CN100510097C - 由Phaffia制备玉米黄素 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了玉米黄素和β-隐黄素的生产方法，包括在水性营养培养基中，需氧条件下培养表达β-胡萝卜素羟化酶基因并且属于Xanthophyllomyces属(Phaffia)的重组微生物，和从所述重组微生物的细胞或培养液分离所得的类胡萝卜素。

Description

由Phaffia制备玉米黄素
本发明涉及叶黄素-类胡萝卜素的生产，特别涉及玉米黄素和β-隐黄素(cryptoxanthin)通过Phaffia属微生物进行生产。
更特别地，本发明提供了一种叶黄素-类胡萝卜素的生产方法，特别是提供了一种玉米黄素和β-隐黄素通过遗传工程修饰的重组Phaffia属微生物进行生产的方法。
用本发明的方法，可以在重组Phaffia属微生物中，生产有用的除虾青素以外的其它叶黄素-类胡萝卜素，如是主要叶黄素-类胡萝卜素的玉米黄素和β-隐黄素。
能生产β-胡萝卜素的任何菌株都适合用作宿主菌。当选择的宿主菌是常规能从β-胡萝卜素生产虾青素的Phaffia菌株时，在导入和表达编码β-胡萝卜素羟化酶的基因后，就可以进行虾青素和其它叶黄素-类胡萝卜素混合物的生产了。另一方面，当选择不能生产虾青素但可以积累β-胡萝卜素的菌株用作宿主菌时，希望可以生产最大量水平的叶黄素-类胡萝卜素，如玉米黄素和β-隐黄素，而且最好还没有虾青素的积累。这种可以积累β-胡萝卜素的宿主菌，可以通过积累虾青素的P.rhodozyma突变而获得。可选择的方法之一是，例如，这种积累β-胡萝卜素的宿主菌可以通过灭活虾青素合成酶而获得。虾青素合成酶是参与虾青素从β-胡萝卜素进行生物合成的酶，该酶在US 6,365,386中有记载。使虾青素合成酶的基因断裂，将是灭活该酶最简便的方法之一。
而且，这种可以积累β-胡萝卜素的宿主菌，也可以从公共典型培养物收集中心获得，例如积累β-胡萝卜素的P.rhodozyma菌ATCC96815，可以从美国典型微生物培养收集中心购买(P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)。从自然界分离新的可积累β-胡萝卜素的P.rhodozyma菌株，则是另一制备本发明宿主菌的方法。需要说明的是，该分离菌株可以是虾青素生产菌的衍生物或自发突变株。
本发明的一个方面是玉米黄素和β-隐黄素的生产方法，包括培养表达β-胡萝卜素羟化酶的重组Phaffia菌株。
所述β-胡萝卜素羟化酶，在β-紫罗酮环3，3’位点催化β-胡萝卜素使其羟基化，经由β-隐黄素而可以生产出叶黄素玉米黄素。编码此酶的基因已经从多个物种分离得到，例如，来自黄杆菌属的(Flavobacterium)种的crtZ基因(US 6,124,113)，来自噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)的crtZ基因，来自草生欧文氏菌(Erwinia herbfcola)的crtZs基因，来自海洋细菌Agrobacterium aurantiacum种以及产碱菌属(Alcaligenes)种，或海洋细菌Paracoccus marcusii(GenBank accession No.Y15112，1997)的crtZ基因，而且Paracoccus carotinifaciens种nov.的β-胡萝卜素羟化酶基因也可以从植物获得。
本发明可以使用任何可编码有β-胡萝卜素羟化酶活性的基因。
优选地，所述β-胡萝卜素羟化酶基因可以从有β-胡萝卜素羟化酶基因的微生物中获得，这些微生物可以选自黄杆菌属，欧文氏菌属(Erwinia)，土壤杆菌属(Agrobacterium)，产碱菌属，和副球菌属(Paracoccus)属微生物。
