CN1161476C - 生物素的发酵生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从脱硫生物素生产生物素的方法，包括将脱硫生物素与含有BIOB以及NIFU和/或NIFS的酶反应系统接触，并从反应混合物中分离所产生的生物素，也涉及一种从脱硫生物素生产生物素的方法，包括在水性培养基中，在脱硫生物素的存在下培养一种微生物，该微生物已被自身编码BIOB和NIFU和/或NIFS的DNA序列或包含于单个或互相独立的多个质粒中的这种DNA序列转化，从培养基中分离所产生的生物素。

Description

生物素的发酵生产
本发明涉及从脱硫生物素生产生物素的发酵方法。
生物素是动物、植物和微生物营养的必需维生素之一，并且是非常重要的医药或食品添加剂。
对生物素的发酵生产有很多研究。已知埃希氏菌属菌株是可用于上述方法的微生物〔参阅日本专利公开(Kokai)No.149091/1986，WO87/01391和日本专利公开(Kokai)No.155081/1987〕。除了上述菌株，已知还有芽胞杆菌属菌株〔日本专利公开(Kokai)No.180174/1991〕，沙雷氏菌属菌株〔日本专利公开(Kokai)No.27980/1990〕和短杆菌属菌株〔日本专利公开(Kokai)No.240489/1991〕。但这些方法还不适于工业应用，这是由于从营养物转化成生物素的低的碳利用率，以及在某些情况下直接中间产物脱硫生物素的聚积。因而必须改进脱硫生物素转化成生物素的效率。已知一种使用大肠杆菌静止细胞系统的从脱硫生物素到生物素的转化反应(Antimicrob.Agents Chemother.21，5，1982)和一种使用大肠杆菌无细胞提取物的从脱硫生物素到生物素的转化反应〔J.Biol.Chem.，270，19158(1995)；Biosci.Biotechnol.Biochem.，56，1780(1992)；Eur.J.Biochem.，224，173(1994)；Arch.Biochem.Biophys.，326，48(1996)〕。根据这些文献，已证实诸如铁氧化还原蛋白-NADP还原酶和黄素氧化还原蛋白以及生物素合成酶的蛋白质因子参与了从脱硫生物素到生物素的形成。然而，在这些条件下只观察到从脱硫生物素的生物素生成的有限效果。很容易使人推测另外一种未知蛋白质参与了这种将脱硫生物素更有效地转化为生物素的反应。
再者，使用球形芽胞杆菌(Bacillus Sphaericus)的纯化的生物素合成酶和光致还原的脱氮核黄素作为人工电子供体而不是使用铁氧化还原蛋白-NADP还原酶和黄素氧化还原蛋白的生理电子转移系统进行的转化反应最近已有报道〔Biochem.Biophys Res.Commun.，217，1231(1995)〕。但该报道的反应效率对于将该反应用于生物素的工业生产来说还不是足够地高。
本发明的一个目的是寻找一种从脱硫生物素生产生物素的更有效的方法。并且为了这一目的已阐明了各种蛋白质因子。我们发现，nifu和nifs基因产物(下文称作NIFU和NIFS)(它们被认为参与固氮酶金属簇核心形成所必需的铁和硫化物的运动〔J.Bacteriology，175，6737(1993)〕)对于从脱硫生物素大量生成生物素来说非常有效。本发明就是基于这些发现。
因而，本发明提供了从脱硫生物素生产生物素的方法，包括将脱硫生物素与含有bioB基因产物(它编码生物素合成酶；下文称作BIOB)和NIFU和/或NIFS的酶反应系统接触，从反应混合物中分离所产生的生物素，尤其是这样一种方法，其中BIOB得自于大肠杆菌以及NIFU和/或NIFS得自于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，或一种前述方法，其中该酶反应混合物还含有S-腺苷甲硫氨酸，L-半胱氨酸和一种电子供应系统，例如，其中该电子供应系统包括NADPH，铁氧化还原蛋白-NADP还原酶和黄素氧化还原蛋白或其中该电子供应系统包括脱氮核黄素或其功能等效组分。
本发明的另一个目的是提供一种上述方法，其中该反应是在pH6.0至8.5，优选7.0至8.0，以及温度为20至45℃，优选25至40℃的范围进行的。
