CN108148763A - 一种通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法 - Google Patents

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王志臻
孙发强
王珊珊
刘珊珊
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    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Abstract

本发明涉及一种通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法，本发明通过流加混合氮源，能够极大程度提高纤细裸藻在摇匀瓶中中后期的发酵水平；通过流加高浓度碳源，能够极大程度保证纤细裸藻摇瓶发酵中后期对碳源的需求，进而能够提高摇瓶中单批次发酵强度；通过以上操作，较大程度地提高了摇瓶发酵过程中纤细裸藻生物量的积累，本发明为纤细裸藻的小试、中试及生产提供重要的参考数据，对纤细裸藻的规模化培养有着极大的意义。

Description

一种通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法
技术领域
本发明涉及一种通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法，属于微生物（微藻）发酵领域，涉及裸藻异养发酵的生产。
背景技术
裸藻，又称眼虫，是由17世纪著名的生物学家列文虎克发现并命名，属裸藻门，裸藻纲，裸藻目中的一种单细胞藻类，因除自身含有叶绿素能够进行光合作用外，还能够利用自主利用自然界有机碳源进行自主营养，具有动物和植物两种特性，裸藻细胞内含有丰富营养成分:维生素、矿物营养物、氨基酸、不饱和脂肪酸、叶绿素、黄体素、玉米黄质、GABA等59种人体每天必需的营养元素，均是维持健康所不可缺少的营养素，早在2013年裸藻就已经被审批为功能性新资源食品原料，但目前工业化养殖技术一直被日本，美国控制，国内一直还没有突破，裸藻作为食品原材料不仅具有全营养的特性，它还含有独特的裸藻多糖，其具有特殊的大分子多孔结构，可以吸附包裹人体中的有害物质如重金属、嘌呤、胆固醇、中性脂肪、酒精等将它们带出体外，因此具有抗氧化、抗病毒、清除自由基的作用。其抗癌、抗细菌活性，抗病毒(HIV)活性的能力也较为显著。在保护肝脏、缓和过敏性皮炎、抑制嘌呤吸收和预防改善痛风方面更是具有独特作用，又因裸藻同时具有动物和植物两种特性，除自身光合作用进行自养营养方式外，还能够通过摄取外界有机碳源进行异养生殖。
目前，纤细裸藻发酵的研究处于初级研究阶段，存在以下的问题：
（1）缺乏高产藻株；
（2）大多研究型企业及院校尚还处在小试实验摸索阶段；
（3）生产工艺急待进一步改进；
（4）培养营养液的成本需要进一步降低；
（5）产物提取及后加工工艺需进一步优化。
在纤细裸藻高密度培养的工业化进程中主要面临着两方面的技术瓶颈，一是能够筛选出高产藻株，二是通过发酵工艺的改变探索最适合纤细裸藻生长的发酵条件，攻克此两点能够为工业化生产的实现提供有力的保障。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法，包括如下步骤：
（1）将纯种纤细裸藻接种至摇瓶营养液中，置于摇床中以温度25～35℃，转速150～250rpm进行48～72h的恒温恒转速培养，得到种子培养藻液；
所述的摇瓶营养液的配方如下：(NH4)2SO4 0.8g/L～1.2g/L、KH2PO4 1.8g/L～2.2g/L、酵母抽提物5.0g/L～15.0g/L、葡萄糖30.0g/L～50.0g/L、Na2SO4 12.0g/L～16.0g/L、K2SO4 0.60g/L～0.70g/L、MgSO4 1.8g/L～2.2g/L、CaCl2 0.25g/L～0.26g/L、微量元素溶液1.5mL/L～2.5mL/L；
其中，微量元素溶液配方为：MnCl2·4H2O 0.82g/L～0.88g/L、FeSO4·7H2O 0.50g/L～0.55g/L、CuSO4·5H2O 0.5g/L～0.7g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L～1.45g/L、NiSO4·6H2O0.05g/L～0.07g/L、CoCl2·6H2O 0.005g/L～0.008g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L～0.012g/L；
