CN112251457B - 一种4-羟基异亮氨酸生产菌的适应性进化方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种4‑羟基异亮氨酸生产菌的适应性进化方法及其应用，属于基因工程领域。本发明提供了L‑赖氨酸感应性进化控制系统及其构建方法，并将其应用于菌株的适应性进化。经实验证明，传代20‑130代，进化后的菌株中4‑HIL产量增加的正突变菌株的比例可以高达91％，L‑赖氨酸副产物含量减少的正突变菌株的比例可以高达50％，正突变菌中L‑赖氨酸含量最高可以降低100％。采用这种方法可显著提高菌株的突变率，大大缩短进化时间。

Description

一种4-羟基异亮氨酸生产菌的适应性进化方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种4-羟基异亮氨酸生产菌的适应性进化方法及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
糖尿病是一种患病率很高的代谢紊乱疾病，目前世界上超过4亿人受到糖尿病的困扰，而这一人数还在持续增加。(2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸(4-HIL)是一种天然的非蛋白氨基酸，具有促进胰岛素分泌，降低胰岛素抵抗，调节血脂异常，改善肝功能等生理作用，在治疗糖尿病及其并发症方面有良好的应用前景。目前4-HIL的主要制备方法是从葫芦巴种子中提取，但是产量很低，难以满足市场需求。于是从2002年开始，人们不断寻找化学-酶法合成4-HIL的方法，但是由于步骤太长、得率较低、纯度较低而没有深入下去。α-酮戊二酸依赖性异亮氨酸双加氧酶能够催化L-异亮氨酸的C4位发生羟基化反应，生成4-HIL。利用基因工程技术在微生物中过量表达异亮氨酸双加氧酶编码基因，进而通过工程菌的发酵来合成4-HIL是到目前为止发现的最简单、有效和经济的4-HIL生产方法。
在微生物发酵法合成4-HIL的研究领域中，主要是将来源于芽孢杆菌的异亮氨酸双加氧酶(又叫作：异亮氨酸羟化酶)编码基因ido导入到大肠杆菌或者谷氨酸棒杆菌中使其高效表达，利用工程菌表达出的异亮氨酸双加氧酶将L-异亮氨酸转变成4-HIL，从而生产出4-HIL。但是在大肠杆菌工程菌中需要加入大量比较昂贵的L-异亮氨酸作为底物，而在谷氨酸棒杆菌工程菌中则是利用菌体自身合成的L-异亮氨酸作为底物，因此采用谷氨酸棒杆菌工程菌生产4-HIL更为经济、有效。
谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01(保藏编号为：CCTCC NO:M2014410，记载和公布于Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(9):3851-3863)是一株L-异亮氨酸生产菌，在该菌株中克隆、表达ido基因后，可以将其自身积累的L-异亮氨酸转化成4-HIL，从而实现4-HIL的一步从头合成，无需添加L-异亮氨酸等前体物质，具有明显的技术优势(ApplMicrobiol Biotechnol,2015,99(9):3851-3863)。但是在工程菌合成4-HIL的过程中，由于L-异亮氨酸合成途径的前几个酶同时参与L-赖氨酸的合成，因此发酵产物总是含有较多的L-赖氨酸副产物；而L-赖氨酸合成途径中产生的二氨基庚二酸又为细胞生长所需，导致很难改造和削弱L-赖氨酸合成途径，这限制了4-HIL产量的提升。因此，如何降低L-赖氨酸含量、提高4-HIL产量仍然是一个重要的技术问题。
发明内容
L-赖氨酸是大宗氨基酸，因此L-赖氨酸生产菌的研究较多。在研究中人们发现了受L-赖氨酸激活的转录正调控因子LysG及其下游靶基因lysE。lysE编码赖氨酸输出蛋白。当L-赖氨酸与LysG结合后就会激活LysG的转录正调控蛋白活性，于是LysG结合于lysE基因的启动子PlysE区域并激活lysE基因的转录，从而合成出LysE蛋白，促进L-赖氨酸向胞外运输。
本发明的第一个目的是提供一种L-赖氨酸感应性进化控制系统pKE，该系统包括L-赖氨酸传感器和进化执行器；所述L-赖氨酸传感器是受L-赖氨酸正调控的转录调控元件lysG-PlysE，由赖氨酸转录调控因子LysG的编码基因lysG及其下游启动子PlysE组成；所述进化执行器行使进化功能，由增变基因和荧光报告基因xfp(如绿色荧光蛋白基因gfp、红色荧光蛋白基因rfp、黄色荧光蛋白基因yfp等)组成。
在一种实施方式中，所述增变基因和荧光报告基因之间含有RBS序列。
在一种实施方式中，所述增变基因包括但不限于突变基因mutD5、胞嘧啶脱氨酶基因cdd。
在一种实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶基因cdd的序列可以为Genbank登录号为CP016335.1核苷酸序列。
在一种实施方式中，所述cdd的核苷酸序列如SEQ ID NO.2第751～1245bp的序列。
在一种实施方式中，所述荧光报告基因xfp包括但不限于绿色荧光蛋白基因gfp、红色荧光蛋白基因rfp或黄色荧光蛋白基因yfp。