更优选地，所述β-胡萝卜素羟化酶基因可以从有β-胡萝卜素羟化酶基因的黄杆菌属的种R1534 WT(ATCC21588)(GenBank accession No.U62808)，噬夏孢欧文氏菌ATCC19321(GenBank accession No.D90087)，草生欧文氏菌ATCC39368(GenBank accession No.M87280)，Agrobacteriumaurantiacum(GenBank accession No.D58420)，产碱菌属PC-1(GenBankaccession No.D58422)，Paracoccus marcusii MH1(GenBank accession No.Y15112)，或者革兰氏阴性菌E-396(FERM BP-4283)(JP-A Hei 10-155497)获得。
更优选地，所述β-胡萝卜素羟化酶基因可以从黄杆菌属的种R1534WT(ATCC21588)(GenBank accession No.U62808)获得，或者该酶也可以从基本上同源的DNA序列获得。
术语“基本上同源的DNA序列”，对编码β-胡萝卜素羟化酶的DNA序列来说，是指编码氨基酸序列的DNA序列，其氨基酸序列与黄杆菌属的种R1534 WT(ATCC21588)crtZ基因的氨基酸序列相比时，有大于60％，优选大于70％，更优选大于80％，最优选大于90％的相同氨基酸，而且该氨基酸显示出与黄杆菌属(Flavobacterium)种R1534 WT(ATCC21588)crtZ基因编码酶有相同性能酶活性。
使用β-胡萝卜素羟化酶基因，可以使Phaffia属微生物产生玉米黄素和β-隐黄素。表达β-胡萝卜素羟化酶基因的Phaffia重组微生物，可以通过已知的重组技术制备。
分离和克隆编码本发明β-胡萝卜素羟化酶DNA的技术，是本领域已知的，包括从基因组DNA分离。从基因组DNA克隆本发明DNA序列，可能会受聚合酶链反应(下文中称为PCR)影响。
分离或克隆编码β-胡萝卜素羟化酶的DNA，优选克隆在合适表达载体之后，用于在宿主微生物Phaffia中表达该酶。
“表达载体”包括能表达包含其中DNA序列的载体，该序列可操作性地连接至其它序列，如调控序列。所述调控序列，能影响所述DNA序列在Phaffia微生物中表达。术语“可操作性地连接”是指，它们处于并排(juxtaposition)位置，其中所描述的成分处在这样一种关系中，即允许它们以预期的方式作用。术语“调控序列”，可以认为，至少应该包括对表达目的基因必需的那些成分，当然也可以包括其它的有益成分。一般来说，调控序列包括启动子，终止子，在某些情况下，还可以包括增强子，反式作用因子，或转录因子。组成型启动子，如来自P.rhodozyma甘油醛-3-脱氢酶(GAP)基因的启动子(WO 97/23,633)，可以用于获得组成型表达。也可以使用诱导型启动子，它能对表达精确调控。诱导性启动子的例子是，编码热休克蛋白或淀粉酶基因，以及类似基因的启动子。
可以使用本领域普通技术人员熟知的方法，构建所述表达载体。
虽然未明确陈述，但是本文已经暗示表达载体必须可以在宿主生物体中复制，它或者以游离基因(episome)形式进行复制，或者以染色体DNA整合的一部分进行复制。一般来说，基因的高稳定性，可以从后续事件中判断。要通过同源重组将表达载体整合进入宿主微生物染色体，那必须制备包含至少一部分与宿主基因组DNA同源的DNA片段的载体。为了达到上述目的，rDNA基因片段可以有效用在Phaffia微生物中。rDNA是一种卫星DNAs，在基因组中以多拷贝形式存在。将rDNA片段用作表达载体重组的靶向DNA，这样，表达在所述载体上的目标DNA，才能够整合进入宿主基因组，并且也以多拷贝的形式存在。多拷贝可以产生基因剂量效应，从而使目标酶过表达。在本发明的实施例中，这种rDNA片段可以方便地达到上述目的。可以认为，本发明也包括其它形式的表达载体。这些载体是上述载体的功能等价物，而且它们是已知的，或者说将来会知道。
