CN1325648C - 改进的类胡萝卜素发酵生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及与类胡萝卜素生产相关的DNA序列;含有这类DNA序列的载体;用这类DNA序列或者载体转化的原核或者真核的宿主细胞;以及在适宜的条件下培养这类细胞以制备类胡萝卜素或从这类细胞或者培养物中分离单一类胡萝卜素并应用于食品和饲料工业的方法。
Description
已经描述了超过600种来源于产胡萝卜素生物的不同类胡萝卜素,这类生物发现于细菌,酵母,真菌和植物中。目前只有其中的两种,β-胡萝卜素和虾青素已利用微生物实现了商品化生产并用于食品和饲料工业。β-胡萝卜素从藻类中获取,虾青素用经典突变方法产生的Pfaffia菌株生产。然而Pfaffia中的发酵有发酵周期长的缺点同时从藻类中的回收非常烦琐。因此需要发展更适于工业应用的生产系统,例如可控产生更高的效价和/或缩短发酵时间。在WO91/13078和EP393690中已分别描述了使用来自于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)和噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的生物合成基因的两个这种系统。此外,克隆了来自于海洋细菌橙黄土壤杆菌(Agrobacteriumaurantiacum)和产碱菌(Alcaligenes)菌株PC-1(crt W)[Misawa,1995,生化和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Com.)
209,867-876][Misawa,1995,细菌学杂志,(J.Bacteriology)
177,6575-6584]和来自于绿藻红球虫(Haemaococcus pluvialis)(bkt)[Lotan,1995,欧洲生化学会联盟通讯(FEBSLetters)
364,125-128][Kajiwara,1995,植物分子生物学](Plant Mol.Biol.)
29,343-352]的三个β-胡萝卜素酮酶(β-胡萝卜素β-4-加氧酶)基因。带有草生欧文氏菌[Hundle,1994,MGG
245,406-416]或者噬夏孢欧文氏菌的产胡萝卜素基因(crtE,crtB,crtY和crtI)且互补于橙黄土壤杆菌[Misawa,1995]的crtW基因或互补于红球虫[Lotan,1995][Kajiwara,1995]的bkt基因的E.coli(大肠杆菌)产生了裸藻酮(β,β-胡萝卜素-4,4′-二酮)的富积,它由β-胡萝卜素通过中间物海胆酮(β,β-胡萝卜素-4-酮)转化生成。把上述基因(crtW或bkt)引入E.coli(大肠杆菌)细胞(除了含有上述类胡萝卜素生物合成基因外,还有噬夏孢欧文氏菌[Kajiwara,1995][Misawa,1995]的crtZ基因),两种情形都导致虾青素(3,3′-二羟-β,β-胡萝卜素-4,4′-二酮)的富积。用bkt基因获得的结果,同其他一些人所作的观察相反[Lotan,1995],他们使用相同的实验方案,但把红球虫的bkt基因引入合成玉米黄质(β,β-胡萝卜素-3,3′二醇)的大肠杆菌(E.coli)宿主(含有与上述噬夏孢欧文氏菌菌株为近亲的草生欧文氏菌的类胡萝卜素生物合成基因),没有观察到虾青素的产生。
由于对更加优化工业应用发酵系统的持续需要,因此本发明首先的一个目标是提供一个工艺,通过在合适的培养条件下培养用一个含有下面DNA顺序的DNA序列转化的细胞制备裸藻酮(β,β-胡萝卜素-4,4′-二酮):
a)一个编码黄杆菌R1534(Flavobacterium SP.R1534)的GGPP合成酶的DNA序列(crtE)或者基本上同源的一个DNA序列;
b)一个编码黄杆R1534的前八氢番茄红素合成酶的DNA序列(crtB)或者基本上同源的一个DNA序列;
c)一个编码黄杆R1534的八氢番茄红素脱氢酶的DNA序列(crtI)或者基本上同源的一个DNA序列;
d)一个编码黄杆R1534的番茄红素环化酶的DNA序列(crtY)或者基本上同源的一个DNA序列;
e)一个编码微生物E-396(FERM BP-4283)的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA序列[crtW E396]或者基本上同源的一个DNA序列。
或一个用含a)到e)中说明的DNA序列的载体转化的细胞以及用本技术领域熟知的方法从这类细胞或培养物中分离的裸藻酮(β,β-胡萝卡素-4,4′-二酮)。
而且,本发明其次的一个目标是提供一个上述的工艺,制备阿东黄质(adonixanthin)和虾青素的混合物或单独的阿东黄质(adonixanthin)或虾青素,其特征性是除包括a)到e)中说明的DNA序列外,还有以下附加的DNA序列:
f)一个编码微生物E-396(FERM BP-4283)的β-胡萝卜素羟化酶的DNA序列[crtZ E396]或者基本上同源的一个DNA序列;
以及如上述e)中说明的DNA序列或者如下序列:
g)一个编码产碱菌PC-1株的β-胡萝卡素β4-加氧酶的DNA序列(crtW)或者基本上同源的一个DNA序列。
以及从这类细胞或培养物分离所需的阿东黄质和虾青素混合物或单独的阿东黄素或虾青素和使用本技术领域已知的方法把所需混合物或单独的类胡萝卡素与其它类胡萝卡素分开。
此外,本发明的一个目标是提供一个工艺,按首先描述的工艺制备玉米黄质,其中特征性地包括以第二种情况下f)中说明的DNA序列代替e)中说明的DNA序列,以及从细胞或培养物中分离玉米黄质和使用本技术领域已知的方法把它和其它类胡萝卡素分开。
此外,本发明的一个目标是提供一个工艺,通过在适宜培养条件下培养用包含以下异源DNA顺序的DNA序列转化的细胞生产阿东黄质(adonixanthin)。
a)一个编码微生物E-396(FERM BP-4283)的GGPP合成酶的DNA序列[crtE E396]或者基本上同源的一个DNA序列;
b)一个编码微生物E-396(FERM BP-4283)的前八氢番茄红素合成酶的DNA序列[crtB E396]或者基本上同源的一个DNA序列;
c)一个编码微生物E-396(FERM BP-4283)的八氢番茄红素脱氢酶的DNA序列[crtI E396]或者基本上同源的一个DNA序列;
d)一个编码微生物E-396(FERM BP-4283)的番茄红素环化酶的DNA序列[crtY E396]或者基本上同源的一个DNA序列;
e)一个编码微生物E-396(FERM BP-4283)的β-胡萝卡素羟化酶的DNA序列[crtZ E396]或者基本上同源的一个DNA序列;和
f)一个编码微生物E-396(FERM BP-4283)的β-胡萝卡素β4-加氧酶的DNA序列[crtW E396]或者基本上同源的一个DNA序列;
以及从细胞或培养物中分离阿东黄质(adonixanthin)和使用本技术领域已知的方法把它和其它类胡萝卡素分开。
此外,本发明的一个目标是提供一个如上所述的工艺,其特征是转化的宿主细胞是一个原核宿主细胞,例如大肠杆菌,芽胞杆菌或者黄杆菌等和一个如上所述的工艺,其特征是转化的宿主细胞是一个真核细胞,例如酵母或真菌细胞。
此外,本发明的一个目标是提供一个DNA序列,它包含一个或几个从下面组中选择的DNA序列:
a)一个编码黄杆菌R1534的GGPP合成酶的DNA序列(crtE)或者基本上同源的一个DNA序列;
b)一个编码黄杆菌R1534的前八氢番茄红素合成酶的DNA序列(crtB)或者基本上同源的一个DNA序列;
c)一个编码黄杆菌R1534的八氢番茄红素脱氢酶的DNA序列(crtI)或者基本上同源的一个DNA序列;
d)一个编码黄杆菌R1534的番茄红素环化酶的DNA序列(crtY)或者基本上同源的一个DNA序列;和
e)一个编码黄杆菌R1534的β-胡萝卡素羟化酶的DNA序列(crtZ)或者基本上同源的一个DNA序列。
本发明的再一个目标是提供一种载体,它含有这类DNA序列,优选形式是表达载体。此外本发明的一个目标是提供一种细胞,它被这类DNA序列或载体转化,优选地是原核细胞并且特别优选地是大肠杆菌或芽胞杆菌菌株。那些转化的真核细胞,优选地是酵母细胞或真菌细胞,也是本发明的一个目的。最后本发明也涉及一种工艺,通过在适宜培养条件下培养这类细胞以制备所需的类胡萝卡素或类胡萝卡素混合物和把所需的类胡萝卡素或类胡萝卡素混合物从这类细胞或培养物中分离以及当只需一种类胡萝卡素时按照本技术领域已知的方法把它从其它类胡萝卡素中分离;同时还涉及一种工艺,用以制备食品和饲料组合物,其特征是在完成这一艺后把类胡萝卡素或类胡萝卡素混合物添加入食品或饲料。
此外,本发明的一个目的是包含以下DNA序列的DNA序列:
a)一个编码黄杆菌R1534的GGPP合成酶的DNA序列(crtE)或者基本上同源的一个DNA序列;
b)一个编码黄杆菌R1534的前八氢番茄红素合成酶的DNA序列(crtB)或者基本上同源的一个DNA序列;和
c)一个编码黄杆菌R1534的八氢番茄红素脱氢酶的DNA序列(crtI)或者基本上同源的一个DNA序列。
本发明的再一个目的是提供一个包含这类DNA序列的载体,优选的形式是表达载体。此外本发明的一个目标是提供一个细胞,它被这类DNA序列或载体转化,优选地是原核细胞并且特别优选地是大肠杆菌或芽胞杆菌菌株。那些转化的真核细胞,优选地是酵母细胞或真菌细胞,也是本发明的一个目的。最后本发明也涉及一种工艺,通过在适宜培养条件下培养这类细胞以制备所需的类胡萝卡素或类胡萝卡素混合物和把所需的类胡萝卡素或类胡萝卜素混合物从这类细胞或培养物中分离以及当只需一种类胡萝卜素时按照本技术领域已知的方法把它从其它类胡萝卜素中分离,优选地是制备番茄红素的这类工艺和制备一种食品或饲料组合物的工艺,其特征是在完成这一工艺后把类胡萝卜素优选地是番茄红素或类胡萝卡素混合物,优选地是包含番茄红素的混合物添加入食品或饲料。
此外,本发明的一个目的是包含以下DNA序列的一个DNA序列:
a)一个编码黄杆菌R1534的GGPP合成酶的DNA序列(crtE)或者基本上同源的一个DNA序列;
b)一个编码黄杆菌R1534的前八氢番茄红素合成酶的DNA序列(crtB)或者基本上同源的一个DNA序列;
c)一个编码黄杆菌R1534的八氢番茄红素脱氢酶的DNA序列(crtI)或者基本上同源的一个DNA序列;和
d)一个编码黄杆菌R1534的番茄红素环化酶的DNA序列(crtY)或者基本上同源的一个DNA序列。
本发明的再一个目的是提供一个包含这类DNA序列的载体,优选地形式是表达载体。此外本发明的一个目标是提供一个细胞,它被这类DNA序列或载体转化,优选地是原核细胞并且特别优选地是大肠杆菌或芽胞杆菌菌株。那些转化的真核细胞,优选地是酵母细胞或真菌细胞,也是本发明的一个目的。最后本发明也涉及一种工艺,通过在适宜培养条件下培养这类细胞以制备所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物和把所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物从这类细胞或培养物中分离以及当只需一种类胡萝卜素时按照本技术领域可能已知的方法把它从其它类胡萝卜素中分离,优选地是制备β-胡萝卜素的这类工艺和制备一种食品或饲料复合物的工艺,其特征是在完成这一工艺后把类胡萝卜素优选地是β-胡萝卜素或类胡萝卜素混合物,优选地是包含β-胡萝卜素的混合物添加入食品或饲料中。
此外,本发明提供一个用上述包括a)到d)的DNA序列或包含该序列的载体和第二个编码产碱菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA序列(crtW)或基本上同源的一个DNA序列或者第二个包含编码产碱菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA序列或基本上同源的DNA序列的载体所转化的细胞;同时提供一种工艺,通过在适宜培养条件下培养这类细胞以制备所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物和把所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物从这类细胞或培养物中分离以及当只需一种类胡萝卜素时按照本技术领域已知的方法把它从其它类胡萝卜素β中分离,优选地是制备海胆酮的这类工艺和制备一种食品或饲料组合物的工艺,其特征是在完成这一工艺后把类胡萝卜素优选地是海胆酮或类胡萝卜素混合物,优选地是将包含海胆酮的混合物添加入食品或饲料。
此外本发明的一个目的是提供一个上述a)到d)的DNA序列和一个编码产碱菌菌株PC-1的β-胡萝卡素β4-加氧酶的DNA序列(crtW)或实质上同源的一个DNA序列以及一个包含这类DNA序列的载体,优选形式是表达载体。此外本发明的一个目的是提供一个细胞,它被这类DNA序列或载体转化,优选地是原核细胞并且特别优选地是大肠杆菌或芽胞杆菌菌株。那些转化的真核细胞,优选地是酵母细胞或真菌细胞,也是本发明的一个目的。最后本发明也涉及一种工艺,通过在适宜培养条件下培养这类细胞以制备所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物和把所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物从这类细胞或培养物中分离以及当只需一种类胡萝卜素时按照本技术领域已知的方法把它从其它类胡萝卜素中分离,特别是制备海胆酮和裸藻酮的这类工艺和制备一种食品或饲料组合物的工艺,其特征是在完成这一工艺后把类胡萝卜素,优选地是海胆酮和裸藻酮或类胡萝卜素混合物,优选地是包含海胆酮和裸藻酮的混合物添加入食品或饲料中。
此外,一个包含以下DNA顺序的DNA序列也是本发明的一个目的:
a)一个编码黄杆菌R1534的GGPP合成酶的DNA序列(crtE)或者基本上同源的一个DNA序列。
b)一个编码黄杆菌R1534的前八氢番茄红素合成酶的DNA序列(crtB)或者基本上同源的一个DNA序列。
c)一个编码黄杆菌R1534的八氢番茄红素脱氢酶的DNA序列(crtI)或者基本上同源的一个DNA序列。
d)一个编码黄杆菌R1534的番茄红素环化酶的DNA序列(crtY)或者基本上同源的一个DNA序列。
e)一个编码黄杆菌R1534的β-胡萝卜素羟化酶的DNA序列(crtZ)或者基本上同源的一个DNA序列。