本发明的第二个目的是提供所述L-赖氨酸感应性进化控制系统pKE的构建方法，包括如下步骤：
1)L-赖氨酸传感器的构建：从谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种(C.glutamicumssp.lactofermentum)SN01(保藏编号为：CCTCC NO:M 2014410，已公布于Appl MicrobiolBiotechnol,2015,99(9):3851-3863的论文中)的基因组DNA中扩增lysG-PlysE；
2)进化执行器的构建：采用化学全合成法合成包含荧光报告基因和增变基因的DNA片段；
3)L-赖氨酸感应性进化控制系统pKE的获得：将步骤1)和步骤2)构建的基因片段通过重叠PCR法合成融合片段，再插入pDTW107温敏载体或pDTW108温敏载体中，得到温敏的L-赖氨酸感应性进化控制系统质粒pKE。
在一种实施方式中，所述lysG-PlysE序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述进化执行器的序列如SEQ ID NO.2所示：
在一种实施方式中，所述pDTW107温敏载体或pDTW108温敏载体的构建方法公开于申请号为CN103409446A的专利申请文件中。
本发明的第三个目的是建立一种菌株的适应性进化方法，所述方法应用所述L-赖氨酸感应性进化控制系统pKE，通过L-赖氨酸传感器感知胞内L-赖氨酸的浓度，并由此调控进化执行器中增变基因和荧光报告基因的表达强度，控制并指示进化进程。
在一种实施方式中，当L-赖氨酸浓度高时，激活L-赖氨酸传感器，进而激活进化执行器中增变基因和荧光报告基因的表达，提高菌株突变率和荧光强度。
在一种实施方式中，当L-赖氨酸浓度低时，L-赖氨酸传感器活性降低，进而降低或不能激活进化执行器中增变基因和荧光报告基因的表达，降低菌株的突变率和荧光强度，直至不再突变并维持在L-赖氨酸浓度低的状态。
在一种实施方式中，所述方法具体为：
1)将温敏的L-赖氨酸适应性进化控制系统表达质粒pKE转化到需要进行进化的宿主菌中，
2)将预进化控制菌株在培养基中进行连续传代培养，每轮培养18-72h，之后将培养液以1％-10％的比例转接到新鲜的培养基中进行下一轮培养，如此进行2-10轮传代进化培养；在培养过程中检测菌液荧光强度的变化，当荧光强度下降的趋势变慢或者荧光强度不再变化后，将菌液涂布于平板上培养2-5天，从而分离出单菌落，划线纯化后获得不同的进化菌株个体。
在一种实施方式中，所述宿主是产4-HIL的菌株。
在一种实施方式中，所述宿主是任何一株表达异亮氨酸双加氧酶基因(ido)的棒状杆菌工程菌株，包括但不限于Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum Cgl/p4-ido、Corynebacterium glutamicum ssp.Lactofermentum SN01/pJYW-4-ido-vgb、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum Cgl/p4-ido-ppc、Corynebacteriumglutamicum ssp.lactofermentum SN02、Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum SL01～SL10、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentumSZ01～SZ10等。
在一种实施方式中，所述Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentumSN01、Cgl/p4-ido公开于Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(9):3851-3863论文中。
在一种实施方式中，所述Corynebacterium glutamicum ssp.LactofermentumSN01/pJYW-4-ido-vgb公开于公开号为CN106591210B的专利中。
公布于Enzyme Microb Technol,2016,87-88:79-85论文中的Cgl/p4-ido-ppc、Cgl/p4-ido-lysC-ppc等菌株；公布于Enzyme Microb Technol,2018,115:1-8论文中的SN02、SL01、SL04等菌株；公布于公开号为CN109929790A的专利中的SZ04菌株；公开于ApplMicrobiol Biotechnol,2019,103:4113-4124论文中的SZ01、SZ02、SZ04、SZ05、SZ06等菌株，得出初始的预进化控制菌株KE。
在一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：
1)在4-HIL生产菌株中导入温敏的L-赖氨酸适应性进化控制系统表达质粒pKE，得到4-HIL进化初始菌株HIL-KE；