分离的编码β-胡萝卜素羟化酶的DNA序列，可以用多种方法进行操作，以使多肽顺利表达。对编码所述β-胡萝卜素羟化酶的核苷酸序列在它插入至表达载体之前进行的操作，希望取决于或必须取决于该表达载体。利用克隆方法修饰核苷酸序列的技术，是本领域技术人员熟知的。
包含所述β-胡萝卜素羟化酶基因被克隆进表达载体的重组DNA，将会被转导至宿主微生物。转导外源DNA至真菌细胞，包括Phaffia微生物的方法，是本领域技术人员熟知的。这些方法包括，例如，LiCl转化法，原生质融合法，电穿孔转导法，用DNAs包被粒子轰击的粒子枪转导法，以及本领域已知的其它方法。在本发明实施例中，使用粒子枪转导法用于P.rhodozmal转化。
这样获得的重组微生物，可以使编码β-胡萝卜素羟化酶的DNA序列过表达。因此，本发明的重组微生物，可以在叶黄素-类胡萝卜素，特别是在玉米黄素和β-隐黄素的生产过程中使用。
本发明的又一个方面是，生产玉米黄素和β-隐黄素的生物学方法，包括将重组Phaffia微生物，在用于生产类胡萝卜素底物存在的情况下，在需氧条件，水性(aqueous)营养培养基中培养，以及从所述重组微生物细胞或者从所述肉汤培养基中分离所要的类胡萝卜素。
类胡萝卜素包括叶黄素，它通常通过在培养基中培养Phaffia株而生产。培养基可以包括对细胞合适的大量和微量营养成分，例如用作碳源促进细胞生长的，同时也用作生产类胡萝卜素底物的糖蜜，蔗糖，或葡萄糖；氮源，如玉米浸渍提取物，酵母提取物，硫酸铵，磷酸铵，氢氧化铵，或尿素；磷源，如磷酸铵，磷酸；以及添加的微量营养元素或矿物质盐，如硫酸镁，硫酸锌，生物素，或去硫生物素。
优选的培养条件是，pH在4-8的范围内，温度在15-26℃之间，培养24-500小时。
更优选的培养条件是，pH在5-7的范围内，温度在18-22℃之间，培养48-350小时。
在培养中，进行通气和搅拌通常能使生产类胡萝卜素得到有利的结果。
如果通过使用本发明的方法培养重组Phaffia株生产类胡萝卜素，那么类胡萝卜素，可以从培养基中分离，这出现在类胡萝卜素被分泌在培养基中的情况中，或者也可以从微生物细胞中分离；另外，如果有必要，希望本申请类胡萝卜素与其它类胡萝卜素分离，那么，可以使用本领域已知的各种方法，这可能出现在只需要一种特定类胡萝卜素的例子中。
本发明生产的类胡萝卜素，可以用在食品或饲料的制备过程中。本领域的技术人员熟知这些制备过程。这些复合食品或饲料，可以进一步包括添加剂，或通常用于这些目的的成分，以及其它本领域范围内已知的物质。
下面实施例是对本发明的进一步解释，而并不是对本发明范围进一步的限制。
下列材料和方法将在下文记载的实施例中使用：
菌株
Prhodozvma ATCC96594(根据布达佩斯条约进行了重新保藏，保藏号为No.ATCC 74438，保藏日期为4月8日，1998)
P.rhodozvma ATCC96815(根据布达佩斯条约进行了保藏，保藏号为No.ATCC 74486，保藏日期为2月18日，1999)
E.coli TOP10：F-，mcrA，delta(mirr-hsdRMS-mcrBC)，phi80，delta(lacZ M15)，delta(lacX74)，recAl，deoR，amD 139，(ara-leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endAl，nupG(Invitrogen Corporation，Carlsbad，USA)
载体
pCR2.1-TOPO(Invitrogen Corporation，Carlsbad，USA)
pGEM-T(Promega Corporation，USA)
方法
限制性酶和T4DNA连接酶购自Takara Shuzo(Ohtsu，Japan).