再者，本发明也提供了一种从脱硫生物素生产生物素的发酵方法，包括在脱硫生物素的存在下并在一种水性培养基中培养一种微生物，该微生物已被自身或包含于单个或互相独立的几个质粒中的编码BIOB和NIFU和/或NIFS的DNA序列转化，从培养基中分离所产生的生物素，尤其是这样一种方法，其中该微生物选自埃希氏菌属并且特别是其中培养进行1至5天，优选1至3天，pH5至9，优选6至8，并且温度范围为10至45℃，优选25至40℃的方法。
本发明使用的酶反应体系包括BIOB，NIFU和/或NIFS作为蛋白质因子。对于上述反应的BIOB来说，可使用含有BIOB的细胞的无细胞提取物或通过常规的酶分离方法部分或完全纯化的BIOB。具有生物素合成酶活性的任何种类的BIOB均可用于该反应，但优选使用大肠杆菌BIOB。如果需要，通过下述步骤可获得大量的纯化的BIOB。构建大肠杆菌的基因文库，它含有覆盖全长bioB基因编码区的适当长度的DNA片段。因为已知大肠杆菌bioB基因位于一段1.3Kb的NcoI-HaeIII片段〔J.Biol.Chem.，263，19577(1988)〕中，可方便地使用该两个限制性内切酶。用于这一目的的一系列载体质粒可通过商业途径获得。可从Pharmacia Biotech Co.获得的载体质粒pTrc 99A是现有技术通常使用的可诱导质粒之一。然后，从上述大肠杆菌菌株的混合培养物中提取来自基因文库的混合杂种质粒DNA，并用于转化bioB基因缺陷型大肠杆菌突变体。大肠杆菌R875〔bioB17：J.Bacteriol.，112，830(1972)〕适用于这一目的。显示生物素原养型的克隆是基于目的bioB基因的表达进行选择的。该克隆应含有bioB基因并进行表达。任何显示该性质的杂种质粒均可用于获得BIOB。被称为pTrc EBI的杂种质粒是目的质粒之一。为获得大量的BIOB，将用适当的细胞学方法被pTrc EBI转化的大肠杆菌JM109(Takara Shuzo Co.，Shiga，日本)在具诱导作用的培养基中进行培养，所产生的BIOB可用一般的层析技术进行分离。或者，大肠杆菌bioB基因表示质粒可根据日本专利公开(Kokai)No.149091/1986或日本专利公开(Kokai)No.236493/1995所公开的已知方法构建。
对上述反应的NIFU和NIFS来说，含有上述NIFU和NIFS蛋白质的细胞的无细胞提取物，或通过常规酶分离方法部分纯化的NIFU和NIFS均可使用。任何一种具有从脱硫生物素形成生物素效能的NIFU和NIFS均可用于该反应。但优选使用肺炎克雷伯氏菌的NIFU和NIFS。肺炎克雷伯氏菌M5al是一种具有nifU和nifS基因的已明确定性的菌株。肺炎克雷伯氏菌的nifU和nifS基因是通过下述步骤获得的。首先用限制性内切酶(例如BamH1)切割的DNA片段构建肺炎克雷伯氏菌M5al的基因文库。因为已知肺炎克雷伯氏菌染色体DNA的一个2.5KbBamH1片段含有目的nifU和nifS基因〔J.Bacteriol.，169，4024(1987)〕，收集长度为2.3-2.6Kb的片段，并将其连接于能在适当微生物中复制的任何载体质粒。载体质粒pUC19(Takara Shuzo Co.)以及大肠杆菌JM109是构建基因文库的适合的质粒和宿主微生物组合之一。然后，目的克隆可用常规方法进行选择，例如使用基于公开的nifU和nifS基因DNA序列而制备的合成寡核苷酸探针进行集落杂交。随后，含有nifU和nifS基因的DNA片段可亚克隆进其它表达载体质粒。该可诱导的载体质粒(例如pTrc 99A)可有利地用于nifU和nifS基因的表达。大肠杆菌JM109(pKNnifO4)是表达nifU和nifS基因的合适克隆之一。基于已公开的bioB，nifS和nifU的DNA序列(可从任何已知的序列数据库，例如European Bioinformatics Institute(Hinston Hall，Cambridge，GB)获得)。编码这些基因的DNA序列也可用现有技术已知的方法进行合成构建，例如参阅EP747 483。使用公知的PCR技术，基于公开的序列可从任何一种微生物中分离编码BIOB、NIFU或NIFS任何一种的DNA序列。这样的微生物可从列于“Industrial Property”〔(1991)1.29-40〕杂志的任何一个已知的保藏机构获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
