素的混合物加入食品或饲料中。
此外，含下述DNA顺序的DNA顺序也是本发明的目的：
a)编码黄杆菌属R1534种的GGPP合酶的DNA顺序(crtE)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
b)编码黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素前体合酶的DNA顺序(crtB)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
c)编码黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素脱氢酶的DNA顺序(crtI)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
d)编码黄杆菌属R1534种的蕃茄红素环化酶的DNA顺序(crtY)，或基本上与其同源的DNA顺序；
本发明的目的也提供含此类DNA顺序的载体，优选表达型载体。此外本发明的目的还提供由此类DNA或载体转化的细胞，优选原核细胞，更优选E.coli或Bacillus菌株。属真核细胞的此种转化细胞，优选酵母细胞或真菌细胞，也属本发明的目的。最后，本发明也涉及在适宜的条件下培养此类细胞制备所需类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物的方法，及从此类细胞或培养基中分离所需类胡萝卜素及其混合物的方法，而如果只有一种类胡萝卜素是所期望的，则可用本领域已知方法将其与可能存在的其它类胡萝卜素分离开。优选此方法用于制备β-胡萝卜素，并优选用于制备食品及饲料组合物，其特征在于用该方法所得类胡萝卜素，优选β-胡萝卜素或类胡萝卜素混合物，优选含β-胡萝卜素的混合物加入食品或饲料中。
而且，本发明提供由上述含a)-d)亚顺序的DNA顺序转化的细胞，或由含该DNA顺序及含编码产碱杆菌(Alcaligenes)菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的第二DNA顺序(crtW)(或与其基本上同源的DNA顺序)的载体转化的细胞，或由含编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶DNA顺序(crtW)(或与其基本上同源的DNA顺序)的第二载体转化的细胞；并提供在适宜条件下培养该细胞制备所需类胡萝卜素及其混合物的方法；及从该细胞或培养基中分离所需类胡萝卜素或其混合物的方法，如果只有一种类胡萝卜素是所需的，则可用本领域已知技术将其与可能存在的其它类胡萝卜素分离开。优选此方法用于制备海胆烯酮，并优选用于制备食品或饲料组合物的方法，其特征在于，将用所述方法所得类胡萝卜素，优选海胆烯酮或类胡萝卜素混合物，优选含海胆烯酮的混合物加入到食品或饲料中。
此外本发明的目的是提供含上述亚顺序a)-d)的DNA顺序，和编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA顺序(crtW)(或本质上与其同源的DNA顺序)，和含该DNA顺序的载体，优选表达型载体。而且，本发明的目的还提供由所述DNA顺序或载体转化的细胞，优选原核细胞，更优选E.coli或Bacillus菌株。属真核细胞的此种转化细胞，优选酵母细胞或真菌细胞，也是本发明的目的。最后本发明涉及在适宜的培养条件下培养所述细胞制备所需类胡萝卜素或其混合物的方法，以及从所述细胞或培养基中分离出所需类胡萝卜素或其混合物的方法，假如只有一种类胡萝卜素是所需的，则可通过本领域已知技术将其与可能同时存在的其它类胡萝卜素分离开，尤其是制备海胆烯酮或鸡油菌黄质的方法，和制备食品和饲料组合物的方法，其特征在于，将以此方法所得类胡萝卜素，优选海胆烯酮或鸡油菌黄质或类胡萝卜素混合物，优选含海胆烯酮或鸡油菌黄质的混合物加入食品或饲料中。
另外，含下述DNA顺序的DNA顺序也是本发明的目的：
a)编码黄杆菌属R1534种的GGPP合酶的DNA顺序(crtE)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
b)编码黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素前体合酶的DNA顺序(crtB)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
c)编码黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素脱氢酶的DNA顺序(crtI)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
d)编码黄杆菌属R1534种的蕃茄红素环化酶的DNA顺序(crtY)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
e)编码黄杆菌属R1534种的β-胡萝卜素羟化酶的DNA顺序(crtZ)，或与其基本上同源的DNA顺序。
本发明的目的也提供含此种DNA顺序的载体，优选表达型载体。此外本发明的目的还提供由此种DNA顺序或载体转化的细胞，优选原核细胞，更优选E.coli或Bacillus菌株。属真核细胞的此种转化细胞，优选酵母细胞或真菌细胞亦是本发明的目的。最后，本发明也涉及在适当条件下培养此种细胞，制备所需类胡萝卜素或其混合物的方法，涉及从此种细胞或培养基中分离所需类胡萝卜素或其混合物的方法，如果只有一种类胡萝卜素是所需的，则可用本领域已知方法将其与可能同时存在的其它类胡萝卜素分开。优选此种方法用于制备玉米黄质，并优选用于食品或饲料组合物的制备，其特征在于，将以此种方法所得类胡萝卜素，优选玉米黄质或类胡萝卜素混合物，优选含玉米黄质的混合物加入食品或饲料中。
此外，本发明的目的是含上述亚顺序a)-e)，具附加有编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA顺序(crtW)(或与其本质上同源的DNA顺序)的DNA顺序，并提供含该DNA顺序的载体，优选表达型载体。此外，本发明的目的还提供由该DNA顺序或载体转化的细胞，优选原核细胞，更优选E.coli或Bacillus菌株。属真核细胞的此种转化细胞，也在本发明目的之列。最后本发明也涉及在适宜条件下培养该细胞，制备所需类胡萝卜素或其混合物的方法，及从该细胞或培养基中分离所需类胡萝卜素及其混合物的方法，如果只有一种类胡萝卜素是所需的，则可用本领域已知方法，将其与可能同时存在的其它类胡萝卜素分开。优选该方法用于制备玉米黄质，阿东黄质(adonixanthin)，或虾黄素，并优选用于制备食品或饲料组合物，其特征在于将以该方法制备出的类胡萝卜素，优选玉米黄质，阿东黄质或虾黄素或类胡萝卜素混合物，优选含玉米黄质、阿东黄质或虾黄素的混合物加入食品或饲料中。
本发明的目的也包括由含上述亚顺序a)-e)的DNA顺序转化的细胞，或由含该顺序并含编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β-加氧酶的第二DNA顺序(crtW)(或与其本质上同源的DNA顺序)的载体转化的细胞，或由含编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA顺序(crtW)(或与其本质上同源的DNA顺序)的第二载体转化的细胞。还涉及在适宜条件下培养该细胞，制备所需类胡萝卜素或其混合物的方法，及从该细胞或培养基中分离所需类胡萝卜素及其混合物的方法，如果只有一种类胡卜素是所需的，则可用本领域已知技术，将其与可能同时存在的其它类胡萝卜素分离开。优选该方法用于制备玉米黄质或阿东黄质，并优选用于制备食品或饲料组合物，其特征在于，将经此法所得类胡萝卜素，优选玉米黄质或阿东黄质，或类胡萝卜素混合物，优选含玉米黄质或阿东黄质的混合物加入食品或饲料中。
本文所提及的短语“基本上同源的DNA顺序”，当相对于crtE编码DNA顺序而言时，是指与黄杆菌属R1534种的crtE编码的氨基酸顺序相比，所述DNA顺序编码的氨基酸顺序表现出有45％以上，优选60％以上，更优选75％以上，最优选90％以上的氨基酸与之相同，同时，若由黄杆菌属R1534种的crtE编码酶时，所述多肽氨基酸顺序表现出与之相同类型的酶活性；同样，当相对于crtB而言时，所谓“基本上同源”意味着有60％以上，优选70％以上，更优选80％以上，最优选90％以上相同；而相对于crtI而言，意指70％以上，优选80％以上，最优选90％以上相同；相对于crtY而言，意指55％，优选70％，更优选80％，最优选90％相同；相对于crtZ而言，意指60％以上，优选70％，更优选80％，最优选90％相同；相对于crtW而言，意指60％以上，优选70％，更优选80％，最优选90％相同。基本上与crtW同源的顺序是已知的，例如，土壤杆菌属金黄菌(Agrobacterium aurantiacum)或绿藻血红球菌pluvialis(greenalgae Haematococous pluvialis)的β-胡萝卜素β4-加氧酶(bkt)型。
基因组型DNA、cDNA或合成DNA的DNA顺序可由已知技术制备[例如参见Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring HaborLaboratory Press 1989]或如实施例1，2或7的具体描述。
然后可将来自此种基因组DNA的本发明DNA顺序克隆，例如采用已知聚合酶链反应(PCR)法进行。该方法的原理可参见如“PCR Pr-otocols：A Guide to Methods and Applications”(Academic Pr-ess，Inc.(1990))。PCR是于体外从不同DNA顺序混合物中生产大量有一定长度和顺序的特异DNA的方法。PCR是以所研究的特异DNA片段的酶促扩增为基础的，被对片段被该顺序特异性的，且能与目的顺序两端的相反链杂交的二个寡核苷酸引物所覆盖。该两引物的3′端的方面相对。经该模板的反复循环热变性，该引物与其互补顺序退火，及以DNA聚合酶使该退火后的引物延伸等步骤，结果使得PCR引物之间的部分扩增。因为每个引物的延伸产物均能作为另一引物的模板，所以每次循环所产生的DNA片段为前一次的两倍。若使用从嗜热细菌Thermus aquaticus分离出的热稳定Taq DNA聚合酶，则可避免使每次热变性步骤之后必需加入的该聚合酶发生热变性作用。这一措施使得只需简单改变循环温度装置，便可导致PCR自动进行。此外，在较高温度下使引物退火和延伸，可提高扩增反应的特异性。提高了的特异性，通过将非目的片段对该酶和该引物的竞争性降至最小，而改善扩增产物的总产率。这样，所研究的特异顺序被高度扩增，且可采用已知技术很容易使之与非特异性顺序分离，例如以琼脂糖凝胶分离法，以及可以采用已知技术，使用载体使之克隆，例如Holten和Graham在Nucleic Acid Res.19，1156(1991)，Kov-alic等人在Nucleic Acid Res.19，4560(1991)，Marchuk等人在Nucleic Acid Res.19，1154(1991)，或Mead等人在Bio/Techno-logy 9，657-663(1991)各文献中所述。