聚合酶链反应(PCR)用Perkin Elmer 2400型热循环仪进行。PCR各个条件在实施例中有记载。PCR引物自商业途径购买。用于DNA测序的荧光DNA引物购自Pharmacia。DNA测序使用自动荧光DNA测序仪进行(ALFred，Pharmacia)。
玉米黄素和β-胡萝卜素可靠样品，分别购自EXTRASYN-THESE S.A.(Genay Cedex，France)和WAKO(Osaka，Japan)。β-隐黄素购自RocheVitamins AG(Basle，Switzerland)。
实施例1：来自黄杆菌属的菌种ATCC21588基因组DNAβ-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)的克隆
首先，制备基因组DNA。将黄杆菌属的菌种R1534 WT细胞(ATCC21588)(US 6,124,113)接种至50ml含有下列成分的培养基中，即接种至含有1％葡萄糖，1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)，1％酵母提取物(Difco)，0.5％ MgSO4，和3％NaCI的培养基中，在27℃需氧条件下培养。过夜培养物(50ml)在10,000g下离心10min。将离心沉淀物用10ml裂解缓冲液(50mM EDTA，0.1M NaCl，pH7.5)稍微冲洗，然后将其在补加了10mg裂解酶的上述缓冲液中重悬，37℃温育15min。在补加0.3ml N-月桂肌氨酸(Lauroyl Sarcosine)(20％)之后，再37℃温育15min，之后用苯酚，苯酚/氯仿，氯仿对DNA进行抽提。所获DNA在室温下用0.3M醋酸钠(pH5.2)进行20min乙醇沉淀，之后10,000g离心15min。所获沉淀物用70％乙醇洗涤，凉干，重悬至1ml TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)中。这样所获得的基因组DNA，先用火胶棉软件包(collodium bags)(Sartorius，Germany)进行48小时抗水性分析，然后在0.3M醋酸钠中用乙醇进行沉淀，接着再重悬至水中。以所制备基因组DNA为模板，使用热循环仪(Perkin elmet 2400，USA)通过PCR扩增，获得β-胡萝卜素羟化酶基因的不含冗余侧翼区编码全长序列。所用合成引物为：PZ1(SEQ ID NO：1)(有Sma I位点CCCGGG)，PZ2(SEQ ID NO：2)(有BamH I位点GGATCC)。
用Advantage-HF PCR试剂盒(CLONTECH Laboratories，Inc.，USA)进行PCR。PCR混合液可以根据制造商提供的用户手册制备。初始模板变性在94℃进行1min。扩增循环，94℃ 30秒，68℃ 4分，循环进行25次。在68℃再反应3分钟之后，将反应混合物在15℃下保温。通过该反应，扩增得到了β-胡萝卜素羟化酶基因的全长ORF DNA片段。将此扩增得到的β-胡萝卜素羟化酶基因连接至pCR2.1-TOPO载体，然后根据制造商提供的构建手册，通过TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation，USA)，将该载体转导至E.coli TOP 10细胞。选择几个克隆进行序列分析。检测每一个β-胡萝卜素羟化酶基因的候选克隆序列。将其中一个显示出与黄杆菌属的菌种ATCC21588(GenBank accession No.U62808)β-胡萝卜素羟化酶序列完全相同的DNA克隆命名为pTOPO-PZ#23N。将来自pTOPO-PZ#23N的522bp Smal/BamHI酶切片段，用作黄杆菌属的菌种的crtZ基因序列盒。实施例2：来自草生欧文氏菌ATCC39368基因组DNAβ-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)的克隆