本发明所用的微生物的培养可用已知的方法进行。含有可同化碳源、可消化氮源、无机盐和微生物生长所需的其它营养物的水性培养基可用作本发明的水性培养基。可使用例如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精或甘油作为碳源。可使用例如胨、豆粉、玉米浆、肉青、硫酸铵、硝酸铵、尿素或任一种这些物质的混合物作为氮源。此外，可使用钙、镁、锌、锰、钴或铁的硫酸盐、盐酸盐或磷酸盐作为无机盐。并且，如果需要，常规营养因子或防沫剂，例如动物油，植物油或矿物油也可包括在该水性培养基中。如果所获得的微生物具有抗生素抗性标记，相关的抗生素也可包括于该培养基中。如果目的基因的表达可受异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导，该化合物也可存在于培养基中。培养基合适的pH值为5至9，优送6至8。合适的培养温度范围为10-45℃，优选25-40℃。培养时间通常为1至5天，优选1至3天。
对于从培养的细胞中制备无细胞提取物来说，可以使用诸如超声处理、在玻璃珠存在下或用弗氏压碎器的细胞破碎的一般方法进行。在细胞破碎后，将所得溶液离心以分离细胞碎片，其上清液即可用作无细胞提取物。
酶反应系统中含有作为反应组分的存在于上述制备的无细胞提取物中的BIOB和NIFU和/或NIFS蛋白质或其部分纯化物。除上述蛋白质以外，加入脱硫生物素作为该反应的底物。加入的脱硫生物素的量根据所用的酶反应系统可有所不同。D-型脱硫生物素和D-和L-型脱硫生物素均可用作底物。S-腺苷甲硫氨酸、L-半胱氨酸和一种电子供应系统，例如脱氮核黄素或脱氮核黄素的功能等效组分的加入可刺激该反应。除了电子供应系统脱氮核黄素或其功能等效组分(特别是作为人工电子供体)可用于该反应外，铁氧化还原蛋白-NADP还原酶和黄素氧化还原蛋白以及NADPH一起也可用作该反应的生理电子供应系统。根据所用的酶反应体系，这些添加组分的最适浓度可有所不同。但总的来说，我们建议，S-腺苷甲硫氨酸为50μM-2mM，L-半胱氨酸为10μm-2mM，脱氮核黄素为10-1000μM。
为了反应的进行，可使用对生物素的形成没有负作用的缓冲液。优选使用Tris-HCl缓冲液。该酶反应适宜在pH范围为6.0至8.5，优选在7.0至8.0的范围内进行。合适的反应温度为20-45℃，优选25-40℃。如果使用脱氮核黄素来刺激反应，适合使用距反应混合物约10cm远处放置的荧光灯进行光还原启动。温育时间可以在30分钟和3小时之间。只要酶仍有活性可以进行较长时间的温育。
除了上述酶反应系统外，也可直接使用nifU和nifS基因。例如，可以将前文所述制备的bioB、nifU和nifS基因置于一个质粒或多个互相独立的质粒中，通过常规转化方法导入宿主微生物例如大肠杆菌中。然后，从脱硫生物素生产生物素可在生长系统、静止系统以及如果需要在使用上述微生物无细胞提取物的酶反应系统中进行。任何一种被修饰的共同过量表达bioB、nifU和nifS基因的大肠杆菌菌株均可有利地用于本发明。在这些菌株中，特别优选大肠杆菌JM109(pTrcEB1，pKNnif05)菌株和大肠杆菌JM109(pKNnif06)菌株。
在上述条件下从脱硫生物素生产的生物素可容易地进行回收。为了这一目的，可以使用通常用于将某种产品从其溶液中提取出来的方法，该方法应适合于生物素的各种性质。例如，将固体物质从溶液中移出之后，将滤液中的生物素吸附于活性碳上，然后洗脱并用离子交换树脂进一步纯化。或者，将滤液直接加到离子交换树脂上，洗脱后，将所需产品从乙醇和水的混合物中重结晶。
下述实施例将更加详细地介绍本发明；但应理解本发明的范围并不限于这些特定的实施例。实施例中提及的并附于本文后面的附图总述于下：