PCR法中所用寡核苷酸引物可按已知技术制备，如Sambrook等人(如前而引用的文献)所介绍的方法。
然后可按已知技术(Sambrook等人前述文献)或实施例1或2的详述，将已扩增的DNA顺序用于筛选DNA文库。
一旦获得本发明的完全DNA顺序，它们可用作前导，来确定克隆其它来源的，基本上同源的DNA顺序的新的PCR引物。此外，它们及其同源DNA顺序，还可通过现有已知技术及Sambrook等人(前述文献)所述，整合入载体中，在适当宿主体系中表达或超表达编码多肽(或多种多肽)。但本领域专业人员熟知，DNA顺序本身也可用来转化本发明的适宜宿主体系，得到编码的多肽的超表达。适宜的宿主体系例如E.coli，Bacilli(如Bacillus Subtilis)，或Flavobact-er菌株之类的细菌。可以使用的E.coli是E.coli K12菌株，例如M15[Villarejo等人在J.Bacteriol.120，466-474(1974)一文中描述为DZ 291]、HB 101(ATCC No.33694)，或E.coli SG 13009[Gottesman等人，J.Bacteriol，148，265-273(1981)]。适宜的真核宿主体系有例如Aspergilli(如Aspergillus niger[ATCC 9142])之类的真菌，或如Saccharomyces(如Saccharomyces cevevisiae)之类的酵母，或Pastoris之类的Pichia，所有这些均可从ATCC获取。
可用于E.coli中表达的适宜载体已有记载，例如Sambrook等人在前述文献中，Fiers等人在“Procd.8th Int.Biotchnology Sym-posium”[Soc.Franc.de Microbiol.，Paris(Durand等人编)，pp.680-697(1988)]中，Bujard等人在“Methods in Enzymology”[eds.Wu和Grossmann，Academic Press，Inc.Vol.，155，416-433(1987)]中，Stüber等人在“Immunological Methods”[eds.Lefkovits和Pernis，Academic Press，Inc.，Vol.IV，121-152(1990)]中所提及的载体。可用于Bacilli中表达的载体是本领域已知的，并如下述文献中所介绍的：EP 405370，EP 635572，Yansura和Henner的Procd.Nat.Acad.Sci.USA 81，439(1984)，Meth.Enzym.185，199-228(1990)或EP 207459。可在真菌中表达的载体亦是本领域已知的，例如EP 420358所述，而在酵母中表达的载体如EP 183070、EP 183071、EP 248227、EP 263311所述。
当该DNA顺序于适宜培养基中，在适当宿主细胞中表达之后，类胡萝卜素便可从培养基(假如它们分泌入培养基中)或从宿主生物体中分离出，如果只有一种特异的类胡萝卜素是需要的，并假如必需从同时存在的其它类胡萝卜素中将其分离开来，则可采用本领域已知技术(参见例如Carotenoids Vol IA：Isolation and Analysis，G.Britton，S.Liaaen-Jensen，H.Pfander；1995，BirkhauserVerlag，Basel)。
本发明的类胡萝卜素可用于制备食品或饲料。本领域专业人员熟知其方法。此种食品或饲料组合物还可含一般为此日的常用的，本领域现有技术已知的添加剂或组份。
前面对本发明作过总的介绍之后，下面的附图和实施例将对本发明加以详述，但并不能由此构成对本发明的限制。
图1为说明黄杆菌属R1534种形成类胡萝卜素的生物合成途径，由此阐明由本发明DNA顺序编码的酶的活性。
图2为用每一泳道顶部所示的限制性内切酶消化，并用探针46F杂交的黄杆菌属R1534种的基团组DNA的Southern印迹图。箭头所指为分离出的2.4kb Xho1/PstI片段。
图3为用ClaI消化，或用ClaI和HindIII双消化的基因组黄杆菌属R1534种DNA Southern印迹图。A，B两组印迹分别表示以探针A杂交和用探针B杂交的结果(见实施例)。标明了1.8kb和9.2kb的ClaI/HindIII片段。
图4为用各泳道顶部所示限制性内切酶消化，并用探针C杂交的基因组黄杆菌属R1534种DNA的Southern印迹图。由箭头标出分离出的2.8Kb SalI/HindIII片段。
图5为用各泳道顶部所示限制性内切酶消化，并用探针D杂交的基因组黄杆菌属R1534的DNA的Southern印迹图。由箭头标明分离出的约3kb BclI/SphI片段。
图6为从获得的基因组克隆推断的黄杆菌属R1534种之类胡萝卜素生物合成簇组织物理图。用于筛选的探针位置由各克隆上短线表示。
图7为横杆菌属R1534种类胡萝卜素生物合成簇及其侧接区域的核苷酸顺序。该核苷酸顺序从所示第1核苷酸(见图6中Bam HI位)开始编号。各ORF(orf-5，orf-1，crtE，crtB，crtI，crtY，crtZ和orf-16)的推断的氨基酸顺序由单字母氨基酸代码表示。箭头(--→)表示的转录方向；星号为中止密码子。
图8为分子量为3133道尔顿的黄杆菌属R1534种的GGPP合成酶(crtE)的蛋白质顺序。
图9为分子量为32615道尔顿的黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素前体合成酶(crtB)的蛋白质顺序。
图10为分子量为54411道尔顿的黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素脱氢酶(crtI)的蛋白质顺序。
图11为分子量为42368道尔顿的黄杆菌属R1534种的蕃茄红素环化酶(crtY)的蛋白质顺序。
图12为分子量为19282道尔顿的黄杆菌属R1534种的β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)的蛋白质顺序。
图13含黄杆菌属R1534种类胡萝卜素生物合成基因簇缺失的重组质粒。
图14为用于PCR反应的引物。用下线画出的顺序是所标明的限制性内切酶的识别位点。小写字母表示由突变引入的核苷酸。方框表明在B.Subtilis中识别的人工RBS。用粗体线印出的字母表示，建立下面基因转译起始位点(ATG)的原始腺嘌呤(见原始操纵子)位置。所有原始黄杆菌属类胡萝卜素生物合成基因的ATG均不得不破坏掉，以免与重建的转录起始位相冲突。箭头表示所示黄杆菌属R1534野生型类胡萝卜素基因的起始和结束。
图15为用于不同构件的接头。下面划线的顺序是所标明的限制性内切酶的识别位。小写字母表示由合成引物引入的核苷酸。方框表明B.Subtilis中识别的人工RBS。箭头表示所示黄杆菌属类胡萝卜素基因的起始和结束。
图16为质粒pBIIKS(+)-克隆59-2，pLyco和pZea4的构建。
图17为质粒p602CAR的构建。
图18为质粒pBIIKS(+)-CARVEG-E和p602 CARVEG-E的构建。
图19为质粒pHP13-2CARZYIB-EINV和pHP13-2PN25ZYIB-EINV的构建。
图20为质粒pXI12-ZYIB-EINVMUTRBS2C的构建。
图21为B.Subtilis菌株BS 1012∷ZYIB-EINV4的Northern印迹分析。A组：质粒pXI12-ZYIB-EINV4交互整合入B.Subtilism果聚糖-蔗糖酶基因中的示意图。B组：用探针A获得的Northern印迹(用CAR 51和CAR 76获得的PCR片段，并与crtZ的3′端及crtY的5′端杂交)。C组：用探针B获得的Northern印迹(从质粒pBIIKS(+)-crtE/2分离出的Bam HI-Xhol片段，并与crtE基因的5′部分杂交)。
图22为三种转化的Bacillus Subtilis菌株：BS1012∷SFCO，BS1012∷SFCOCATI和BA1012∷SFCONEOI的整合位点示意图。只有当这些菌株具有可扩增结构时，才能实现合成黄杆菌属类胡萝卜素操纵子(SFCO)的扩增作用。探针A用于测定整合的SFCO的拷贝数。该图还示出红霉素抗性基因(ermAM)、氯霉素抗性基因(cat)，新霉素抗性基因(neo)，B.subtilis的cryT基因中止子(cryT)、果聚糖-蔗糖酶基因(sac-B5′和sac-B3′)，pXI12的质粒顺序(pXI12)，起源于veg启动子复合物位点I的启动子(PvegI)。
图23为质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO和pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT的构建。
图24为质粒pZea4的完整核苷酸顺序。
图25为产碱杆菌PC-1的合成crtW基因。转译的蛋白顺序示于双股链DNA顺序之上。用于PCR合成的12个寡核苷酸(crtW1-crtW12)以下面划线表示出来。
图26为质粒pBIIKS-crtEBIYZW的构建。携带合成crtW基因的pALTER-Ex2-crtW的HindIII-PmlI片段被克隆进HindIII和MluI(平头)位点。PvegI和Ptac是用于两操纵子转录的启动子。该质粒的ColE1复制起始点与pALTER-Ex2构件中存在的p15A起始点相似。
图27为实施例7构建的所有质粒相关插入段。瓦解的基因用11表示。限制性位点：S＝SacI、X＝XbaI、H＝HindIII，N＝NsiI、Hp＝HpaI、Nd＝Ndel。
图28为由本发明方法从β-胡萝卜素获得的各种反应产物(类胡萝卜素)。
实施例1所用原料和一般方法
细菌菌株和质粒：黄杆菌属R1534种野生型(ATCC 21588)是用于克隆的基因的DNA来源。黄杆菌属R1534种野生型DNA的部分基因组文库被构建入pBluescriptII+(KS)或(SK)载体中(Stratagene，La Jolla，USA)，并转化入E.coli XL-1 blue(stratagene)或JM109。
培养基和生长条件：转化的E.coli于37℃，在加有用于选择的100μg氨苄青霉素(Amp)/ml的Luria液体培养基中生长。黄杆菌属R1534种野生型于27℃，在含1％葡萄糖，1％胰胨(Difco Laborat-ories)，1％酵母提取液(Difco).0.5％MgSO4·7H2O和3％NaCl的培养基中生长。
菌落筛选：使用下述引物，基本上按照Zon等人[Zon等人，Biotechniques 7，696-698(1989)]的方法采用PCR法对E.Coli转化子进行筛选：引物#7：5′-CCTGGATGACGTGCTGGAATATTCC-3′引物#8：5′-CAAGGCCCAGATCGCAGGCG-3′
基因组DNA：将50ml黄杆菌属R1534种过夜培养物，于10000g条件下离心处理10分钟。将所得沉淀用10ml裂解缓冲液(50mMEDTA，0.1M NaCl pH7.5)快速洗涤，再悬浮于补充有10mg溶菌酶的4ml相同缓冲液中，于37℃保温15分钟。加入0.3ml N-月桂酰肌氨酸(20％)后，再于37℃继续保温15分钟，然后用苯酚、苯酚/氯仿和氯仿提取DNA。于室温下，存在0.3M醋酸钠(pH5.2)条件下，将该DNA用乙醇沉淀20分钟，接着于10000g离心处理15分钟。用70％乙醇漂洗所得沉淀，干燥，并再悬浮于1ml TE(10mM Tr-is，1mM EDTA，pH8.0)中。