（2）将步骤（1）得到的得到种子培养藻液转接到装有营养液的下一级摇瓶中，接种体积为营养液装液量的5～10%，于25～30℃、150～250rpm条件下进行48～72h的恒温恒转速培养，同时测定藻细胞的生物量干重；
（3）若步骤（2）得到的藻液中藻细胞的生物量干重大于18～22g/L时，按步骤（1）的培养条件重复进行培养，直至藻种中纤细裸藻生物量干重达到10～12g/L；若藻液中藻细胞的生物量干重小于等于18～22g/L时，则直接进行下一步摇瓶培养；
（4）将步骤（3）符合条件的藻液以5～10%（V/V）的接种量接种到装有发酵培养基的摇瓶中，于28～32℃、125～175rpm条件下进行发酵培养；
所述的发酵培养基的配方为：(NH4)2SO4 0.8g/L～1.2g/L、酵母抽提物2.5g/L～3.5g/L、谷氨酸钠8.0g/L～9.0g/L、KH2PO4 1.8g/L～2.2g/L、CaCl2 0.25g/L～0.26g/L、葡萄糖50.0g/L～70.0g/L、玉米浆干粉4.0g/L～5.0g/L、Na2SO4 12.0g/L～16.0g/L、MgSO4 1.8g/L～2.2g/L、K2SO4 0.60g/L～0.70g/L、微量元素溶液 1.5mL/L～2.5mL/L；
（5）发酵培养50～70h后，待发酵罐营养液中葡萄糖含量降至10g/L以下开始多次流加葡萄糖溶液，使葡萄糖含量控制在30～50g/L之间，同时在发酵培养30～40h期间进行流加氮源溶液，氮源溶液的流加量为摇瓶装液量的1/5～1/4，发酵培养至80～120h期间时，定时测定发酵过程葡萄糖消耗速率，待其降至2g/L·h以下，停止葡萄糖溶液流加，直至剩余葡萄糖耗尽后停止发酵。
根据本发明优选的，步骤（1）～（3）中所述的摇瓶的体积为250mL，装液量为50mL。
根据本发明优选的，步骤（5）流加的葡萄糖溶液浓度为700.0～750.0g/L。
根据本发明优选的，步骤（5）流加的氮源溶液浓度为210.0～320.0g/L。
根据本发明优选的，步骤（5）流加的氮源溶液中氮源为酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠的混合物，其中，玉米浆干粉浓度为125.0～175.0g/L，酵母抽提物浓度为10.0～20.0g/L，谷氨酸钠浓度为75.0～125.0g/L。
本发明具有如下优点和效果：本发明通过流加混合氮源，能够极大程度提高纤细裸藻在摇匀瓶中中后期的发酵水平；通过流加高浓度碳源，能够极大程度保证纤细裸藻摇瓶发酵中后期对碳源的需求，进而能够提高摇瓶中单批次发酵强度；通过以上操作，较大程度地提高了摇瓶发酵过程中纤细裸藻生物量的积累、。本发明为纤细裸藻的小试、中试及生产提供重要的参考数据，对纤细裸藻的规模化培养有着极大的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例所用种子培养基配方为：(NH4)2SO4浓度为1.0g/L、酵母抽提物浓度为10.0g/L、KH2PO4浓度为2.0g/L、葡萄糖浓度为40g/L、MgSO4浓度为2.0g/L、CaCl2浓度为0.255g/L、Na2SO4浓度为14.0g/L、K2SO4浓度为0.65g/L、微量元素含量为2.0mL/L。其中，微量元素溶液的配方为：FeSO4·7H2O 0.5g/L、MnCl2·4H2O 0.82g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L、CoCl2·6H2O0.005g/L、NiSO4·6H2O 0.05g/L、CuSO4·5H2O 0.5g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L。
发酵培养基配方为：NH4)2SO4浓度为1.0g/L、KH2PO4浓度为2.0g/L、酵母抽提物浓度为3.0g/L、玉米浆干粉浓度为4.5g/L、谷氨酸钠浓度为8.5g/L、葡萄糖浓度为50.0g/L、Na2SO4浓度为14.0g/L、MgSO4浓度为2.0g/L、K2SO4浓度为0.65g/L、(CaCl2浓度为0.255g/L、微量元素含量为2mL/L。其中，微量元素溶液的配方为：MnCl2·4H2O 0.82g/L、CoCl2·6H2O0.005g/L、FeSO4·7H2O 0.5g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L、NiSO4·6H2O 0.05g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L、 CuSO4·5H2O 0.5g/L。
（1）从-80℃冰箱中取甘油管保藏的纯种纤细裸藻藻种，将其接种至装有50mL种子营养液的250mL摇瓶中，在摇床中以温度25℃、转速150rpm进行48小时的恒温恒转速培养。