此外本发明的一个目的是提供一个包含这类DNA序列的载体,优选形式是表达载体。此外本发明的一个目的是提供一个细胞,它被这类DNA序列或载体转化,优选地是原核细胞并且特别优选地是大肠杆菌或芽胞杆菌菌株。那些转化的真核细胞,优选地是酵母细胞或真菌细胞,也是本发明的一个目的。最后本发明也涉及一种工艺,通过在适宜培养条件下培养这类细胞以制备所需的类胡萝卜素或类胡萝卜混合物和把所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物从这类细胞或培养物中分离以及当只需一种类胡萝卜素时按照本技术领域已知的方法把它从其它类胡萝卜素中分离,优选地是制备玉米黄质的这类工艺和制备一种食品或饲料组合物的工艺,其特征是完成这一工艺流程后把类胡萝卜素,优选地是玉米黄质或类胡萝卜素混合物,优选地是包含玉米黄质的混合物添加入食品或饲料中。
此外一个上述的包含序列a)到e)的DNA序列和另外一个编码产碱杆菌PC-1株的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA序列或者实质上同源的一个DNA序列是本发明的目的,同时本发明提供一个含上述DNA序列的载体,优选形式是表达载体。此外本发明的一个目的是提供一个细胞,它被这类DNA序列或载体转化,优选地是原核细胞并且特别优选地是大肠杆菌或芽胞杆菌菌株。那些转化的真核细胞,优选地是酵母细胞或真菌细胞,也是本发明的一个目的物。最后本发明也涉及一种工艺,通过在适宜培养条件下培养这类细胞以制备所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物和把所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物从这类细胞或培养物中分离以及当只需一种类胡萝卜素时按照本技术领域可能已知的方法把它从其它类胡萝卜素中分离,优选地是制备玉米黄质,阿东黄质或虾青素的这类工艺和制备一种食品或饲料组合物的工艺,其特征是在完成这一工艺流程后把类胡萝卜素优选地是玉米黄质,阿东黄质或虾青素或者类胡萝卜素混合物,优选地是包含玉米黄质,阿东尼黄质或虾青素的混合物添加入食品或饲料。
此外,提供一个用上述包括顺序)a)到e)的DNA序列或包含该序列的载体和第二个编码产碱菌PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA序列(crtW)或实质上同源的一个DNA序列或者第二个包含编码产碱菌菌株PC-1的β-胡萝卜素β4-加氧酶的DNA序列或实质上同源的DNA序列的载体所转化的细胞;同时提供一种工艺,通过在适宜培养条件下培养这类细胞以制备所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物和把所需的类胡萝卜素或类胡萝卜素混合物从这类细胞或培养物中分离以及当只需一种类胡萝卜素时按照本技术领域已知的方法把它从其它类胡萝卜素中分离,优选地是制备玉米黄质或安东尼黄质的这类工艺和制备一种食品或饲料组合物的工艺,其特征是在完成这一工艺后把类胡萝卜素优选地是玉米黄质或阿东黄质或类胡萝卜素混合物,优选地是包含玉米黄质或阿东黄质的混合物添加入食品或饲料。
此外本发明的目的是提供前述的DNA序列和载体以及制备一种食品或饲料组合物的工艺,其特征是在完成前述工艺后把由该工艺制备的类胡萝卜素加入到食品或饲料中。
在这里应当说明的是表达语句“一个基本上同源的DNA序列”就编码crtE的DNA序列而言是指一个DNA序列,它编码的氨基酸顺序当与黄杆菌1534的crtE的氨基酸顺序相比时表现出超过45%,优选地超过60%以及更加优选地超过75%和最优选地超过90%的相同氨基酸并且是一段与黄杆菌1534crtE编码的酶表现同种酶活性的多肽的氨基酸序列。相似的对crtB而言,这意味着超过60%,优选地超过70%,更优选地超过80%并最优选地超过90%;对crtI而言意味着超过70%,优选地超过80%并最优选地超过90%;对crtY而言意味着55%,优选地70%,更优选地80%和最优选地90%。
“基本上同源的DNA序列”就编码crtWE396的DNA序列而言是指一个DNA序列,它编码的氨基酸顺序当与微生物E396(FERM BP-4283)的crtW的氨基酸顺序相比时表现超过60%,优选地超过75%以及最优选地超过90%的相同氨基酸并且是一段与微生物E396 crtW编码的酶表现同种酶活性的多肽的氨基酸序列。相似地对crtZ E396而言,这意味着超过75%,优选地超过80%以及最优选地超过90%;对crtE E396,crtB E396,crtI E396,crtY E396和crtZ E396而言这意味着超过80%,优选地超过90%以及最优选地95%。
基因组DNA,cDNA或合成DNA形式的DNA序列可由本技术领域熟知的方法制备[参看例如Sambrook等,《分子克隆》(Molecular Cloning),冷泉港实验室出版社1989]或由例如实施例1,2或7中的具体描述制备。本发明上下文中应该注意的是所有编码crt-基因产物的用于本发明生产类胡萝卜素工艺的DNA序列也能按已知方法或相似于实施例7中具体描述的方法制备成合成DNA。
本发明的DNA序列从上述基因组DNA中的克隆可以使用例如周知的聚合酶链式反应(PCR)方法实现。该方法的原理概述于PCR流程:方法和应用指南(Aguide to methods and Applications),Academic Press,Inc.(1990)。PCR是一个从不同DNA序列混合物中体外扩增大量有特定长度和顺序的一个特异DNA的方法。为此,PCR建立在对感兴趣的特异DNA片段的酶扩增基础上,该片段两侧被两个对这个序列特异的并能与靶序列相反链杂交的寡核苷酸引物攻击。引物通过3′末端彼此相对进行定向。模板热变性,引物与互补顺序的退火,DNA聚合酶进行退火引物的延伸的重复循环导致了PCR引物间片段的扩增。由于每个引物的延伸产物可作为另一引物的模板,每个循环实质上把上一循环中DNA片段的量扩大了一倍。通过使用分离自嗜热细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)中的热稳定Taq聚合酶,已可能避免要求每个热变性步骤后必须添加酶的聚合酶热变性。这个发展导致了使用几种简单的温度-循环设备的PCR的自动化。另外,扩增反应的特异性由于允许使用更高的引物退火和延伸的温度而得到提高。增加的特异性通过减少非靶序列对酶和引物的竞争改进了扩增产物的总产量。这样,感兴趣的特异序列得到高效扩增,并且可通过本技术领域已知的方法例如通过琼脂糖凝胶而很容易地从非特异性序列中分离,以及使用诸如Holten和Graham在核酸研究(Nucleic Acid Res.)
19,1156(1991)中,Kovalic等在核酸研究(Nucleic AcidRes.)
19,4560(1991)中,Marchuk等在核酸研究(Nucleic Acid Res.)
19,1154(1991)中或Mead等在生物技术(Bio/Technology)
9,657-663(1991)中所述的载体按本技术领域已知的方法很容易地克隆。
在PCR流程中所用的寡聚核苷酸引物可使用在本技术领域已知的和诸如Sambrook等s.a所述的方法制备。
扩增的DNA序列接着可按本技术领域已知的(Sambrook等s.a.)或实施例1和2中具体描述的方法用于筛选DNA文库。
一旦得到本发明的完整DNA序列,它们就可作为确定用于克隆基本上同源的其它来源DNA序列的新PCR引物的指南。另外,它们和上述同源DNA序列可按照本技术领域已知的和Sambrook等(s.a.)所述的方法整合入载体以在合适的宿主系统中表达或过量表达编码的多肽。并且,本技术领域熟练的技术人员知道DNA序列本身亦可用于转化本发明适宜的宿主系统以得到过量表达的编码多肽。合适的宿主系统是例如细菌诸如大肠杆菌,芽胞杆菌诸如枯草芽胞杆菌或黄杆菌菌株。可用的大肠杆菌是大肠杆菌K12菌株例如M15[Villarejo等在细菌学杂志(J.Bacteriol.)
120,466-471(1974)中描述为DZ291]或大肠杆菌SG13009[Gottesman等,细菌学杂志(J.Bacteriol.)
148,265-273(1981)]。合适的黄杆菌菌株可以从任何本技术领域熟练的技术人员熟知的并列表于例如“工业特性”(“Industrial Property”)(1994年1月,29-40页)期刊中的菌种收藏馆诸如美国典型菌种收藏馆(ATCC)或真菌中心保藏所(CBS)获得,它们是例如黄杆菌R1534(ATCC No.21588,分类为未知细菌;或CBS519.67)或列表为CBS517.67到CBS521.67及CBS523.67到CBS525.67的所有黄杆菌菌株,特别是R1533(它是CBS523.67或ATCC21081,分类为未知细菌;亦可参看USP3,841,967)。另外一些黄杆菌菌株也描述于WO91/03571。合适的真菌系统是例如真菌诸如曲霉(Aspergilli)例为黑曲霉(Aspergillus niger)或酵母菌诸如酵母(Saccharomyces)例为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia)诸如巴斯德毕赤氏酵母Pastoris都可以从美国典型菌种收藏馆获得。
可用于大肠杆菌中表达的合适载体由诸如Sambrook等[s.a.]或Fiers等在第八届国际生物技术讨论会会报(Procd.8th Int.Biotechno logySymposium)[Soc.Franc.de Microbiol.,Paris(Durand等,编辑),680-697页(1988)]中或Bujard等在酶学方法(Methods in Enzymology)中,Wu和Grossmann编辑,Academic Press,Inc.卷155,416-433(1987)和Stuber等在(Immunological Methods)免疫学方法中,Lefkovits和Pernis编辑,Academic Press,Inc.,卷四,121-152(1990)记载。可用于芽胞杆菌中表达的载体为本技术领域熟知并由Yansura和Henner描述于诸如EP405370,EP635572美国国家科学院院报(Procd.Nat.Acad.Sci.USA)
81,439(1984)或描述于酶学方法(Meth.Enzym)
185,199-228(1990)或EP207459。用于真菌中表达的载体为本技术领域熟知并描述于诸如EP420358中,用于酵母的描述于EP183070,EP183071,EP248227,EP263311。用于黄杆菌中表达的载体为本技术领域熟知并描述于实施例或例如《质粒技术》(Plasmid Technology),J.Grinsted和P.M.Bennett编辑,Academic Press(1990)。
一旦这类DNA序列在置于适宜培养基中的合适宿主细胞中表达,类胡萝卜素在分泌入培养基时可从培养基中分离或可从宿主微生物中分离,如果需要一种特殊的类胡萝卜素,那么可由本技术领域熟知的方法(参看例如《类胡萝卜素》卷IA:分离和鉴定,G.Britton,S.Liaaen-Jensen,H.Pfander;1995,Birkhauser Verlag,Basel)把它从其它存在该类胡萝卜素的类胡萝卜素分离。
本发明的类胡萝卜素可用于制备食品或饲料的工艺流程。本技术领域熟练的技术人员熟知这类工艺。这些食品或饲料复合物可进一步包含一般用于此目的的并由现有技术周知的添加剂或组分。
在上文已概括描述本发明后,下面的图和实施例意于说明本发明的细节,但并不因此而在任何意义上对本发明加以限制。
图1:图解说明黄杆菌R1534的组成物或类胡萝卜素的生物合成途径以阐明本发明DNA序列编码的酶的活性。
图2:将黄杆菌R1534基因组DNA用标于每一泳道上面的限制性内切酶消化并与探针46F杂交的Southern印迹。箭头指示分离的2.4kb Xhol/PstI片段。
图3:将黄杆菌R1534基因组DNA用ClaI消化或用ClaI和HindIII双消化后的Southern印迹。展示于泳道A和泳道B的印迹分别是与探针A和探针B杂交(参看实施例)。指出了1.8kb和9.2kb的ClaI/HindIII酶切片段。
图4:将黄杆菌R1534基因组DNA用标于每一泳道上面的限制性内切酶消化并与探针C杂交的Southern印迹。箭头指示分离的2.8kb SalI/HindIII片段。
图5:将黄杆菌R1534基因组DNA用标于每一泳道上面的限制性内切酶消化并与探针D杂交的Southern印迹。箭头指示分离的接近3kb的BclI/SphI片段。
图6:从得到的基因组克隆推导出的黄杆菌R1534中类胡萝卜素生物合成簇结构的物理图谱。用于筛选的探针的位置以条形表示于每个克隆。
图7:黄杆菌R1534类胡萝卜素生物合成簇的核苷酸顺序及它的侧翼区。核苷酸序列从显示的第一个核苷酸计数(参看图6中BamHI位点)。推导的开放阅读框(简称ORF)(orf-5,orf-1,crtE,crtB,crtI,crtY,crtZ和orf-16)的氨基酸顺序以单字母氨基酸代码的形式表示。箭头(-->)指示转录方向;星号是终止密码子。
图8:黄杆菌R1534的GGPP合成酶(crtE)的蛋白序列,其分子量为31331道尔顿。
图9:黄杆菌R1534前八氢番茄红素合成酶(crtB)的蛋白序列,其分子量为32615道尔顿。
图10:黄杆菌R1534八氢番茄红素脱氢酶(crtI)的蛋白序列,其分子量为544II道尔顿。
图11:黄杆菌R1534番茄红素环化酶(crtY)的蛋白序列,其分子量为42368道尔顿。
图12:黄杆菌R1534β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)的蛋白序列,其分子量为19282道尔顿。
图13:包含黄杆菌R1534类胡萝卜素生物合成基因簇缺失的重组质粒。
图14:用于PCR反应的引物。下面划线的序列是标示的限制性内切酶的识别位点。小引出线是指通过突变引入的核苷酸。盒子表示在枯草芽胞杆菌中识别的人工RBS。粗体小引出线表示造成下一个基因翻译起始位点(ATG)的最初腺嘌呤的位置(参看最初的操纵子)。全部固有的黄杆菌类胡萝卜素生物合成基因都必须破坏掉以避免干扰重建的转录起始位点。箭头标明展示的黄杆菌R1534 WT类胡萝卜素基因的起点和终点。
图15:用于不同构建的接头。下划线序列是所标限制性内切酶的识别位点。小引出线指示由合成引物引入的核苷酸。盒子说明在枯草芽胞杆菌中识别的人工RBS。箭头标明展示的黄杆菌类胡萝卜素基因的起点和终点。