2)将进化初始菌株HIL-KE在培养基中进行连续传代培养，每轮培养18-72h，之后将培养液以1％-10％的比例转接到新鲜的培养基中进行下一轮培养，如此进行2-10轮传代进化培养；在培养过程中检测菌液荧光强度的变化，当荧光强度下降的趋势变慢或者荧光强度不再变化后，将菌液涂布于平板上培养2-5天，从而分离出单菌落，划线纯化后获得不同的进化菌株个体；
3)取多个进化菌株在发酵培养基中进行发酵验证，测定L-赖氨酸产量和4-HIL产量。
4)对4-HIL产量显著提高或者L-赖氨酸含量显著降低的进化菌株于37℃升温培养过夜，去除进化菌株中的温敏性进化控制系统质粒pKE，得到进化终止菌株。
本发明还要求保护所述适应性进化菌在制备4-羟基异亮氨酸或其衍生物方面的应用。
有益效果：本发明提供了一类L-赖氨酸感应性进化控制系统表达质粒及其构建方法，以及利用这套系统进行的L-赖氨酸传感器驱动的适应性进化方法，采用这种方法对产4-HIL的工程菌可以进行高效的适应性进化控制。在几种测试情况下，进化后的菌株中4-HIL产量增加的正突变菌株的比例可以高达91％，L-赖氨酸副产物含量减少的正突变菌株的比例可以高达50％。采用这种方法经过2-10轮培养即12-240代就可以完成菌株的适应性进化，从而将进化时间大幅缩短至1.5-30天，快速获得4-HIL产量提高1.23倍及以上的进化菌株，以及L-赖氨酸含量降低100％的正突变菌株。经摇瓶培养和发酵罐发酵后，可使4-HIL的产量达30g/L以上，最高可达35g/L。相对于自然进化和随机突变(例如，易错PCR随机突变的正突变概率约0.1％)，正突变的概率大幅提高。
具体实施方式
4-HIL与L-赖氨酸的检测方法：氨基酸产量用HPLC衍生化法测定：样品经过5％的三氯乙酸稀释50倍后放置沉淀4h，12000r/min离心20min，上清用滤膜过滤后用HPLC测样。测定试剂为流动相水相buffer A(1L)：醋酸钠3.01g，三乙胺200μL，四氢呋喃5mL，用10％醋酸调pH至7.2；有机相buffer B(1L)：醋酸钠3.01g溶解后用10％醋酸调pH至7.2，加入400mL乙腈和400mL甲醇。梯度洗脱条件为：0min 8％buffer B，20min 60％buffer B，25min100％buffer B，28.5min 8％buffer B，色谱柱温为40℃，流速为0.8mL/min。
发酵培养基：葡萄糖140g/L，(NH4)2SO4 20g/L，玉米浆10g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO40.5g/L，FeSO4 0.5g/L，CaCO3 20g/L，pH 7.2。
LBB培养基：酵母提取物2.5g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨5g/L，脑心浸液18.5g/L。
实施例1 L-赖氨酸感应性进化控制质粒pKE-1和菌株SZ06-KE-1的构建
以谷氨酸棒杆菌乳糖发酵亚种SN01(保藏编号为：CCTCC NO:M 2014410，已公布于Appl Microbiol Biotechnol,2015,99(9):3851-3863的论文中)的基因组DNA为模板，所用引物为KF和KR，扩增L-赖氨酸传感器lysG-PlysE(即K，序列如SEQ ID NO.1所示)。采用化学全合成法合成进化执行器E(序列如SEQ ID NO.2所示)。K和E经过重叠PCR得到KE片段，所用引物为KF和ER。
KF：TAATGTCGACTTAAGGCCGCAATCCCTCG；
KR：ACCATCCTATAACTCCTTCTCGGTCCGATGGACAGCAAAAG；
ER：TGCATCTGCAGCTAAAGAGCCTTATCCGGAG；
在温敏载体pDTW108的XhoI、PstI位点间插入KE片段，得到温敏的L-赖氨酸感应性进化控制质粒pKE-1。其中，温敏载体pDTW108已公开于申请号为CN103409446A的专利申请文件中。将质粒pKE-1转化到4-HIL生产菌SZ06(已公布于Appl Microbiol Biotechnol,2019,103:4113-4124的论文中)中，得到产4-HIL的L-赖氨酸感应性进化控制菌株SZ06-KE-1。
实施例2 SZ06-KE-1的适应性进化过程和进化结果
将进化控制菌株SZ06-KE-1按终OD562为1.8的接种量接种至发酵培养基中，于30℃发酵48h，进行第一轮培养，约传代16代；之后将培养液以4％的比例转接到新鲜的发酵培养基中，于30℃发酵48h，进行第二轮培养。如此培养8轮共计130代后，菌液的单位荧光强度从10013降至5370。将此时的菌液稀释10-6-10-8倍，取100μL涂布于LBB固体培养基上，于30℃培养3天，当平板上长出单菌落后，随机挑取23个独立单菌落进行分离纯化，获得23株不同的进化个体菌株SZ06-KE-1-M1～SZ06-KE-1-M23。
