CN105002227B - 一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法 - Google Patents

一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，属于微生物发酵领域。本发明采用含有微量元素的培养基为发酵培养基，发酵过程中流加葡萄糖溶液维持发酵液中葡萄糖含量在30～50g/L之间，同时流加一次发酵液体积1/5～1/4的210.0～320.0g/L混合氮源溶液。本发明通过流加葡萄糖能够保证发酵中后期裂殖壶菌对碳源的需求，提高摇瓶中单批次发酵强度；通过流加混合氮源能够提高裂殖壶菌在摇瓶中后期的发酵水平；上述操作能较大程度地提高摇瓶发酵过程中裂殖壶菌生物量的积累、促进菌丝体中DHA的积累。本发明对裂殖壶菌的规模化培养生产DHA有着极大的意义。

Description

一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯 酸的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及二十二碳六烯酸的生产，具体涉及一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法。
背景技术
研究发现，二十二碳六烯酸(22:6n-3,docosahexaenoic acid,DHA)是人脑成分中主要组成物质之一，其含量大约可占人脑脂质的10％，由于其在大脑中的存在，在一定程度上可以提高脑的柔软性，抑制脑的老化。在胎儿时期，从受精卵在母亲子宫内分裂开始就需要DHA，因此，孕妇应摄入足量的DHA，以促进胎儿大脑的发育和脑细胞的增殖。现在社会，人们越来越注重孕期DHA的补充，在正常的情况下，一位孕妇每天应摄入0.5～1.5g DHA，特别是在胎儿大脑发育最快的妊娠第4个月至婴儿出生后1岁末未发育完成这一重要时期，DHA的摄入尤为重要。
摄入足量的DHA不仅对孕妇及体内胎儿发育有好处，而且婴幼儿、儿童及青少年也应该进行DHA的补充，由于他们正处于接受大量信息的学习阶段，这对脑细胞是一种刺激，补充能保证脑细胞突触延长，使神经细胞之间联系加强，信息的传递更为迅速，大脑功能增强，记忆力提高。此外，DHA对老年人也有重要的保健功能，调查发现，老年人补充适量DHA可以延缓大脑萎缩，防止大脑功能衰退和老年性痴呆症发生。
DHA被人誉为“心血管疾病无可比拟的特效品”，其生理保健功能还有很多，如：(1)可以降低血清中甘油三酯生成及从肝脏排出；(2)降低低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、增加高密度脂蛋白，改变脂蛋白中脂肪酸的组成，从而增加其流动性；(3)增加胆固醇的排泄，抑制内源性胆固醇的合成；(4)可以预防和治疗动脉硬化，对高血压、心血管疾病有一定的治疗作用，被称为“血管清道夫”。
传统的DHA来源主要来自深海鱼油，现如今，鱼油的发展受到自然环境、产品质量、生产成本等各方面的限制越来越大，DHA的价格高居不下，寻求廉价的DHA生物资源提取的可替代的新途径受到国内外学者的广泛关注。
真菌发酵生产DHA是目前国际及国内普遍认可的生物技术，利用真菌发酵生产DHA的研究主要集中在裂殖壶菌Schizochytrium和破囊壶菌Thraustochytrium，裂殖壶菌是目前工业上应用更为广泛的DHA生产菌种，该技术规模化投产之后能够通过利用真菌发酵生产DHA可以克服从鱼油获取DHA的不足，能够人为控制影响因素，保持DHA产量和含量的稳定。
裂殖壶菌发酵生产DHA的研究已经取得非常可观的进展，但还存在以下的问题：
(1)缺乏高产菌株；
(2)大多研究型企业及院校还处在摇瓶及小规模实验阶段；
(3)提取工艺有待进一步改进；
(4)培养基质的成本需要进一步降低；
(5)发酵工艺需进一步优化。
在裂殖壶菌发酵生产DHA的工业化进程中，当前最迫切的任务一是能够筛选出高产菌株，二是通过发酵工艺的改变探索最适合裂殖壶菌高产DHA的发酵条件，攻克此两点能够为工业化生产的实现提供有力的保障。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌菌种接种至装有种子培养基的摇瓶中，于25～35℃摇床中以150～250rpm转速进行恒温恒转速培养20～35h。
