ES2201219T3 - Produccion fermentativa de biotina. - Google Patents
Produccion fermentativa de biotina.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE BIOTINA A PARTIR DE DESTIOBIOTINA EN EL QUE SE PONE EN CONTACTO DESTIOBIOTINA CON UN SISTEMA DE REACCION ENZIMATICO QUE CONTIENE BIOB Y TAMBIEN NIFU Y/O NIFS, Y AISLAMIENTO DE LA BIOTIMA RESULTANTE DE LA MEZCLA DE REACCION, Y A UN PROCESO PARA LA PRODUCCION DE BIOTINA A PARTIR DE DESTIOBIOTINA EN EL QUE CULTIVA UN MICROORGANISMO QUE HA SIDO TRANSFORMADO MEDIANTE LAS SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN BIOB Y NIFU Y/O NIFS O MEDIANTE UNO O VARIOS PLASMIDOS INDEPENDIENTES UNOS DE OTROS QUE INCLUYEN DICHAS SECUENCIAS, EN UN MEDIO NUTRITIVO ACUOSO, EN PRESENCIA DE DESTIOBIOTINA, Y AISLANDO LA BIOTINA RESULTANTE DEL MEDIO DE CULTIVO.
Description
Producción fermentativa de biotina.
Esta invención se refiere a un proceso
fermentativo para la producción de biotina a partir de
destiobiotina.
La biotina es una de las vitaminas esenciales
para la nutrición de los animales, plantas y microorganismos, y muy
importante como medicina o aditivo alimentario.
Existen muchos estudios sobre la producción
fermentativa de biotina. Las cepas de Escherichia son
conocidas como microorganismos que pueden utilizarse para el
anterior proceso [ver publicación de Patente Japonesa (Kokai) No.
149091/1987]. Además de las cepas anteriormente mencionadas,
también son conocidas cepas de Bacillus [Publicación de
patente Japonesa (Kokai) No. 180174/1991] cepas de Serratia
[Publicación de Patente Japonesa (Kokai) No. 27980/1990] cepas de
Brevibacterium [Publicación de Patente Japonesa (Kokai) No.
240489/1991]. Pero estos procedimientos todavía no son adecuados
para su uso industrial debido a la baja eficiencia de la
recuperación del carbono de los nutrientes en biotina y, en algunos
casos, de la acumulación de intermediarios directos, destiobiotina.
Es por tanto deseable mejorar la eficiencia de la conversión de
destiobiotina en biotina. Es conocida una reacción de conversión de
destiobiotina en biotina utilizando el restante sistema celular de
Escherichia coli (Antimicrob. Agents Chemother. 21, 5, 1982)
y una utilizando extracto libre de células de Escherichia
coli [J. Biol. Chem., 270, 19158 (1995); Biosci. Biotechnol.
Biochem., 56, 1780 (1992); Eur. J. Biochem., 224, 173 (1994); Arch.
Biochem. Biophys., 326, 48 (1996). De acuerdo con estas
publicaciones, se ha aclarado que los factores proteicos tales como
ferredoxina-NADP reductasa y flavodoxina junto con
la biotina sintasa están involucrados en la formación de biotina a
partir de destiobiotina. A pesar de todo, solamente se ha observado
un efecto limitado para la producción de biotina a partir de
destiobiotina bajo estas condiciones. Se ha especulado de forma
simple que otra proteína desconocida puede estar involucrada en esta
reacción para convertir más eficientemente destiobiotina en
biotina.
Además, ha sido notificada recientemente una
reacción de conversión utilizando la biotina sintasa purificada de
Bacillus sphaericus con deazariboflavina fotoreducida como
un donador de electrones artificial en lugar de utilizar un sistema
de transferencia de electrones fisiológica de
ferredoxina-NADP reductasa y flavodoxina [Biochem.
Biophys. Res. Commun., 217, 1231 (1995)]. Sanyal et al. Notificaron
un procedimiento de la producción de biotina a partir de
destiobiotina utilizando la biotina sintasa de Escherichia
coli y S-adenosilmetionina, [Biochemistry, 33,
3625 (1994)]. No obstante, ambas eficiencias de las reacciones
descritas no son suficientemente altas para la reacción para ser
útiles en la producción industrial de biotina.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
es encontrar un proceso más eficiente de producir biotina a partir
de destiobiotina, y para este fin se han elucidado varios factores
proteicos. Se ha encontrado que los productos génicos de nifU y nifS
(de aquí en adelante referidos como NIFU y NIFS), que han sido
sugeridos estar involucrados en la movilización del hierro y el
sulfuro necesarios para la formación del núcleo metálico de la
nitrogenasa [J. Bacteriology, 175, 6737 (1993)], son
significativamente efectivos para la producción de cantidades
mayores de biotina a partir de destiobiotina. La presente invención
está basada a raíz de estos hallazgos.
De acuerdo con esto, la presente invención
proporciona un procedimiento para la producción de biotina a partir
de destiobiotina que comprende contactar la destiobiotina con un
sistema de reacción enzimática que contiene el producto génico bioB
(que codifica la biotina sintasa; de aquí en adelante referida como
BIOB) y también NIFU y/o NIFS, y aislando la biotina resultante a
partir de la mezcla de reacción, especialmente como un proceso en
donde BIOB deriva de Escherichia coli y NIFU y/o NIFS derivan
de Klebsiella pneumoniae, o un proceso como el que se ha
descrito antes en donde la mezcla de reacción del enzima además
contiene S-adenosilmetionina,
L-cisteína y un sistema donador de electrones, por
ejemplo en donde el sistema donador de electrones comprende NADPH,
ferredoxina-NADP reductasa y flavodoxina o en donde
el sistema donador de electrones comprende deazariboflavina o un
componente equivalente funcional del mismo.
Es además objeto de la presente invención
proporcionar un proceso como el que se ha descrito antes en donde
la reacción se efectúa a un pH de 6.0 a 8.5, preferiblemente a
partir de 7,0 a 8,0, y en un rango de temperatura de alrededor de 20
a 45ºC, preferiblemente a partir de 25 a 40ºC.