将这23株进化后的个体菌株接种于发酵培养基中，在24孔深孔板中于30℃发酵后，测定发酵产物中的4-HIL产量，结果显示，发酵96h，21株菌的4-HIL产量(6.4～9.4g/L)都高于出发菌SZ06(5.4g/L)，其余2株产量为5.0g/L，正突变率高达91％。其中4株菌(SZ06-KE-1-M7、SZ06-KE-1-M15、SZ06-KE-1-M21、SZ06-KE-1-M22)的4-HIL产量比SZ06高出50％以上。
实施例3 SZ06-KE-1-Mn的进化终止和发酵结果
将4株4-HIL产量显著提高的进化菌株SZ06-KE-1-M7、SZ06-KE-1-M15、SZ06-KE-1-M21、SZ06-KE-1-M22于37℃升温培养过夜，去除进化菌株中的温敏性进化控制系统质粒pKE-1，得到进化终止菌株SZ06-M7、SZ06-M15、SZ06-M21、SZ06-M22。
将这4株进化终止菌株接种于发酵培养基中，在摇瓶中于30℃发酵后，测定发酵产物中的4-HIL产量，结果显示，发酵96h，4株菌的4-HIL产量分别为7.3、8.6、8.6、9.5g/L，比出发菌SZ06(4.2g/L)分别高出71％、102％、102％、123％。
实施例4 L-赖氨酸适应性进化控制质粒pKE-2和菌株SZ04-KE-2的构建
按实施例1所述方法制备包含L-赖氨酸传感器K和进化控制执行器E的KE片段，插入温敏载体pDTW107的XhoI、PstI位点间，得到包含传感器和执行器的温敏的L-赖氨酸适应性进化控制质粒pKE-2。其中，温敏载体pDTW107已公开于公开号为CN103409446A的专利申请文件中。将质粒pKE-2转化到4-HIL生产菌SZ04(已公布于公开号为CN109929790A的专利申请文件中)中，得到产4-HIL的L-赖氨酸适应性进化控制菌株SZ04-KE-2。
实施例5 SZ04-KE-2的三轮适应性进化结果
将进化控制菌株SZ04-KE-2按终OD562为1.8的接种量接种至发酵培养基中，于30℃发酵36h，进行第一轮培养，约传代12代；之后将培养液以6％的比例转接到新鲜的发酵培养基中，于30℃发酵36h，进行第二轮培养。如此培养3轮共计36代后，菌液的单位荧光强度从6342降至4988。将此时的菌液稀释10-6-10-7倍，取100μL涂布于LBB固体培养基上，于30℃培养4天，当平板上长出单菌落后，随机挑取23个独立单菌落进行分离纯化，获得23株不同的进化个体菌株SZ04-KE-2-M1～SZ04-KE-2-M23。
将这23株进化后的个体菌株接种于发酵培养基中，在24孔深孔板中于30℃发酵后，测定发酵产物中的4-HIL产量，结果显示，发酵96h，12株菌的4-HIL产量(8.1～11.7g/L)高于出发菌SZ04(6.6g/L)，正突变率达到52％；10株菌的4-HIL产量(5.4～6.4g/L)略低于出发菌SZ04。
实施例6 L-赖氨酸适应性进化控制菌株SZ04-KE-1的三轮适应性进化结果
按实施例1中制备出的温敏的L-赖氨酸感应性进化控制质粒pKE-1转化到4-HIL生产菌SZ04中，得到产4-HIL的L-赖氨酸感应性进化控制菌株SZ04-KE-1。
将进化控制菌株SZ04-KE-1按终OD562为1.8的接种量接种至发酵培养基中，于30℃发酵60h，进行第一轮培养，约传代20代；之后将培养液以2％的比例转接到新鲜的发酵培养基中，于30℃发酵60h，进行第二轮培养。如此培养3轮共计60代后，菌液的单位荧光强度从7386降至5986。将此时的菌液稀释10-6-10-8倍，取100μL涂布于LBB固体培养基上，于30℃培养3天，当平板上长出单菌落后，随机挑取22个独立单菌落进行分离纯化，获得22株不同的进化个体菌株SZ04-KE-1-M1～SZ04-KE-1-M22。
将这22株进化后的个体菌株接种于发酵培养基中，在24孔深孔板中于30℃发酵后，测定发酵产物中的L-赖氨酸产量，结果显示，11株菌的L-赖氨酸含量(0.00～1.40g/L)低于出发菌SZ04(1.44g/L)，正突变率为50％；另外11株菌的L-赖氨酸含量(1.45～2.06g/L)显著高于出发菌SZ04。
发明人还尝试将实施例1～6构建获得的突变菌在发酵罐水平发酵，可使4-HIL的产量达30g/L以上，最高可达35g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种4-羟基异亮氨酸生产菌的适应性进化方法及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1003
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttaaggccgc aatccctcga ttgctgcatc aacgacggcg tctgtgagtc tagctagaga 60
tctagattcc aggcgccatc gttgccaata catcggtgta tcaatgggta tctcatcgag 120
gaggatcact tctcctgctt ttagcatggg agcagcttgg gtttcgggaa gaagtcccca 180