将草生欧文氏菌(Escherichiav.ulneris)ATCC39368细胞接种至10ml含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)，0.5％酵母提取物(Difco)，0.5％NaCl的培养基中，在26℃需氧条件下培养。过夜培养物(10ml)在10,000g下离心10min。所获沉淀物，根据制造商提供的方法，使用QIAGEN Blood& Cell Culture DNA Midi试剂盒(QIAGEN，Germany)，进行基因组DNA的制备。以所制备基因组DNA为模板，使用热循环仪(Perkin elmer 2400，USA)，通过PCR扩增，可获得β-胡萝卜素羟化酶基因不含冗余侧翼区的全长编码序列。所用两合成引物为：EZ1(SEQ ID NO：3)(有Sma I位点CCCGGG)，EZ2(SEQ ID NO：4)(有SalI位点GTCGAC)。
PCR用Advantage-HF PCR试剂盒(CLONTECH Laboratories，Inc.，USA)进行。PCR合剂可以根据制造商提供的用户手册制备。初始模板变性94℃ 1min。扩增循环，94℃ 30秒，68℃ 4分，循环25次。在68℃再反应3分钟之后，将反应混合物15℃保温。经过该反应，β-胡萝卜素羟化酶基因全长ORF DNA片段(543bp)就扩增得到了。将此扩增得到的β-胡萝卜素羟化酶基因连接至pCR2.1-TOPO载体，然后根据制造商提供的构建手册，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation，USA)将该载体转导至E.coli TOP 10细胞。选择几个细胞克隆进行序列分析。检测了每一个β-胡萝卜素羟化酶基因的候选克隆序列。将其中一个与草生欧文氏菌ATCC39368(GenBank accession No.M87280)β-胡萝卜素羟化酶序列完全相同的DNA克隆命名为pTOPO-EZ #2。将来自pTOPO-EZ #2的543bp SmaI/Sal I酶切片段，用作草生欧文氏菌的crtZ基因序列盒。
实施例3：表达载体成分的制备
对表达载体的各种成分：G418抗性基因，P.rhodozyma甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(本文称为GAP)启动子和终止位点，P.rhodozyma rDNA片段，进行制备。G418抗性基因序列盒制备如下：将SacI接头连接至含有G418抗性基因序列盒pUC-G418载体(US Patent No.6,365，386B1)的单一HindIII位点，所得载体命名为pG418Sa512。来自pG418Sa512的1.7kb Kpn I/Sac I片段，用作G418抗性基因序列盒。
GAP基因每一启动子和终止位点以及rDNA片段，可以用P.rhodozymaATCC 96594基因组DNA作为模板，通过PCR获得。要获得基因组DNA，可以对P.rhodozyma ATCC 96594细胞在YPD(Difco Laboratories)培养基中过夜培养，使用QIAGEN Blood & Cell Culture DNA Midi试剂盒获得(QIAGEN，Germany)。
以所制备基因组DNA为模板，使用Advantage-H-F PCR试剂盒(CLONTECH Laboratories，Inc.，USA)，热循环仪(Perkin elmer 2400，USA)，进行PCR。
用于扩增GAP启动子序列的两合成引物为：GAP#1(SEQ ID NO：5)(有Not I位点GCGGCCGC)，GAP#5(SEQ ID NO：6)(有Sma I位点CCCGGGG)。
初始模板变性94℃ 5min。扩增循环，94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃1分，循环25次。在72℃延伸10分钟之后，将反应混合物4℃保温。经过该反应，GAP启动子DNA片段(398bp)就扩增得到了。将此扩增得到的GAP启动子连接至pCR2.1-TOPO载体，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation，USA)将该其转导至E.coli TOP 10细胞。选择几个细胞克隆进行序列分析。检测了每一个GAP启动子候选克隆的序列。其中一个与P.rhodozyma(GenBank accession No.Y08366)GAP启动子完全相同的DNA克隆，被命名为pTOPO-pGAP2#1。将来自pTOPO-pGAP2#1的398bp Not I/Sma I酶切片段，用作GAP启动子序列盒。