Además, la presente invención también proporciona
un proceso fermentativo para la producción de biotina a partir de
destiobiotina que comprende el cultivo de un microorganismo, que ha
sido transformado por las secuencias de DNA que codifican BIOB y
NIFU y/o NIFS o comprendida por uno solo o independiente el uno del
otro por varios plásmidos en presencia de destiobiotina y en un
medio acuoso de nutrientes, y aislando la biotina resultante a
partir del medio de cultivo, especialmente como un proceso en donde
el microorganismo está seleccionado a partir del género
Escherichia y específicamente un proceso en donde el cultivo
se efectúa de 1 a 5 días, preferiblemente de 1 a 3 días, a un pH de
5 a 9, preferiblemente de 6 a 8, y en un rango de temperatura de 10
a 45ºC, preferiblemente de 25 a 40ºC.
El sistema de reacción enzimática usado en esta
invención contiene BIOB, NIFU y/o NIFS como factores proteicos.
Como el BIOB de la reacción anterior, se puede utilizar un extracto
libre de células de las células que contienen BIOB o el BIOB
parcialmente o completamente purificado a través de métodos de
aislamiento convencionales. Cualquier clase de BIOB que posea
actividad biotina sintasa puede también utilizarse para esta
reacción, pero es preferible utilizar BIOB de Escherichia
coli. Si se desea, se puede obtener una gran cantidad de BIOB
purificada a partir de los siguientes procedimientos. Se construye
una librería génica de Escherichia coli que contenga una
longitud apropiada de fragmento de DNA cubriendo el tamaño completo
de la región codificante del gen bioB. Ya que se conoce que el gen
bioB de Escherichia coli está localizado en un fragmento de
1,3 Kb NcoI-HaeIII [J. Biol. Chem., 263, 19577
(1988)], pueden utilizarse estos dos enzimas de restricción de
forma adecuada. Una gran variedad de vectores plasmídicos que pueden
utilizarse para este propósito están disponibles a partir de
distribuidores comerciales. El vector plasmídico pTrc99A, obtenible
de Pharmacia Biotech Co., es uno de los plásmidos inducibles
generalmente utilizados en el campo. Luego DNAs plasmídicos híbridos
mezclados de la librería génica se extraen de la mezcla de cultivo
de las cepas mencionadas anteriormente de Escherichia coli,
y se utilizan para transformar mutantes deficientes en el gen bioB
de Escherichia coli. Escherichia coli R875 [bioB17; J.
Bacterial., 112, 830 (1972)] es adecuado para este propósito. Los
clones que muestran prototrofia por la biotina se seleccionan
basándose en la expresión del gen objetivo bioB. Este clon contendrá
el gen bioB y lo expresará. Cualquier plásmido híbrido que muestra
esta propiedad puede utilizarse para obtener BIOB. El plásmido
híbrido llamado pTrcEB1 es uno de los plásmidos objetivo. Para
obtener una gran cantidad de BIOB, Escherichia coli JM109
(Takara Shuzo Co., Shiga, Japón) transformado por pTrcEB1 mediante
un método celular adecuado es cultivado en un medio de nutrientes
por inducción, y el BIOB producido puede aislarse utilizando las
técnicas de cromatografía general. Como alternativa, el plásmido de
expresión del gen bioB de Escherichia coli puede construirse
de acuerdo con los procedimientos presentados en la Publicación de
Patente Japonesa (Kokai) No. 149091/1986 o Publicación de Patente
Japonesa (Kokai) No. 236493/1995.
Como el NIFU y el NIFS de la reacción anterior,
se puede utilizar un extracto libre de células conteniendo las
proteínas anteriores de NIFU y NIFS, o NIFU y NIFS parcialmente
purificados a través de métodos de aislamiento tradicionales.
Cualquier clase de NIFU y NIFS con efectos sobre la formación de
biotina a partir de destiobiotina puede utilizarse para esta
reacción. Pero es preferible utilizar NIFU y NIFS de Klebsiella
pneumoniae. Klebsiella pneumoniae M5a1 es una cepa bien
caracterizada que posee los genes nifU y nifS. Los genes nifU y
nifS de Klebsiella pneumoniae se obtienen a partir de los
siguientes procedimientos. Una librería génica de Klebsiella
pneumoniae M5a1 se construye primero utilizando cortes de
fragmentos de DNA por enzimas de restricción como BamHI. Ya que es
conocido que un fragmento de 2,5 Kb del DNA cromosómico de
Klebsiella pneumoniae contiene los genes objetivo nifU y nifS
[J. Bacterial., 169, 4024 (1987], fragmentos de DNA de
2,3-2,6 Kb de longitud se recogieron y se ligaron
con cualquier vector plasmídico que es replicable en microorganismos
apropiados. El vector plasmídico pUC19 (Takara Shuzo Co.) con
Escherichia coli JM109 es una de las combinaciones adecuadas
de un plásmido y un microorganismo huésped para construir una
librería génica. Entonces los clones objetivo pueden seleccionarse
mediante métodos convencionales tales como hibridación de colonias
usando sondas de oligonucleótidos preparadas basadas en la
secuencia de DNA publicada de los genes nifU y nifS.
Consecuentemente, el fragmento de DNA portando los genes nifU y nifS
puede subclonarse en otro vector de expresión plasmídico. El vector
plasmídico inducible tal como pTRc99A puede favorablemente
utilizarse para expresar los genes nifU y nifS. Basándose en las
secuencias de DNA publicadas de bioB, nifU y nifS que pueden
obtenerse a partir de cualquier banco de datos de secuencias, por
ejemplo las secuencias de DNA del Instituto Europeo de
Bioinformática (Hinston Hall, Cambridge, GB)que codifican
tales genes pueden también ser construidos sintéticamente mediante
métodos conocidos en el campo, ver por ejemplo, PE 747 483. Las
secuencias de DNA que codifican cualquier BIOB, NIFU o NIFS pueden
aislarse a partir de cualquier microorganismo basado en las
secuencias publicadas utilizando las tecnologías de PCR conocidas.
Tales microorganismos pueden obtenerse a partir de cualquier
autoridad depositaria conocida listada en la revista "Industrial
Property" [(1991) 1, 29-40], por ejemplo
la American Type Culture Collection (ATCC).