图1：大肠杆菌bioB基因的克隆策略。
图2：pTrc EB1的结构。
图3：纯化的大肠杆菌BIOB SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
图4：纯化的大肠杆菌BIOB的吸收光谱。
图5：肺炎克雷伯氏菌nifU和nifS簇的克隆策略以及pKNnif02的结构。
图6：具有肺炎克雷伯氏菌nifU和nifS簇的中间质粒pKNnif03的构建。
图7：nifU和nifS基因表达质粒pKNnif04的构建。
图8：nifU和nifS基因表达质粒pKNnif05的构建。
图9：bioB、nifU和nifS基因表达质粒pKNnif06的构建。
实施例1
大肠杆菌bioB基因的克隆和表达
(1)总DNA的制备
将大肠杆菌HB101在37℃〔J.Mol.Biol．41，459(1969)；TakaraShuzo Co.〕培养于100ml Luria液体培养基(LB)(1％胰胨，0.5％酵母提取物，0.5％NaCl；pH7.5)中10小时，并离心收集细菌细胞。用酚方法从细胞中提取总DNA(基因融合实验，冷泉港实验室出版社1984，pp.137-139；Sambrook et al.1989“分子克隆”，冷泉港实验室出版社)，得到0.7mg的总DNA。
(2)基因组文库制备
如图1所示，将3μg的总DNA用NcoI和HaeIII完全消化，通过琼脂糖凝胶电泳分离1.2-1.5kb的片段。用DNA连接试剂盒(TakaraShuzo Co.，Japan)根据制造商的说明，将该DNA片段与用NcoI和SmaI消化的载体质粒pTrc 99A(Pharmacia Bio tech Co.，Pharmacia，Uppsala，Sweden)相连接。通过适当的细胞学方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社1982，pp.252-253)将该连接混合物转移至大肠杆菌菌株JM109〔基因33，103(1985)〕，并在LB培养基琼脂平板上将该菌株进行氨苄青霉素抗性筛选(100μg/ml)。获得了在强杂种色氨酸/乳糖启动子〔基因69，301-315(1988)；以下称“trc启动子”〕下游具有插入的基因组DNA片段的3000个单个克隆，并将其作为基因组文库。
将具有基因组文库的氨苄青霉素抗性菌株在37℃下，在含有100μg/ml氨苄青霉素的50ml LB培养基中培养16小时，离心收集细菌细胞。用碱变性方法从细菌细胞中提取质粒DNA库(分子克隆，冷泉港实验室出版社1982，pp.90-91)。
(3)筛选具有大肠杆菌bioB基因的杂种质粒
用适当细胞学方法将质粒DNA库转移至大肠杆菌bioB缺陷型突变体R875〔J.Bacteriol.112，830-839(1972)〕。为获得携带bioB基因的克隆，在含有100μg/ml氨苄青霉素，0.075U/ml抗生物素蛋白和0.1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培养基琼脂平板上筛选氨苄青霉素抗性和生物素原养型转化体。
将所获得的转化体之一在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养，从细胞中提取杂种质粒。用限制性内切酶分析分离的质粒。该杂种质粒具有含有bioB基因的1.3kb的NcoI-HaeIII片段，并被命名为pTrc EB1(见图2)。将具有该质粒的大肠杆菌菌株JM109命名为大肠杆菌JM109(pTrc EB1)。
(4)大肠杆菌中bioB基因的表达
在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中将大肠杆菌JM109(pTrc EB1)在37℃预培养过夜。将0.1ml的该预培养物转移至试管中的5ml同一种培养基中。37℃培养3小时后，以2mM的浓度加入IPIG以诱导trc启动子，并继续培养4小时。收集细菌细胞并用盐水洗涤。经超声处理破碎细胞，并将总细胞蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以证实bioB基因的表达，这是根据Laemmli描述的方法进行的〔Nature，227，680-685(1970)〕。BIOB以约2％总细胞蛋白质的量被过量产生。