用于Southern印迹分析和克隆实验的所有基因组DNA均以H2O透析48小时(使用棉胶袋(collodium bag，sartorius，Germany))，然后在0.3M乙酸钠存在下用乙酸沉淀、并再悬浮于H2O中。
探针标记：DNA探计按Sambrook等人前述文献的随机引发法(random-priming)用(α-32p)dGTP(Amersham)标记。
用于筛选微基因文库的探针：探针46F是使用引物#7和#8，以黄杆菌属R1534种基因组DNA为模板，经PCR反应所得的119bp片段。该探针被认为是黄杆菌属R 1534种八氢蕃茄红素合成酶(crtB)基因的片段，因为它表现出与来自其它菌种(如E.uredovora，E.herfi-cola)的八氢蕃茄红素合成酶基因有显著的同源性。探针A是起源于克隆85插入段右支的184bp BstXI-PstI片段。探针B是从克隆85插入段左端获得的397bp XhoI-NotI片段。探针C是从克隆85插入段的右端获得的536bp BglII-PstI片段。探针D是从克隆59插入段分离出的376bp KpnI-BstyI片段。各探针的定位示于图6中。
寡核苷酸合成：用Applied Biosystems 392 DNA合成仪合成PCR反应或测序用的寡核苷酸。
Southern印迹分析：为进行杂交试验，将黄杆菌属R1534种基因组DNA(3μg)用适当的限制性内切酶消化，并于0.75％琼脂糖凝胶上电泳。如Sourthern，E.M.所述[Southern，E.M.J.Mol.Biol.98，503(1975)]将其转移到Zeta-探针印迹膜(BIO-RAD)上。预杂交和杂交是于65℃，在7％SDS、1％BSA(fraction V；Boehring-er)，0.5M Na2HPO4，pH7.2中进行的。杂交之后，于室温下用2×SSC，1％SDS将该膜洗2次，时间5分钟，再于65℃用0.1％SSC，0.1％SDS洗二次15分钟。
DNA顺序分析：使用Sequenase Kit(USA Biochemical)，采用双脱氧键中止技术[Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74，5463-5467(1977)]进行顺序测定。使用Genetics Computer，Inc.的GCG顺序分析软件包(Version 8.0)将两股链完全测序及进行顺序分析[Devereux等人，Nucleic Acids，Res.12，387-395(1984)]。
分析类胡萝卜素：将携带各种质粒构建体的E.Coli XL-1或JM109细胞(200-400ml)，加在补充有100μg氨苄青霉素/ml的LB中，在振荡烧瓶中，于37℃和220rpm振动条件下，生长如本文所示的时间，通常24-60小时。
使用旋转匀浆器(Polytron，Kinematica AG，CH-Luzern)，用足量丙酮提取这些微生物中的类胡萝卜素。用融结玻璃抽滤器将该匀浆过滤入圆底烧瓶中。采用旋转蒸发器，用水泵抽真空，于50℃将该滤液蒸发。为检测玉米黄质，将残渣溶解于正已烷/丙酮(86∶14)中，然后用标准相HPLC，按Weber，S.所述[Weber，S.inAnalytical Methods for Vitamins and Carotenoids in Feed，keller，H.E.，Editor，83-85(1988)]进行分析。为检测β-胡萝卜素和蕃茄红素，则将蒸发的提取物溶解于正己烷/丙酮(99∶1)中，并采用HPLC，按Hengartner等人所述[Hengartner et al.Helv.Chin.Acta 75，1848-1865(1992)]进行分析。
实施例2黄杆菌属R1534种类胡萝卜素生物合成基因的克隆
为鉴定和分离出携带类胡萝卜素生物合成途径基因的DNA片段，本发明人使用了DNA片段46F(见方法一节)探测携带用不同限制性内切酶消化的黄杆菌属R1534种染色体DNA的Southern印迹(图2)。与该探针杂交的2.4kb XhoI/PstI片段看来是最适宜作为起始的片段。将基因组黄杆菌属R1534种DNA用XhoI/PstI消化，并在1％琼脂糖凝胶上电泳。根据共迁移的DNA标志，将该凝胶上约2.4kb区域切下，并分离该DNA。将黄杆菌属R1534种基因组DNA的XhoI/PstI微基因文库构建入pBluescriptIISK(+)的XhoI-PstI位点。然后将100个E.Coli XL1转化子用引物#7和引物#8(与前面获得119bp片段(46F)所用相同的引物)，借助PCR法进行筛选。发现一个阳性转化子，称之为克隆85。对该插入片段的测序显示，该顺序不仅与八氢蕃茄红素合成酶(crtB)同源，而且也与欧文氏杆菌属(Erwinia)的herbicola和uredovora种二者的八氢蕃茄红素脱氢酶(crtI)同源。采用同样方法，使用探针A和B可获得克隆85的左边和右边的基因组顺序。将黄杆菌属R1534种基因组DNA用ClaI和HindIII双消化，并用探针A和B进行Southern印迹分析。用探针A，鉴定出了一个约1.8kb的ClaI/HindIII片段(图3A)，将其分离出并亚克隆进pBluescri-ptIIKS(+)的ClaI/HindIII位点。用探针A筛选E.Coli XL1转化子得到6个阳性克隆。将这些阳性克隆之一的插入片段，克隆43-3测序，发现与上述两种Erwinia属的crtI基因N-末端和crtY基因C-末端同源。用探针B，检测出约9.2kb的ClaI/HindIII片段(图3B)，将其分离出并亚克隆进pBluescriptIIKS(+)。
筛选该转化子得到一个阳性克隆51，对该插入片段5′和3′端测序发现，只有靠近HindIII位点区表现出与上述Erwinia属类胡萝卜素生物合成基因(如crtB基因和crtE基因)有相关同源性。ClaI位点周围的顺序未表现出与类胡萝卜素生物合成途径已知基因同源。根据这些信息，并为有利于进一步测序及构建工作，该克隆51的4.2kb BamHI/HindIII片段被亚克隆进pBluescriptIIKS(+)相应位点，得到克隆2。将该克隆插入片段测序，证实存在与Erwinia细菌crtB和crtE基因同源的基因。这些基因被定位在离HindIII位点1.8kb的范围内。该插入段的其余2.4kb与已知的类胡萝卜素生物合成基因无同源性。
使用探针C与经不同限制性内切酶消化的黄杆菌属R1534种基因组DNA杂交，检测出ClaI位点下游的其它基因组顺序图47。
将经Southern分析鉴定出的2.8kb SalI/HindIII片段分离出，并亚克隆进pBluescriptIIKS(+)的HindIII/XhoI位点。用探针A筛选E.Coli XL1转化子得到一个阳性克隆，称之为克隆59。该克隆插入片段证实为克隆43-3顺序，并另外还含与来自其它已知蕃茄红素环化酶的crtY基因N末端同源的顺序。为获得被认为是丢失的crtZ基因，将黄杆菌属R1534种的Sau3AI部分消化基因文库构建ApB-luescriptIIKS(+)的BamHI位点。用探针D筛选该文库，得到几个阳性克隆。一个转化子，被命名为克隆6a，有4.9kb插入片段。对该插入片段测序得知，除有已知的编码crtB、crtI和crtY顺序之外，还有丢失的crtZ基因。从携带R1534 BclI/SphI片段的微基因文库中分离出克隆7g(图5)，并用探针D筛选。克隆7g的插入片段大小为约3kb。
上述覆盖黄杆菌属R1534种基因组约14kb的六个独立的克隆插入段汇编入图6中。
从BamHI位点(位置1)到碱基对8625的确定的序列示于图7中。克隆的R1534顺序的推定蛋白编码区
使用能借助其密码子用法与给定密码子频度表相似性，来识别蛋白编码区的GCG软件包CodonPreference程序，进行计算机分析，揭示出编码推定蛋白的8个开放阅读框架(ORF)：编码分子量大于41382道尔顿的多肽的1-1165部分ORF(ORF-5)；编码分子量40081道尔顿的多肽的1180-2352的ORF(ORF-1)；编码分子量为31331道尔顿的多肽的2521-3405(crtE)ORF；编码分子量为32615道尔顿的多肽的4316-3408(crtB)ORF；编码分子量为54411道尔顿的多肽的5797-4316(crtI)ORF；编码分子量为42368道尔顿的多肽的6942-5797(crtY)ORF；编码分子量为19282道尔顿的多肽的7448-6942(crtZ)(ORF)；和编码分子量为19368道尔顿的多肽的8315-7770ORF(ORF-16)；ORF-1和crtE与其它几个有相反的转录取向(图6)。crtI，crtY和crtZ ORF的转译起始位点，根据与Shine/Delgarno(S/D)[Shine和Dalgarno，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71，1342-1346(1974)]共有顺序AGG-6-9N-ATG(图10)同源的序列的定位，和根据与E.herbicola和E.uredovora各酶的N末端顺序同源性，可以很清楚地确定出。ORF crtB的转译，很可能从间隔很小的三个密码子ATG(4316)、ATG(4241)、和ATG(4211)开始。第一个密码子即使不具有该三个密码子中最好的S/D顺序，仍产生与E.herbicola和E.uredovora crtB蛋白N末端最高同源性的转译产物，因此是最大可能的转译起始位点。ORF crtE转译很可能从150bp中发现的5个不同起始密码子开始：ATG(2389)，ATG(2446)，ATG(2473)，ATG(2497)，AGT(2521)。根据下面的观察，我们确信ATG(2521)是crtE的最大可能转录起始位，即该ATG密码子的前面具有所有5个上述假定的起始位的最好的共有S/D顺序；同时编码的蛋白推定的N-末端氨基酸顺序与E.herbicola和E.uredovora的crtE酶N末端有最多的同源性。crt转译起始位和基因产物的特征
五种类胡萝卜素生物合成基因的转译起始位点如下所示，可能的核糖体结合位点由下面划线表示出。基因crtZ、crtY、crtI和crtB非常接近，以致于前一个基因的TGA中止码与下一基因的ATG重叠。五个基因中仅有三个(crtI、crtY和crtZ)与最佳的共有S/D顺序相符。方框TGA顺序表示前面基因的中止密码子。
Figure A9610811400261
黄杆菌属R1534种各crt基因的氨基酸顺序
所有黄杆菌属R1534种的五个ORF与其它菌属的已知类胡萝卜素生物合成基因同源，集聚于约5.2kb的一段顺序内(图7)。GGDP合成酶(crtE)
香叶基香叶基焦磷酸合成酶(crtE基因产物)的氨基酸(aa)顺序由295个aa组成，示于图8。该酶能将焦磷酸法呢酯和焦磷酸异戊烯酯于1′-4位缩合。八氢蕃茄红素合酶(crtB)
该酶催化两个酶促反应步骤。首先将两个香叶基香叶基焦磷酸酯(C20)头对头缩合成C40类胡萝卜素八氢蕃茄红素前体。第二步将该前体的环丙基环重排得到八氢蕃茄红素。由黄杆菌属R1534种的crtB基因编码的303个aa示于图9中。八氢蕃茄红素脱氢酶(crtI)