El cultivo de los microorganismos utilizados en
la presente invención puede efectuarse mediante los procedimientos
conocidos. Un medio acuoso conteniendo una fuente de carbono
asimilable, una fuente de nitrógeno digerible, una sal inorgánica, y
otros nutrientes necesarios para el crecimiento de los
microorganismos pueden utilizarse en el medio (de cultivo) de
nutriente acuoso. Como fuente de carbono puede emplearse, por
ejemplo, glucosa, fructosa, lactosa, galactosa, sacarosa, maltosa,
almidón, dextrina o glicerol. Como fuente de nitrógeno puede
emplearse, por ejemplo, peptona, polvo de soja, licor de trigo,
extracto de carne, sulfato amónico, nitrato amónico, urea o una
mezcla de cualquiera de estos componentes. Además, como sal
inorgánica, se puede emplear un sulfato, hidrocloruro o fosfato de
calcio, magnesio, zinc, manganeso, cobalto o hierro. Y, si es
necesario, factores nutricionales convencionales o agentes
antiespumosos, como aceite animal, aceite vegetal o aceite mineral
se pueden incluir también en el medio nutritivo acuoso. Si los
microorganismos obtenidos tienen marcadores resistentes a
antibióticos, puede ser incluido en el medio antibiótico relevante.
Si la expresión de los genes objeto es inducible por
isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG), este compuesto puede estar también presente en el medio. El
pH del medio de cultivo es adecuado de 5 a 9, preferiblemente de 6 a
8. El rango de temperatura de cultivo es adecuado de 10 a 45ºC,
preferiblemente 25-40ºC. El tiempo de cultivo es
normalmente a partir de 1 a 5 días, preferiblemente de 1 a 3
días.
Para la preparación de extracto de células libres
a partir de las células obtenidas por cultivo, se pueden aplicar
métodos generales como la sonicación, rotura de células en
presencia de cuentas de cristal o por prensa francesa. Después de la
rotura de células, la solución obtenida se centrifuga para separar
los restos de células, y se puede usar este sobrenadante como
extracto de células libres.
El sistema de reacción enzimática contiene como
componente reactivo BIOB y también proteínas NIFU y/o NIFS en los
extractos de células libres como se preparó anteriormente o
aquellos purificados parcialmente. Además de las proteínas
anteriores, se añadió destiobiotina como el sustrato para esta
reacción. La cantidad de destiobiotina que se debe agregar puede
variar dependiendo del sistema de reacción enzimático empleado. Se
pueden usar como sustrato la forma-D y una mezcla de
destiobiotina en forma L y D. La adición de
S-adenosilmetionina, L-cisteína y un
sistema donador de electrones, como la deazariboflavina o un
componente equivalente funcional de deazariboflavina, estimula la
reacción. En lugar del sistema de aporte de electrones
deazariboflavina o su componente equivalente funcional (más
particularmente como donador de electrones artificial) para la
reacción, ferrodoxinaa-NADP reductasa y flavodoxina
junto con NADPH se pueden usar como sistema donador de electrones
fisiológico para la reacción. Las concentraciones óptimas de estos
componentes aditivos pueden variar dependiendo del sistema de
reacción enzimática empleado. Pero en general, se recomienda 50
\muM-2 mM para la
S-adenosil-metionina, 10
\muM-2 mM para la L-cisteína y
10-1000 \muM para deazariboflavina.
Para proceder la reacción, puede usarse una
solución tampón que no tiene influencia negativa en la formación de
biotina. Se usó preferiblemente el tampón Tris-HCl.
La reacción enzimática se efectuó adecuadamente a un pH en el rango
de 6,0 a 8,5, más preferiblemente en el rango de 7,0 a 8,0. La
temperatura de reacción es adecuada entre 20 y 45ºC, más
preferiblemente entre 25 y 40ºC. Si deazariboflavina se utiliza para
estimular la reacción, se comienza adecuadamente por fotoreducción
usando una lámpara fluorescente localizada a 10 cm de distancia de
la mezcla de reacción. El periodo de incubación puede estar entre
30 minutos y 3 horas. Una incubación mucho más larga se puede
efectuar siempre que los enzimas sean activos.
Además del sistema de reacción enzimática como se
describió anteriormente, es también útil utilizar directamente los
genes nifU y nifS. Por ejemplo, los genes bioB, nifU y nifS
preparados como se describió anteriormente pueden colocarse en un
plásmido o en múltiples plásmidos independientes, e introducidos en
el microorganismo del huésped como Escherichia coli por un
método de transformación convencional. Luego la producción de
biotina a partir de destiobiotina se puede realizar bajo un sistema
de crecimiento, un sistema de descanso y, se desea, un sistema de
reacción enzimático usando el extracto de células libres del
microorganismo mencionando anteriormente. Cualquier cepa de
Escherichia coli modificada para sobreexpresar los genes
bioB, nifU y nifS juntos pueden ser usada favorablemente. Entre
estas cepas, las cepas preferidas particularmente son
Escherichia coli JM109 (pTrcEB1, pKNnif05) y Escherichia
coli JM109 (pKNnif06).
La biotina producida a partir de la destiobiotina
bajo las condiciones descritas anteriormente puede ser recuperada
fácilmente. Para este propósito un proceso usado generalmente para
extraer un cierto producto a partir de esta solución puede ser
empleado el cual es aplicable a las propiedades varias de la
biotina. Así, por ejemplo, después que los materiales sólidos se
hayan extraído de la solución, la biotina en el filtrado se absorbe
con carbón activo, luego se eluyó y purificó además con una resina
intercambiadora de iones. Alternativamente, el filtrado se aplica
directamente a una resina intercambiadora de iones y, después de la
elución, el producto deseado se recristalizó a partir de una mezcla
de alcohol y agua.
La presente invención explicará con más detalle
refiriéndose a los Ejemplos siguientes; aunque, esto debe ser
entendido que la presente invención no se limita a aquellos
Ejemplos en particular. Las figuras (Fig.) referidas en los Ejemplos
y anexos de aquí son primero resumidas como sigue:
Fig. 1: Estrategia de clonación del gen bioB de
Escherichia coli.
Fig. 2: Estructura de pTrcEB1.
Fig. 3: Electroforesis de gel de
poliacrilamida-SDS de Escherichia coli BIOB
purificada.
Fig. 4: Espectro de absorción de BIOB de
Escherichia coli purificada.
Fig. 5: Estrategia de clonación de los grupos
nifU y nifS de Klebsiella pneumoniae y estructura de
pKNnif02.
Fig. 6: Construcción del plásmido intermediario
pKNnif03 con el grupo de nifU y nifS de Klebsiella
pneumoniae.
Fig. 7: Construcción del plásmido pKNnif04 de
expresión de los genes nifU y nifS.
Fig. 8: Construcción del plásmido pKNnif05 de
expresión de los genes nifU y nifS.
Fig. 9: Construcción del plásmido pKNnif06 de
expresión de los genes bioB, nifU y nifS.