实施例2
BIOB的分离
将大肠杆菌JM109(pTrc EB1)细胞用含有100μg/ml氨苄青霉素的2L Terrific液体培养基(TB；每升含24g酵母提取物/Difco，12g胰胨/Difco，4g甘油，2.31g KH2PO4，12.54g K2HPO4)在37℃需氧培养3小时。在加入1mM IPTG后继续培养3小时以诱导BioB蛋白质的表达。8000xg离心20分钟收集细胞，用含有0.1M NaCl和1mM EDTA的20mM Tris-HCl/pH8.1(下文称为TB)洗涤，用不含1mM EDTA的同一种缓冲液洗涤并贮存于-80℃直至使用。除非另有说明，所有的柱操作均是在室温下进行，其它的操作是在4-10℃进行。BIOB被示踪为相当于柱层析上红带的SDS-PAGE蛋白质带(分子量为37kDa)。用含有5mM 2-巯基乙醇(下文称作2-ME)的约60ml TB将细胞解冻，并在0.25mM苯甲基磺酰氟，10μg/ml脱氧核糖核酸酶I和10μg/ml核糖核酸酶A的存在下通过弗氏压碎器进行破碎，并通过15000xg离心30分钟除去细胞碎片。用含有5mM 2-ME的TB将溶液增容至200ml，并在该溶液中加入相同体积的(200ml)含有20％硫酸铵(w/v)的TB。加入1mM EDTA后，溶液中的蛋白质被加样至已用含有2mM 2-ME和10％硫酸铵平衡的Pheny1-Toyopearl 650M(4.4×10cm；Tosoh，Tokyo，Japan)上，用同一种缓冲液洗涤并用不含10％硫酸铵的同一种缓冲液洗脱。将洗脱液用含有2mM2-ME的TB稀释4倍，并加样至已用含2mM2-ME的TB平衡过的Q-Sepharose(4.4×10cm，Pharmacia)上。用同一种缓冲液洗涤后，用1200ml的0-0.5M线性梯度NaCl进行洗脱。收集位于0.3M NaCl浓度周围的BIOB峰，加入硫酸铵至10％(w/v)并将该溶液加样至已用含有2mM 2-ME和10％(w/v)硫酸铵平衡过的Phenyl-Toyopearl6505(2.2×5cm，Tosoh)上。用同一种缓冲液洗涤后，用250ml的10-0％(w/v)线性梯度硫酸铵进行洗脱。收集位于6％硫酸铵浓度周围的BIOB峰，用Centriprep-30(Amicon)浓缩至约3ml，并通过用含有2mM 2-ME和0.25M NaCl的TB平衡过的HiPrep Sephacryl S200HR26/60(Pharmacia)。收集具红色的BIOB峰，用同一体积的含有2mM 2-ME的TB稀释并加样至已用相同缓冲液平衡过的RESOURCE Q6ml(Pharmacia)上。洗涤后，用120ml 0-0.5M线性梯度NaCl进行洗脱。收集具红色的BIOB峰。贮存前，用含有1mM二硫苏糖醇(下文称作DTT)的50mM Tris-HCl/pH8.1将BIOB再一次稀释至蛋白质终浓度为约1mg/ml，并在室温下用100μM FeCl3和50μM Na2S厌氧温育2小时。通过用含有0.2mM DTT的0.1M Tris-HCl/pH7.5平衡过的Sephadex G-25(M，1.5×18cm，Pharmacia)除去多余的离子和DTT。将BIOB蛋白质浓缩至蛋白质终浓度为20-30mg/ml并贮存于-80℃。上述制备的BioB蛋白质的纯度估计为80％以上，并在SDS-PAGE上具有约37kDa分子量的单一蛋白质带(见图3)。上述制备的BioB蛋白质显示了铁-硫蛋白质典型的吸收光谱图形(见图4)。
实施例3
克雷伯氏菌nifU和nifS基因的克隆和表达
(1)总DNA的制备
将肺炎克雷伯氏菌菌株M5a1〔Nature，237，102(1972)〕在37℃在50ml LB培养基中生长10小时，离心收集细菌细胞。用酚方法提取总DNA。
(2)基因组文库制备