所述的种子培养基的配方为：葡萄糖30.0g/L～50.0g/L、酵母抽提物5.0g/L～15.0g/L、Na2SO412.0g/L～16.0g/L、MgSO41.8g/L～2.2g/L、K2SO40.60g/L～0.70g/L、(NH4)2SO40.8g/L～1.2g/L、CaCl20.25g/L～0.26g/L、KH2PO41.8g/L～2.2g/L、微量元素溶液1.5mL/L～2.5mL/L；其中，微量元素溶液的配方为：FeSO4·7H2O 0.50g/L～0.55g/L、MnCl2·4H2O 0.82g/L～0.88g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L～1.45g/L、CoCl2·6H2O 0.005g/L～0.008g/L、NiSO4·6H2O 0.05g/L～0.07g/L、CuSO4·5H2O 0.5g/L～0.7g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L～0.012g/L。
(2)将步骤(1)得到的种子液转接到装有种子培养基的摇瓶中，接种体积为培养基装液量的5～10％，于25～30℃、150～250rpm条件下进行恒温恒转速培养16～20h，测量所得种子液的细胞干重，若得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L，则直接进行步骤(4)。
(3)若步骤(2)得到的种子液中细胞干重没达到18～22g/L，则将其进一步转接到装有种子培养基的摇瓶中，按照步骤(2)中的方法进行培养；重复该步骤一次或多次至培养得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L。
(4)将上述细胞干重达到18～22g/L的种子液以5～10％(V/V)的接种量接种到装有发酵培养基的摇瓶中，于28～32℃、125～175rpm条件下进行发酵培养。
所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖100.0g/L～120.0g/L、酵母抽提物2.5g/L～3.5g/L、玉米浆干粉4.0g/L～5.0g/L、谷氨酸钠8.0g/L～9.0g/L、Na2SO4 12.0g/L～16.0g/L、MgSO4 1.8g/L～2.2g/L、K2SO4 0.60g/L～0.70g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L～1.2g/L、CaCl20.25g/L～0.26g/L、KH2PO4 1.8g/L～2.2g/L、微量元素溶液1.5mL/L～2.5mL/L，微量元素溶液的配方同上所述。
(5)发酵培养30～40h后，待发酵液中葡萄糖含量降至30g/L以下开始分批流加葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖含量为30～50g/L，同时在发酵培养30～40h期间流加一次浓度为210.0～320.0g/L的混合氮源溶液，混合氮源的流加量为摇瓶装液量的1/5～1/4，该混合氮源含有酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠中的一种或多种；发酵培养至80～120h期间时，定期测定发酵过程葡萄糖消耗速率，待其降至2g/L·h以下，停止葡萄糖溶液流加，直至剩余葡萄糖耗尽后停止发酵。
步骤(1)中所述的裂殖壶菌菌种优选为裂殖壶菌ATCC20888。
步骤(1)～(3)中所述的摇瓶的体积优选为250mL，装液量优选为50mL。
步骤(4)中所述的摇瓶的体积优选为1000mL，装液量优选为200mL。
步骤(5)中所述的葡萄糖溶液的浓度优选为700.0～750.0g/L。
步骤(5)中所述的混合氮源溶液中优选含有酵母抽提物、玉米浆干粉和谷氨酸钠；优选的，其中，玉米浆干粉浓度为125.0～175.0g/L，酵母抽提物浓度为10.0～20.0g/L，谷氨酸钠浓度为75.0～125.0g/L。