图16:质粒pBIIKS(+)-clone59-2,pLyco和pZea4的构建。
图17:质粒p602CAR的构建。
图18:质粒pBIIKS(+)-CARVEG-E和p602CARVEG-E的构建。
图19:质粒pHP13-2CARZYIB-EINV和pHP132PN252YIB-EINV的构建。
图20:质粒pXI12-ZYIB-EINVMUTRBS2C的构建。
图21:枯草芽孢杆菌BS1012∷ZYIB-EINV4的Northern印迹检测。图片
A:图解表示质粒pXI12-ZYIB-EINV4相互整合入枯草芽胞杆菌的果聚糖-蔗糖酶基因。图片B:用探针A(用CAR51和CAR76获得的PCR片段,其可与crtZ的3′端和crtY的5′端杂交)所得的Northern印迹。图片C:用探针B(从质粒pBIIKS(+)-crtE/2中分离的BamHI-Xhol片段,其可与crtE基因5′部分杂交)所得的Northern印迹。
图22:图解表示三个转化的枯草芽胞杆菌:BS1012∷SFCO,BS1012∷SFCOCAT1和BA1012∷SFCONE01的整合位点。合成的黄杆菌类胡萝卜素操纵子(SFCO)的扩增只能在那些具有可扩增结构的菌株中获得。探针A用于测定整合的SFCO,红霉素抗性基因(ermAM),氯霉素抗性基因(cat),新霉素抗性基因(neo),枯草芽胞杆菌cryT基因的终止子,果聚糖-蔗糖酶基因(sac-B5′和sac-B3′),质粒pXI12序列(pXI12),起源于Veg启动子复合物位点I的启动子的拷贝数。
图23:质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO和pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT的构建。
图24:质粒pZea4的全部核苷酸序列。
图25:合成的产碱菌PC-1的crtW基因。翻译的蛋白质序列表示在双链DNA序列上面。用于PCR合成的12个寡聚核苷酸(crtW1-crtW12)下面划了线。
图26:质粒pBIIKS-crtEBIYZW的构建。将载有合成的crtW基因的pALTER-Ex2-crtW的HindIII-PmlI片段克隆入HindIII和MluI(平端)位点。PvegI和Ptac是用于两个操纵子转录的启动子。这个质粒的ColEl复制起点与pALTER-Ex2构造中存在的p15A复制起点相容。
图27:实施例7中构建的所有质粒有关的插入片段。断裂的基因用∥表示。限制性酶切位点:S=SacI,X=Xbal,H=HindIIII,N=NsiI,Hp=HpaI,Nd=Ndel。
图28:按照本发明的流程从β-胡萝卜素获得的反应产物(类胡萝卜素)。
实施例1
所用的材料和一般方法
细菌菌株和质粒:黄杆菌R1534WT(ATCC21588)是基因克隆的DNA来源。部分黄杆菌R1534WT DNA的基因组文库构建入pBluescriptII+(KS)或(SK)载体(Stratagene,La,Jolla,USA)并转化进入大肠杆菌XL-lblue(Stratagene)或JM109。
培养基和生长条件:转化的大肠杆菌生长于Luria肉汤培养基(LB)中,温度37℃,100mg氨苄青霉素/ml作为选择。黄杆菌R1534wT生长于27℃下的含1%葡萄糖,1%胰化蛋白胨(Difco实验室),1%酵母浸出汁(Difco),0.5%MgSO4·7H2O和3%NaCl的培养基中。
克隆筛选:大肠杆菌转化子筛选是通过基本按照Zon等[Zon等,生物技术(BioTechniques)7,696-698(1989)]描述的PCR法进行,使用下面的引物:
引物#7:5′-CCTGGATGACGTGCTGGAATATTCC-3′
引物#8:5′-CAAGGCCCAGATCGCAGGCG-3′
基因组DNA;将50毫升黄杆菌R1534过夜培养物在10,000g离心10分钟。沉淀用10毫升裂解缓冲液(50mM EDTA,0.1M Nacl pH7.5)简短地冲洗,重新悬浮于4毫升补充有10毫克裂解酶的相同缓冲液中并在37℃温育15分钟。在加入0.3毫升N-月桂酰肌氨酸(20%)后,37℃下继续温育15分钟,然后用酚,酚/氯仿和氯仿提取DNA。DNA在0.3M醋酸钠(pH5.2)存在下用乙醇在室温沉淀20分钟,接着在10,000g离心15分钟。沉淀用70%乙醇漂洗,干燥并在1毫升TE(10mm Tris,1mm EDTA,pH8.0)中重新悬浮。
所有用于Southern印迹检测和克隆实验的基因组DNA都使用火棉胶袋(Sartorius,Germany)对水透析48小时,0.3M醋酸钠存在下乙醇沉淀并用水重新悬浮。
探针标记:DNA探针按照[Sambrook等,s.a]的随机引物法用(a-32P)dGTP(Amersham)标记。
用于选择微基因文库的探针:探针46F是用PCR法使用引物#7和#8并以黄杆菌R1534基因组DNA为模板获得的119bp的片段。建议这个探针为黄杆菌R1534八氢番茄红素合成酶(crtB)基因的片段,因为它与其它种类(例如噬夏孢欧文氏菌,草生欧文氏菌)的八氢番茄红素合成酶基因表现显著同源性。探针A是一个184bp的BstXI-PstI片段,来源于克隆85插入的右臂。探针B是一个397bp的XhoI-NotI片段,获取于克隆85插入的左端。探针C是一个536bp的BglII-PstI片段,来自于克隆85的右端。探针D是一个376bp的KpnI-BstYI片段,分离自克隆59的插入。图6中有各个探针的定位。
寡聚核苷酸合成:用于PCR反应或测序的寡聚核苷酸是用一个AppliedBiosystems392 DNA合成仪合成。
Southern印迹检测:将用于杂交实验的黄杆菌R1534基因组DNA(3毫克)用合适的限制性内切酶消化并在0.75%琼脂糖凝胶中电泳。按照[Sourthern,E.M.,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)
98,503(1975)]所述转移至Zeta探针印迹膜(BIO-RAD)。预杂交和杂交在7%SDS,1%BSA(fraction V;Boehringer),0.5M Na2HPO4 pH7.2中65℃进行。杂交后膜在室温下2×SSC,1%SDS中5分钟洗两次,在65℃0.1%SSC,0.1%SDS中15分钟洗两次。
DNA序列测定:测序按双脱氧链终止技术[Sanger等,美国科学院院报(Proe.Acad.Sci.USA)
74,5463-5467(1977)]进行,使用测序酶试剂盒(UnitedStates Biochemical)。两条链都完全测序并且使用Genetics Computer,Inc的GCG序列测定软件包(8.0版本)进行序列分析[Devereux等,核酸研究(NucleicAcids.Res.)
12,387-395(1984)]。
类胡萝卜素的鉴定:载有不同构造质粒的大肠杆菌XL-1或JM109细胞(200-400毫升)在37℃220rpm摇瓶中的补充有100毫克氨苄青霉素/毫升的LB培养基按文中说明的时间培养,通常24到60小时。
将微生物中存在的类胡萝卜素使用旋转匀浆器用足量体积丙酮提取(Polytron,Kinematica AG,CH-Luzern)。匀浆液接着通过一个吸滤器的烧结玻璃滤入一个圆底烧瓶。滤液在使用喷水真空装置的旋转蒸发器中50℃蒸发。对于玉米黄质测定,在用[Weber,S.《(饲料中维生素和类胡萝卜素分析方法》,Keller,H.E.编辑,83-85(1988)]所述方法使用常规相HpLC分析之前,残余物先溶于n-己烷/丙酮中(86∶14)。对于β-胡萝卜素和番茄红素检定,蒸发的提取液溶于n-己烷/丙酮(99∶1)并按[Hengartner等,瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta)
75,1848-1865(1992)]所述用HPLC分析。
实施例2
黄杆菌R1534类胡萝卜素生物合成基因的克隆
为鉴别和分离带有类胡萝卜素生物合成途径基因的DNA片段,我们使用DNA片段46F(参看方法)探测黄杆菌R1534的用不同限制性内切酶消化的(图2)Southern印迹所载的染色体DNA。与探针杂交的2.4kbXhoI/PstI片段看起来最适合作为起始。黄杆菌R1534基因组DNA用XhoI/PstI消化后在1%琼脂糖凝胶中跑胶。参照共迁移的DNA标记,从胶上切下大约2.4kb的区带并分离DNA。黄杆菌R1534基因组DNA的一个XhoI/PstI的微基因文库构建入pBluescriptIISK(+)的XhoI-PstI位点。使用引物#7和引物#8(相同于前述用于获得119bp片段(46F)的引物)的PCR法继而选择到100个大肠杆菌XL1转化子。找到一个称为克隆85的阳性转化子。插入序列的测序揭示出这段序列不但与欧文氏菌属herbicola和wredovora菌种的八氢番茄红素合成酶(crtB)同源而且与它们的八氢番茄红素脱氢酶(crtI)同源。克隆85的左手和右手基因组序列也是通过相同的方法使用探针A和探针B获得。将黄杆菌R1534基因组DNA用ClaI和HindIII双消化后与探针A和探针B进行Southern检测。用探针A鉴别了一个接近1.8kb的ClaI/HindIII片段,,分离并亚克隆入pBluescriptIIKS(+)的ClaI/HindIII位点。用探针A筛选大肠杆菌XL1转化子得到6个阳性克隆。其中一个阳性克隆即克隆43-3的插入序列测了序并表现出对上述两种欧文氏菌种的crtI基因N-末端和crtY基因C-末端的同源性。用探针B检测到接近9.2kb的一个ClaI/HindIII片段,分离并亚克隆入pBlue scriptIIKS(+)。
筛选转化子出现一个阳性克隆,克隆51。插入片段5′和3′的测序揭示只有接近HindIII位点的区呈现对上述欧文氏菌株类胡萝卜素生物合成基因(例如crtB基因和crtE基因)有关的同源性。ClaI周围的序列不表现对类胡萝卜素生物合成途径已知基因的同源性。以此信息为基础并为了便利进一步的测序和构建工作,克隆51的4.2kbBamHI/HindIII片段亚克隆入pBluescriptIIKS(+)的各个位点,产生克隆2。这个克隆插入片段的测序证实了与欧文氏菌种crtB和crtE基因同源的基因的存在。这些基因定于HindIII位点的1.8kb范围内。插入序列的剩余2.4kb与已知的类胡萝卜素生物合成基因不同源。
其余的ClaI位点下游的基因组序列用探针C检测,该探针与用不同限制性内切酶消化的黄杆菌R1534基因组DNA杂交(如图4)。
用Southern检测鉴定了一个2.8kb SalI/HindIII片段,分离并亚克隆到pBluescriptIIKS(+)的HindIII/XhoI位点。用探针A筛选大肠杆菌XL1转化子给出一个命名为克隆59的阳性克隆。这个克隆的插入片段证实了克隆43-3的序列并另外含有与其它已知番茄红素环化酶crtY基因N-末端同源的序列。为了获得假设的丢失crtZ基因,将黄杆菌R1534的Sau3AI部分消化文库构建入pBluescriptIIKS(+)的BamHI位点。用探针D筛选这个文库给出多个阳性克隆。一个命名为克隆6a的转化子含有4.9kb的插入片段。插入片段的测序揭示除了已知的编码crtB,crtI和crtY的序列外,还有丢失的crtZ基因。将克隆7g从载有R1534Bcl/sphI片段的微文库中分离并用探针D筛选出来。充隆7g的插入序列大小接近3kb。
上述克隆的六个独立插入序列覆盖了黄杆菌R1534基因组的接近14kb大小,汇编于图6。
确定的从BamHI位点(位置1)到碱基对8625的序列范围的序列展示于图7 。
克隆的R1534序列中假想蛋白编码区
计算机分析使用GCG软件包的CodonPreference程序,它根据蛋白编码区密码子使用率与提供的密码子频率表的相似性识别蛋白编码区,分析结果揭示了八个编码假想蛋白的开放阅读框(ORFs):一个编码大于41382道尔顿多肽的从1到1165的部分开放阅读框(ORF5);编码分子量40081道尔顿多肽的从1180到2352的开放阅读框(ORF-1);编码分子量31331道尔顿多肽的从2521到3405的开放阅读框(crtE);编码分子量32615道尔顿多肽的从4316到3408的开放阅读框(crtB);编码分子量54411道尔顿多肽的从5797到4316的开放阅读框(crtI);编码分子量42368道尔顿多肽的从6942到5797的开放阅读框(crtY);编码分子量19282道尔顿多肽的从7448到6942的开放阅读框(crtZ);编码分子量19368道尔顿多肽的从8315到7770的开放阅读框(ORF-16);ORF-1和crtE具有与其它相反的转录方向。ORFs crtI,crtY和crtZ的翻译起始位点可以根据恰当定位的同源于Shine/Delgano(S/D)[Shine和Dalgarno,美国国家科学院院报(Proc.NatlAcad.Sci.USA)
71,1342-1346(1974)]共有序列AGG--6-9--ATG的序列(图10)和对草生欧文氏菌与噬夏孢欧文氏菌各酶的N-端序列的同源性而清楚地确定。ORF crtB的翻译可能从三个空间接近的密码子ATG(4316),ATG(4241)和ATG(4211)起始。第一个,虽然没有三个中最好的S/D序列,但产生与草生欧文氏菌和噬夏孢欧文氏菌crtB蛋白N-末端同源性最高的翻译产物,因而最有可能是翻译起始位点。ORF crtE的翻译可能起始于发现于150bp内的五个不同起始密码子:ATG(2389),ATG(2446),ATG(2473),ATG(2497)和ATG(2521)。我们基于以下观察,相信ATG(2521)是crtE的最可能的翻译起始位点:这个ATG起始密码子前面有上述五个假设起始位点中最好的一致S/D序列;以及假想编码蛋白N-未端氨基酸序列与草生欧文氏菌和噬夏孢欧文氏菌crtE酶N-末端有最高同源性;
crt翻译起始位点和基因产物的特征
五个类胡萝卜生物合成基因的翻译起始位点显示在下面,可能的核糖体结合位点下面划线。基因crtZ,crtY,crtI和crtB聚集地如此紧密以致于前一个基因的TGA终止密码子跨越了下一个基因的ATG。五个基因中只有三个(crtI,crtY和crtZ)符合最佳S/D序列的共有序列。框中的TGA序列显示前一个基因的终止密码子。
黄杆菌R1534各个crt基因的氨基酸序列
黄杆菌R1534的全部五个开放阅读框对已知的其它种类胡萝卜素生物合成基因具有同源性,它们聚集于序列的接近5.2kb附近(图7)。
GGDP合成酶(crtE)