（2）将步骤（1）得到的藻液取样镜检，确保无染菌之后转接到装有50mL营养液的250mL摇瓶中，接种体积为营养液液量的5%，于25℃、150rpm条件下进行恒温恒转速培养48小时，测定所得纤细裸藻生物量干重为10.5g/L，收集藻液。
（3）将步骤（2）收集的藻液20mL接种到装有200mL发酵营养液的1000mL摇瓶中，于28℃、150rpm条件下进行发酵培养。
（5）发酵培养55h后，待发酵罐营养液中葡萄糖含量降至10g/L以下开始多次流加葡萄糖溶液（750.0g/L），维持营养液中葡萄糖含量为30～50g/L；在发酵培养至37.5h时，流加50mL混合氮源溶液（235g/L），该混合氮源溶液包括酵母抽提物10.0g/L、玉米浆干粉125.0g/L、谷氨酸钠100.0g/L。发酵培养93h时，测定发酵过程葡萄糖消耗速率降至2g/L·h以下时，停止葡萄糖溶液流加，继续培养的同时测定发酵液中葡萄糖含量，直至剩余葡萄糖浓度低于5g/L时停止发酵。其中，葡萄糖浓度检测所用方法为酶法测定，仪器为山东科学院生产的生化传感分析仪，操作方法如下：取少量培养藻液，离心后取上清液用无菌水稀释100倍，用上样器吸取25μL稀释液注入已定标好的生化传感分析仪的进样口中，屏幕显示数值稳定后，读取数值即为发酵液中葡萄糖含量。
收集藻液用无菌水进行两次洗涤后，离心，收集菌泥进行真空冷冻干燥，测定藻细胞生物量干重，通过真空冷冻干燥后测得发酵液中的菌体干重达到25.5g/L。
实施例2
本实施例所用种子培养基配方为：(NH4)2SO4浓度为1.0g/L、酵母抽提物浓度为8.0g/L、KH2PO4浓度为2.0g/L、葡萄糖浓度为50g/L、Na2SO4浓度为14.0g/L、MgSO4浓度为2.0g/L、K2SO4浓度为0.65g/L、CaCl2浓度为0.255g/L、微量元素含量为2.0mL/L。其中，微量元素溶液的配方为：ZnSO4·7H2O 1.40g/L 、MnCl2·4H2O 0.82g/L、FeSO4·7H2O 0.5g/L、CuSO4·5H2O0.5g/L、、CoCl2·6H2O 0.005g/L、NiSO4·6H2O 0.05g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L。
发酵培养基配方为：(NH4)2SO4浓度为1.0g/L、葡萄糖浓度为70.0g/L、酵母抽提物浓度为3.0g/L、玉米浆干粉浓度为4.5g/L、谷氨酸钠浓度为8.5g/L、KH2PO4浓度为2.0g/L、MgSO4浓度为2.0g/L、Na2SO4浓度为14.0g/L、K2SO4浓度为0.65g/L、CaCl2浓度为0.255g/L、微量元素含量为2mL/L。其中，微量元素溶液的配方为：FeSO4·7H2O 0.5g/L、MnCl2·4H2O0.82g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L、CoCl2·6H2O 0.005g/L、NiSO4·6H2O 0.05g/L、CuSO4·5H2O0.5g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L。
（1）从-80℃冰箱中取甘油管保藏的纯种纤细裸藻藻种，将其接种至装有50mL营养液的250mL摇瓶中，于25℃摇床中以150rpm转速进行恒温恒转速培养48小时。
（2）将步骤（1）得到的藻液取样镜检，确保无染菌之后转接至装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，接种体积为培养基装液量的10%，于25℃、150rpm条件下进行恒温恒转速培养48小时，测定所得种子液的细胞干重为10.5g/L，收集种子液。
（3）将步骤（2）收集的种子液20mL接种到装有200mL发酵培养基的1000mL摇瓶中，于28℃、150rpm条件下进行发酵培养。
（5）发酵培养60h后，若发酵液中葡萄糖含量降至10g/L以下，开始分批流加葡萄糖溶液（750.0g/L），维持藻液中葡萄糖含量为30～50g/L；在发酵培养至37.5h时，流加50mL混合氮源溶液（235g/L），该混合氮源溶液含有酵母抽提物10.0g/L、玉米浆干粉125.0g/L、谷氨酸钠100.0g/L。发酵培养105h时，测定发酵过程葡萄糖消耗速率降至2g/L·h以下，停止葡萄糖溶液流加，继续培养的同时测定发酵液中葡萄糖含量，直至剩余葡萄糖含量低于5g/L时停止发酵。其中，葡萄糖浓度检测所用方法为酶法测定，仪器为山东科学院生产的生化传感分析仪，操作方法如下：取少量培养藻液，离心后取上清液用无菌水稀释100倍，用上样器吸取25μL稀释液注入已定标好的生化传感分析仪的进样口中，屏幕显示数值稳定后，读取数值即为发酵液中葡萄糖含量。收集藻液用无菌水洗涤两次后，离心，收集菌泥进行真空冷冻干燥，测定纤细裸藻生物量干重，通过真空冷冻干燥后测得发酵液中的菌体干重达到27.3g/L。