本发明具有如下优点和效果：本发明通过流加混合氮源，能够极大程度提高裂殖壶菌在摇匀瓶中后期的发酵水平；通过流加高浓度碳源，能够极大程度保证裂殖壶菌摇瓶发酵中后期对碳源的需求，进而能够提高摇瓶中单批次发酵强度；通过以上操作，较大程度地提高了摇瓶发酵过程中裂殖壶菌生物量的积累、促进了菌丝体中DHA的积累。本发明为裂殖壶菌的小试、中试及生产提供重要的参考数据，对裂殖壶菌的规模化培养生产DHA有着极大的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例所用种子培养基配方为：葡萄糖浓度为40g/L、酵母抽提物浓度为10.0g/L、Na2SO4浓度为14.0g/L、MgSO4浓度为2.0g/L、K2SO4浓度为0.65g/L、(NH4)2SO4浓度为1.0g/L、CaCl2浓度为0.255g/L、KH2PO4浓度为2.0g/L、微量元素含量为2.0mL/L。其中，微量元素溶液的配方为：FeSO4·7H2O 0.5g/L、MnCl2·4H2O 0.82g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L、CoCl2·6H2O 0.005g/L、NiSO4·6H2O 0.05g/L、CuSO4·5H2O 0.5g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L。
发酵培养基配方为：葡萄糖浓度为110.0g/L、酵母抽提物浓度为3.0g/L、玉米浆干粉浓度为4.5g/L、谷氨酸钠浓度为8.5g/L、Na2SO4浓度为14.0g/L、MgSO4浓度为2.0g/L、K2SO4浓度为0.65g/L、(NH4)2SO4浓度为1.0g/L、CaCl2浓度为0.255g/L、KH2PO4浓度为2.0g/L、微量元素含量为2mL/L。其中，微量元素溶液的配方为：FeSO4·7H2O 0.5g/L、MnCl2·4H2O0.82g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L、CoCl2·6H2O 0.005g/L、NiSO4·6H2O 0.05g/L、CuSO4·5H2O 0.5g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L。
(1)从-80℃冰箱中取甘油管保藏的裂殖壶菌ATCC20888菌种，将其接种至装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，于25℃摇床中以150rpm转速进行恒温恒转速培养28小时。
(2)将步骤(1)得到的种子液取样镜检，确保无染菌之后转接到装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，接种体积为培养基装液量的5％，于25℃、150rpm条件下进行恒温恒转速培养18.5小时，测定所得种子液的细胞干重为20.5g/L，收集种子液。
(3)将步骤(2)收集的种子液20mL接种到装有200mL发酵培养基的1000mL摇瓶中，于28℃、150rpm条件下进行发酵培养。
(5)发酵培养37.5h后，待发酵液中葡萄糖含量降至30g/L以下开始分批流加浓度为750.0g/L的葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖含量为30～50g/L；同时在发酵培养至37.5h时，流加50mL浓度为235g/L的混合氮源溶液，该混合氮源溶液含有酵母抽提物10.0g/L、玉米浆干粉125.0g/L、谷氨酸钠100.0g/L。发酵培养93h时，测定发酵过程葡萄糖消耗速率降至2g/L·h以下，停止葡萄糖溶液流加，继续培养并测定发酵液中葡萄糖含量，直至剩余葡萄糖含量低于5g/L时停止发酵。其中，葡萄糖浓度检测所用方法为酶法测定，仪器为山东科学院生产的生化传感分析仪，操作方法如下：取少量发酵液，离心后的上清液用无菌水稀释100倍，将吸取好的25μL稀释液注入已定标好的生化传感分析仪的进样口中，屏幕显示数值稳定后，所得数值即为发酵液中葡萄糖含量。
收集发酵液用无菌水进行两次洗涤后，离心，收集菌泥进行真空冷冻干燥，测定细胞干重及油脂和DHA含量，通过真空冷冻干燥法测得发酵液中的细胞干重达到92.5g/L，通过有机溶剂萃取法测得混合油脂含量占细胞干重的78.69％，通过气相色谱分析法测得DHA占混合油脂的比重为60.75％；发酵液中DHA积累量达44.22g/L。本批次发酵后所得混合油脂的组成成分分析见表1：
表1
脂肪酸种类 质量百分组成(％)
C12:0 0.03
C14:0 1.09
C16:0 24.10
C16:1 0.04
C18:0 1.10
C18:1 0.06
C18:2 0.07
C18:3 0.11
C20:3 0.48
角鲨烯 0.67
C20:5 0.43
C22:0 0.27
C22:5 10.80
C22:6 60.75