焦磷酸香草基香草基酯合成酶(crtE基因产物)的氨基酸(aa)序列含有295个氨基酸并显示于图8。这个酶在1′-4位缩合焦磷酸法呢基酯和焦磷酸异戊烯酯。
八氢番茄红素合成酶(crtB)
此酶催化两步酶反应。首先以头对头反应把两个焦磷酸香草基香草基酯(C20)缩合为C40类胡萝卜素前八氢番茄红素。然后重排前八氢番茄红素的环丙基环形成八氢番茄红素。黄杆菌R1534crtB基因编码的303个氨基酸显示于图9。
八氢番茄红素脱氢酶(crtI)
黄杆菌R1534的八氢番茄红素脱氢酶含有494个氨基酸,显示于图10,功用类似于草生欧文氏菌和噬夏孢欧文氏菌的crtI酶,通过四个脱氢步骤,把无色的类胡萝卜素八氢番茄红素转化为红色的番茄红素。
番茄红素环化酶(crtY)
黄杆菌R1534的crtY基因产物足够在番茄红素的两侧引入b-紫罗酮环以得到β-类胡萝卜素。黄杆菌R1534的番茄红素环化酶包括382个氨基酸(图11)。
β-胡萝卜素羟化酶(crtZ)
crtZ的基因产物包括169个氨基酸(图12),羟化β-胡萝卜素形成叶黄素玉米黄质。
开放阅读框(orf-1,orf-5和orf-16)的假想酶功能
orf-1在氨基酸水平上与多种有机体[例如热带假丝酵母(Candidatropicalis),人,大鼠]的乙酰乙酰-辅酶A硫解酶有超过40%相同性。因而此基因最可能设想为乙酰乙酰-辅酶A硫解酶(乙酰-辅酶A转乙酰基酶),它缩合两分子乙酰-辅酶A形成乙酰乙酰辅酶A。HMG-辅酶A合成酶把乙酰乙酰-辅酶A与第三个乙酰-辅酶A缩合形成β-羟基-β-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-COA)。这个复合物是甲羟戊酸途径的一部分,这一途径除产生甾醇外还产生多种不同细胞功能的类异戊二烯。在细胞和植物中,类异戊二烯途径也能合成一些独特产物例如类胡萝卜素,生长调节剂(诸如植物中的赤霉素和脱落酸)和次生代谢物例如植物抗毒素[Riou等,基因
148,293-297(1994)]。
orf-5与不同链霉菌[例如紫红链霉菌(S.violaceoruber,肉桂地链霉菌(S.cinnamonensis)]的聚酮化合物合成酶的氨基酸序列有接近30%的低同源性。这些抗生素合成酶(聚酮化合物合成酶)分成两组。I-型聚酮化合物合成酶是大的多功能蛋白,而II-型聚酮化合物合成酶是与聚酮化合物合成亚反应有关的各个蛋白组成的多蛋白复合体[Bibb,等,基因
142,31-39(1994)]。
orf-16编码的假想蛋白与柱孢(或圆筒)鱼腥蓝细菌(Anabaena cylindrica)可溶性氢化酶亚单位相比在氨基酸水平上有42%相同性。
开放阅读框(crtE,crtB,crtI,crtY和crtZ)对类胡萝卜素生物合成途径酶活性的功能归属。
通过测定大肠杆菌宿主菌株中类胡萝卜素的积累揭示了不同开放阅读框基因产物的生化归属,这些宿主菌株已用黄杆菌菌种基因簇的不同缺失的变种转化因而不能表达所有的crt基因(图13)。
构建了三个不同的质粒:pLyco,p59-2和pZea4。质粒p59-2通过把克隆2的HindIII/BamHI片段亚克隆到克隆59的HindIII/BamHI位点获得。p59-2载有crtE,crtB,crtI,和crtY基因的开放阅读框因而应当导致β-胡萝卜素的产生。pLyeo通过从质粒p59-2缺失用于编码大约一半(N-端)crtY基因的KpnI/KpnI片段获得。用pLyco转化的大肠杆菌细胞,因而具有截短的非功能crtY基因,应当产生番茄红素,它是β-胡萝卜素的前体。pZea4通过连接包含crtE,crtB,crtI和大部分crtY基因的p59-2的ASCI-SpeI片段和包含用于完整crtY基因的序列和crtZ基因的克隆6a的AscI/XbaI片段构建而成。pZea4[其全序列参看图24;核苷酸1到683来自于pBluescriptIIKS(+),核苷酸684到8961来自于黄杆菌R1534WT基因组,核苷酸8962到11233来自于pBluescriptIIKS(+)]因而具有玉米黄质生物合成途径的所有5个开放阅读框。质粒pZea4在1995年5月25日收藏于DSM-Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zell Kulturen GmbH(德国),登记号DSM10012。用后一个质粒转化的大肠杆菌细胞从而应当产生玉米黄质。为了检测产生的类胡萝卜素,转化子在摇瓶中生长48小时然后按方法部分所述进行类胡萝卜素检定。图13总结了上述质粒的不同插入片段以及细胞中检测到的主要类胡萝卜素。
同预期一致,载有pLyco的大肠杆菌细胞产生番茄红素,载有p59-2的产生β-胡萝卜素(all-E,9-Z,13-Z),载有pZea4的细胞产生玉米黄质。这证实克隆了所有黄杆菌R1534合成玉米黄质或它们的前体(八氢番茄红素,番茄红素和β-胡萝卜素)必需的基因。
实施例3
用于表达类胡萝卜素合成酶的材料和方法
细菌菌株和质粒:载体pBluescript IIKS(+)或(-)(Stratagene,La Jolla,USA)和pUC18[Vieira和Messing,基因(Gene)
19,259-268(1982);Norrander基因(Gene)
26,101-106(1983)]用于对不同大肠杆菌菌株例如XL-1blue(Stratagene),TG1或JM109进行克隆。在所有枯草芽胞杆菌转化中,使用1012菌株。质粒pHP13[Haima et al.,分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)
209,335-342(1987)]和p602/22[LeGrice,S.F.J.基因表达技术(GeneExpression Technology),Goeddel,D.V.,Editor,201-214(1990)]是格兰氏(+)/(-)菌穿梭质粒,能够在枯草芽胞杆菌和大肠杆菌细胞中复制。质粒p205包含克隆入pUC18的SmaI位点的启动子VegI。质粒pXI12是用于基因在枯草芽胞杆菌(B.subtilis)中组成型表达的整合载体[Haiker等,第7届工业微生物遗传学国际讨论会(7th Int.Sym Posium on the Genetics of IndustrialMicroorgamsms),June 26-July1,1994,Mongreal,Quehec,Canada(1994)]。质粒pBEST501[Itaya et al.,核酸研究(Nucleic Acids Res.)
17(11),4410(1989)]含有来源于金黄色葡萄球菌(S.aureus)[Mckenzie,et al.,质粒(Plasmid)
15,93-103(1986)];Mckenzie等,质粒(Plasmid)
17,83-84(1987)]质粒pUB110的新霉素抗性基因盒。已证明这个新霉素基因当以单拷贝存在于枯草芽胞杆菌基因组时可用作选择标记。质粒pC194(ATCC37034)(GenBank entry:LO8860)来源于金黄色葡萄球菌[Horinouchi and Weisblaum,细菌学杂志,(J.Bacteriol)
150,815-825(1992)]并含有氯霉素乙酰转移酶基因。
培养基和生长条件:大肠杆菌在Luria肉汤(LB)中37℃生长,100毫克氨苄青霉素(Amp)/毫升作为选择。枯草芽胞杆菌细胞生长于补充有红霉素(1毫克/毫升),新霉素(5-180毫克/毫升)或氯霉素(10-80毫克/毫升)的VY-培养基。
转化:大肠杆菌转化使用电穿孔法,使用BIO-RAD公司的基因脉冲设备(Hercules,CA,USA),实验参数如下(200W,250mFD,2.5V)。枯草芽胞杆菌的转化基本按照标准流程,方法2.8,描述于[Cutting and Vander Horn,芽胞杆菌的分子生物学方法](Molecular Biological Methods for Bacillus),HarWood,C.R.and Cutting,S.M.,Editor,John Wiley&Sons:Chichester,England.61-74(1990)]。
克隆选择;细菌克隆筛选按[Zonet al.,s.a.]所述进行。
寡聚核苷酸合成:用于PCR反应或测序的寡聚核苷酸用AppliedBiosystems 392 DNA合成仪合成。
PCR反应:PCR反应参照使用说明使用U I Tma DNA聚合酶(PerkinElmer Cetus)或Pfu Vent聚合酶(New England Biolabs)完成。典型的50毫升PCR反应包含:100ng模板DNA,10pM每种引物,所有四种dNTP′S(终浓度300mM),MgCl2(使用UITma聚合酶时;终浓度2mM),1×UITma反应缓冲液或1×Pfu缓冲液(由厂家提供)。除了DNA聚合酶外的所有反应成分在95℃温育2分钟,接着是简述于相应各部分(参看下面)的循环。在所有反应中部有一个通过在第一轮循环的72℃延伸步骤加入聚合酶的热启动。在PCR反应结束,用酚/氯仿抽提之前,都要用1%琼脂糖凝胶对试样进行检测。水相中的扩增片段用1/103M醋酸钠溶液和二体积乙醇沉淀。12000rpm离心5分钟后,沉淀用充足体积的水,通常40毫升重新悬浮,然后用指示的限制性内切酶完成消化。消化后的混合物在1%低熔点琼脂上分离。预期大小的PCR产物从琼脂上切下,当片段大于400bp时用玻璃珠方法CGENECLEAN KIT,Bio 101,Vista CA,USA)纯化或小于400bp时按[Heery et al.,TIBS6(6),173(1990)]所述直接从胶中拉出。
用于基因扩增和定点诱变的寡聚核苷酸
下面描述了允许不同质粒构建所用的全部PCR反应。全部使用的引物总结于图14。
引物#100和#101用于扩增含有一个SpeI限制性位点和一个位于基因转录起始位点上游的人工核糖体接合位点的完全crtE基因的PCR反应。在扩增片段的3′末端引入了两个单一的限制性位点,AvrII和SmaI,以便于进一步的克隆操作。PCR反应使用UITma聚合酶在下面条件下扩增:5个循环的程序:95℃,1分钟/60℃,45秒/72℃,1分钟和20个循环的程序:95℃,1分钟/72℃,1分钟。质粒pBIIKS(+)-clone2作为模板DNA。最终的PCR产物用SpeI和SmaI消化并用GENECLEAN试剂盒分离。片段的大小接近910bp。
引物#104和#105用于扩增位于crtZ基因编码序列的从翻译起始位点到SalI限制性位点区域的PCR反应。在crtZ基因的5′端引入一个EcoRI位点,一个合成的RBS和一个NdeI位点。PCR条件如上所述。质粒pBIIKS(+-clone 6a作为DNA模板,最终PCR产物用EcoRI和SalI消化。接近480bp的片段用GENECLEAN试剂盒分离。
引物MUT1和MUT5用于扩增完整crtY基因。在5′端,存在包含SaLI位点的crtZ基因的最后23个核苷酸,接着是人工的RBS位于crtY基因翻译起始位点前面。创造的人工RBS包含一个PmlI限制性位点。扩增片段的3′末端包含crtI基因的22个核苷酸,前面是新创造的含有一个MunI限制性位点的人工RBS。PCR反应所用条件如上所述,使用以下循环程序:5轮95℃,45秒/60℃,45秒/72℃,75秒接着是22个循环程序:95℃,45秒/66℃,45秒/72℃,75秒。质粒pXI12-ZYIB-EINV4作为Pfu Vent聚合酶的模板。1225bp的PCR产物制成平头末端并使用Sure-Clone试剂盒(Pharmacia)按使用说明克隆到pUC18的SmaI位点。
引物MUT2和MUT6用于扩增完全的crtI基因。在5′端存在crtY基因的最后23个核苷酸,接着是人工RBS位于crtI基因翻译起始位点之前。新创造的RBS包括一个MunI限制性位点。扩增片段的3′末端包含位于crtB基因上游的人工RBS,它包括一个BamHI限制性位点。PCR反应所用条件基本如上所述,包括下面循环程序:5轮95℃,30秒/60℃,30秒/72℃,75秒,接着是25个循环程序:95℃,30秒/66℃,30秒/72℃,75秒。质粒pXI12-ZYIB-EINV4作为Pfu Vent聚合酶的模板。1541bp的PCR产物用MunI和BamHI消化,以用于进一步克隆操作。
引物MUT3和CAR17用于扩增crtB基因的N-末端。在5′端存在crtI基因的最后28个核苷酸,接着是一个人工RBS,它位于crtB基因翻译起始位点之前。这个新创造的RBS包含一个BamHI限制性位点。称为PCR-F的扩增片段含有位于crtB基因N-末端的HindIII限制性位点。PCR反应使用的条件与文中其它部分所述相同,包含下面的循环程序:5轮95℃,30秒/58℃,30秒/72℃,20秒,接着是25轮程序:95℃,30秒/60℃,30秒/72℃,20秒。质粒pXI12-ZYZB-EINV4作为Pfu Vent聚合酶的模板。接近160bp的PCR产物用BamHI和HindIII消化。
用于扩增氯霉素抗性基因(cat)的寡聚核苷酸
引物CAT3和CAT4用于扩增发现于金黄色葡萄球菌的质粒pC194(ATCC37034)[Horinouchi and Weisblum,s.a.]的氯霉素抗性基因。PCR反应所用的条件如前所述,包括下面的循环程序:5轮95℃,60秒/50℃,60秒/72℃,2分钟,接着是20轮循环程序:95℃,60秒/60℃,60秒/72℃,2分钟。质粒pC198用作Pfu Vent聚合酶的模板。接近1050bp的PCR产物用EcoRI和AatII消化。
用于产生接头的寡聚核苷酸:接头通过把两个相应引物每种90纳克加入到Eppendorf管中获得。混合物在真空离心蒸发浓缩器中干燥,沉淀重悬于1 ×连接缓冲液(Boehringer,Mannheim,Germany)。溶液在50℃温育3分钟,冷却至室温,以允许引物正确杂交。接头现在已准备好连接到合适的位点。所有用于产生接头的寡聚核苷酸显示于图15。
引物CS1和CS2用于形成包含下列限制性位点的接头,HindIII,AflII,ScaI,XbaI,PmeI和EcoRI。
引物MUT7和MUT8用于形成包含限制性位点SalI,AvrII,PmlI,MluI,MunI,BamHI,SphI和HindIII的接头。
引物MUT9和MUT10用于在crtY上游引入人工RBS。
引物MUT11和MUT12用于在crtE上游引入人工RBS。
RNA的提取:总RNA按照[Maes and Messens,核酸研究(Nucleic AcidsRes.)