黄杆菌属R1534种的八氢蕃茄红素脱氢酶由494个aa组成，如图10所示，性能与E.herbicola和E.uredovora的crtI酶相似，经四个脱氢步骤，将无色类胡萝卜素八氢蕃茄红素转化为红色蕃茄红素。蕃茄红素环化酶(crtY)
黄杆菌属R1534种的crtY基因产物能将β-芷香酮环引入蕃茄红素两侧，获得β-胡萝卜素。该黄杆菌属R1534种的蕃茄经素环化酶由382个aa组成(图11)。β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)
crtZ的基因产物由169个aa组成(图12)，能将β-胡萝卜素羟基化，得到叶黄素玉米黄质。推测的ORF(orf-1，orf-5，orf-16)的酶促功能
orf-1就氨基酸水平而言，与来自各种生物体(如热带假丝酵母(Candida tropicalis)、人、大鼠等)的乙酰乙酰-CoA硫解酶有40％以上相同。因此该基因很可能推定为乙酰乙酰-CoA硫解酶(乙酰基-CoA乙酰基转移酶)，该酶能将两分子乙酰基-CoA缩合成乙酰乙酰基CoA。乙酰乙酰基-CoA通过HMG-CoA合成酶与第三个乙酰基-CoA缩合，形成β-羟基-β-甲基戊二酰基-CoA(HMG-CoA)。该化合物是除能产生甾醇外还产生各种具有不同细胞功能的类异戊二烯的甲羟戊酸途径的一部分。在细菌和植物中，类异戊二烯途径也能合成某些独特产物，如类胡萝卜素，生长调节剂(如植物中的赤霉素，abcissic酸)，以及植物抗毒素之类的次级代射产物[Riou等人，Gene 148，293-297(1994)]。
orf-5与来自不同键霉菌属(如S.violaceoruber，S.cinnamo-nensis)的polykitide合成酶的氨基酸顺序有约30％的低同源性。这些抗生素合成酶(polyketide合成酶)被分成两类。I类是多功能大蛋白，而II类是由参与polyketide合成次级反应的几个蛋白组成的多蛋白复合物[Bibb等人，Gene 142，31-39(1994)]。
由orf-16编码的推定蛋白，氨基酸与可溶性Anabaena cylin-drica氢化酶亚基有42％相同。ORF(crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ)对类胡萝卜素生物合成途径酶促活性的功能分配
不同ORF基因产物的生物化学功用，可以通过分析用黄杆菌属细菌基因簇的缺失突变(不是所有的crt基因全部表达)转化的E.Coli宿主菌株中，类胡萝卜素的聚积情况来确定(图13)。
构建三种不同的质粒：pLyco，p59-2和pZea4。质粒p59-2系通过将克隆2的HindIII/BamHI片段亚克隆进克隆59的HindIII/Bam-HI位点而获得。p59-2携带crtE、crtB、crtI和crtY基因的ORF，应产生β-胡萝卜素。pLyco由p59-2质粒缺失编码crtY基因的约一半(N末端)的KpnI/KpnI片段而获得。用pLyco转化E.Coli因而含有被切断的非功能性crtY基因，应产生蕃茄红素，即β-胡萝卜素前体。pZea4系通过将p59-2的AscI-SpeI片段，它含crtE，crtB，crtI和crtY基因的大部分，与克隆6a的AscI/XbaI片段，它含有完整的crtY基因和crtZ基因的顺序，相连接而构建的。因此pZea4[其完全顺序见图24；核苷酸1-683来自pBluesciptIIKS(+)，核苷酸684-8961来自黄杆菌属R1534野生型基因组，核苷酸8962-11233来自pBluescriptIIKS(+)]具有玉米黄质生物合成途径的所有5个ORF。该质粒pZea4已于1995年5月25日贮藏于DSM-Deuts-che Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Germany)，入藏号DSM 10012。因此用该后一质粒转化的E.coli细胞应产生玉米黄质。为检测该类胡萝卜素产生，将转化子在振动烧瓶中生长48小时，然后按方法一节所述进行类胡萝卜素分析。图13汇集了上述质粒的不同插入段，及检测出的主要类胡萝卜素。
正如所预期的、携代pLyco的E.coli细胞产生蕃茄红素，而携代p59-2的E.coli细胞产生β-胡萝卜素(所有E，9-Z，13-Z)，而携代pZea4构建体的细胞产生玉米黄质。这证实了合成玉米黄质或其前体(八氢蕃茄红素、蕃茄红素、β-胡萝卜素)的黄杆菌属R1534五种的所有必需基因均被克隆。
实施例3用于类胡萝卜素合成酶表达的原料和方法
细菌菌株和质粒：使用载体pBluescriptIIKS(+)或(-)(Str-atagene，La Jolla，USA)和pUC18[Vieira和Messing，Gene 19，259-268(1982)；Norrander等人，Gene 26，101-106(1983)]在不同E.coli菌株，如XL-1 blue(Stratagene)，TG1或JM 109中进行克隆。在所有B.Subtilis转化中，使用菌株1012。质粒pHP13[Haima等人，Mol.Gen.Genet.209，335-342(1987)]，和质粒p602/22[LeGrice，S.F.J.in Gene Expression Technology，Go-eddel，D.V.Editor，201-214(1990)]是能在B.Subtilis和E.Coli细胞中复制的革兰氏(+)/(-)穿梭载体。质粒p205含克隆进pUS18的SmaI位点的VegI启动子。质粒pXI12是B.Subtilis中基因组成型表达的整合载体[Haiker等人，in 7th Int.Symposium onthe Genetics of Industrial Microorganisms，June 26-July 1，1994，Mongreal，Quebec，Canada(1994)]。
质粒pBEST501[Itaya等人，Nucleic Acids Res.17(11)，4410(1989)]含来源于S.aureus的质粒pUB110(GenBank entry：M19465)的新霉素抗性基因盒[Mckenzie等人，Plasmid 15，93-103(1986)；Mckenzie等人，Plasmid 17，83-84(1987)]。当其以单拷贝形式存在于B.Subtilis基因组中时，该新霉素抗性基因表现出选择标志的作用。质粒pC194(ATCC 37034)(GenBank entry：L08860)来源于S.aureus[Horinouchi和Weisblaum，J.Bacteriol.150，815-825(1982)]，并含氯霉素乙酰转移酶基因。
培养基和生长条件：E.coli于37℃，在加有选择用的100μg氨苄青霉素(Amp)/ml的Luria液体培养基(LB)中生长。B.Subtilis细胞则在补充有红霉素(1μg/ml)，或新霉素(5-180μg/ml)，或者氯霉素(10-80μg/ml)的VY培养基中生长。
转化：E.coli的转化，是使用BIO-RAD基因脉冲发生器(Herc-ules，CA，USA)进行电穿孔来完成的，所用参数为(200Ω，250μFD，2.5V)。B.Subtilis的转化则基本上是根据Cutting和VanderHron在Molecular Biological Method for Bacillus[Harwood，C.R.and Cutting，S.M.，Editor，John Wiley & Sons：Chiches-ter.England，61-74(1990)]一书中的标准程序方法2.8进行的。
菌落筛选：按Zon等人前述文献所述进行细菌菌落筛选。
寡核苷酸合成：PCR反应或测序所用的寡核苷酸用AppliedBiosystems 392 DNA合成仪合成。
PCR反应：PCR反应使用U1Tma DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)，或Pfu Vent聚合酶(New England Biolabs)，按制造商的说明来进行。典型的50μl PCR反应包括：100ng模板DNA，每一种引物为10PM，所有4种dNTP(最终浓度300μM)，MgCl2(若使用U1Tma聚合酶时；最终浓度2mM)，1×U1Tma反应缓冲液，或1×Pfu缓冲液(由制造商提供)。将除DNA聚合酶外的所有反应组份于95℃保温2分钟，按各部分(见下面)所述进行循环步骤。所有反应均通过在第一循环的72℃延伸步骤期间加入聚合酶，而进行热启动。PCR反应结束时，取一个等分试样在1％琼脂糖凝胶上分析，然后用苯酚/氯仿提取。用1/10的3M乙酸钠溶液和二倍体积乙醇，沉淀水相中的扩增片段。于12000rpm离心处理5分钟后，将所得沉淀再悬浮于足量水中(一般为40μl)，然后用所示限制性内切酶消化。消化之后将混合物于1％低熔点琼脂糖上分离。将预期大小的PCR产物从琼脂糖上切下，当片段400bp以上时，用玻璃珠法(GENECLEAN KIT，Bio 101，Vis-ta CA，USA)提纯，而当片段短于400bp时，则直接从该凝胶上离心析出，如Heery等人[Heery等人，TIBS6(6)，173(1990)]所述。
基因扩增及定点诱变所用寡聚体
构建不同质粒而进行的所有PCR反应如下面所述。所用所有引物汇集于图14中。
引物#100和#101被用于扩增完全crtE基因的PCR反应，所述完全crtE基因在该基因转录起始位上游有一个SpeI限制位点和一个人工核糖体结合位点(RBS)。在该扩增片段的3′端，引入两个独特的限制位点，即AvrII和SmaI位点，以利于进一步的克隆。该PCR反应是以U1Tma聚合酶进行的，使用下述扩增条件进行：以95℃，1分钟/60℃，45秒/72℃，1分钟的模式循环5次；和以95℃，1分钟/72℃，1分钟的模式循环20次。质粒pBIIKS(+)-克隆2用作模板DNA。最终PCR产物用SpeI和SmaI消化，并用GENECLEAN KIT分离。该片段大小约为910bp。
引物#104和#105用于扩增crtZ基因的从转译起始点到位于基因编码顺序中的SalI限制位点的PCR反应。在crtZ基因的5′端引入EcoRI，合成的RBS和NdeI位点。该PCR反应条件如上所述。质粒pBIIKS(+)-克隆6a用作模核DNA，将PCR终产物用EcoRI和SalI消化。用GENECLEAN KIT分离出约480bP的片段。
引物MUT1和MUT5用于扩增完全crtY基因。在5′端存在包括SalI位点的crtZ基因的后23个核苷酸，接着是crtY基因转译起始位前面的人工RBS。该人工建立的RBS的包括有PmlI限制位点。该扩增片段的3′端含crtI基因的22个核苷酸，在其前面有含MunI限制位点的所建立的人工RBS。该PCR反应所用条件同上，使用下述循环模式：95℃，45秒/60℃，45秒/72℃，75秒循环5次；接着95℃，45秒/66℃，45秒/72℃，75秒循环22次。质粒pXI12-ZYIB-EINV4用作Pfu Vent聚合酶的模板。将1225bP的PCR产物切成平头，并克隆进pUC18的SmaI位点(使用Sure-Clone Kit(Pharmacia)，并遵厂商说明)。