肺炎克雷伯氏菌nifU的nifS基因克隆的操作过程示于图5。用BamHI完全消化总DNA(2μg)，通过琼脂糖凝胶电泳获得2.3-2.6kb的DNA片段。用BamHI完全消化载体质粒PUC19(TakaraShuzo Co.)，然后用碱性磷酸酶处理以避免自连接。用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo Co.)将上述制备的基因组DNA片段与切割的pUC19连接，用适当细胞学方法将该连接混合物转移至大肠杆菌菌株JM109中。在LB培养基琼脂平板上筛选氨苄青霉素抗性(100μg/ml)菌株。获得2000个具有基因组DNA片段的单个克隆作为基因组文库。
(3)筛选具有肺炎克雷伯氏菌nifU和nifS基因的克隆
根据Maniatis等人描述的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社1982，pp.326-328)进行集落杂交来筛选具有肺炎克雷伯氏菌nifU和nifS基因的克隆。
将琼脂平板上生长的克隆转移至尼龙膜(Hy bondN，AmershamCo.)上并用碱溶解。变性的DNA被固定至膜上。根据制造商的说明用DIG DNA标记的检测系统(Boehringer MannheimCo.，Mannheim，Germany)进行杂交。合成两个具有部分nifU和nifS基因序列的寡核苷酯。该序列如下所示：
nifU探针5′AGAGGAGCACGACGAGGGCAAGCTGATCTGCAAAT
nifS探针5′CGTTGGTCAGCGTGATGTGGGCGAATAACGAAACC
用DIG寡核苷酸3’-末端标记试剂盒(Boehringer MannheimCo。)将这些寡核苷酸的3’-末端进行标记，将标记的寡核苷酸混合物用作杂交的探针。用DIG发光检测试剂盒(Boehringer Mannheim Co.)检测杂交的克隆。获得26个携带nifU和nifS基因的候选物。
选出4个候选物，并将具有该候选物的转化体在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基上生长。用碱变性方法从细胞中提取杂种质粒并用限制性酶(BamHI，VspI和ScaI)进行分析。用ALFred DNA测序仪(Pharmacia Biotech Co.)确定插入DNA片段两端的300-400个核苷酸的序列。被确定的序列与Beynon〔J.Bacteriol.169，4024-4029(1987)〕公开的肺炎克雷伯氏菌nifU，S簇的核苷酸序列相同。这些结果显示，所获得的克隆具有肺炎克雷伯氏菌nifU，S簇。将nifU，S簇以与乳糖(lac)启动子在载体中的相同方向插入的杂种质粒命名为pKNnif01。将具有以lac启动子相反方向插入的nifU，S簇的杂种质粒命名为pKNnif02(见图5)。
(4)杂种质粒pKNnif03的构建(见图6)
将载体质粒pBluescript II-SK+(Toyobo Co.，Tokyo，Japan)用HincII和BamHI完全消化。将杂种质粒pKNnif02用VspI完全消化。将切割的pKNnif02用DNA平头化试剂盒(Takara Shuzo Co.，Japan)进行平头化并用BamHI完全消化。通过琼脂糖凝胶电泳获得一个含有nifU，S簇的2.4kb的片段。将该2.4kb的片段用DNA连接试剂盒插入切割的pBluescript II-SK+中，得到杂种质粒pKNnif03。
(5)杂种质粒pKNnif04的构建(见图7)
将载体质粒pTrc99A用KpnI和BamHI完全消化。将杂种质粒pKNnif03用KpnI和BamHI完全消化，通过琼脂糖凝胶电泳获得一个含有nifU，S簇的2.4kb的KpnI-BamHI片段。用DNA连接试剂盒将该2.4kb的片段与切割的pTrc99A连接。最终得到在trc启动子下游插入了nifU，S簇的杂种质粒pKNnif04。具有该杂种质粒的大肠杆菌菌株JM109被命名为大肠杆菌JM109(pKNnif04)。
(6)克雷伯氏菌nifU和nifS基因的表达