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agttaacggg atttcagcaa ggcgtccaga tagttgcgct ttagtttctg cttgcagcaa 660
caccattttc cgcgctgctt gcacaaggac ttcacccgct tcggttgctt tggccggttg 720
ggtgcgcgat accaatactc gacccacgtg atgctcgaga gctttaacgc gctgactcac 780
cgccgacggg gaaatggaaa gggctaagga ggcgccttcg aagctgcctt catcaatgat 840
cgagagcaaa gtgtccaggt gaatggggtt catgaagcta tattaaacca tgttaagaac 900
caatcatttt acttaagtac ttccataggt cacgatggtg atcatggaaa tcttcattac 960
aggtctgctt ttgggggcca gtcttttgct gtccatcgga ccg 1003
<210> 2
<211> 1245
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agaaggagtt ataggatggt ttccaagggc gaggagctgt tcaccggcgt tgttccaatc 60
ctggttgagc tggacggcga cgttaacggc cacaagttct ccgtttccgg cgagggcgag 120
ggcgacgcta cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgcca 180
gttccatggc caaccctggt taccaccctg acctacggcg ttcagtgctt ctcccgctac 240
ccagaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcta tgccagaggg ctacgttcag 300
gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgctga ggttaagttc 360
gagggcgaca ccctggttaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 420
aacatcctgg gccacaagct ggagtacaac tacaactccc acaacgttta catcatggct 480
gacaagcaga agaacggcat caaggttaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 540
tccgttcagc tggctgacca ctaccagcag aacaccccaa tcggcgacgg cccagttctg 600
ctgccagaca accactacct gtccacccag tccgctctgt ccaaggaccc aaacgagaag 660
cgcgaccaca tggttctgct ggagttcgtt accgctgctg gcatcaccct gggcatggac 720
gagctgtaca agtaagagag gagggattgc atgactgaag atgacttaga tctgctgcac 780
cgcacagtag aactagccac gcaggcactc aagcagggaa acagtcctta tggatccctg 840
ctggttgatc ccttcggcgc ggtcgttttt gaagaccaca accgagatgc cgatggggat 900
ctgaccaagc acccggaatt cgccatcgcc aaatatgcga tcgaaaatta cagtgcatca 960
gaacgtgctg cgtgcactgt ttatacctcg acggaacatt gcgcgatgtg cgccggtgcc 1020
catgcgtggg ctggactggg caaaatttac tgcgccacca caggtgagca aacagccgct 1080
tggtacgcaa agtggggtgc agaatctggg cctttgaacc cgatttcagc ggacaaaatt 1140
agcccgaaca tatccatcga aggacctgct tccagatttg atgaagtcct gtatgaactg 1200
catcgatggt tttatttagg gcagtctccg gataaggctc tttag 1245
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taatgtcgac ttaaggccgc aatccctcg 29