Escherichia coli HB 101 [J. Mol. Biol.,
41, 459 (1969); Takara Shuzo Co.] se cultivó en 100 ml de caldo de
Luria (LB) (1% de triptona, 0,5 % de extracto de levadura, 0,5% de
NaCl; pH 7,5) a 37ºC durante 10 horas, y se recuperaron las células
bacterianas por centrifugación. Se extrajo el DNA entero a partir
de las células por el método del fenol (Experiments with gene
fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1984, Págs.
137-139; Sambrook et al, 1989 "Molecular
Cloning". Cold Spring Harbor Laboratory Press), y se obtuvo 0,7
mg de DNA entero.
Como se muestra en la Fig. 1, 3 \mug del DNA
entero se digirió completamente con NcoI y HaeIII, y los fragmentos
de DNA de 1,2-1,5 kb se aislaron por electroforesis
en gel de agarosa. Los fragmentos de DNA se ligaron con el vector
del plásmido pTrc99A (Pharmacia Biotech Co., Pharmacia, Uppsala,
Suecia) digerido con NcoI y SmaI usando el Kit de ligación de DNA
(Taka Shuzo Co., Japón) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La mezcla de ligación se transfirió a la cepa de
Escherichia coli JM109. [Gene, 33, 103 (1985)] por un método
celular adecuado (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press 1982, Págs. 252-253), y las cepas se
seleccionaron para resistencia a la ampicilina (100 \mug/mL) en
una placa de agar de medio LB. Se obtuvieron como librería genómica
3.000 clones individuales con los fragmentos de DNA genómicos
insertados corriente abajo al promotor híbrido fuerte
triptófano/lactosa [Gene 69, 301-315 (1988); a
partir de ahora "promotor trc"]
Las cepas resistentes a la ampicilina conteniendo
la librería genómica se cultivaron a 37ºC durante 16 horas en 50 ml
de medio LB conteniendo 100 \mug/mL de ampicilina, se recogieron
células bacterianas por centrifugación. El conjunto de DNA de
plásmidos se extrajo de las células bacterianas por el método de
desnaturalización-alcalina (Molecular Cloning, Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1982, pág.
90-91).
El conjunto de DNA del plásmido se transfirió en
mutantes R875 deficientes de bioB de Escherichia coli bioB
[J. Bacteriol. 112, 830-839 (1972)] por un método
celular adecuado. Para obtener un clon que lleve el gen bioB, se
cultivaron los transformantes para resistencia a la ampicilina y
prototróficos de biotina en placa de agar de medio LB conteniendo
100 \mug/ml de ampicilina, 0,0075 U/mL de avidina y 0,1 mM
isopropil-beta-D-tio-galactopiranósido
(IPTG).
Uno de los transformantes obtenidos se cultivó en
un medio LB conteniendo 100 \mug/mL, y el plásmido híbrido se
extrajo de las células. El plásmido aislado se analizó usando
enzimas de restricción. El plásmido híbrido tenía un fragmento
NcoI-HaeIII de 1,3 kb conteniendo el gen bioB y se
designó pTrcEB1 (ver Fig.2). La cepa de Escherichia coli
JM109 teniendo este plásmido se llamó Escherichia coli JM109
(pTrcEB1).
Escherichia coli JM109 (pTrcEB1) se
precultivó a 37ºC toda la noche en un medio LB conteniendo 100
\mug/mL de ampicilina. 0,1 ml del precultivo se transfirió a 5 ml
del mismo medio en un tubo de ensayo. Después del cultivo a 37ºC
durante 3 horas, se añadió IPTG a 2 mM para inducir el promotor trc,
y el cultivo continuó durante 4 horas. Las células bacterianas se
recogieron y lavaron con salino. Las células se rompieron por
sonicación, y las proteínas de las células enteras se sometieron a
electroforesis de gel de dodecil sulfato de
sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) para
confirmar la expresión del gen bioB de acuerdo con el protocolo
descrito por Laemmli [Nature, 227, 680-685 (1970)].
BIOB se sobreprodujo en cantidades de alrededor de un 2% de
proteínas de células enteras.
Se cultivaron aeróbicamente las células de
Escherichia coli JM109 (pTrcEB1) en 2L de caldo Terrific
(TB); 24 g de extracto de levadura/Difco, 12 g de tristona/Disco, 4
g de glicerol, 2,31 g de K_{2}PO_{4}, 12,54 g K_{2}HPO_{4}4
en 1 litro) conteniendo 100 \mug/mL de ampicilina a 37ºC durante
3 horas. La expresión de la proteína BioB se indujo por cultivo
adicional durante 3 horas después de la adición de IPTG 1 mM. Las
células se recogieron por centrifugación a 8000 x g durante 20
minutos, se lavaron con 20 mM de Tris-HCl/pH 8,1 (a
partir de ahora referido como TB) que contiene 0,1 M de NaCl y 1 mM
de EDTA, lavado con el mismo tampón sin 1 mM de EDTA y guardado a
-80ºC hasta su uso. Todas las operaciones de columna se efectuaron a
temperatura ambiente y otras operaciones a 4-10ºC a
menos que se indique de otra manera. El BIOB corrió como una banda
de proteína en SDS-PAGE (37 kDa de peso molecular)
correspondiendo con la banda roja en cromatografías en columna. Las
células se descongelaron con alrededor de 60 mL de TB conteniendo 5
mM 2-mercaptoetanol (a partir de ahora referido como
2-ME) y desestabilizadas por prensa francesa en
presencia de 0,25 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 10
\mug/mL de desoxiribonucleasa I y 10 \mug/mL de ribonucleasa A,
y el desecho celular se extrajo por centrifugación a 15000 x g
durante 30 minutos. La solución se llenó hasta 200 mL con TB
conteniendo 2-ME 5 mM, y el mismo volumen de TB se
añadió a la solución (200 mL) conteniendo un 20% de sulfato de
amonio (p/V). Después de la adición de EDTA 1mM, las proteínas en
la solución se cargaron en Fenil-Toyopearl 650 M
(4,4 x 10 cm; Tosoh, Tokyo, Japón) que se equilibró con TB
conteniendo 2 mM 2-ME y 10% de sulfato de amonio,
lavado con el mismo tampón y eluído con el mismo tampón sin sulfato
de amonio al 10%. La fracción eluída se diluyó 4 veces con TB