将大肠杆菌JM109(pKNnif04)在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃过夜预培养。将0.1ml该预培养物转移至试管中的5ml同一种培养基中。30℃培养3小时后，以1mM的浓度加入IPTG以诱导trc启动子，并继续培养3小时。收集细菌细胞并用盐水洗涤。经超声处理破碎细胞，并根据Laemmli描述的方法〔Nature，227，680-685(1970)〕将总细胞蛋白进行SDS-PAGE以证实nifU和nifS基因的表达。
                           实施例4
              制备具有/没有NIFU和NIFS的大肠
                    杆菌的无细胞提取物
在含有100μg/ml氨苄青霉素的Terrific液体培养基(见实施例2)中将大肠杆菌JM109(pKNnif04)和大肠杆菌JM109(pTrc 99A)细胞在30℃需氧培养3小时。加入1mM IPTG后继续培养3小时来诱导NifU和NIFS的表达。8000xg离心20分钟收集细胞，用含有0.1MNaCl和1mM EDTA的TB洗涤一次，用不含1mM EDTA的同种缓冲液洗涤两次并贮存于-80℃直至使用。
按如下所述制备每一菌株的无细胞提取物。解冻细胞并悬浮于相对于细胞湿重的约2倍体积的含有0.2mM 2-ME的0.1M Tris-HCl/pH7.5中。将悬液中的细胞脱气，用氩气清洗并在有氩气的密封试管中用超声处理器(Bioruptor，Cosmo Bio)破碎。100000xg离心30分钟除去不溶性物质。得到的上清液被用作无细胞提取物。用6％三氯乙酸进行蛋白质沉淀和用丙酮洗涤蛋白质后，通过BCA蛋白质分析系统(PIERCE，Rockford，IL61105，USA)确定该无细胞提取物的总蛋白质浓度。通过上述方法得到了蛋白质浓度约为30mg/ml的无细胞提取物。在相同蛋白质浓度下与具有pTrc 99A的大肠杆菌JM109相比，表达NIFU和NIFS的大肠杆菌JM109(pKNnif04)的无细胞提取物显示明显的红色。将无细胞提取物在有氩气的密封试管中贮存于-80℃。
实施例5
体外酶反应(DAF系统)
酶反应混合物在50μl的总体积中含有100μM脱硫生物素，1000μM S-腺苷甲硫氨酸〔SAM〕，200μM L-半胱氨酸，50μM脱氮核黄素〔DAF〕，0.6mg/ml(16μM)BIOB蛋白质，20mg蛋白质/ml的大肠杆菌JM109(pKNnif04)和大肠杆菌JM109(pTrc99A)的无细胞提取物混合物，以及0.1M Tris-HCl/pH7.5。通过在黑暗条件下重复进行轻微吸气和氩气压力使存在于300μl锥形底玻璃试管中的酶反应混合物处于厌氧条件。用位于10cm远的20W荧光灯泡进行光照射，在30℃启动反应。反应80分钟后，在95℃加热终止反应，通过用胚芽乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)(ATCC 8014)进行微生物分析来确定所产生的生物素。将从大肠杆菌JM109(pKNnif04)和大肠杆菌JM109(pTrc99A)得到的两种无细胞提取物以不同的比率并以反应混合物中20mg/ml的恒定蛋白质浓度进行混合。与从表达NIFU和NIFS蛋白质的大肠杆菌JM109(pKNnif04)得到的无细胞提取物的比率增加相一致，观察到生物素的产量显著增加。
当从大肠杆菌JM109(pKNnif04)得到的无细胞提取物的含量为64％时，其生物素的产量比对照高约1.8倍(见表1)。
表1
  B∶A比率(％) 产生的生物素(ng/ml)   相对指数(％)
  0∶100(对照)     532.8     100
    16∶84     688.3     129.2
    32∶68     829.8     155.7
    64∶36     927.3     174.0
    100∶0     811.3     152.3
附注：A＝大肠杆菌JM109(pTrc 99A)的无细胞提取物
      B＝大肠杆菌JM109(pKNnif04)的无细胞提取物
实施例6