Claims (5)

1.一种通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法，包括如下步骤：
（1）将纯种纤细裸藻接种至摇瓶营养液中，置于摇床中以温度25～35℃，转速150～250rpm进行48～72h的恒温恒转速培养，得到种子培养藻液；
所述的摇瓶营养液的配方如下：(NH4)2SO4 0.8g/L～1.2g/L、KH2PO4 1.8g/L～2.2g/L 、酵母抽提物5.0g/L～15.0g/L、葡萄糖30.0g/L～50.0g/L、Na2SO4 12.0g/L～16.0g/L、K2SO40.60g/L～0.70g/L、MgSO4 1.8g/L～2.2g/L、CaCl2 0.25g/L～0.26g/L、微量元素溶液1.5mL/L～2.5mL/L；
其中，微量元素溶液配方为：MnCl2·4H2O 0.82g/L～0.88g/L、FeSO4·7H2O 0.50g/L～0.55g/L、CuSO4·5H2O 0.5g/L～0.7g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L～1.45g/L、NiSO4·6H2O0.05g/L～0.07g/L、CoCl2·6H2O 0.005g/L～0.008g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L～0.012g/L；
（2）将步骤（1）得到的得到种子培养藻液转接到装有营养液的下一级摇瓶中，接种体积为营养液装液量的5～10%，于25～30℃、150～250rpm条件下进行48～72h的恒温恒转速培养，同时测定藻细胞的生物量干重；
（3）若步骤（2）得到的藻液中藻细胞的生物量干重大于18～22g/L时，按步骤（1）的培养条件重复进行培养，直至藻种中纤细裸藻生物量干重达到10～12g/L；若藻液中藻细胞的生物量干重小于等于18～22g/L时，则直接进行下一步摇瓶培养；
（4）将步骤（3）符合条件的藻液以5～10%（V/V）的接种量接种到装有发酵培养基的摇瓶中，于28～32℃、125～175rpm条件下进行发酵培养；
所述的发酵培养基的配方为：(NH4)2SO4 0.8g/L～1.2g/L、酵母抽提物2.5g/L～3.5g/L、谷氨酸钠8.0g/L～9.0g/L、KH2PO4 1.8g/L～2.2g/L、CaCl2 0.25g/L～0.26g/L、葡萄糖50.0g/L～70.0g/L、玉米浆干粉4.0g/L～5.0g/L、Na2SO4 12.0g/L～16.0g/L、MgSO4 1.8g/L～2.2g/L、K2SO4 0.60g/L～0.70g/L、微量元素溶液 1.5mL/L～2.5mL/L；
（5）发酵培养50～70h后，待发酵罐营养液中葡萄糖含量降至10g/L以下开始多次流加葡萄糖溶液，使葡萄糖含量控制在30～50g/L之间，同时在发酵培养30～40h期间进行流加氮源溶液，氮源溶液的流加量为摇瓶装液量的1/5～1/4，发酵培养至80～120h期间时，定时测定发酵过程葡萄糖消耗速率，待其降至2g/L·h以下，停止葡萄糖溶液流加，直至剩余葡萄糖耗尽后停止发酵。
2.根据权利要求1所述的通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法，其特征在于，步骤（1）～（3）中所述的摇瓶的体积为250mL，装液量为50mL。
3.根据权利要求1所述的通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法，其特征在于，步骤（5）流加的葡萄糖溶液浓度为700.0～750.0g/L。
4.根据权利要求1所述的通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法，其特征在于，步骤（5）流加的氮源溶液浓度为210.0～320.0g/L。
5.根据权利要求1所述的通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法，其特征在于，步骤（5）流加的氮源溶液中氮源为酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠的混合物，其中，玉米浆干粉浓度为125.0～175.0g/L，酵母抽提物浓度为10.0～20.0g/L，谷氨酸钠浓度为75.0～125.0g/L。
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