20(16),4374(1992)]所述的方法从对数生长期的枯草芽胞杆菌中制备。
Northern印迹检测:高达30毫克的枯草芽胞杆菌RNA在制备于1×MOPS和0.66M甲醛中的1%琼脂糖凝胶中电泳以用于杂交实验。转移至Zeta-探针印迹膜(BIO-RAD),紫外线交联,预杂交和杂交按照[Farrell,J.R.E.,RNA方法学。分离和鉴定实验指南(RNA Method ologies.A laboratory Guide forisolation and characterization)San Diego,USA:Academic Press(1993)]所述进行。所用洗脱条件是:在2×SSPE/0.1%SDS中洗2次各20分钟,接着65℃在0.1%SSPE/0.1%SDS中洗1次20分钟。Northern印迹然后以Phosphorimager(Molecular Dynamics)或以Kodak X-射线膜上放射自显影检测。
分离基因组DNA:枯草芽胞杆菌基因组DNA按照[13]中所述的标准流程方法2.6从25毫升过夜培养物中分离。
Southern印迹检测:枯草芽胞杆菌基因组DNA(3毫克)用适当的限制性内切酶消化并在0.75%琼脂糖凝胶上电泳以用于杂交实验。按照[Southern,E.M.,s.a.]所述转移至Zeta-探针印迹膜(BIO-RAD)。预杂交和杂交在7%SDS,1%BSA(fraction V;Boehringer),0.5M Na2HPO4,pH7.2,65℃进行。杂交后膜在2×SSC,1%SDS中室温5分钟洗两次,随后在0.1%SSC,0.1%SDS中65℃15分钟洗两次。Southern印迹然后以Phosphorimager(Molecular Dynamics)或以KodakX-射线膜上放射自显影检测。
DNA序列测定:序列测定使用测序酶试剂盒Version 1.0(United StatesBiochemical)通过双脱氧链末端终止技术进行。序列分析使用GeneticsComputer,Inc.[Devereux et al.,s.a.]的GCG序列分析软件包(Version 8.0)进行。
枯草芽胞杆菌中的基因扩增:为了扩增枯草芽胞杆菌中SFCO的拷贝数,把一单克隆接种入15毫升VY-培养基,培养基中补充有1.5%葡萄糖和0.02毫克氯霉素或新霉素/毫升,这取决于扩增能力结构中存在的抗生素抗性基因(参看结果和讨论)。第二天750毫升这种培养物接种到含1.5%葡萄糖的VY-培养基,补充有(60,80,120和150毫克/毫升)氯霉素以筛选氯霉素抗性突变体或补充有160毫克/ml和180毫克/毫升新霉素以筛选新霉素抗性突变体。培养物生长过夜,第二天50毫升不同稀释度(1∶20,1∶400,1∶8000,1∶160000)在含合适抗生素浓度的VY琼脂平板中铺平板。大的单克隆随后进一步检测以确定拷贝数目和类胡萝卜素产出量。
类胡萝卜素检测:大肠杆菌或枯草芽胞杆菌转化子(200-400毫升)分别在补充有抗生素的LB培养基或VY-培养基中37℃下以220rpm的摇瓶培养,生长时间如文中所述,通常24到72小时。微生物产生的类胡萝卜素在旋转匀浆器中(Poly tron,Kinematica AG,CH-Luzem)用足够体积的丙酮提取。匀浆滤过吸滤器的烧结玻璃进入圆底烧瓶。滤液通过含喷水真空装置的旋转蒸发器在50℃下蒸发。对于玉米黄质检测,剩余物溶于正己烷/丙酮(86∶14)然后按照[Weber,S.,s.a.]所述用常相HpLC测定。对于β-胡萝卜素和番茄红素检测,蒸发后的提取物溶于正己烷/丙酮(99∶1)并按照[Hengarneret al.,s.a.]所述用HpLC测定。
实施例4
大肠杆菌中类胡萝卜素的生产
通过分析大肠杆菌宿主菌中类胡萝卜素的富集揭示了黄杆菌属sp.(Flavobacteriwm sp.)类胡萝卜素生物合成基因簇不同开放阅读框(ORF′S)基因产物的生物化学归属,该大肠杆菌用载有黄杆菌属sp.基因簇缺失的质粒转化因而缺失某些crt基因产物。大肠杆菌中的相似功能测定由其他作者描述[Misawa et al.,s.a.;Perry等,细菌学杂志(J.Bacteriol.)
168,607-612(1986);Hundle等,(Molecular and General Genetics)
254(4),406-416(1994)]。三个不同的质粒pLyco,pBIIKS(+)-clone59-2和pZea4构建于三个分离自基因组的pBIIKS(+)-clone2,pBIIKS(+)-clone59和pBIIKS(+)-clone6a(参看图16)。
质粒pBIIKS(+)-clone59-2通过把pBIIKS(+)-clone2的HindIII/BamHI片段亚克隆到pBIIKS(+)-clone59的HindIII/BamHI位点获得。产生的质粒pBIIKS(+)-clone59-2载有crtE,crtB,crtI和crtY基因的完整开放阅读框因而应当导致β-胡萝卜素的产生。pLyco通过从质粒pBIIKS(+)-clone59-2中缺失编码大约一半crtY基因(N-端)的KpnI/KpnI片段获得。用pLyco转化的大肠杆菌细胞,因而具有截短的无功能crtY基因,应当产生β-胡萝卜素的前体番茄红素。pZea4通过连接含有crtE,crtB,crtI和大部分crtY基因的pBIIKS(+)-clone59-2的AscI-SpeI片段和含有crtZ基因及补充完整上述截短crtY基因的序列的克隆6a的AscI/XbaI片段构建而成。pZea4从而含有玉米黄质生物合成途径的全部5个开放阅读框。用后一个质粒转化的大肠杆菌因而应当产生玉米黄质。为了检测产生的类胡萝卜素,转化体在摇瓶中培养43小时然后按照方法部分所述进行类胡萝卜素检测。图16总结了上述质粒的构建。
与预期一致,载有pLyco的大肠杆菌细胞产生番茄红素,载有pBIIKS(+)-clone59-2的产生β-胡萝卜素(all-E,9-Z,13-Z),载有pZea4构造的细胞产生玉米黄质。这些证实我们克隆了黄杆菌菌种R1534用于玉米黄质或它们的前体(八氢番茄红素,番茄红素和β-胡萝卜素)合成的所有必需基因。获得的产出水平显示于表1。
质粒 | 宿主 | 玉米黄质 | β-胡萝卜素 | 番茄红素 |
pLyco | 大肠杆菌JM109 | 未测出 | 未测出 | 0.05% |
pBIIKS(+)-clone59-2 | ″ | 未测出 | 0.03% | 未测出 |
pZea4 | ″ | 0.033% | 0.0009% | 未测出 |
表1:载有质粒pLyco,pBIKS(+)-clone59-2和pZea4,摇瓶培养43小时的大肠杆菌转化体中类胡萝卜素含量。显示值表明类胡萝卜素占总细胞干重(200毫升)的百分含量。ND=未测出。
实施例5
枯草芽胞杆菌中类胡萝卜素产生
在枯草芽胞杆菌生产类胡萝卜素的第一个方法中,我们把黄杆菌类胡萝卜素生物合成基因克隆到p602/20[LeGrice,S.FJ.,s a.]衍生物革兰氏(+)/(-)穿梭载体p602/22中。最终构建体p602-CARVEG-E的组装始于pZea4(缺失654-3028)的PvuII-AvrII片段和质粒pBIIKS(+)-clone6a的AvrII-EcoRI片段连接入载体p602/22EcoRI和ScaI位点的三连接。质粒pZea4(缺失654-3028)通过用SacI和EspI消化pZea4获得。结构pZea4(缺失654-3028)缺少crtE基因上游的大部分序列,它们对类胡萝卜素生物合成不是必需的。质粒p602-CAR含有接近6.7kb的黄杆菌R1534基因组DNA,除了含有全部五个类胡萝卜素基因(大约4.9kb)外,还有位于crtZ翻译起始位点上游的1.2kb基因组DNA和另外200bp位于crtE翻译起始位点上游的基因组DNA。crtZ,crtY,crtI和crtB基因克隆到启动子PN25/0的下游,它是一个可调节的大肠杆菌T5噬菌体启动子融合一个在枯草芽胞杆菌中有功能的乳糖操纵子元件[LeGrice,S.F.J.,s.a.]的衍生物。很明显在p602CAR构建体中,PN25/0启动子和crtZ转录起始位点之间1200bp的距离不是最优的并且会在下面阶段中加以改进。p602CAR的构建示意图显示于图17中。为了保证crtE基因在枯草芽胞杆菌中的转录,在该基因上游引入了VegI启动子[Moran等,分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)
186,339-346(1982);LeGrice等,分子和普通遗传学(Mol.Gen.Genet.
204,229-236(1986))]产生了质粒构建体p602-CARVEG-E。起源于[LeGrice等,s.a.]描述的Veg启动子复合物位点I的VegI启动子在大肠杆菌中显示出功能[Moran等,s.a.]。为了得到这个新的构建体,质粒p602 CAR用SalI和HindIII消化,然后把含有完整crtE基因的片段和大部分的编码crtB的序列亚克隆到质粒p205的XhoI和HindIII位点。产生的质粒p205 CAR包含的crtE基因正好在PvegI启动子的下游。为了重建黄杆菌菌种类胡萝卜素基因簇,分离了以下三个片段:P205CAR的PmeI/Hind III片段,p602 CAR的HincII/XbaI片段和EcoRI/HindIII片段并连接到pBluescriptIIKS(+)的EcoRI和XbaI位点,产生了构建体pBIIKS(+)-CARVEG-E。分离后一个质粒的EcoRI-XbaI片段并连接到p602/22的EcoRI和XbaI位点产生了类似于p602 CAR的质粒,但其crtE基因由PvegI启动子驱动。为获得质粒p602 CARVEG-E所进行的构建步骤示意于图18。用此质粒转化的大肠杆菌TG1细胞合成玉米黄质。相反,用同一构建体转化的枯草芽胞杆菌菌株1012不产生任何类胡萝卜素。对多个不产生玉米黄质的枯草芽胞杆菌转化体的检测总是揭示出转化的质粒遭受了严重的缺失。这种不稳定性可归因于构建体大小太大。
为了获得在枯草芽胞杆菌中稳定构建体把类胡萝卜素基因克隆到由[Haima等,s.a.]构建的革兰氏(+)/(-)穿梭载体pHP13中。稳定性问题认为由下面原因消除1)减小了载有类胡萝卜素基因的克隆插入物的大小2)翻转了crtE基因的方向,从而只需一个启动子就可表达所有五个基因,而不是象先前的构建体一样需要两个启动子。此外,载有合成的黄杆菌类胡萝卜素操纵子(SFCO)的质粒转化的细胞生产类胡萝卜素的能力将会回答是否有一个可行的模式方法问题。图19总结了所有构建步骤和为了得到最终构建体pHP13-2PNZYIB-EINV而制造的中间质粒。简要地:为了便于下面的构建,把一个用引物CS1和CS2获得的合成接头引入到穿梭载体pHP13的HindIII和EcoRI位点制造载体pHP13-2。中间构建体pHP13-2CARVEG-E通过亚克隆p602 CARVEG-E的AflII-XbaI片段到pHP13-2的AflII和XbaI位点构建而成。下一步骤要点是crtE基因的翻转,通过去除含有原来的crtE基因的XbaI和AvrII片段并代之以质粒pBIIKS(+)-PCRRBScrtE的XbaI-AvrII片段而完成。产生的质粒命名为pHP13-2CARZYIB-EINV并且是第一个有SFCO功能的构建体。上述的中间构建体pBIIKS(+)-PCRRBScrtE通过用SpeI和SmaI消化用引物#100和#101产生的PCR产物并连接到pBluescriptIIKS(+)的SpeI和SmaI位点获得。为了得到接近启动子PN25/0的crtZ转录起始点进行了以下三连接,pHP13-2CARZYIB-EINV的BamHI-SalI片段(含有五个类胡萝卜素基因中的四个),含有PN25/0启动子的同一质粒的BamHI-EcoRI片段,和含有前导合成RBS的大部分crtZ基因的pBIIKS(+)-PCRRBS crtZ的EcoRI-SalI片段。上述的质粒pBIISK(+)-PCRRBS crtZ通过用EcoRI和SalI消化用引物#104和#105扩增的PCR产物并连接到质粒pBluescriptIISK(+)的EcoRI和SalI位点获得。在产生的载体pHP13-2PN25ZYIB-EINV中,SFCO由噬菌体T5启动子PN25/0驱动,它应当是组成型表达,因为构建体中缺少功能性乳糖阻遏物[Peschke和Beuk,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)
186,547-555(1985)]。用这种构建体转化的大肠杆菌TG1细胞产生玉米黄质。尽管如此,当这种质粒转化到枯草芽胞杆菌中时,检测不到类胡萝卜素产生。这些转化体中质粒的检测显示出严重的缺失,指向不稳定性问题,类似于用前述质粒进行的观察结果。
实施例6
染色体整合构建体
由于前面的构建体观察到不稳定性,我们决定使用整合/表达载体pXI12把黄杆菌属sp.的类胡萝卜素生物合成基因整合到枯草芽胞杆菌基因组中。这个载体整合到枯草芽胞杆菌基因组果聚糖-蔗糖酶基因(sacB)后允许全部操纵子的组成型表达。组成型表达由VegI启动子推动并导致中等水平表达。含有合成黄杆菌类胡萝卜素操纵子(SFCO)的质粒pXI12-ZYIB-EINV4的构建如下:pBIISK(+)-PCRRBS crtZ的NdeI-HincII片段克隆到pXI12的NdeI和SmaI位点,产生的质粒命名为pXI12-PCR crtZ。接下来的步骤中,pHP13-2PN25ZYIB-EINV的BstEII-PmeI片段连接到pXI12-PCR crtZ的BstEII-PmeI片段(参看图20)。用产生的构建体pXI12-ZYIB-EINV4转化枯草芽胞杆菌能把CAR基因通过坎贝尔型反应或交互重组整合上去。其中一个转化体,BS1012∷ZYIB-EINV4,具有类胡萝卜素生物合成基因到果聚糖-蔗糖酶基因的交互重组,进行了进一步检测(图21)。虽然这一菌株并不合成类胡萝卜素,但通过与探针A杂交的Northern印迹进行RNA检测显示出存在特异的5.4kb和4.2kb的多顺反子mRNA′S(参看图21,图片B)。尽管较大的mRNA具有预期的信息大小,但较短mRNA的起源并不清楚。同一Northern印迹与探针B杂交只检测出较大mRNA片段,指出在crtB基因末端的转录提前终止。这个位置终止信号的存在是有意义的,因为在黄杆菌属SP.R1534基因组原来的操纵子结构中,crtE和crtB基因是面对面的。有了这种构象,crtB5′端的转录终止信号就有意义,它是为了避免合成能够干扰crtE基因mRNA转录的反义RNA。由于这一区域同野生型状态相比已被相当大的改变,含有这个终止子的序列可能也被改变成产生渗漏的终止子。使用抗血清对类胡萝卜素途径不同crt酶的Western印迹检测指出这种可能性,即核糖体结合位点可能造成了类胡萝卜素合成的缺乏。在引入的五个基因中只有crtZ基因产物,β-胡萝卜素羟化酶可以测出。这是唯一的被起源于载体pXI12,已知在枯草芽胞杆菌中有功能的RBS位点前导的基因。[McLaughlin等,生物学化学杂志(J.Biol.Chem.)