conteniendo 2-ME 2 mM y cargado sobre
Q-Sefarosa (4,4 x 10 cm, Pharmacia) que se equilibró
con TB conteniendo 2-ME 2 mM. Después de lavarlo con
el mismo tampón, la elución se efectuó con 1200 ml de un gradiente
lineal de NaCl 0,5 M. El pico de BIOB se recogió alrededor de una
concentración de NaCl de 0,3 M, se añadió sulfato de amonio al 10%
(p/V) y la solución se cargó en Fenyl-Toyopearl 650S
(2,2 x 5 cm, Tosoh) que se equilibró con TB conteniendo
2-ME 2 mM y 10% de sulfato de amonio (p/V). Después
de lavarse con el mismo tampón, la elución se efectuó con 250 mL de
un gradiente lineal (p/V) de sulfato de amonio del
10-0%. Se recogió el pico de BIOB alrededor de una
concentración de sulfato de amonio al 6%, concentrada con cerca de 3
mL por Centripep-30 (Amicon) y pasada a través de
HiPrep Sephacryl S200HR 26/60 (Pharmacia) con TB conteniendo
2-ME 2 mM y NaCl 0,25 M. Se recogió el pico de BIOB
con color rojo, diluido con el mismo volumen de TB conteniendo
2-ME 2mM y cargado sobre 6 ml de RESOURCE Q
(Pharmacia) que se equilibró con el mismo tampón. Después del
lavado, la elución se efectuó con 120 ml de un gradiente lineal de
NaCl 0-0,5 M. Se recogió el pico de BIOB con color
rojo. Antes del almacenaje, el BIOB se diluyó una vez a una
concentración final de proteína de cerca de 1 mg/mL con 50 mM de
Tris-HCl/pH 8,1 conteniendo 1 mM de ditiotreitol (a
partir de ahora referido como DTT) e incubado anaeróbicamente con
100 \mug de FeCl_{3} y 50 \muM de Na_{2}S a temperatura
ambiente durante 2 horas. El exceso de iones y DTT se extrajeron
pasando a través de Sephadex G-25 (M, 1,5 x 18 cm,
Pharmacia) con Tris-HCl 0,1 M/pH 7,5 conteniendo
DTT 0,2 mM. La proteína BioB se concentró a una concentración de
proteína final de 20-30 mg/mL y se guardó a -80ºC.
La pureza de la proteína BioB preparada como se estimó anteriormente
estaba sobre el 80% por una banda de proteína única con un peso
molecular de alrededor de 37 kDa en SDS-PAGE (ver
Fig.3). La proteína BioB preparada como antes mostró un patrón de
espectro de absorción típico de proteínas
hierro-azufre (ver Fig.4).
La cepa M5a1 de Klebsiella pneumoniae
[Nature, 237, 102 (1972)] creció en 50 mL de medio LB a 37ºC
durante 10 horas, y las células bacterianas se recuperaron por
centrifugación. El DNA entero se extrajo a partir del método de
fenol.
La clonación de los genes nifU y nifS de
Klebsiella pneumoniae se realizó como se muestra en la
Fig.5. El DNA entero (2 \mug) se digirió completamente con BamHI,
se obtuvieron 2,3-2,6 kb de fragmentos de DNA por
electroforesis en gel de agarosa. Se digirió completamente el
vector del plásmido pUC19 (Takara Shuzo Co.) con BamHI, y luego se
trataron con fosfatasa alcalina para evitar la
auto-ligación. Los fragmentos de DNA genómico
preparados anteriormente se ligaron con el pUC19 partido usando el
Kit de ligación de DNA (Takara Shuzo Co.), y la mezcla de ligación
se transfirió a la cepa de Escherichia coli JM109 por un
método celular adecuado. Las cepas se seleccionaron por su
resistencia a la ampicilina (100 \mug/ml) en una placa de agar con
medio LB. 2.000 de los clones individuales que tienen fragmentos de
DNA genómico se obtuvieron como librería genómica.
La selección del clon que tiene los genes nifU y
nifS de Klebsiella pneumoniae se realizó por hibridación de
colonia de acuerdo con el protocolo descrito por Maniatis et al.
(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1982, págs.
326-328).
Las colonias crecidas en la placa de agar se
transfirieron a membranas de nylon (Hybond-N,
Amersham Co.) y lisadas por alcalinos. El DNA desnaturalizado se
inmovilizó luego en las membranas. La hibridación se realizó usando
el sistema de Detección y Marcaje de DNA DIG (Böehringer Mannheim
Co., Mannheim, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Se sintetizaron dos oligonucleótidos teniendo
secuencias parciales de los genes de nifU y nifS. Las secuencias se
muestran como sigue:
Sonda-nifU
5'AGAGGAGCACGACGAGGGCAAGCTGATCTGCAAAT
Sonda-nifS
5'CGTTGGTCAGCGTGATGTGGGCGAATAACGAAACC
Los extremos-3' se marcaron
usando el Kit de marcaje del extremo-3' de
Oligonucleotidos DIG (Boëhringer Mannheim Co.), y una mezcla del
oligonucleótido marcado se usó como una sonda para hibridación. Los
clones hibridados se detectaron usando el Kit de Detección
Luminiscente DIG (Boehringer Mannheim Co.). Se obtuvieron veinte
seis candidatos para el portador de los genes nifU y nifS.
Fueron escogidos cuatro candidatos, y los
transformantes conteniendo los candidatos crecieron en un medio LB
conteniendo 100 \mug/mL de ampicilina. Los plásmidos híbridos se
extrajeron a partir de células por el método de
desnaturalización-alcalina y analizados usando
enzimas de restricción (BamHI, VspI y ScaI), se determinaron
300-400 secuencias de nucleótidos a partir de ambos
extremos de los fragmentos de DNA insertados usando el secuenciador
DNA ALFred (Pharmacia Biotech Co.). Las secuencias determinadas
fueron idénticas a la secuencia de nucleótidos de del "clúster"
S de nifU de Klebsiella pneumoniae, publicada por Beynon [J.
Bacteriol. 169, 4024-4029 (1987)]. Estos resultados
mostraron que los clones obtenidos tenían el "clúster" S de
nifU de Klebsiella pneumoniae. El plásmido híbrido en que el
"clúster" S de nifU, se insertó en la misma dirección que el
promotor de la lactosa (lac) en el vector se llamó pKNnif01. El
plásmido híbrido en que el "clúster" S de nifU se insertó en
dirección opuesta al promotor lac se llamó pKNnif02 (ver
Fig.5).