质粒MUT2和MUT6被用于完全crtI基因扩增。在5′端存在crtY基因的后23个核苷酸，接着是领前于crtI基因转译起始位的人工RBS。该新建立的RBS包括MunI限制位点。该扩增片段的3′端，包括含BamHI限制位点的crtB基因上游的人工RBS。该PCR反应所用条件基本上同上，包括下述循环模式：95℃，30秒/60℃，30秒/72℃，75秒循环5次，接着以95℃，30秒/66℃，30秒/72℃，75秒模式循环25次。质粒pXI12-ZYIB-EINV4用作Pfu Vent聚合酶的模板。为进行更进一步的克隆步骤，用MunI和BamHI消化该1541bp的PCR产物。
引物MUT3和CAR17被用于crtB基因N末端扩增。在5′端存在crtI基因的后28个核苷酸，接着是crtB基因转译起始位点前面的人工RBS。该所建立的RBS包括一个BamHI限制位点。该扩增片段，称为PCR-F，也含位于crtB基因N末端的HindIII限制位点。该PCR反应所用条件如本文别处所述，包括下述循环模式：95℃，30秒/58℃，30秒/72℃，20秒循环5次；接着以95℃，30秒/60℃，30秒/72℃，20秒模式循环25次。质粒pXI12-ZYIB-EINV4用作Pfu Vent聚合酶的模板。将该约160bp的PCR产物用BamHI和HindIII消化。氯霉素抗性基因(cat)扩增所用的寡聚体
引物CAT3和CAT4用于pC194(ATCC 37034)[Horinouchi和Weisblum前述文献了，一种S.aureus中发现的R质粒的氯霉素抗性基因的扩增。所用PCR反应条件如前所述，包括下述循环模式：95℃，60秒/50℃，60秒/72℃，2分钟循环5次，接着以95℃，60秒/60℃，60秒/72℃，2分钟循环20次。质粒pC198用作pfu Vent聚合酶的模板。将该约1050bp的PCR产物用ECORI和AatII消化。
用于产生接头的寡聚体：将两相应引物各90ng加入Eppendorf管中获得接头。将该混合物快速真空干燥，将所得残渣再悬浮于1X连接缓冲液(Ligation butter)(Boehringer，Mannheim，Germany)中。将该液于50℃保温3分钟，然后冷却至室温，使该引物适当杂交。这时该接头准备好连接进适当位点。所有用于产生接头的寡聚体如图15所示。
引物CS1和CS2用于形成含下述限制位点：HindIII、AflII、ScaI、XbaI和EcoRI的接头。
引物MUT7和MUT8用于形成含限制位点SalI、AvrII、PmlI、MluI、MunI、BamHI、SphI和HindIII的接头。
引物MUT9和MUT10用于引入crtY上游的人工RBS。
引物MUT11和MUT12用于引入crtE上游的人工RBS。
分离RNA：根据Maes和Messens[Nucleic Acids Res. 20(16).4374(1992)]所述方法，从对数生长期的B.Subtilis制备总RNA。
Northern印迹分析：为进行杂交试验，将多至30μg B.Subti-lis RNA在1×MOPS和0.66M甲醛中的1％琼脂糖凝胶上电泳。将其转移至Zeta-Probe印迹膜(BIO-RAD)上，UV交联，预杂交和杂交按Farrell，J.R.E.[RNA Methodologies.A Laboratory Guide forisolation and characterization.San Diego，USA，AcademicPress(1993)]所述进行。洗涤条件如下：2×SSPE/0.1％SDS中2×20分钟，接着在0.1％SSPE/0.1％SDS(于65℃)中1×20分钟。然后用磷成像仪(Phosphorimager，Malecular Dynamics)或用放射自显影仪在X射线膜上(Kodak)进行Northirn印迹分析。
分离基因组DNA：B.Subtilis基因组DNA是根据[13]文献所述标准程序法2.6，从25ml过夜培养物中分离的。
Southern印迹分析：为进行杂交试验，将B.Subtilis基因组DNA(3μg)用适当限制性内切酶消化，并在0.75％琼脂糖凝胶上电泳。按Southern，E.M.前述文献方法将其转移至Zeta-Probe印迹膜(BIO-RAD)上。预杂交和杂交是在7％SDS，1％BSA(fraction V，Boehringer)、0.5M Na2HPO4中，pH7.2，65℃条件下进行。杂交之后，将该膜在2×SSC，1％SDS中，室温下洗两次，时间5分钟；再用0.1％SSC，0.1％SDS，65℃15分钟洗两次。用磷成像仪(Mole-cular Dynamics)或用放射自显影仪在X射线膜(Kodak)上进行Sou-thern印迹分析。
DNA顺序分析：使用Sequenase Kit Version 1.0(United St-ates Biochemical)采用双脱氧链中止技术(Sanger等人前述文献)测定顺序。使用Genetics Computer，Inc.[Devereux等人前述文献]的GCG顺序分析软件包(Version 8.0)进行顺序分析。
B.Subtilis中的基因扩增：为扩增B.Subtilis转化体中SFCO拷贝数，将单个菌落接种入补充有1.5％葡萄糖和0.02mg氯霉素或新霉素/ml(取决于哪种抗生素抗性基因存在于扩增结构中，见结果和讨论)的15ml VY培养基中。第二天将750μl该培养物接种于含1.5％葡萄糖13ml VY培养基中，对于cat抗性的突变种补充(60，80，120和150μg/ml)对于新霉素抗性突变种，补充160μg/ml和180μg/ml。将培养物生长过夜，第二天，将50μl不同的稀释液(1∶20，1∶400，1∶8000，1∶160000)分别铺于带有适当抗生素浓度的VY琼脂平板上。然后分析大的单个菌落，测定拷贝数，和类胡萝卜素的产量。
分析类胡萝卜素：使E.Coli或B.Subtilis转化体(200-400ml)在37℃，分别在补充有抗生素的LB培养基或VY培养基中生长文中指定的时间，通常为24至72小时，生长是在振荡烧瓶中，于220rpm条件下进行的。
使用旋转匀浆器(Polytron，Kinematica AG，CH-Luzern)，以足够体积的丙酮提取该微生物中产生的类胡萝卜素。用融结玻璃抽滤器将该匀浆液过滤入圆底烧瓶中。用水泵抽真空，50℃下，将该滤液用旋转蒸发器蒸发。为检测玉米黄质，将残留物溶于正己烷/丙酮(86∶14)中，然后按Weber，S.前述文献，将其进行标准相HPLC分析。为检测β-胡萝卜素和蕃茄红素，将蒸发的提取物溶于正己烷/丙酮(99∶1)中，按Hengartner等人前述文献进行HPLC分析。
实施例4E.Coli中类胡萝卜素的产生
黄杆菌属细菌的类胡萝卜素生物合成簇不同开放阅读框架(ORF)的基因产物的生物化学功用，可通过分析E.Coli宿主菌株中类胡萝卜素的积聚情况来阐明，这些菌株是用携带有缺失的黄杆菌属细菌基因簇的质粒转化的(从而缺少某些crt基因产物)。E.Coli中相似的功能检测已有其它研究者介绍过[Misawa等前述文献；Perry等人，J.Bacteriol.，168，607-612(1986)；Hundle等人，Molecularand General Genetics 245(4)，406-416(1994)]。从三种基因组分离物pBIIKS(+)-克隆2，pBIIKS(+)-克隆59和pBIIKS(+)-克隆6a构建三种不同粒质pLyco，pBIIKS(+)-克隆59-2和pZea4(见图16)。
质粒pBIIKS(+)-克隆59-2是通过将pBIIKS(+)-克隆2的HindIII/BamHI片段亚克隆进pBIIKS(+)-克隆59的HindIII/BamHI位点而得。所得质粒pBIIKS(+)-克隆59-2携带crtE、crtB、crtI和crtY基因的完全ORF，应产生β-胡萝卜素。pLyco是通过由质粒pBIIKS(+)-克隆59-2缺失编码crtY基因的约一半(N末端)的KpnI/KpnI片段而得。因此用pLyco转化的E.Coli，因而带有截断的非功能性crtY基因，应产生蕃茄红素，即β-胡萝卜素前体。将含crtE、crtB、crtI，和大部分crtY基因的pBIIKS(+)-克隆59-2的AscI-SpeI片段，与含CrtZ基因和构成上述截断的crtY基因成一完整基因的其余顺序的克隆6a的AscI/XbaI片段相连接而构建pZea4。因此pZea4因而含有玉米黄质生物合成途径的所有5种ORF。因此用该质粒转化的E.Coli细胞应产生玉米黄质。为检测类胡萝卜素产生，将转化体于振荡烧瓶中生长43小时。然后按方法一节所述进行类胡萝卜素分析。图16汇集上述质粒的构造。
正如所预期的，携带pLyco的E.Coli细胞产生蕃茄红质，携代pBIIKS(+)-克隆50-2的细胞产生β-胡萝卜素(所有E.9-Z，13-Z)，而有pZea4构建体的细胞则产生玉米黄质。这证实我们已克隆了所有用于合成玉米黄质或其前体(八氢蕃茄红素、蕃茄红素、β-胡萝卜素)的黄杆菌属R1534种的全部必需基因。所获产物水平如表1所示。  质粒       宿主      玉米黄质    β-胡萝卜素    蕃茄红素pLyco    E.coli JM109     ND          ND           0.05％pBIIKS(+)     ″          ND          0.03％       ND-clone59-2pZea4         ″          0.033％     0.0009％     ND表1：携带质粒pLyco，pBIIKS(+)-克隆59-2和pZea4的E.coli转化体，振荡烧瓶中培养43小时后的类胡萝卜素含量。该值表示类胡萝卜素占干细胞总质量(200ml)的百分数，ND＝未检测出。
实施例5B.Subtilis中类胡萝卜素的产生
于B.Subtilis中产生类胡萝卜素的第1方法中，我们将黄杆菌属细菌的类胡萝卜素生物合成基因克隆进革兰氏(+)/(-)穿梭载体p602/22[一种p602/20的衍生物，是LeGrice，S.F.J.前述文献]。最终构建体p602-CARVEG-E的组装是从pZea4(缺失654-3028)的PvuII-AvrII片段，和来自质粒pBIIKS(+)-克隆6a的AvrII-EcoRI片段连接于载体p602/22的EcoRI和ScaI位点的三重连接开始的。质粒pZea4(缺失654-3028)是用SacI和EspI消化pZea4而得。凸端和凹端均用Klenow酶切成平头并再连接。构建体pZea4(缺失654-3028)缺乏crtE基因上游的大部分顺序，该部分是去物合成类胡萝卜素非必需的。质粒p602-CAR有黄杆菌属R1534基因组DNA的约6.7kb，除含所有5种类胡萝卜素基因(约4.9kb)外，还含有位于crt2转译起始位点上游的1.2kb基因组DNA，和crtE转录起始位点上游的200bp。crtZ、crtY、crtI和crtB基因克隆进PN25/O启动子(一种可调节的E.coli噬菌体T5启动子衍生物)下游，它与lac操纵子元件融合(该元件在B.subtilis是有功能的，见LeGrice，S.F.J.前述文献)。很明显，p602CAR构建体中，PN25/O启动子和crtZ转录起始位点之间大于1200bp的这段距离并不是最佳的，将在下面步骤中加以改善。p602 CAR构造简图示于图17。为确保crtE基因在B.subtilis中转录，将VegI启动子[Moran等人，Mol.Gen.Genet.186，339-346(1982)；LeGrice等人，Mol.Gen.Genet.204，229-236(1986)]引入该基因上游，得到质粒构建体p602-CARVEG-E。该VegI启动子，来源于LeGrice等人前述文献所介绍的Veg启动子复合物的SiteI，表现出在E.coli中具有功能[Moran等人前述文献]。为获得该新构建体，用SalI和HindIII消化质粒p602 CAR，将含完全crtE基因和大部分crtB编码顺序的片段亚克隆进质粒p205的XhoI和HindIII位点。所得质粒p205 CAR在PvegI启动子的下游含有该crtE基因。为再构建黄杆菌属细菌类胡萝卜素基因簇，分离出下述三个片段：p205 CAR的PmeI/HindIII片段，p602 CAR的HincII/XbaI片段和EcoRI/HindIII片段，并连接到pBluescriptIIKS(+)的EcoRI和XbaI位点，结果得到构建体pBIIKS(+)-CARVEG-E。分离出该后一质粒的EcoRI-XbaI片段，连接到p602/22的EcoRI和XbaI位点，得到相似于p602 CAR的，但含有PvegI启动子驱动的crtE基因的质粒。得到质粒p602 CARVEG-E的所有构建步骤汇总于图18。用该质粒转化的E.coli TG1细胞合成玉米黄质。相反，用同样物建体转化的B.subtilis菌株1012不产生任何类胡萝卜素。对几种玉米黄质阴性B.subtilis转化子的分析均发现，该转化质粒已发生严重缺失现象。该不稳定性可能是由于该构建体过大所致。