256,11283-11291(1981)]提出mRNA Shine-Dalgarno序列[Shine和Delagarno,s.a.]和16S核糖体RNA之间的碱基对相互作用,允许核糖体选择合适的起始位点,在革兰氏阳性细菌(枯草芽胞杆菌)中比在革兰氏阴性细菌(大肠杆菌中更加稳定。为了获得高稳定复合体,我们用设计的与枯草芽胞杆菌16S核糖体RNA3′末端互补的合成RBS′s交换了前导于每一个crtY,crtI,crtB和crtE基因的革兰氏阴性黄杆菌SP.的RBS位点。这一交换应当允许枯草芽胞杆菌中不同类胡萝卜素基因有效的翻译起始。选择的构建这个含有全部四种改变位点的pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C的策略总结于图20。为了便于在pBluescriptIIKS(+)中的进一步克隆操作,借助用引物MUT7和MUT8获得的接头,引入了附加的限制性位点,克隆在所述载体的SalI和HindIII位点之间。新产生的构建体pBIIKS(+)-LINKER78含有引入的以下限制性位点:AvrII,PmlI,MulI,MunI,BamHI和SphI。选择的用于产生合成的位于不同类胡萝卜素基因上游的核糖体接合位点的一般方法是通过使用一个PCR为基础的突变组合进行,其中的基因使用载有修饰的核糖体接合位点的确定引物或使用含这类序列的合成接头重建。前导于crtI和crtB基因的核糖体接合位点的重建通过使用含有适当改变的核糖体接合位点的引物MUT2和MUT6扩增crtI基因完成。获得的PCR-I片段用MunI和BamHI消化后连接到pBIIKS(+)-LINKER78的MunI和BamHI位点。产生的中间构建体被命名为pBIIKS(+)-LINKER78PCRI。前导于crtB基因的核糖体接合位点的重建通过使用载有改变的crtB上游的核糖体接合位点的引物MUT3和引物CAR17的一小段PCR片段获得。扩增的PCR-F片段用BmHI和HindIII消化并亚克隆到pBIIKS(+)-LINKER78的BamHI和HindIII位点,产生构建体pBIIIKS(+)LINKER78PCRF用BamHI和SapI把PCR-I片段从pBIIKS(+)-LINKER78PCRI中切出并连接到pBIIIKS(+)-LINKER78PCRF的BamHI和SapI位点。产生的质粒pBIIKS(+)-LINKER78PCRFI含有融合到PCR-F片段中的PCR-I片段。这个构建体用SalI和PmlI酶切并引入一个通过引物MUT9和MUT10退火形成的合成接头。进行后一步骤是为了便于即将替换在上述构建体中的原先的黄杆菌RBS。产生的质粒命名为pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIA。前导于crtY和crtI基因的合成RBS′s的组装通过使用引物MUT1和MUT5的PCR完成。扩增的片段PCR-G在克隆到pUC18的Smai位点之前制成平头末端,克隆产物是构建体pUC18-PCR-G。下一步是把PCR-G片段克隆到PCR-A和PCR-I片段之间。为此目的通过用MunI和PmlI消化从pUC18-PCR-G中分离PCR-G并连接到pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIA的MunI和PmlI位点。构建体包括全部四个片段,PCR-F,PCR-I,PCR-G和PCR-A,它们相互接近组装并含有四个人工RBS位点(crtY,crtI和crtB)中的三个。用合成的RBS′s交换前导于crtY,crtI和crtB基因的黄杆菌RBS′s是通过用质粒pBIIKS(+)-LINKER78PCRFIGA的HindIII-SalI片段代替质粒pXI12-ZYIB-EINV4的HindIII-SalI片段完成的。产生的质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBSC接着转化到大肠杆菌TG1细胞和枯草芽胞杆菌1012。这些细胞产生玉米黄质证实了PCR扩增的基因是功能性的。得到的枯草芽胞杆菌菌株命名为BS1012∷SFCO1。最后一个要被交换的黄杆菌RBS是前导于crtE基因的。这通过使用引物MUT11和MUT12获取的接头来完成。野生型RBS用NdeI和SpeI从pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS中去除并插入上述的接头。在构建体pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C中,所有的黄杆菌RBS′s都被合成的有一致序列AAAGGAGG-7-8N-ATG(参看表2)的RBS′s置换。用这个构建体转化的大肠杆菌TG1细胞表明最后的RBS置换也未妨碍产生玉米黄质的能力。所有包含新引
表2
mRNA
核苷酸序列
crtZ AAAGGAGGGUUUCAU
AUGAGC
crtY AAAGGAGGACACGUG
AUGAGC
crtI AAAGGAGGCAAUUGAG
AUGAGU
crtB AAAGGAGGAUCCAAUC
AUGACC
crtE AAAGGAGGGUUUCUU
AUGACG
枯草芽胞杆菌 16S rRNA 3′-UCUUUCCUCCACUAG
大肠杆菌 16S rRNA 3′-AUUCCUCCACUAG
表2:在构建体pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C,pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT和pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO中合成的核糖体结合位点的核苷酸序列。前导于各类胡萝卜素基因与枯草芽胞杆菌16S核糖体RNA3′末端互补的Shine-Dalgarno序列的核苷酸以粗体表示。也展示了大肠杆菌16S核糖体RNA的3′末端作为对照。
划线的AUG是所述基因的翻译起始位点。
入合成RBS′s 的区域都由测序证实。用质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2转化枯草芽胞杆菌细胞并筛选到一个通过交互重组把SFCO整合到染色体果聚糖-蔗糖酶基因的转化体。这个菌株命名为BS1012∷SFCO2。这一菌株类胡萝卜素产生的检测表明,其玉米黄质产量大约是使用是到枯草芽胞杆菌转化体的质粒转化的大肠杆菌玉米黄质产量的40%。当比较BS1012∷SFCO1菌株与其大肠杆菌对应体时得到类似的观察结果(30%)。虽然大肠杆菌多出18倍的类胡萝卜素基因,但其类胡萝卜素产出只高出2-3倍的系数。更剧烈的是观察到的载有大约200拷贝pZea4构建体的大肠杆菌细胞和载有18拷贝质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C的大肠杆菌细胞之间类胡萝卜素含量的差别。第一个转化体比后者多产生48倍的玉米黄质。观察到的这一差别不能仅仅归因于在这些转化体中存在大约11倍多的类胡萝卜素生物合成基因。这一差别的原因可能也有新构建的SFCO的次优化性能,其中分离了野生型黄杆菌操纵了的重叠基因以引入合成的RBS′s。这可能导致了重建合成操纵子的低翻译效率(例如归因于在野生型操纵子中存在的假想翻译偶联效应的消除)。
为了增加类胡萝卜素产量,制造了pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO和pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT两个新构建体,它们在SFCO整合到染色体果聚糖-蔗糖酶后,能产生具有如[Janniere等,基因(Gene)
40,47-55(1985)]所述扩增能力结构的菌株。质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO于1995年5月25日存放到(DSM-DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkultu ren GmbH)(Germany),登记号DSM10013。这些可扩增结构,当与抗性标记(例如氯霉素,新霉素,四环素)连接时,能在每一染色体扩增至20-50拷贝。含有SFCO,抗性基因和pXI12序列的可扩增结构两翼是Sac-B3′基因的直接重复(参看图22)。含增加的SFCO数目的新菌株现在可通过筛选对抗生素具有增加的抗性水平的转化体获得。为了构建质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CNEO,用PstI和SmaI从质粒pBEST501中分离新霉素抗性基因并亚克隆到pUC18载体的PstI和EcoO1091位点。产生的构建体命名为pUC18-Neo。为了得到最终构建体,用包含新霉素抗性基因的pUC18-Neo的Sma I-AatII片段代替质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C的PmeI-AatII片段。质粒pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2CCAT按如下步骤获得:使用引物对cat3和cat4借助PCR方法离pCI94的氯霉素抗性基因。片段用EcoRI和AatII消化并亚克隆到pUC18的EcoRI和AatII位点。产生的质粒命名为pUC18-CAT。最终载体通过用载有氯霉素抗性基因的pUC18-CAT的EcoRI-AatII片段代替pXI12-ZYIB-EINV4MUTRBS2C的PmeI-AatII片段获得。图23总结了获取上述构建体的不同步骤。两种质粒都转化到枯草芽胞杆菌菌株1012,并且筛选到来源于坎贝尔型整合的转化体。选择BS1012∷SFCONEO1和BS1012∷SFCOCAT1两株菌用于进一步的扩增。两菌株的单克隆通过按方法部分所述在不同浓度抗生素中培养得以独立扩增。对于载有cat基因的菌株,氯霉素浓度为60,80,120和150毫克/毫升。对于载有neo基因的菌株,新霉素浓度为160和180毫克/毫升。在两种菌株中只获得了含有较少SFCO′S扩增的菌株。在菌株BS1012∷SFCONEO1产生的子代菌株中,对较高新霉素浓度的抗性与染色体上SFCO′S数目的增加有关,也与这些细胞产生高水平的类胡萝卜素有关。从菌株BS1012∷SFCOCAT1获得的子代菌株中得到了不同的结果。在这些菌株中,增加至150毫克氯霉素/毫升导致了,正如预期的,染色体中较高数目的SFCO拷贝。
实施例7
含CrtW质粒的构建以及用于类胡萝卜素生产
聚合酶链式反应为基础的基因合成。编码产碱菌属菌株PC-1的β-胡萝卡素β-4-加氧酶的人工crtW基因核苷酸序列通过使用GCG威斯康星序列分析软件包(GCG Wisconsin Sequence Analysis Package)版本8.0的反向翻译(Back Translate)程序[遗传学计算机集团,麦迪逊,威斯康星,美国(GeneticComputer Group,Madison,WI,USA)]和大肠杆菌的密码子频率参照表(由反向(Bach)翻译程序提供)对概述于[Misawa,1995]的氨基酸序列进行反向翻译获得。含有726个核苷酸的合成基因基本按照[Ye,1992]所述的方法构建。合成所需的12个寡聚核苷酸序列(crtW1-crtW12)显示于图25。简要说明,设计长寡聚核苷酸是为了有15-20个碱基的短重叠,作为扩展寡聚核苷酸的引物。四个循环后应当出现几个拷贝的全长基因,它继而由两个末端寡聚核苷酸crtW15和crtW26扩增。这两个短寡聚核苷酸序列是,正向引物crtW15(5′-TATATCTAGAca
tatgTCCGGTCGTAAACCGG-3′),反向引物crtW26(5′-TATAgaattccacgtgTCA
AGCACGACCACCGGTTTTACG-3′),与DNA模板配对的序列下面划线。小写字母显示引入的限制性位点(正向引物的NdeI位点和反向引物的EcoRI和PmlI位点),是为了后面克隆到表达载体pALTER-E×2中。
聚合酶链式反应。所有12种长寡聚核苷酸(crtW1-crtW12;每种7nM)和两种末端引物(crtW15和crtW26;每种0.1mM)混合并加到含有ExpandTM高保真聚合酶(Boehringer,Mannheim)(3.5单位)和dNTP′S(每种100mM)的PCR反应混合物中。PCR反应按下面的程序运行30循环:94℃1分钟,50℃两分钟和72℃3分钟。PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶中分离,切下大约700bp的带并用玻璃珠方法(Geneclean试剂盒,Biolol,Vista,CA,USA)纯化。片段随后用Sure-Clone试剂盒(Pharmacia,Uppsala,Sweden)克隆到质粒pUC18的SmaI位点。产生的crtW合成基因的序列通过用测序酶试剂盒版本1.0(United States Biochemical,Cleveland,OH,USA)测序得以证实。用这种方法构建的crtW基因发现含有少量错误,它随后通过定点突变得以修正。
质粒的构建。含有革兰氏阴性细菌黄杆菌R1534WT(ATCC21588)[Pasamontes,1995#732]类胡萝卜素生物合成基因(crtE,crtB,crtY,crtI和crtZ)的质粒pBIIKS(+)-CARVEG-E(参看实施例5)(图26)克隆到载有枯草芽胞杆菌Veg启动子位点I[LeGrice,1986#806]的修饰pBluescriptIIKS(+)载体(Stratagene,La Jolla,USA)中。这种组成型启动子已证明在大肠杆菌中是功能性的。载有质粒pBIIKS(+)-CARVEG-E的大肠杆菌菌株TG1转化体合成玉米黄质。质粒pALTER-Exz-crtW通过克隆合成的crtW基因的NdeI-EcoRI限制性片段到质粒pALTER-Exz(Promega,Madison,WI)的相应位点构建而成。质粒pALTER-Exz是一个低拷贝质粒,它带有的P15a复制起点允许它与ColE1载体共存于同一宿主。质粒pBIIKS-crtEBIYZW(图26)通过克隆pALTER-Exz-crtW的HindIII-PmlI片段到HindIII和如[Sambtook,1989#505]所述用Klenow酶进行补平反应获得制成平头末端的MluI位点来获取。crtZ基因的失活通过删除285bp的NsiI-NsiI片段,继之以补平反应和重新连接完成,产生了质粒pBIIKS-crtEBIY[DZ]W。载有非功能性基因crtW和crtZ的质粒pBIIKS-crtEBIY[DZW]通过用NdeI和HpaI消化质粒pBIIKS-crtEBIY[DZ]W,在用Klenow酶补平位点后随之实现质粒的自身重连接获得。用这一质粒转化的大肠杆菌由于积累β-胡萝卜素而呈现黄-橙色。质粒pBIIKS-crtE BIYZ[DW]有截短的crtW基因,它通过如上面简述的删除质粒pBIIKS-crtE BIYZW的NdeI-HpaI片段获得。质粒pALTER-Exz-crtEBIY[DZW]和pALTER-Exz-crtEBIYZ[DW]通过分别从pBIIKS-crtEBIY[DZW]和pBIIKS-crtEBIYZ[DW]中分离BamHI-XbaI片段并克隆到pALTER-Exz的BamHI和XbaI位点获得。质粒pBIIKS-crtW通过用NsiI和SacI消化pBIIKS-crtEBIYZW,用Klenow酶缩进DNA突出端并自身-再连接质粒获得。图27汇编了用于本文的所有质粒的有关插入片段。