El plásmido del vector
pBluescriptII-SK+ (Toyobo Co., Tokyo, Japón) se
digirió completamente con HincII y BamHI. El plásmido híbrido
pKNnif02 se digirió completamente con VspI. El pKNnif02 cortado se
cortó en romo con el Kit DNA Blunting (Takara Shuzo Co., Japón) y
completamente digerido con BamHI. Unas 2,4 kb de fragmento
conteniendo el "clúster" S de nifU, se obtuvo por
electroforesis en gel de agarosa. Las 2,4 kb del fragmento se
insertaron en el pBluescriptII-SK+ cortado usando el
Kit de ligación del DNA para obtener el plásmido híbrido
pKNnif03.
El vector plasmídico pTrc99A se digirió
completamente con KpnI y BamHI. El plásmido híbrido pKNnif03 se
digirió completamente con KpnI y BamHI, y unas 2,4 kb del fragmento
KpnI-BamHI conteniendo el "clúster" S de nifU
se obtuvieron por electroforesis en gel de agarosa. Las 2,4 kb del
fragmento se ligaron con el pTrc99A cortado usando el Kit de
Ligación de DNA. Se obtuvo finalmente el plásmido híbrido pKNnif04
en que el "clúster" S de nifU, se insertó corriente abajo al
promotor trc. La cepa de Escherichia coli JM109 con el
plásmido híbrido se llamó Escherichia coli JM109
(pKNnif04).
Se precultivó Escherichia coli JM109
(pKNnif04) a 30ºC toda la noche en un medio LB conteniendo 100
\mug/mL de ampicilina. 0,1 mL del precultivo se transfirió a 5 mL
del mismo medio en un tubo de ensayo. Después del cultivo a 30ºC
durante 3 horas, se añadió IPTG 1 mM para inducir el promotor trc,
y se continuó el cultivo durante 3 horas. Las células bacterianas
se recogieron y lavaron con salino. Las células fueron
desestabilizadas por sonicación, y todas las proteínas de la célula
se sometieron a SDS-PAGE para confirmar las
expresiones de los genes nifU y nifS de acuerdo con el protocolo
descrito por Laemmli [Nature, 227, 680-685 (1970)].
Se sobreprodujeron NIFU Y NIFS en las células.
Las células de Escherichia coli JM109
(pKNnif04) y Escherichia coli JM109 (pTrc99A) se cultivaron
anaeróbicamente con caldo Terrific (ver Ejemplo 2) conteniendo 100
\mug/ml de ampicilina a 30ºC durante 3 horas. Se indujo la
expresión de NifU y NIFS por cultivo adicional durante 3 horas
después de la adición de IPTG 1 mM. Las células se recogieron por
centrifugación a 8000 x g durante 20 minutos, se lavaron una vez
con TB conteniendo NaCl 0,1 M de y EDTA 1 mM, se lavaron dos veces
con el mismo tampón sin EDTA 1mM y se guardó a -80ºC hasta su
uso.
Se preparó extracto de células libres de cada
cepa como sigue. Las células se descongelaron y se suspendieron en
cerca de 2 volúmenes de Tris-HCl 0,1 M/pH 7,5
conteniendo 2-ME 0,2 mM contra el peso de célula
seco. Las células en suspensión fueron desgasificadas, purgadas
mediante gas argón y desestabilizadas por sonicador (Bioruptor,
Cosmo Bio) en un tubo sellado con argón. Los materiales insolubles
se extrajeron por centrifugación a 100000 x g durante 30 minutos.
El sobrenadante resultante se usó como el extracto de células
libres. La concentración de proteínas totales de los extractos de
las células libres se determinó por el sistema de ensayo de proteína
BCA (PIERCE, Rockford, IL 61105, USA) después de la precipitación
de la proteína con ácido tricloroacético al 6% y lavado de la
proteína con acetona. Los extractos de células libres con una
concentración de proteína de alrededor de 30 mg/mL se obtuvieron por
el método anterior. Los extractos de células libres de
Escherichia coli JM109 (pKNnif04) expresando NIFU y NIFS
mostraron color rojo remarcable comparado con el de Escherichia
coli JM109 portador de pTrc99A en la misma concentración de
proteína. Se guardaron los extractos de células libres a -80ºC con
argón en tubos sellados.
La mezcla de reacción enzimática contiene
destiobiotina 100 \muM,
S-adenosil-metionina [SAM] 1000
\muM, L-cisteína 200 \muM , deazariboflavina
[DAF] 50 \muM, proteína BIOB 0,6 mg/mL (16 \muM), 20 mg de
proteína/mL de la mezcla de los extractos de células libras de
Escherichia coli JM109 (pKNnif04) y Escherichia coli
JM109 (pTrc99A), y Tris-HCl 0,1 M/pH 7,5 en un
volumen total de 50 \mul. La mezcla de reacción enzimática en un
recipiente sellado se llevó a condiciones anaeróbicas por
repetición de aspiración débil y presión de argón en oscuridad. La
reacción se empezó a 30ºC por irradiación débil con una bombilla
fluorescente de 20 W situada a 10 cm de distancia. Después de 80
min. de reacción, la reacción se paró calentando a 95ºC, y se
determinó la biotina producida por el ensayo microbiológico usando
Lactobacillus plantarium (ATCC8014). Dos formas de extractos
de células libres derivadas de Escherichia coli JM109
(pKNnif04) y Escherichia coli JM109 (pTrc99A) se mezclaron en
varias proporciones a una concentración de proteína constante de 20
mg/mL en las mezclas de reacción. De acuerdo con el incremento de
la proporción del extracto de células libres de Escherichia
coli JM109 (pKNnif04) que expresó las proteínas NIFU y NIFS, se
observó un incremento significativo de la producción de
biotina.