用于扩增GAP终止子序列的合成引物为：GAP#33(SEQ ID NO：7)(有BamHl-Sal I位点GGATCCGTCGAC)，GAP#4(SEQ ID NO：8)(有Kpn I位点GGTACC)。
PCR条件与上述GAP启动子所用的条件相同。经过该反应，GAP终止子DNA片段(302bp)就扩增得到了。将此扩增得到的GAP终止子连接至pCR2.1-TOPO载体，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Corporation，USA)将该其转导至E.coli TOP 10细胞。选择几个细胞克隆进行序列分析。检测了每一个GAP终止子候选克隆的序列。其中一个与P.rhodozyma(GenBankaccession No.Y08366)GAP终止子完全相同的DNA克隆，被命名为pTOPO-tGAP#1。将来自pTOPO-tGAP #1的302bp Bam H I/Kpn I酶切片段或296bp SalI/Kpn I酶切片段，用作GAP终止子序列框。
用于扩增rDNA片段的两合成引物为：R#1(SEQ ID NO：9)(有Sac I位点GAGCTC)，R#2(SEO ID NO：10)(有NotI-Sac I位点GCGGCCGCGAGCTC)。
PCR条件与上述GAP启动子所用的条件相同。经过该反应，包含rDNA的DNA片段(3126bp)就扩增得到了。将此扩增得到的rDNA连接至pCR2.1-TOPO载体，用TOPO TA克隆试剂盒将该其转导至E.coli TOP 10细胞。选择几个细胞克隆进行序列分析。检测了每一个rDNA候选克隆的序列。其中一个与P.rhodozyma(GenBank accession No.D31656，AF139632)rDNA序列完全相同的DNA克隆，命名为pTOPO-rDNA #1。将来自pTOPO-rDNA#1的1960bp SacII/Not I酶切片段，用作rDNA序列框。
实施例4：携带获自黄杆菌属的菌种或草生欧文氏菌β-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)表达载体的构建
要构建携带黄杆菌属的菌种crtZ的表达载体，需要用pGEM-T作骨架，将rDNA序列框、GAP启动子序列框(获自实施例3)，黄杆菌属的sp.crtZ基因序列框(获自实施例1)，GAP终止子序列框、G418抗性基因序列框的BamHI/Kpn I片段(获自实施例3)，按顺序依次连接。所获表达载体命名为pRPZG-ptGAP2。
要构建携带草生欧文氏菌crtZ的表达载体，需要用pGEM-T作骨架，将rDNA序列框、GAP启动子序列框(获自实施例3)，草生欧文氏菌crtZ基因序列框(获自实施例2)，GAP终止子序列框、G418抗性基因序列框SalI/Kpn I片段(获自实施例3)，按顺序依次连接。所获表达载体命名为pREZG-ptGAP2。
实施例5：将携带黄杆菌属的菌种或草生欧文氏菌β-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)的表达载体导入P.rhodozyma
实施例4中所获的每一表达载体，pRPZG-ptGAP2，pREZG-ptGAP2，都分别携带有黄杆菌属的菌种或草生欧文氏菌crtZ基因。用EP 1,158,051中描述的粒子枪法，将上述表达载体转化β-胡萝卜素主要生产突变株，P.rhodozyma ATCC 96815。使用含有0.75M D-山梨醇、D-甘露醇，0.1mg/ml庆大霉素的YPD-琼脂培养基，对重组菌株进行直接筛选。
作为结果，每种pRPZG-ptGAP2，pREZG-ptGAP2中，获得了几百个有0.1mg/ml庆大霉素抗性的转化株。随机选取每种转化株35株，作进一步定性分析。
实施例6：P.rhodozyma crtZ重组菌株的特征表征
通过上述方法获得的crtZ重组菌株P.rhodozyma ATCC 96815，用500mlErlenmeyer摇瓶，培养在50ml生产培养基中，20℃震荡7天。在这之前，用种培养物接种，该种培养物是在7ml种培养基试管(直径21mm)中20℃震荡培养3天制备的。取出合适体积的培养肉汤，用于分析细胞生长和类胡萝卜素产量。