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
accatcctat aactccttct cggtccgatg gacagcaaaa g 41
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgcatctgca gctaaagagc cttatccgga g 31

Claims (7)

1.一种L-赖氨酸感应性进化控制系统，其特征在于，包括L-赖氨酸传感器和进化执行器；所述L-赖氨酸传感器含有受L-赖氨酸正调控的转录调控元件lysG-PlysE，编码所述lysG-PlysE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述进化执行器含有增变基因和荧光报告基因xfp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种构建权利要求1所述L-赖氨酸感应性进化控制系统的方法，其特征在于，将含有编码lysG-PlysE的基因片段和进化执行器的基因片段插入pDTW107温敏载体或pDTW108温敏载体中；编码所述lysG-PlysE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述进化执行器的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述L-赖氨酸感应性进化控制系统在微生物筛选或微生物适应性进化方面的应用。
4.一种提高4-羟基异亮氨酸高产菌株筛选效率的方法，其特征在于，所述方法应用权利要求1所述的L-赖氨酸感应性进化控制系统，通过L-赖氨酸传感器感知胞内L-赖氨酸的浓度，并由此调控进化执行器中增变基因和荧光报告基因的表达强度，控制并指示进化进程；所述调控具体是：当L-赖氨酸浓度高时，提高菌株突变率和荧光强度；当L-赖氨酸浓度低时，降低菌株的突变率和荧光强度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述L-赖氨酸感应性进化控制系统转化到4-羟基异亮氨酸生产菌株中；所述4-羟基异亮氨酸生产菌株包括：表达异亮氨酸双加氧酶基因ido的棒状杆菌；或Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum Cgl/p4-ido、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum Cgl/p4-ido-ppc、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum SN01/pJYW-4-ido-vgb、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum SN02、Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum SL01～SL04、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentumSL02、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum SL03、Corynebacteriumglutamicum ssp.lactofermentum SZ01、Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum SZ02、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum SZ03、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum SZ04、Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum SZ05、Corynebacterium glutamicum ssp.lactofermentum SZ06。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤：
1)将温敏的L-赖氨酸适应性进化控制系统表达质粒pKE转化到需要进行进化的宿主菌中；
2)将预进化控制菌株在培养基中进行连续传代培养，每轮培养18-72h，之后将培养液以1％-10％的比例转接到新鲜的培养基中进行下一轮培养，如此进行2-10轮传代进化培养；在培养过程中检测菌液荧光强度的变化，当荧光强度下降的趋势变缓或不变后，将菌液涂布于平板上培养2-5天，从而分离出单菌落，划线纯化后获得不同的进化菌株个体；
3)去除进化菌株中的温敏性进化控制系统质粒pKE，得到进化终止菌株。
7.权利要求1所述L-赖氨酸感应性进化控制系统或权利要求4～6任一所述方法在制备4-羟基异亮氨酸或其衍生物方面的应用。
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