\newpage
Se observó una producción de biotina de alrededor
de 1,8 veces superior a la del control cuando el contenido del
extracto de células libres de Escherichia coli JM109
(pKNnif04) fue del 64% (ver Tabla 1).
| Proporción de B:A(%) | Biotina producida (ng/mL) | Índice relativo (%) |
| 0:100 (Control) | 532.8 | 100 |
| 16:84 | 688.3 | 129.2 |
| 32:68 | 829.8 | 155.7 |
| 64:36 | 927.3 | 174.0 |
| 100:0 | 811.3 | 152.3 |
| Comentario: A= Extracto libre de células de Escherichia coli JM109 (pTrc99A) | ||
| \hskip1,78cm B= Extracto de libre de células de Escherichia coli JM109 (pKNnif04) |
El vector plasmídico pMW218 (Nippon Gene Co.,
Tokyo, Japón) se digirió completamente con KpnI y BamHI. El
fragmento de 2,4 kb de KpnI-BamHI que lleva el
"clúster" S de nifU el nifU, obtenido del plásmido híbrido
pKNnif03 del Ejemplo 3 se ligó con el pMW218 cortado usando el Kit
de ligación de DNA. Se obtuvo finalmente el plásmido híbrido
pKNnif05 donde el "clúster" S de nifU, se insertó corriente
abajo del promotor lac.
El vector plasmídico pMW218 y el plásmido híbrido
pKNnif05 se transfirieron a Escherichia coli JM109 (pTrcEB1)
mediante un método celular adecuado, y se seleccionaron los
transformantes en una placa de agar con medio LB conteniendo 100
\mug/mL de ampicilina y 10 \mug/mL de kanamicina. La cepa de
Escherichia coli JM109 teniendo el plásmido híbrido pTrcEB1
y el vector plasmídico pMW218 se denominó Escherichia coli
JM109 (pTrcEB1 y pMW218). La cepa de Escherichia coli JM109
teniendo los plásmidos híbridos pTrcEB1 y pKNnif05 se denominó
Escherichia coli JM109 (pTrcEB1, pKNnif05).
Se digirió completamente el plásmido híbrido
pTrcEB1 con BamHI y se trató con fosfatasa alcalina para evitar su
propia ligación. El plásmido híbrido pKNnif02 se digirió
completamente con VspI. El pKNnif02 cortado, se cortó en romo con el
Kit DNA Blunting y se ligó con el enlazante BamHI (Takara Shuzo
Co.) usando el Kit de Ligación de DNA. Tras la digestión completa
con BamHI, un fragmento BamHI de 2,4 kb conteniendo el
"clúster" S de nifU, se obtuvo por electroforesis en gel de
agarosa. Las 2,4 kb del fragmento se insertaron en el pTrcEB1
cortado usando el Kit de ligación de DNA. Se obtuvo finalmente el
plásmido híbrido pKNnif06 en el que los genes bioB, nifU y nifS se
insertaron corriente abajo del promotor trc. La cepa de
Escherichia coli JM109 teniendo este plásmido híbrido se
denominó Escherichia coli JM109 (pKNnif06).
Escherichia coli JM109 (pTrcEB1, pKNnif05)
y Escherichia coli JM109 (pKnif06) se precultivaron a 30ºC
toda la noche en un medio LB conteniendo 100 \mug/mL de
ampicilina y 10 \mug/mL de kanamicina y en un medio LB conteniendo
100 \mug/mL de ampicilina respectivamente. 0,1 ml de los
precultivos se transfirieron a 5 ml del mismo medio en tubos de
ensayo. Después del cultivo a 30ºC durante 3 horas, se añadió IPTG
a 1Mm para la inducción, y el cultivo se continuó durante 3 horas.
Las células bacterianas se recogieron y se lavaron con salino. Las
células se desestabilizaron por sonicación, y las proteínas de la
célula enteras se sometieron a SDS-PAGE para
confirmar la expresión de los genes bioB, nifU, y nifS de acuerdo
con el protocolo descrito por Laemmli [Nature, 227,
680-685 (1970)]. Se encontró que estaban
sobreexpresadas las proteínas BIOB, NIFU y NIFS juntas en las
células.
Escherichia coli JM109 (pTrEB1, pMW218) y
Escherichia coli JM109 (pTrcRB1, pKNnif05) se inocularon en
50 mL de medio PC (2% glicerol, 5% proteasa peptona, 2% de
casaminoácidos, 1% de K_{2}HPO_{4}, 0,05% de KCl, 0,05% de
MgSO_{4} 7H_{2}0, 0,001% DE MnSO_{4} 4-6
H_{2}0, 0,001% FeSO_{4}, 7H_{2}0; Ph 7,0) que contiene 100
\mug/mL ampicilina, 10 \mug/mL kanamicina y 200 \mug/mL de
destiobiotina, y sujeto a agitación del cultivo a 30ºC durante 3
horas. Luego, se añadió IPTG a 1mM para inducir el promotor trc, y
la agitación del cultivo se llevó a 30ºC durante 27 horas.
Escherichia coli JM109 (pTrc99A), Escherichia coli
JM109 (pTrcEB1) y Escherichia coli JM109 (pKNnif06) se
inocularon en 50 ml de medio PC conteniendo 100 \mug/mL de
ampicilina y 200 \mug/mL de destiobiotina, y cultivado según lo
descrito anteriormente.
Después del cultivo, 1,5 mL de caldo de cultivo
se centrifugó para extraer las células bacterianas, y se obtuvo el
sobrenadante. La producción de biotina en el sobrenadante se ensayó
por el ensayo microbiológico usando Lactobacillus plantarium
(ATCC8014). La media de las cantidades de biotina producidas por
las cuatro cepas se muestra en la Tabla 2.
| Número de cepa | Biotina (mg/L) |
| JM109 (pTrc99A) | 0 |
| JM109 (pTrcEB1) | 2,03 |
| JM109 (pTrcEB1, pMW218) | 2,61 |
| JM109 (pTrcEB1, pKNnif05) | 4,00 |
| JM109 (pKNnif106) | 4,71 |
Las células de Escherichia coli JM109
(pKTnif04) se cultivaron anaeróbicamente con 1L de caldo Terrific
conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina a 26ºC durante 3 horas. La
expresión de los genes NIFU y NIFS se indujo por cultivo adicional
durante 3 horas después de la adición de IPTG 1 mM. Las células
(peso en seco 5,4 g) se recogieron por centrifugación a 8.000 x
durante 20 minutos, se lavaron con Tris-HCl20 mM/pH
7,4 conteniendo NaCl 0,1 M y EDTA1 mM, se lavaron dos veces con el
mismo tampón sin EDTA 1 mM y se guardaron a -80ºC hasta su uso.