培养基组合物如下：
种培养基：葡萄糖30.0g/l，NH4Cl 4.83g/l，KH2PO4 1.0g/l，MgSO4-7H2O0.88g/l，NaCl 0.06g/l，CaCl2-2H2O 0.2g/l，KH苯二甲酸盐(phtalate)20.0g/l，FeSO4-7H2O 28mg/l，痕量元素溶液0.3ml，维他命贮存液1.5ml，(pH调整至5.4-5.6)。
痕量元素溶液：4N-H2SO4 100ml/l，柠檬酸-H2O 50.0g/l，ZnSO4-7H2O16.7g/l，CuSO4-5H2O 2.5g/l，MnSO4-4，5H2O 2.0g/l，H3BO3 2.0g/l，Na2MoO4 2.0g/l，KI 0.5g/l。
用于种培养基的维他命贮存液：4N-H2SO4 17.5ml/l，内消旋肌醇40.0g/l，尼克酸(Nicotinic acid)2.0g/l，Ca-D-泛酸盐2.0g/l，维他命B1(硫胺HCl)2.0g/l，p-氨基苯甲酸(aminobenzoic)1.2g/l，维他命B6(吡多辛HCl)0.2g/l，生物素贮存液8.0ml.
生物素贮存液制备如下：将4N-H2SO4加入至50ml乙醇中，调整溶液体积至100ml，然后再加入400mg D-生物素。
生产培养基：葡萄糖22.0g/l，KH2PO4 14.25g/l，MgSO4-7H2O 2.1g/l，CaCl2-2H2O 0.865g/l，(NH4)2SO4 3.7g/l，FeSO4-7H2O 0.28g/l，痕量元素溶液4.2ml，维他命贮存液9.35ml，(pH调整至5.5)。
用于生产培养基的维他命贮存液：4N-H2SO4 17.5ml/l，尼克酸2.0g/l，Ca-D-泛酸盐3.0g/l，维他命B，(硫胺HCl)2.0g/l，p-氨基苯甲酸1.2g/l，维他命B6(吡多辛HCl)0.2g/l，生物素贮存液30.0ml
将一部分种培养基(seed culture)种子培养基一种培养基肉汤(2.5ml)，转移至500ml Erlenmeyer摇瓶47.5ml生产培养基中。然后，20℃开始以200rpm旋震培养。培养第二天，培养基加入5ml50％葡萄糖溶液，继续培养。培养第四天，取2ml培养肉汤，再在培养基中加入5ml50％葡萄糖溶液，继续培养3天。第七天，取出一份培养物，分析类胡萝卜素产量和细胞生长。
分析细胞生长，可以用UV-1200光度计(Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan)测量600nm处光密度。
为了分析β-胡萝卜素、β-隐黄素、玉米黄素含量，将取出肉汤与溶剂混合物(乙醇，己烷，乙酸乙酯)混合，然后玻璃珠剧烈震荡，从P.rhodozyma细胞和肉汤中提取类胡萝卜素。提取后，离心除去破碎细胞、玻璃珠，所得上清液进行HPLC分析，测出类胡萝卜素含量。所用HPLC条件如下：HPLC柱：Chrompack Lichrosorb si-60(4.6mm，250mm)；温度：室温；洗脱：丙酮/己烷(18/82)，1ml/l水加入至洗脱液中；注入体积：10ul，流速：2.0ml/min；检测：UV 450nm
结果发现，所有重组株(两种crtZ表达载体，pRPZG-ptGAP2和pREZG-ptGAP2，每种35株转化株)都生产玉米黄素和β-隐黄素并且没有虾青素积累。
选自表达黄杆菌属的菌种crtZ基因或草生欧文氏菌crtZ基因的每种3株典型重组株及其宿主细胞(P.rhodozyma ATCC 96815)的生长情况，分别见下表。
表：摇瓶培养物重组株的胡萝卜素产生和生长情况
 
菌株 crtZ来源 CARO(mg/l) CRYPT(mg/l) ZEA(mg/l) ASTA(mg/l) OD660nm
PZ-7 黄杆菌属的种 4.7 3.5 5.7 0.0 46.3
PZ-24 黄杆菌属的种 7.1 2.7 2.7 0.0 48.3
PZ-25 黄杆菌属的种 6.3 2.1 2.7 0.0 48.3
EZ-7 草生欧文氏菌 3.3 2.7 2.2 0.0 49.0
EZ-13 草生欧文氏菌 3.3 2.8 2.3 0.0 44.7
EZ-14 草生欧文氏菌 3.6 3.1 2.4 0.0 45.9