为了获得在B.subtilis中稳定的质粒，将类胡萝卜素基因克隆进Haima等人前述文献中构建的革兰氏(+)/(-)穿梭载体pHP13。所述稳定性问题设想可通过下述方法得以消除：1)减小携带类胡萝卜素基因的克隆插入段的大小，2)倒转crtE基因取向，这样为表达所有五种基因只需1个启动子，而不像前述构建体一样需要2个。而且，从用此种携带合成黄杆菌属细菌类胡萝卜素操纵子(SECO)的质粒转化的细胞产生类胡萝卜素的能力，可判断一种设计方案是否可行。图19归纳了所有构建步骤，及为得到最终构建体pHP13-2PN-ZYIB-EINV所制造的中间质粒。简言之，为便于下述构建法，将以引物CS1和CS2获得的合成接头，引入穿梭载体pHP13的HindIII和EcoRI位点之间，制成pHP13-2载体。将p602 CARVEG-E的AflII-XbaI片段亚克隆进pHP13-2的AflII和XbaI位点构建中间构建体pHP13-2CARVEG-E。下一步为倒转crtE基因，即除去含原始crtE基因的XbaI和AvrII片段，而用质粒pBIIKS(+)-PCRRBScrtE的XbaI-AvrII片段替代。所得质粒称之为pHP13-2CARZYIB-EINV，代表具功能性SFCO的第一构建体。上面提到的中间构建体pBIIKS(+)-PCRRBScrtE，通过用SpeI和SmaI消化以引物#100和#101产生的PCR产物，并连接于pBluescriptIIKS(+)的SpeI和SmaI位点而得。为使得crtZ转录起始位靠近启动子PN25/O，制成三连接体，即连接pHP13-2CARZYIB-EINV的BamHI-SalI片段(含5种类胡萝卜素基因的4种)，含PN25/O启动子的同样质粒的BamHI-EcoRI片段，和pBIIKS(+)-PCRRBScrtZ的EcoRI-SalI片段(含由合成RBS领先的大部分crtZ基因)。上述质粒pBIIKS(+)-PCRRBScrtZ，通过用EcoRI和SalI消化以引物#104和#105扩增的PCR产物，并连接于pBluescript-IISK(+)的EcoRI和SalI位点而成。所得载体pHP13-2PN25ZYIB-EINV中，SFCO由噬菌体T5启动子PN25/O驱动，应当为组成型表达，因为该构建体中不存在功能性Lac阻遏物[Peschke and Beuk，J.Mol.Biol.186，547-555(1985)]。用该构建体转化的E.coli TG1细胞产生玉米黄质。但若该质粒转化进B.subtilis中，则检测不到有类胡萝卜素产生。将这些转化子，进行质粒分析表明，存在引起不稳定问题的严重缺失现象，这和前面所研究的质粒相似。
实施例6
染色体整合构建体
由于从前面的构建体所观察到的不稳定现象，我们决定使用整合/表达载体pXI12，将黄杆菌属细菌的类胡萝卜素生物合成基因整合入B.subtilis的基因组。整合进B.subtilis基因组的果聚糖-蔗糖酶基因(sacB)后，该载体可使整个操纵子得到组成型表达。该组成型表达由VegI启动子所驱动，并引起中等水平表达。含有合成黄杆菌属类胡萝卜素操纵子(SFCO)的质粒pXI12-ZYIB-EINV4的构建过程如下：将pBIISK(+)-PCRRBScrtZ的NdeI-HincII片段克隆进pXI12的NdeI和SmaI位点，所得质粒称之为pXI12-PCRcrtZ。接着，将pHP13-2PN25ZYIB-EINV的BstEII-PmeI片段连接到pXI12-PCRcrtZ的BstEII-PmeI片段上(见图20)。借助Campbell型反应或借助交互重组，可使以所得构建体pXI12-ZYIB-EINV4转化的B.Su-btilis整合CAR基因。进一步分析含有类胡萝卜素生物合成基因交互重组进果聚糖-蔗糖酶基因的一种转化子BS1012∷ZYIB-EINV4(图21)。即使该菌株不合成类胡萝卜素，由Northern印迹分析RNA表明，当用探针A杂交时，存在5.4kb和4.2kb特异性多顺反子mPNA(见图21，B组)。较大的RNA有所预料的信息尺寸，而较短mRNA的来源不清楚。该Northern印迹与探针B杂交后仅检测出大的mRNA片段，表明在crtB基因末端转录的提前中止。该位置中止信号的存在说明了问题，因为黄杆菌属R1534种基因组的原始操纵子编排方式中，crtE和crtB基因互相面对面排列。借助此种构形，crtB 5′端的转录中止信号起了作用，以避免合成反意义链RNA(该链可干扰crtE基因mRNA的转录)。因为相对于野生型来说，该区域已经大大改变，构成该中止子的顺序也可能改变使其成为有“漏缝”的中止子。使用抗类胡萝卜素途径中，不同crt酶的抗血清进行的western印迹分析表明，核糖体结合位点可能与胡萝卜素合成失效有关。引入的5种基因中，只有crtZ的基因产物β-胡萝卜素羟化酶可检测出。这是由RBS位点领先的，源自pXI12载体，已知在B.subtilis具有功能的唯一基因。McLaughlin等人[J.Bid.Chem.256，11283-11291(1981)]已经提出，mRNA的Shine-Dalgarno顺序[Shineand Dalagarno前述文献]和16S rRNA之间的碱基对相互作用(使核糖体选择适当的起始顺序)，在革兰氏阳性生物体(B.Subtilis)中，比在革兰氏阴性生物体(E.coli)中，要稳定得多。为获得高稳定性复合物，将各基因crtY、crtI、crtB和crtE前面的，革兰氏阴性黄杆菌属细菌的RBS位点，用按互补于B.Subtilis 16S rRNA 3′端设计的合成RBS(见表2)交换。该交换应使得不同类胡萝卜素基因在B.Subtilis中能有效地引发转译。该策略被选择用来构建含汇集于图20中的所有四个变化位点的质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C。为有利于在pBluescriptIIKS(+)中进一步的克隆步骤，使用用引物MUT7和MUT8获得的接头引入另外的限制位点，于所述载体的SalI和HindIII位点之间克隆。所得新的构建体pBIIKS(+)-LINKER78有下述限制位点引入：AvrII、pmlI、MulI、MunI、BamHI和SphI。被选用的建立不同类胡萝卜素基因上游的合成RBS的一般方法，是使用PCR与诱变相组合的技术，其中，使用携带经修饰的RBS位点的指定的引物，或使用带有该顺序的合成接头，再构建基因。通过用引物MUT2和MUT6扩增crtI基因，使crtI和crtB基因前面的RBS重建，该方法包括适当改变的RBS位点。获得的PCR-I片段用MunI和BamHI消化，并连接于pBIIKS(+)-LINKER78的MunI和BamHI位点。所得的中间构建体被命名为pBIIKS(+)-LINKER78PCRI。crtB基因前面的RBS的重建是使用携带改变了的crtB上游的RBS位点的引物MUT3，和引物CAR17所获得的小PCR片段来完成的。用BamHI和HindIII消化该扩增的PCR-F片段，并亚克隆进pBIIKS(+)-LINKER78的BamHI和HindIII位点，得到构建体pBIIKS(+)-LINKER78PCRF。用BamHI和SapI切下pBIIKS(+)-LINKER78PCRI的PCR-I片段，连接到pBIIKS(+)-LINKER78PCRF的BamHI和SapI位点。所得质粒pBIIKS(+)-LINKER78PCRFI带有与PCR-F片段融合的PCR-I片段。将该构建体用SalI和PmlI切割，并引入由引物MUT9和MUT10退火所获得的合成接头。该后一步骤有利于将要进行的上述构建体中原始黄杆黄属RBS的替换。所得质粒命名为pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIA。crtY和crtI基因前面的合成RBS的组装是使用MUT1和MUT5引物通过PCR反应进行的。该扩增的片段PCR-G被载成平头末端，然后克隆进pUC18的SmaI位点，得到构建体pUC18-PCR-G。接着于PCR-A和PCR-I片段之间克隆PCR-G片段。为此目的，用MunI和PmlI消化使该PCR-G从pUC18-PCR-G中分离出来，并连接到pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIA的MunI和PmlI位点。该构建体包含所有4个片段，PCR-F、PCR-I、PCR-G和PCR-A，相互紧挨着组装起来，并含4个人工RBS位点中的3个(crtY、crtI、crtB)。基因crtY、crtI和crtB基因前面的黄杆菌属RBS由合成的RBS替换，是通过用质粒pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIGA的HindIII-SalI片段代替质粒pXI12-ZYIB-EINV4的HindIII-SalI片段来完成的。该所得质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBSC随后转化入E.coli TG1细胞和B.Subt-ilis 1012细胞。用这些细胞能产生玉米黄质，证实其中PCR扩增的基因具有功能。获得的该B.Subtilis菌株命名为BS1012∷SFCO1。被交换的最后的黄杆菌属RBS是crtE基因前面RBS。使用以引物MUT11和MUT12获得的接头来进行。从pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS中用NdeI和SpeI除去野生型RBS，并将上面的接头插入。构建体pXI12-ZYIBEINV4MUTRBS2C中所有黄杆菌属RBS构由具有共有顺序AAAGGAGG-7-8N-ATG的合成RBS代替(见表2)。用该构建体转化的E.coliTG1细胞表明，该最后一种RBS替换，不与产生玉米黄质的能力相干扰。