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种通过流加策略提高摇瓶发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌ATCC20888菌种接种至装有种子培养基的摇瓶中，于25～35℃摇床中以150～250rpm转速进行恒温恒转速培养20～35h；
所述的种子培养基的配方为：葡萄糖30.0g/L～50.0g/L、酵母抽提物5.0g/L～15.0g/L、Na2SO4 12.0g/L～16.0g/L、MgSO4 1.8g/L～2.2g/L、K2SO4 0.60g/L～0.70g/L、(NH4)2SO40.8g/L～1.2g/L、CaCl2 0.25g/L～0.26g/L、KH2PO4 1.8g/L～2.2g/L、微量元素溶液1.5mL/L～2.5mL/L；
其中，微量元素溶液的配方为：FeSO4·7H2O 0.50g/L～0.55g/L、MnCl2·4H2O 0.82g/L～0.88g/L、ZnSO4·7H2O 1.40g/L～1.45g/L、CoCl2·6H2O 0.005g/L～0.008g/L、NiSO4·6H2O 0.05g/L～0.07g/L、CuSO4·5H2O 0.5g/L～0.7g/L、Na2MoO4·2H2O 0.008g/L～0.012g/L；
(2)将步骤(1)得到的种子液转接到装有种子培养基的摇瓶中，接种体积为培养基装液量的5～10％，于25～30℃、150～250rpm条件下进行恒温恒转速培养16～20h，测量所得种子液的细胞干重，若得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L，则直接进行步骤(4)；
(3)若步骤(2)得到的种子液中细胞干重没达到18～22g/L，则将其进一步转接到装有种子培养基的摇瓶中，按照步骤(2)中的方法进行培养；重复该步骤一次或多次至培养得到的种子液中细胞干重达到18～22g/L；
(4)将上述细胞干重达到18～22g/L的种子液以5～10％(V/V)的接种量接种到装有发酵培养基的摇瓶中，于28～32℃、125～175rpm条件下进行发酵培养；
所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖100.0g/L～120.0g/L、酵母抽提物2.5g/L～3.5g/L、玉米浆干粉4.0g/L～5.0g/L、谷氨酸钠8.0g/L～9.0g/L、Na2SO4 12.0g/L～16.0g/L、MgSO4 1.8g/L～2.2g/L、K2SO4 0.60g/L～0.70g/L、(NH4)2SO4 0.8g/L～1.2g/L、CaCl20.25g/L～0.26g/L、KH2PO4 1.8g/L～2.2g/L、微量元素溶液1.5mL/L～2.5mL/L；
(5)发酵培养30～40h后，待发酵液中葡萄糖含量降至30g/L以下开始分批流加葡萄糖溶液，维持发酵液中葡萄糖含量为30～50g/L，同时在发酵培养30～40h期间流加一次浓度为210.0～320.0g/L的混合氮源溶液，混合氮源的流加量为摇瓶装液量的1/5～1/4，该混合氮源含有酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠中的一种或多种；发酵培养至80～120h期间时，定期测定发酵过程葡萄糖消耗速率，待其降至2g/L·h以下，停止葡萄糖溶液流加，直至剩余葡萄糖耗尽后停止发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)～(3)中所述的摇瓶的体积为250mL，装液量为50mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的摇瓶的体积为1000mL，装液量为200mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的葡萄糖溶液的浓度为700.0～750.0g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5)中所述的混合氮源溶液中含有酵母抽提物、玉米浆干粉、谷氨酸钠；其中，玉米浆干粉浓度为125.0～175.0g/L、酵母抽提物浓度为10.0～20.0g/L、谷氨酸钠浓度为75.0～125.0g/L。
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