类胡萝卜素检测。载有不同质粒构建体的大肠杆菌TG-1转化体在补充有抗生素(氨苄青霉素100毫克/毫升,四环素12.5毫克/毫升)的Luria肉汤培养基中220rpm摇瓶37℃生长20小时。用丙酮从细胞中抽提类胡萝卜素。丙酮用真空方法去除,剩余物溶于甲苯。有色溶液在惠普(Hewlett-Packard)系列1050设备上进行高效液相层析(HpLC)检测。类胡萝卜素在Nucleosil Si-100,200×4毫米,3米的二氧化硅柱中分离。溶剂系统包括两种溶剂:已烷(A)和己烷/THF,1∶1(B)。在15分钟内用13到50%(B)的线性梯度洗脱。流速为1.5毫升/分钟。用光(电)二极管矩阵检测器检测到450nm的峰。单个类胡萝卜素色素通过比较与化学纯参比样品的吸收光谱和标准保留时间得以鉴别。参比样品通过化学合成制备并用核磁共振(NMR),质谱(MS)和紫外光谱(UV-Spectra)鉴定。从除载有黄杆菌属SP.R1534菌株的类胡萝卜素生物合成基因外还有产碱菌PC-1[Misawa,1995#670]编码β-胡萝卜素酮酶的crtW基因的质粒pBIIKS-crtEBIYZW转化的大肠杆菌细胞中分离的色素经过HpLC检测给出以下主要峰,鉴定为:b-隐黄质,虾青素,阿东黄质和玉米黄质,鉴定基于它们的保留时间和与给定化学纯类胡萝卜素参比样品吸收光谱的比较。载有pBIIKS-crtEBIYZW的大肠杆菌转化体中积累的色素的相对含量(面积百分数)显示于表3[“CRX”;隐黄质;“ASX”:虾青素;“ADX”:阿东黄质;“ZXN”:玉米黄质;“ECM”:海胆酮;“MECH”:3-羟海胆酮;“CXN”:裸藻酮]。所有鉴定的类胡萝卜素峰面积之和定义为100%。表3中的显示数值代表每个转化体四个单独培养物的平均值。与前述结果相比,载有相同基因但在两个名为pBIIKS-crtEBIYZ[DW]和pALTER-Exz-crtW质粒上的大肠杆菌转化体显示出阿东黄质的急剧下降和完全缺失虾青素色素,但其玉米黄质相对量(%)增加。海胆酮,羟基海胆酮和裸藻酮水平与在相同质粒(pBIIKS-crtEBIYZDW)上载有全部crt基因的转化体相比保持不变。质粒pBIIKS-crtEBIYZ[DW]是一个高拷贝质粒,载有功能性的黄杆菌菌种R1534的crtE,crtB,crtY,crtI,crtZ基因和截短的crtW基因非功能形式,而crtW基因的功能性拷贝位于低拷贝质粒pALTER-Exz-crtW。为了检测crtW基因对于crtZ基因的过量表达效应,用载有处于高拷贝质粒pBIIKS-crtW上的crtW基因的质粒pBIIKS-crtW和编码黄杆菌crt基因的低拷贝构建体pALTER-Exz-crtEBIYZ[DW]共转化大肠杆菌细胞。用HpLC检测这些转化体中的色素,检测到存在β-胡萝卜素,隐黄质,虾青素,阿东黄质,玉米黄质, 3-羟海胆酮和痕量的海胆酮和裸藻酮(表3)。
在低拷贝质粒pALTER-Exz-crtW上有crtW基因和在高拷贝质粒pBIIKS-crtEBIY[DZW]上有crtE,crtB,crtY和crtI基因的转化体只表达少量的裸藻酮(6%)但表达高水平的海胆酮(94%),而在高拷贝质粒pBIIKS-crtW上载有crtW基因和在低拷贝构建体pALTER-Exz-crtEBIY[DZW]上载有其它crt基因的细胞分别有78.6%和21.4%的海胆酮和裸藻酮(表3)。
表3
质粒 | CRX | ASX | ADX | ZXN | ECH | HECH | CXN |
pBIIKS-crtEBIYZWpBIIKS-crtEBIYZ[ΔW]+pALTER-Ex2-crtWpBIIKS-crtEBIY[ΔZ]WpBIIKS-crtEBIY[ΔZW]+pBIIKS-crtW | 1.12.2-- | 2.0--- | 44.225.4-- | 52.472.4-- | <1<166.594 | <1<1-- | <1<133.56 |
实施例8
使用革兰氏阴性细菌E-396的crtW和crtZ基因进行选择性类胡萝卜素生产
在这一部分我们描述大肠杆菌转化体,它只积累一种(裸藻酮)或两种主要的类胡萝卜素(虾青素,阿东黄质)和少量的阿东红质(adonirubin),而不是在多数类胡萝卜素产生细菌[Yokoyama等,生物科学,生物技术,生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)58:1842-1844(1994)]和显示于表3的一些大肠杆菌转化体中所见的复杂的多种类胡萝卜素。构建只产生一种类胡萝卜素的菌株的能力是迈向成功的生物技术类胡萝卜素生产工艺的主要步骤。伴有中间物减少的单一类胡萝卜素积累的增加是通过用来源于产虾青素的革兰氏阴性细菌E-396(FERM BP-4283)[Tsubokura等,EP-申请号(EP-application)0635576A1]的与它们同源的基因替代黄杆菌R1534的crtZ和/或合成的crtW基因(参看实施例5)来获得。分离crtWE396和crtZE396两个基因并用于构建简述于下面的新质粒。
通过聚合酶链式反应分离菌株E-396的crtW基因的假设片段。基于橙黄土壤杆菌,产碱菌PC-1(WO95/18220)[Misawa等,细菌学杂志(J.Bacteriol)177:6575-6584(1995)]和红球虫[Kajiwara等,植物分子生物学(Plant Mol.Biol.29:343-352(1992)][Lotan等,欧洲生化学会联合会通信(FEBS letters),364:125-128(1995)]crtW酶蛋白质序列比较,鉴定了命名为I和II的具有高氨基酸保守性并位置分开大约140个氨基酸的两个区,并选择用于设计显示于下面的简并PCR引物。N-端肽HDAMHG(区域I)用于设计两个17基体(mer)简并引物序列crtW100和crtW101:
crtW100:5′-CA(C/T)GA(C/T)GC(A/C)ATGCA(C/T)GG-3′
crtW101:5′-CA(C/T)GA(C/T)GC(G/T)ATGCA(C/T)GG-3′
对应于区域II的C-端肽H(W/H)EHH(R/L)用于设计两个有反义序列的17基体(mer)简并引物crtW105和crtW106:
crtW105:5′-AG(G/A)TG(G/A)TG(T/C)TC(G/A)TG(G/A)TG-3′
crtW106:5′-AG(G/A)TG(G/A)TG(T/C)TCCCA(G/A)TG-3′
聚合酶链式反应。PCR使用Gene Amp试剂盒(Perkin Elmer Cetus)按照厂商说明书进行。不同的PCR反应包含简并引物组合(crtW100/crtW105或crtW100/crtW106或crtW101/crtW105或crtW101/crtW106),终浓度各为50pM,以及细菌E-396的基因组DNA(200ng)和2.5单位Taq聚合酶。按下列循环程序共进行了35个循环PCR:95℃30秒,55℃30秒,72℃30秒。用下列引物组合crtW100/crtW105和crtW101/crtW105进行的PCR反应给出了大约500bp的PCR扩增产物,与预期片段大小相符。使用引物crtW101和crtW105的PCR反应中获得的500bp片段,JAPclone8,从1.5%琼脂糖凝胶中切下并用GENECLEAN试剂盒纯化,随后使用Sure-Clone试剂盒按照厂商说明书克隆到pUC18的SmaI位点。产生的质粒命名为pUC18JAPclone8并且对插入物测序。比较测定的序列与Misawa等在1995年公布的(WO95/18220)橙黄土壤杆菌的crtW基因(GenBank登记号D58420)显示在核苷酸序列水平上96%相同,暗示两种微生物可能紧密相关。
分离菌株E-396的crt基因簇。将E-396的基因组DNA用不同组合限制性酶消化过夜并用琼脂糖凝胶电泳分离,之后通过Southern印迹把产生的片段转移到硝酸纤维素膜。印迹与通过BssHII和MluI消化前述PCR片段JAP clone8获得的32p标记的334bp片段杂交。检测到一个最适于用于克隆的与探针杂交的大约9.4kb的EcoRI/BamHI片段,因为它有足够的长度以可能载有完整的crt基因簇。分离这一片段并克隆到pBluescriptIIKS的EcoRI和BamHI位点产生了质粒pJAPCL544(图29)。基于PCR片段JAPclone8的序列合成了两个引物以获得该片段左方和右方更多的序列信息。图30显示了获得的含有细菌E-396的crtWE396(从核苷酸40到768)和crtZE396(从核苷酸765到1253)基因的序列。crtWE396基因的核苷酸序列显示于图31,编码的氨基酸序列在图32。crtZE396基因的核苷酸序列显示于图33,相应的氨基酸序列在图34。对比E-396的crtWE396基因和橙黄土壤杆菌的crtW基因显示出在核苷酸水平97%相同和在氨基酸水平99%相同。对crtZ基因的值分别为98%和99%。
质粒构建:按照厂商推荐方法,使用引物crtW107和crtW108以及Boehringer Mannheim的ExpandTM高保真PCR系统,通过PCR分离到在E-393基因组中相邻的两个基因crtWE396和crtZE396。为了便于随后的克隆步骤(参看下面部分),含有人工NdeI位点(划线序列)的引物crt107(5′-AT
CATATGAGCGCACATGCCCTGCCCAAGGC-3′)跨越crtWE396基因的ATG起始密码子并且具有XhoI位点的(划线序列)反向引物crtW108(5′-AT
CTCGAGTCACGTGCGCTCCTGCGCCTCGGCC-3′)恰好位于crtZE396TGA终止密码子的下游。最后的PCR反应混合液有10pM每种引物,2.5mg细菌E-396的基因组DNA和3.5单位Taq DNA/PwoDNA聚合酶混合液。总共用下列循环程序进行了35个循环:95℃,1分钟;60℃,1分钟;72℃,1分钟30秒。大约1250bp的PCR产物从1%琼脂糖凝胶中分离并用GENECLEAN纯化,之后用Sure-Clone试剂盒连接到pUC18的SmaI位点。产生的构建体命名为pUC18-E396crtWZPCR(图35)。两个基因的功能度测试如下。用NdeI和XhoI把crtWE396和crtZE396基因从质粒pUC18-E396crtWZPCR中分离并克隆到质粒pBIIKS-CHEBIYZW的NdeI和SalI位点,产生质粒pBIIKS-crtEBIY[E396WZ](图36)。用这一质粒转化的大肠杆菌TG1细胞产生虾青素,阿东黄质和阿东红质但不产生玉米黄质(表4)。
质粒pBIIKS-crtEBIY[E396W]DZ有一个截短的非功能crtZ基因。图37简述了此质粒的构建。 PCR反应如简述于本文它处的方法进行,使用引物crtW113/crtW114并且以200ng质粒pUC18-JAPclone8作为模板,应用20循环的如下方案:95℃,45秒/62℃,20秒/72℃,20秒。
引物crtW113:(5′-ATATACATATGGTGTCCCCCTTGGTGCGGGTGC-3′)
引物crtW114:(5′-TATGGATCCGACGCGTTCCCGGACCGCCACAATGC-3′)
产生的150bp片段用BamHI和NdeI消化并克隆到pBIISK(+)、-PCRRBScrtZ的相应位点产生构建体pBIISK(+)-PCRRBScrtZ-2。最终的载有黄杆菌crtE,crtB,crtI,crtY基因,E-396的crtWE396基因及截短的非功能黄杆菌crtZ基因的质粒通过分离pBIISK(+)-PCRRBScrtZ-2的MluI/NruI片段(280bp)并克隆到质粒pBIIKS-crtEBIY[E396WZ]的MluI/PmlI位点获得。用此质粒转化的大肠杆菌细胞产生100%裸藻酮(表4;“CRX”;隐黄质;“ASX”:虾青素;“ADX”:阿东黄质;“ZXN”:玉米黄质;“ECH”:海胆酮;“HECH”:3-羟海胆酮;“CXN”:裸藻酮;“BCA”:β胡萝卜素;“ADR”:阿东红质(adonirubin);数字代表各种类胡萝卜素占细胞产生的总类胡萝卜素的百分数)。
表4
质粒 | CRX | ASX | ADX | ZXN | ECH | HECH | CXN | BCA | ADR |
pBIIKScrtEBIYZW | 1.1 | 2.0 | 44.2 | 52.4 | <1 | <1 | <1 | ||
pBIIKS-crtEBIY[E396WZ] | 74.4 | 19.8 | 5.8 | ||||||
pBIIKS-crtEBIY[E396W]ΔZ | 100 |
载有pBIIKScrtEBIYZW(参看实施例7)的大肠杆菌转化体的结果也显示于表4以表明新基因crtWE396和crtZE396对这些新转化体类胡萝卜素产生的显著效应。
实施例9
革兰氏阴性细菌E-396其余crt基因的克隆
载有pJAPCL544质粒的TG1大肠杆菌转化子不产生可检测量的类胡萝卜素(未显示结果)。序列测定及质粒pJAPCL544插入物3′端(BamHI位点)与黄杆菌121534crt基因簇比较显示只存在crtE基因C-末端的一部分。这一结果解释了上述转化体中类胡萝卜素产生的缺乏。为了分离基因丢失的N-末端,E-396的基因组DNA用6种限制性酶的不同组合消化:EcoRI,BamHI,PstI,SacI,SphI和XbaI并通过Southern印迹技术转移到硝酸纤维素膜。此膜与32P放射性标记探针[来源于pJAPCL544插入物3′端的一个463bpPstI-BanHI片段(图29)]杂交突出了一个大约1300bp长度的PstI-PstI片段。比片段分离并克隆到pBSIIKS(+)的PstI位点产生了质粒pBSIIKS-#1296。插入物的序列显示于图38(小写字母指获得的新序列。大写字母表示也存在于质粒pJAPCL544插入物3′端的序列)。完整的crtE基因从而有882bp的长度(参看图39)并编码一个294个氨基酸的GGPP合成酶(图40)。此crtE酶与草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)crtE氨基酸序列有38%相同并且与黄杆菌(Flavobacterium)R1534WT有66%相同。
质粒构建。为得到载有E-396完整crt基因簇的质粒,从pJAPCL544中分离编码crt W,crtZ,crtY,crtI和crtB基因的4.7kb MlnI/BamHI片段并克隆到pUC18-E396crtWZPCR的MluI/BamHI位点(参看实施例8)。新构建体命名为pE396CARcrtW-B(图4 1)并缺少crtE基因的N-末端。crtE基因丢失的C-未端部分然后通过连接上述pBIIKS-#1296的PstI片段到pE396CARcrtW-B的PstI位点之间而引入。产生的质粒命名为pE396 CARcrtW-E(图41)。载有上述质粒的大肠杆菌转化体中类胡萝卜素分布为:阿东黄质(65%),虾青素(8%)和玉米黄质(3%)。显示的百分数反映了占细胞产生类胡萝卜素总量的比率。
实施例10
黄杆菌(Flavobacterium)R1534中虾青素和阿东黄质生产
在细菌中,黄杆菌(Flavobacterium)可代表3R,3R′玉米黄质发酵生产工艺发展的最好来源。通过经典突变获得的黄杆菌(Flavobacterium SP.)衍生菌株R1534在过去二十年中用于发展大规模发酵生产玉米黄质虽然收效甚微,但吸引了广泛的关注。此微生物类胡萝卜素生物合成基因的克隆,如实施例2中所概述,可能提供了替代经典突变方法的更合理方法,使用分子工具扩增相关基因拷贝数,下调节它们的表达并消除类胡萝卜素生物合成途径的难关。此外,附加异源基因(例如crtW)的导入会导致产生出此菌通常并不合成的类胡萝卜素(虾青素,阿东红质,阿东黄质,裸藻酮,海胆酮)。这类重组黄杆菌(Flavobacterium)R1534菌株的构建以产生虾青素和阿东黄质将概述于下面。
基因转移到黄杆菌(Flavobacterium SP.)