ATCC96815 10.2 0.0 0.0 0.0 51.9
CARO：ss-胡萝卜素；CRYPTO：β-隐黄素；ZEA：玉米黄素；ASTA：虾青素
如表所示，β-胡萝卜素向β-隐黄素、玉米黄素的转化，在所有表达黄杆菌属的种crtZ基因或草生欧文氏菌crtz基因的Phaffia重组株中都得到了例证。
序列表
<110>罗奇维生素股份公司(Roche Vitamins AG)
<120>由Phaffia制备玉米黄质
<130>NDR5225
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<400>1
Figure C03823180D00151
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<400>2
Figure C03823180D00152
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<400>3
Figure C03823180D00153
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<400>4
Figure C03823180D00154
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<400>5
Figure C03823180D00155
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<400>6
Figure C03823180D00161
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<400>7
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<400>8
Figure C03823180D00163
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<400>9
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<400>10

Claims (6)

1.一种生产玉米黄素和β-隐黄素的方法，包括在水性营养培养基、需氧条件下，培养表达β-胡萝卜素羟化酶基因并且属于Xanthophyllomyces属或Phaffia的重组微生物，以及从所述重组微生物细胞或培养液中，分离所获得的类胡萝卜素，其中β-胡萝卜素羟化酶基因源于选自下列的微生物：黄杆菌属的种R1534 WT(ATCC21588)，噬夏孢欧文氏菌ATCC19321，草生欧文氏菌ATCC39368，Agrobacterium aurantiacum，产碱菌属PC-1，Paracoccus marcusii MH1，和革兰氏阴性菌E-396(FERM BP-4283)，它们都含有β-胡萝卜素羟化酶基因，其中培养是在pH 4-8，温度15-26℃下，培养24-500小时。
2.权利要求1的方法，其中重组微生物来自Xanthophyllomycesdendrorhous或Phaffia rhodozyma ATCC96815。
3.权利要求1的方法，其中β-胡萝卜素羟化酶基因源于黄杆菌属菌种R1534 WT(ATCC21588)，或β-胡萝卜素羟化酶基因的DNA序列基本上与之同源，由此在与黄杆菌属菌种R1534 WT的crtZ的氨基酸序列相比时其氨基酸序列显示高于90％同一性氨基酸。
4.权利要求2的方法，其中β-胡萝卜素羟化酶基因源于黄杆菌属菌种R1534 WT(ATCC21588)，或β-胡萝卜素羟化酶基因的DNA序列基本上与之同源，由此在与黄杆菌属菌种R1534 WT的crtZ的氨基酸序列相比时其氨基酸序列显示高于90％同一性氨基酸。
5.权利要求1-4中任意一项的方法，其中β-胡萝卜素羟化酶基因通过使用调控序列在重组微生物中表达，所述调控序列能实现DNA序列在属于Phaffia的微生物中的表达。
6.权利要求1的方法，其中培养是在pH5-7，温度18-22℃下，培养48-350小时。
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