          表2mRNA                      核苷酸顺序crtZ                      AAAGGAGGGUUUCAUAUGAGCcrtY                      AAAGGAGGACACGUGAUGAGCcrtI                      AAAGGAGGCAAUUGAGAUGAGUcrtB                      AAAGGAGGAUCCAAUCAUGACCcrtE                      AAAGGAGGGUUUCUUAUGACGB.subtilis      16S rRNA 3′-UCUUUCCUCCACUAGE.coli          16S rRNA 3′-AUUCCUCCACUAG表2：构建体pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C，构建体pXI12-ZYIB-
 EINV4MUTRBS2CCAT，和构建体pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO
 的合成核糖体结合位点的核苷酸顺序。各类胡萝卜素基因前面
 的、互补于B.Subtilis的16S rRNA 3′端的Shine-Dalgarno
 顺序之核苷酸，用粗体字表示。E.coli的16S rRNA 3′端也列
 入，用以比较。底下划线的AUG是所述基因的转译起始位点。通过测序分析可以确证含所引入的合成RBS的所有区域。用质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2转化B.subtilis细胞，挑选含有通过交互重组，整合入染色体果聚糖-蔗糖酶基因的SFCO的转化子。该菌株命名为BS1012∷SFCO2。对该菌株类胡萝卜素的产生进行分析表明，其产生的玉米黄质的量，是以得到该B.subtilis转化子所用质粒去转化E.coli所产生之玉米黄质的约40％。将BS1012∷SFCO1菌株与其E.coli同类菌株进行比较，观察到相似情况(30％)。虽然E.coli细胞含的类胡萝卡素基因多18倍，而产生的类胡萝卜素量仅高2-3倍。更为悬殊的是携带pZea4构建体约200拷贝的E.coli，和携带质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C 18拷贝的E.coli之间，所观察到的类胡萝卜素含量的差异。前一转化子产生的玉米黄质比后一转化子要多48倍。该差异看来并不仅仅是由于该两转化子中存在的类胡萝卜素生物合成基因相差约11倍造成的，或许还由于所构建的SFCO的次优化效能所致，该SFCO中，野生型产菌杆属操纵子的重叠基因被分出而引入合成RBS。这可能引起重建合成操纵子的较低转译效率(例如，由于消除了野生型操纵子存在的假定转译双倍效应(put-ative translational coupling effect)所致)。
为提高类胡萝卜素产量，制得两种新的构建体，pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO和pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT，在SFCO整合入染色体果聚糖-蔗糖酶位点后，产生带有可扩增结构[如Janniere等人，在Gene 40，47-55(1985)中所述]的菌株。质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO。于1995年5月25保藏于DSM-Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und ZellkulturenGmbH(Germany)，保藏号DSM10013。该可扩增结构，当与抗性标志(例如氯霉素、新霉素、四环素)连接时，可每条染色体扩增20-50拷贝。该可扩增结构由SFCO，抗性基因，和pXI12顺序(由Sac-B3′基因直接重复侧接)组成(见图22)。带增加SFCO拷贝数的菌株，现可借助挑选抗生素抗性水平提高的转化子而获得。为构建质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO用PstI和SmaI从质粒pBEST501中分离出新霉素抗性基因，亚克隆进pUC18载体的PstI和EcoO1091位点。所得构建体称之为pUC18-Neo。为得到最终构建体，用含新霉素抗性基因的pUC18-Neo的SmaI-AatII片段替换质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C的PmeI-AatII片段。质粒pXI12-ZYIB-EINV4M-UTRBS2CCAT按下面方法获得：借助使用引物对Cat3和Cat4的PCR反应分离出pC194中的氯霉素抗性基因。用EcoRI和AatII消化该片段，并亚克隆进pUC18的EcoRI和AatII位点。所得质粒称之为pUC18-CAT。用携带氯霉素抗性基因的pUC18-CAT的EcoRI-AatII片段替换pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C的PmeI-AatII片段，获得最终载体。图23综述了获得上述构建体的不同步骤。将该二质粒转化入B.Subtilis菌株1012，挑选出从Campbell型整合得到的转化子。挑选出BC1012∷SFCONEO1和BS1012∷SFCOCAT1两个菌株进行进一步扩增。将该两菌株的各个菌落，如方法一节所述在不同抗生素浓度中，各自分别生长扩增。对携带cat基因的菌株来说，氯霉素浓度为60、80、120和150μg/ml。对携带neo基因的菌株来说，新霉素浓度为160和180μg/ml。两菌株中，仅获得具SFCO最小扩增的菌株。而从BS1012∷SFCONEO1菌株产生的子代菌株中，对较高新霉素浓度的抗性与染色体中SFCO数增加有关，并且由这些细胞产生较高水平类胡萝卜素。从BS1012∷SFCOCAT1菌株获得的子代菌株都得到不同结果。在这些菌株中，将浓高提高到多层150μg氯霉素/ml，正如所预期的，在染色体中得到较高数量SFCO拷贝。
实施例7构建含CrtW的质粒并用于生产类胡萝卜素
基于聚合酶链反应的基因合成：编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β-4-加氧酶的人工CrtW基因的核苷酸顺序，使用GCGWisconsin顺序分析软件包(Version 8.0，Genetics ComputerGroup，Madison，WI，USA)的逆转译程序，和E.coli密码子频度参考表(由Bach Translate Program提供)，来逆转译Misawa(1995)提出的氨基酸顺序而获得。该由726个核苷酸组成的合成基因基本上按(Ye，1992)所述方法构建。合成所需的12个寡核苷酸(crtW1-crtW12)顺序如图25所示。简言之，设计具有15-20个碱基的短重叠的长的寡核苷酸，用作寡核苷酸延伸的引物。四次循环之后，应存在几个全长变基因拷贝，然后通过两末端寡核酸crtW15和crtW26扩增。该两短寡核苷酸的顺序是正向引物(forward primer)crtW15(5′-TATATCTAGAcatatgTCCGGTCGTAAA CCGG-3′)和反向引物(rev-erse primer)crtW26(5′-TATAgaattccacgtg TCA AGCACGACCACCGG-TTTTACG-3)，其中与DNA模板匹配的顺序由下面划线表示。小写字母表示为以后克隆进pALTER-EX2表达载体而引入的限制位点(对于正向引物为NdeI、对于反向引物为EcoRI和PmlI)。
聚合酶链反应：将所有12个长寡核苷酸(crtW1-crtW12；各为7nM)和两个末端引物(crtW15和crtW26；各为0.1mM)混合在一起，并加入含ExpandTM High Fidelity聚合酶(Boehringer，Mann-heim)(3.5单位)，和dNTP(所有4种，各100mM)的PCR反应混合物中。按下述模式，该PCR反应进行30次循环：94℃，1分钟/50℃，2分钟/72℃，3分钟。于1％琼脂糖凝胶上分离该PCR反应产物，切下约700bp的谱带，使用玻璃珠法提纯(Geneclean Kit，Bio101，Vis-ta，CA，USA)。然后将该片段克隆进质粒pUC18的SmaI位点(使用Sure-Clone Kit，Pharmacia，Uppsala，Sweden)。采用Sequena-se Kit Version 1.0(United States Biochemical，Cleveland，OH，USA)测序来证实所生成的crtW合成基因顺序。发现用该法构建的crtW基因包含很少错误，采用定点诱变法将其校正。
构建质粒：质粒pBIIKS(+)-CARVEG-E(见实施例5，图26)含克隆进携带B.subtilis Veg启动子[Legrice，1986，#806]位点I的修饰pBluescriptII KS(+)载体(Stratagene，La，Jolla.USA)的革兰氏阴性黄杆菌属细菌菌株R1534野生型(ATCC21588)[Pasamont-es，1995#732]的类胡萝卜素生物合成基因(crtE、crtB、crtY、crtI和crtZ)。该组成型启动子已表明在E.coli中具有功能。携带质粒pBIIKS(+)-CARVEG-E的E.coli菌株TG1的转化子合成玉米黄质。通过克隆合成crtW基因的NdeI-EcoRI限制片段入质粒pALT-ER-Ex2(Promega，Madison，WI)的相应位点，构建质粒pALTER-Ex2-crtW。质粒pALTER-Ex2是具有复制p15a起始点的低拷贝质粒该起始点使其与colE1载体维持在同一宿主中。克隆pALTER-Ex2-crtW的HindIII-PmlI片段入HindIII和切成平头末端的MluI位点(由Klenow酸补平反应获得，如Sambrook所述(1989#505))，而获得质粒pBIIKS-crtEBIYZW(图26)。通过缺失285bp NSiI-NSiI片段而使crtZ基因失活，接着进行补平反应中并再连接，得到质粒pB-IIKS-crtEBIY[ΔZ]W。携带非功能性crtW和crtZ的质粒pBIIKScr-tEBIY[ΔZW]，通过用NdeI和HpaI消化质粒pBIIKS-crtEBIY[ΔZ]W，在用Klenow酶在该位点进行补平反应后，进行该质粒自身再连接而构建成。用该质粒转化的E.coli，由于β-胡萝卜素积聚而呈桔黄色。正如上面所介绍的一样，质粒pBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]带有通过缺失质粒pBIIKS-crtEBIYZW的NdeI-HpaI片段所获得的被载断的crtW基因。质粒pALTER-Ex2-crtEBIY[ΔZW]和pALTER-Ex2-crtEBIYZ[ΔW]，通过分别从pBIIKS-crtEBIY[ΔZW]和pBII-KS-crtEBIYZ[ΔW]中分离出BamHI-XbaI片段，并将其克隆入pAL-TER-Ex2的BamHI和XbaI位点而获得。质粒pBIIKS-crtW是通过用NsiI和SacI消化pBIIKS-crtEBIYZW，并在用Klenow酶消除DNA悬垂物之后使质粒自身再连接而获得。图27汇集了本文中所用的所有质粒的相关插入段。