Todas las operaciones de columna fueron
realizadas anaeróbicamente a temperatura ambiente a menos que se
indicara de otra manera. Las proteínas NIFU y NIFS corrieron como
bandas de proteína en SDS-PAGE. Las células se
descongelaron con 40 mL de Tris-HCl 20 mM/pH 7,4
conteniendo 5 mM de ditiotreitol (a partir de ahora referido como
DTT) y se desestabilizó por prensa francesa en presencia de fluoruro
de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM, desoxiribonucleosa I 10 \mug/mL,
ribonucleasa A 10 \mug/mL y pirodoxal fosfato 5 Mm. Los restos
celulares se extrajeron por centrifugación a 7.700 x g durante 30
minutos y la fracción insoluble se extrajo por centrifugación a
48.000 x g durante 30 minutos. La solución se enrasó hasta 50 mL
con el mismo tampón y se añadió sulfato de estreptomicina a la
solución a una concentración final de 1% (p/V). El residuo insoluble
se extrajo por centrifugación a 48.000 x g durante 20 minutos y se
añadió sulfato de amonio sólido al sobrenadante hasta el 30% de
saturación. Después de agitar enérgicamente a temperatura ambiente
durante 10 minutos, se obtuvo el precipitado conteniendo las
proteínas NIFU y NIFS por centrifugación a 48.000 x g durante 10
minutos. Se resuspendió el precipitado en Tris-HCl
20 mM/pH 7,4 conteniendo DTT, y el sobrenadante obtenido por
centrifugación a 48.000 x g durante 30 minutos se cargó en RESOURCE
Q (6 mL, Pharmacia) que se equilibró con Tris-HCl 20
mM/pH 7,4 conteniendo 5 mM DTT. Después de lavar con el mismo
tampón, se realizó la elución mediante 150 mL de gradiente lineal de
NaCl 0,05 M. Las proteínas NIFU y NIFS fueron
co-eluídas en una fracción de 20 ml de alrededor de
0,3 M de NaCl, y la fracción se recogió y concentró hasta 3,5 mL por
PM-30 (Amicon). La solución de proteína concentrada
se pasó a través de HiPrep Sephacryl S-200 HR 26760
(Pharmacia) con Tris-HCl 20 mM/pH 7,4 que contiene
DTT 5 mM y NaCl 0,25 M. Todas las proteínas NIFS se recuperaron
como un complejo proteico con la proteína NIFU, y alguna parte de
la proteína NIFU como un monómero. El complejo NIFU/S se eluyó en
una posición de peso molecular de alrededor de 140 kDa, y el
monómero NIFU se eluyó en una posición de peso molecular de 35 kDa.
Los 18 mL de la fracción que contiene el complejo NIFU/S y los 24
mL de fracción que contiene el monómero NIFU se concentraron hasta
3 mL por CentriPlus-30 (Amicon) y se guardaron a
-80ºC.
La mezcla de reacción enzimática sin extractos
libres de células contiene destiobiotina 100 \muM, SAM 1000
\muM, L-cisteína 200 \muM, deazariboflavina 50
\muM, 0,6 mg/mL (16 \muM) de proteína BIOB, DTT 10 mM y
Tris-HCl 0,1 M/pH 7,5 en un volumen total de 50
\muL. La mezcla de reacción enzimática en un tubo de vidrio spitz
de 300 \muL se llevó a condiciones anaeróbicas por repetición de
aspiración débil y bajo presión de argón en la oscuridad. La
reacción comenzó por irradiación débil a 10 cm de distancia con una
bombilla fluorescente de 20 W a 30ºC. Después de 80 min. de
reacción, la reacción se paró por calentamiento a 95ºC, y la biotina
producida se determinó por ensayo microbiológico usando
Lactobacillus plantarium (ATCC8014).
Se examinó el efecto de las adiciones del
complejo NIFU/S purificado y/o monómero NIFU purificado en la
mezcla de reacción enzimática. La adición de 13 \muM del complejo
NIFU/S purificado o 30 \muM del monómero NIFU mostró una
producción de biotina superior de alrededor de 4 veces. La adición
de 13 \muM del complejo NIFU/S purificado y 30 \muM del
monómero NIFU mostró una producción de biotina superior de
alrededor de 9 veces. (ver Tabla 3)
| Complejo NIFU/S 13 \muM | Monómero NIFU 30 \muM | Biotina producida (ng/mL) |
| - | - | 54,15 |
| + | - | 202,75 |
| - | + | 203,51 |
| + | + | 453,83 |
Claims (9)
1. Un proceso para la producción de biotina a
partir de destiobiotina que comprende el contacto de destiobiotina
con una mezcla de reacción del enzima que comprende el producto del
gen bioB y un producto génico adicional seleccionado del
grupo consistente en un producto génico de nifU, un producto
génico de nifS, y una combinación de los mismos, y
aislamiento de biotina a partir de la mezcla de reacción.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el producto génico de bioB se deriva de Escherichia
coli, y el producto génico de nifU y el producto génico
de nifS derivan de Klebsiella pneumoniae.
3. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones
1 ó 2, donde la mezcla de reacción además contiene
S-adenosilmetionina, L-cisteína y un
sistema donador de electrones.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el sistema donador de electrones comprende NADPH,
ferrodoxinaa-NADP reductasa y flavodoxina.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 3,
donde el sistema donador de electrones comprende
deazariboflavina.
6. Un proceso de acuerdo con alguna de las
reivindicaciones de 1 a 5, donde la reacción se efectúa a pH a
partir de 6,0 a 8,5, preferiblemente a partir de 7,0 a 8,0, y en un
rango de temperaturas a partir de 20 hasta 45ºC, preferiblemente a
partir de 25 hasta 40ºC.
7. Un proceso para la producción de biotina a
partir de destiobiotina que comprende el cultivo de un
microorganismo, que ha sido transformado por una secuencia de DNA
que codifica para BIOB y una secuencia de DNA adicional seleccionada
a partir del grupo que consiste de una secuencia que codifica NIFU,
una secuencia que codifica NIFS, y una secuencia que codifica una
combinación de NIFU y NIFS; donde dichas secuencias de DNA se
expresan en una plásmido único o independientemente los unos de los
otros en varios plásmidos, en un medio nutritivo acuoso, en
presencia de destiobiotina, y aislando la biotina resultante del
medio de cultivo.
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7,
donde el microorganismo se selecciona del género
Escherichia.
9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7
u 8, donde el cultivo se efectúa de 1 a 5 días, preferiblemente de
1 a 3 días, a un pH a partir de 5 hasta 9, preferiblemente de 6
hasta 8, y en un rango de temperaturas a partir de 10ºC a 45ºC,
preferiblemente de 25 hasta 40ºC.
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