通过接合转移进行质粒转移。为了接合杂交,我们构建了质粒pRSF1010-Ampr,一个小(8.9kb)广泛宿主范围质粒RSF1010(IncQ不相容组)[Guerry等,细菌学杂志(J.Bacteriol.)117:619-630(1974)]的衍生物,并用大肠杆菌S17-1作为转移菌株[Priefer等,细菌学杂志(J.Bacteriol.)163:324-330(1985)]。通常,如果由IncP1不相容组的质粒(例如R1,R751)提供转移功能,任何IncQ质粒(例如RSF1010,R300B,R1162)都可能转移到利幅平抗性黄杆菌。
利用福平抗性(Rifr)黄杆菌R1534细胞在100毫克利福平/毫升中筛选获得。挑选到一个抗性克隆并制成贮藏培养物。接合流程如下:
第1天:
-3毫升黄杆菌R1534Rifr在黄杆菌培养基(F-培养基)中于30℃下生长24小时(参看实施例1)
-3毫升载有可转移质粒的转移大肠杆菌菌株在LB培养基中于37℃下生长过夜(O/N)(例如载有pRSF1010-Ampr的大肠杆菌S17-1或载有R751和pRSF1010-Ampr的大肠杆菌TG-1细胞。
第2天:
-沉淀1毫升黄杆菌R1534Rif细胞并重新悬浮于1毫升新鲜F-培养基。
-沉淀1毫升大肠杆菌细胞(参看上面)并重新悬浮于1毫升LB培养基。
-供体和受体细胞随后以1∶1和1∶10的比率在Eppendorf管中混合并且把30毫升涂到铺于含有F-培养基的琼脂平板上的硝酸纤维素滤膜上面并在30℃下培育过夜(O/N)。
第3天:
-接合混合物F-培养基洗脱并铺平板到含有100毫克利福平和100毫克氨苄青霉素/毫升的F-培养基上以选择转化接合体和抑制供体细胞。
第6-8天:
-产生的克隆在检测之前于含有100毫克利福平和100毫克氨苄青霉素/毫升的F-培养基再铺一次平板。
电穿孔质粒转移。电穿孔流程如下:
1.把10毫升黄杆菌菌种R1534的过夜(O/N)培养物加入500毫升F-培养基并在30℃下培养至OD600=0.8-0.1。
2.4000g,4℃下离心10分钟收获细胞。
3.用等体积冰冷去离子水洗细胞(2次)。
4.重新悬浮细菌沉淀于1毫升冰冷去离子水中。
5.取50毫升细胞与0.1毫克质粒DNA用于电穿孔。
6.用15到25KV/cm的场强和1-3ms完成电穿孔。
7.电穿孔后细胞立即稀释于1毫升F-培养基并在30℃,180rpm培养2小时,之后铺平板到含有相应选择性抗生素的F-培养基上。
质粒构建:质粒pRSF101-Ampr是通过把pBR322的Ampr基因克隆到RSF1010的EcoRI/NotI位点之间而获得。Ampr基因起源于pBR322并且如图42所示用PCR方法使用引物AmpR1和AmpR2分离。
AmpR1:
5′-TATAT
CGGCCGACTAGTAAGCTTCAAAAAGGATCTTCACCTAG-3′,划线的序列含有引入的EagI,SpeI和HindIII限制性位点以便于随后的构建。
AmpR2:
5′-ATAT
GAATTCAATAATATTGAAAAAGGAAG-3′,划线的序列对应于引入的EcoRI位点以便于克隆到RSF1010(参看图42)。
PCR反应混合液含有10PM每种引物(AmpR1/AmpR2), 0.5毫克质粒pBR322和3.5单位TaqDNA/PWO DNA聚合酶混合液。按下列流程总共进行了35个扩增循环:95℃,45秒;59℃,45秒;72℃,1分钟。大约950的PCR产物用酚/氯仿抽提一次并用0.3M醋酸钠和2体积乙醇沉淀。沉淀重新悬浮于水并用EcoRI和EagIO/N消化。消化液通过电泳分离,片段从1%琼脂糖凝胶中分离并使用GENECLEAN纯化,之后连接到RSF1010的EcoRI和NotI位点。产生的质粒命名为pRSF1010-Ampr(图42)。
质粒RSF1010-Ampr-crt1通过从pBIIKS-crtEBIY[E396WZ]分离HindIII/NotI片段并克隆到RSF1010-Ampr的HindIII/EagI位点之间获得。产生的质粒RSF1010-Ampr-crt1载有crtWE396,crtZE396,crtY基因和crtI基因的N-末端(无功能的)。质粒RSF1010-Ampr-crt2载有由E-396的crtWE396和crtZE396和黄杆菌R1534的crtY,crtI,crtB和crtE基因组成的完整crt基因簇,它通过分离pBIIKS-crtEBIY[E396WZ]的大HindIII/XbaI片段并克隆到RSF1010-Ampr的SpeI/HindIII位点获得(图43)。
载有质粒RSF1010-Ampr,质粒RSF1010-Ampr-crt1或质粒RSF1010-Ampr-crtZ的黄杆菌R1534转化体通过如上所述的接合方法,使用大肠杆菌S17-1作为转移菌株获得。
两株黄杆菌转化体类胡萝卜素产生的比较。各个转化体过夜培养物稀释到20毫升新鲜F-培养基中至最终的OD600值是0.4。30℃生长48小时后收集细胞并按照实施例7所述检测类胡萝卜素含量。表5显示了三个对照培养物黄杆菌[R1534WT],[R1534WT RIfR](利福平抗性)和[R1534WT RifrRSF1010-AmpR](载有RSF1010-Ampr质粒)及两个转化体[R1534 WTRSF1010-AmpR-crt1]和[R1534 WT RSF1010-AmpR-crt2]的结果。后面的两个转化体都能合成虾青素和阿东黄质但少有玉米黄质。最信人感兴趣的是[R1534 WT RSF1010-AmpR-crt2]黄杆菌转化体比R1534产生大约4倍多的类胡萝卜素。这种类胡萝卜素总产量的增加最可能归因于存在于这些细胞的类胡萝卜素生物合成基因簇数目的增加(例如与细胞中质粒总拷贝数相对应)。
表5
转化体 | 类胡萝卜素占总干重百分数 | 干重中类胡萝卜素总含量(%) |
R1534WT | 0.039%β-胡萝卜素0.001%β-隐黄质0.018%米黄质 | 0.06% |
R1534 Rifr | 0.036%β-胡萝卜素0.002%β-隐黄质0.022%玉米黄质 | 0.06% |
R1534 Rifr[RSF1010-Ampr] | 0.021%β-胡萝卜素0.002%β-隐黄质0.032%米黄质 | 0.065% |
R1534 Rifr[RSF1010-Ampr-crt1] | 0.022%虾青素0.075%阿东黄质0.004%玉米黄质 | 0.1% |
R1534 Rifr[RSF1010-Ampr-crt2] | 0.132%β-胡萝卜素0.006%海胆酮0.004%羟基海胆酮0.003%β-隐黄质0.044%虾青素0.039%阿东黄质0.007%米黄质 | 0.235% |
Claims (5)
1.制备阿东黄质和虾青素的混合物或单独的阿东黄质或虾青素的方法,所述方法包括在适宜充分表达可催化焦磷酸法呢基酯和焦磷酸异戊烯酯转化成阿东黄质和虾青素的培养条件下,培养含有焦磷酸法呢基酯和焦磷酸异戊烯酯的重组宿主细胞,其中所述重组宿主细胞用包含调节序列以及含有以下编码酶的DNA序列的多核苷酸的表达载体转化:
a)DNA序列,其编码黄杆菌R1534的焦磷酸香草基香草基酯合成酶(crtE)(SEQ ID NO:2),或者编码与黄杆菌R1534 crtE的氨基酸序列有超过90%的相同氨基酸、且显示与黄杆菌R1534 crtE编码的酶有相同酶活性的氨基酸序列;
b)DNA序列,其编码黄杆菌R1534的前八氢番茄红素合成酶(crtB)(SEQID NO:3),或者编码与黄杆菌R1534 crtB的氨基酸序列有超过90%的相同氨基酸、且显示与黄杆菌R1534 crtB编码的酶有相同类型酶活性的氨基酸序列;
c)DNA序列,其编码黄杆菌R1534的八氢番茄红素脱氢酶(crtI)(SEQ IDNO:4),或者编码与黄杆菌R1534 crtI的氨基酸序列有超过90%的相同氨基酸、且显示与黄杆菌R1534 crtI编码的酶有相同类型酶活性的氨基酸序列;
d)DNA序列,其编码黄杆菌R1534的番茄红素环化酶(crtY)(SEQ IDNO:5),或者编码与黄杆菌R1534 crtY的氨基酸序列有超过90%的相同氨基酸、且显示与黄杆菌R1534 crtY编码的酶有相同类型酶活性的氨基酸序列;
e)DNA序列,其编码微生物E-396(FERM BP-4283)的β-胡萝卜素羟化酶[crtZE396](SEQ ID NO:34),或编码与微生物E-396(FERM BP-4283)crtZE396的氨基酸序列有超过95%的相同氨基酸、且显示与微生物E-396(FERMBP-4283)crtZE396编码的酶有相同类型酶活性的氨基酸序列;
f)DNA序列,其编码产碱杆菌PC-1株的β-胡萝卜素β4-加氧酶(crtW)(SEQ ID NO:29),或编码与产碱杆菌PC-1株crtW的氨基酸序列有超过90%的相同氨基酸、且显示与产碱杆菌PC-1株crtW编码的酶有相同类型酶活性的氨基酸序列;
以及从这类细胞的培养基中分离阿东黄质和虾青素混合物或单独的阿东黄质或虾青素。
2.权利要求1的方法,其特征是所转化的宿主细胞是原核宿主细胞。
3.权利要求2的方法,其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌,芽孢杆菌或黄杆菌。
4.权利要求1的方法,其特征是所转化的宿主细胞是真核宿主细胞。
5.权利要求4的方法,其中所述真核宿主细胞是酵母或真菌细胞。
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