类胡萝卜素分析：在补充有抗生素(氨苄青霉素100μg/ml，四环素12.5μg/ml)的Luria液体培养基中，将携带有不同质粒构建体的E.coli TG-1转化子于振荡烧瓶中，在37℃，220rpm振荡条件下生长20小时。用丙酮从细胞中提取出类胡萝卜素。真空除去丙酮，残渣再溶解于甲苯中。在Hewlett-Parkard Series 1050仪器上，将该有色溶液进行高效液体色谱(HPLC)分析。类胡萝卜素于硅柱Nucleosil Si-100，200x4mm，3m上分离开。溶液体系包括两种溶剂：己烷(A)和己烷/THF 1∶1(B)。在15分钟内施用13-50％(B)的线性梯度液洗脱。流速为1.5ml/min。借助光二极管系统检测器于450nm波长处检测峰值。各类胡萝卜素，通过将其吸收光谱和典型保留时间，与化学纯各种类胡萝卜素的标准样品进行比较而鉴定出，所述标准样品由化学合成，并经NMR，MS和UV光谱表明其特征。将用除携代黄杆菌属细菌菌株R1534的类胡萝卜素生物合成基因外，还带有产碱杆菌PC-1[Misawa，1995#670]编码β-胡萝卜素酮酶的crtW基因的质粒pBIIKS-crtEBIYZW转化的E.coli细胞中分离出的色素，进行HPLC分析，得到下述经鉴定为β-隐黄质、虾黄素、阿东黄质和玉米黄质的各主要峰，该鉴定根据保留时间、及其吸收光谱与化学纯类胡萝卜素标准样品相比较而得。携带pB-IIKS-crtEBIYZW的E.coli转化子中积聚的色素的相对量(面积百分比)示于表3中[其中“CRX”为隐黄质；“ASX”为虾黄素；“ADX”为阿东黄质；“ZXN”为玉米黄质；“ECM”为海胆烯酮；“MECH”为3-羟海胆烯酮“CXN”为鸡油菌黄质]。所有鉴定出的类胡萝卜素峰总面积∑被定义为100％。表3中所列数字代表每种转化子的4份独立培养物之平均值。携带同样基因在两种质粒上，即pBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]和pALTER-Ex2-crtW上的E.coli转化子，与前面结果相比，表现出阿东黄质显著较低，并完全无虾黄素色素(表3)，而玉米黄质相对量(％)却增加了。与在同样质粒(pBIIKS-crtEBI-YZΔW)上携带所有crt基因的转化子相比，海胆烯酮，羟基海胆烯酮和鸡油菌黄质水平保持不变。质粒pBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]是携带黄杆菌属细菌菌株R1534的功能性基因crtE、crtB、crtY、crtI、cryZ，并携带被截断的，无功能的crtW基因的高拷贝质粒，而crtW基因的功能性拷贝位于低拷贝质粒pALTER-Ex2-crtW上。为分析与crtZ相对而言，crtW基因的超表达效应，将E.coli细胞用携带crtW基因的高拷贝质粒pBIIKS-crtW和编码黄杆菌属质粒pBIIKS-crt基因的低拷贝构建体pALIER-Ex2-crtEBIYX[ΔW]共转化。用HPLC分析这些转化子的色素产物，检测到存在有β-胡萝卜素、隐黄质、虾黄素、阿东黄质、玉米黄质、3-羟海胆烯酮、和痕量海胆烯酮和鸡油菌黄质(表3)。
由带有crtW基因的低拷贝质粒pALTER-Ex2-crtW和带有crtE、crtB、crtY和crtI基因的高拷贝质粒pBIIKS-crtEBIY[ΔZW]所得到的转化子仅表达少量鸡油菌黄质(6％)，但有高水平海胆烯酮(94％)，而在高拷贝质粒pBIIKS-crtW上携代crtW基因，且在低拷贝质粒构建体pALTER-Ex2-crtEBIY[ΔZW]上携带其它crt基因的细胞分别产生78.6％的海胆烯酮和21.4％的鸡油菌黄质(表3)。
                     表3
  质粒             CRX   ASX   ADX   ZXN   ECH   HECH   CXNpBIIKS-crtEBIYZW       1.1   2.0   44.2  52.4  ＜1   ＜1    ＜1pBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]+pALTER-Ex2-crtW       2.2   -     25.4  72.4  ＜1   ＜1    ＜1pBIIKS-crtEBIY[ΔZ]W   -     -     -     -     66.5  -      33.5pBIIKS-crtEBIY[ΔZW]   -     -     -     -     94    -      6+pBIIKS-crtW

Claims (35)

1、一种含有选自下组一种或多种DNA顺序的DNA顺序：
a)编码黄杆菌属R1534种GGPP合成酶的DNA顺序(crtE)，或与其基本上同源的DNA顺序；
b)编码黄杆菌属R1534种八氢蕃茄红素前体合成酶的DNA顺序(crtB)，或与其基本上同源的DNA顺序；
c)编码黄杆菌属R1534种八氢蕃茄红素脱氢酶的DNA顺序(crtI)，或与其基本上同源的DNA顺序；
d)编码黄杆菌属R1534种蕃茄红素环化酶的DNA顺序(crtY)，或与其基本上同源的DNA顺序；
e)编码黄杆菌属R1534种β-胡萝卜素羟化酶的DNA顺序(crtZ)，或与其基本上同源的DNA顺序。
2、权利要求1的DNA顺序，含下述DNA顺序：
a)编码黄杆菌属R1534种GGPP合成酶的DNA顺序(crtE)或与其基本上同源的DNA顺序；和
b)编码黄杆菌属R1534种八氢蕃茄红素前体合成酶的DNA顺序(crtB)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
c)编码黄杆菌属R1534种八氢蕃茄红素脱氢酶的DNA顺序(crtI)，或与其基本上同源的DNA顺序。
3、权利要求1的DNA顺序，包含下述DNA顺序：
a)编码黄杆菌属R1534种的GGPP合成酶的DNA顺序(crtE)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
b)编码黄杆菌属R1534种八氢蕃茄红素前体合成酶的DNA顺序(crtB)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
c)编码黄杆菌属R1534种八氢蕃茄红素脱氢酶的DNA顺序(crtI)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
d)编码黄杆菌属R1534种蕃茄红素环化酶的DNA顺序(crtY)，或与其基本上同源的DNA顺序；
4、权利要求1的DNA顺序，包含下述DNA顺序：
a)编码黄杆菌属R1534种的GGPP合成酶的DNA顺序(crtE)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
b)编码黄杆菌属R1534种八氢蕃茄红素前体合成酶的DNA顺序(crtB)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
c)编码黄杆菌属R1534种八氢蕃茄红素脱氢酶的DNA顺序(crtI)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
d)编码黄杆菌属R1534种的蕃茄红素环化酶的DNA顺序(crtY)，或与其基本上同源的DNA顺序；和
e)编码黄杆菌属R1534种β-胡萝卜素羟化酶的DNA顺序(crtZ)，或与其基本上同源的DNA顺序。
5、权利要求4的DNA顺序，其中除含有权利要求4指定的DNA顺序外，还含有编码产碱杆菌菌株PC-1β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA顺序(crtW)，或与其基本上同源的顺序。
6、如权利要求3的DNA顺序，除含有权利要求3指定的DNA顺序外，还含有编码产碱杆菌菌株PC-1β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA顺序(crtW)，或与其基本上同源的DNA顺序。
7、含权利要求1DNA顺序的载体。
8、含权利要求2DNA顺序的载体。
9、含权利要求3DNA顺序的载体。
10、含权利要求4DNA顺序的载体。
11、含权利要求5DNA顺序的载体。
12、含权利要求6DNA顺序的载体。
13、由权利要求1DNA顺序或由权利要求7载体转化的细胞。
14、由权利要求2DNA顺序或由权利要求8载体转化的细胞。
15、由权利要求3DNA顺序或由权利要求9载体转化的细胞。
16、由权利要求4DNA顺序，或由权利要求10载体转化的细胞。
17、由权利要求5DNA顺序或由权利要求11载体转化的细胞。
18、由权利要求6DNA顺序或由权利要求12载体转化的细胞。
19、由权利要求4DNA顺序，或由权利要求10载体和编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的第二DNA顺序(crtW)或与其基本上同源的DNA顺序，或由含编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA顺序(crtW)或与其基本上同源的DNA顺序的第二载体转化的细胞。
20、由权利要求3DNA顺序，或由权利要求9载体和编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的第二DNA顺序(crtW)或与其基本上同源的DNA顺序，或由含编码产碱杆菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4加氧酶的DNA顺序(crtW)或与其基本上同源的DNA顺序的第二载体转化的细胞。
21、权利要求13-20任意一项的细胞，其中该细胞为原核细胞。
22、权利要求21的细胞，该细胞是大肠杆菌。
23、权利要求21的细胞，该细胞为芽孢杆菌属菌株。
24、权利要求13-20任意一项的细胞，该细胞为真核细胞。
25、权利要求24的细胞，该细胞为酵母细胞。
26、权利要求24的细胞，该细胞为真菌细胞。
27、一种制备所需类胡萝卜素或其混合物的方法，该方法是在适宜的培养条件下，培养权利要求13-26任意一项的细胞，并从该细胞或培养基中分离出所需类胡萝卜素或其混合物，如果只有一种类胡萝卜素是所需的，则采用本领域已知方法，将其从可能存在的其它类胡萝卜素中分离出来。
28、权利要求27的方法，通过培养权利要求14的细胞制备蕃茄红素。
29、权利要求27的方法，通过培养权利要求15的细胞制备β-胡萝卜素。
30、权利要求27的方法，通过培养权利要求18或20的细胞，制备海胆烯酮。
31、权利要求27的方法，通过培养权利要求18的细胞，制备鸡油菌黄质。
32、权利要求27的方法，通过培养权利要求17或19的细胞，制备玉米黄质。
33、权利要求27的方法，通过培养权利要求17或19的细胞，制备阿东黄质。
34、权利要求27的方法，通过培养权利要求17的细胞，制备虾黄素。
35、一种制备食品或饲料组合物的方法，其特征在于将经权利要求27-34任意一项的方法所得类胡萝卜素或其混合物，加入食品或饲料中。
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