其同表达bioB、nifU和nifS基因的大肠杆菌菌株的构建
(1)杂种质粒pKNnif05的构建(见图8)
将载体质粒pMW218(Nippon Gene Co.，Tokyo，Japan)用KpnI和BamHI完全消化。用DNA连接试剂盒将从实施例3中的杂种质粒pKNnif03得到的携带nifU，S簇的2.4kb KpnI-BamHI片段与切割的pMW218连接。最终得到了在lac启动子的下游插入了nifU，S簇的杂种质粒pKNnif05。
用适当细胞学方法将载体质粒pMW218和杂种质粒pKNnif05转移至大肠杆菌JM109(pTrc EB1)，并在含有100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的LB培养基琼脂平板上筛选转化体。将具有杂种质粒pTrcEB1和载体质粒pMW218的大肠杆菌菌株JM109命名为大肠杆菌JM109(pTrcEB1和pMW218)。将具有杂种质粒pTrc EB1和pKNnif05的大肠杆菌菌株JM109命名为大肠杆菌JM109(pTrcEB1，pKNnif05)。
(2)杂种质粒pKNnif06的构建(见图9)
将杂种质粒pTrc EB1用BamHI完全消化并用碱性磷酸酶处理以避免自连接。将杂种质粒pKNnif02用VspI完全消化。用DNA平头化试剂盒将切割的pKNnif02平头化并用DNA连接试剂盒与BamHI接头(Takara Shuzo Co.)连接。用BamHI完全消化后，用琼脂糖凝胶电泳获得含有nifU，S簇的2.4kb的BamHI片段。用DNA连接试剂盒将该2.4kb的片段插入到切割的pTrc EB1中。最终获得了在trc启动子下游插入了bioB、nifU和nifS基因的杂种质粒pKNnif06。具有该杂种质粒的大肠杆菌菌株JM109被命名为大肠杆菌JM109(pKNnif06)。
(3)大肠杆菌中bioB、nifU和nifS基因的共表达
在含有100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml卡那霉素的LB培养基中和含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中分别将大肠杆菌JM109(pTrc EB1，pKNnif05)和大肠杆菌JM109(pKNnif06)在30℃过夜预培养。将0.1ml该预培养物转移至存在于试管中的5ml同一处培养基中。30℃培养3小时后，以1mM浓度加入IPTG诱导，并继续培养3小时。收集细菌细胞并用盐水洗涤。经超声处理破碎细胞，根据Laemmli描述的方法〔Nature，227，680-685(1970)〕将总细胞蛋白进行SDS-PAGE以证实bioB、nifU和nifS基因的表达。发现细胞中共同大量产生了BIOB、NIFU和NIFS蛋白质。
实施例7
发酵生产生物素
(1)由大肠杆菌JM109(pTrc EB1，pKNnif05)和大肠杆菌JM109(pKNnif06)生产生物素
将大肠杆菌JM109(pTrc EB1，pMw218)和大肠杆菌JM109(pTrc Eb1，pKNnif05)接种于含有100μg/ml氨苄青霉素，10μg/ml卡那霉素和200μg/ml脱硫生物素的50ml PC培养基(2％甘油，5％蛋白酶胨，2％酪蛋白水解物，1％K2HPO4，0.05％KCl，0.05％MgSO4·7H2O，0.001％MnSO4·4-6H2O，0.001％FeSO4·7H2O；pH7.0)中。并在30℃震荡培养3小时。然后，以1mM的浓度加入IPTG来诱导trc启动子，并在30℃震荡培养27小时。将大肠杆菌JM109(pTrc 99A)，大肠杆菌JM109(pTrc EB1)和大肠杆菌JM109(pKNnif06)接种于50ml含10μg/ml氨苄青霉素和20μg/ml脱硫生物素的PC培养基中，并以与上述相同的方式培养。
培养后，将1.5ml的培养液离心以除去细菌细胞，得到上清液。通过用胚芽乳杆菌
(ATCC8014)的微生物检测来测定上清液中生物素的产生。该4个菌株产生的生物素的平均量示于表2。
表2
菌株编号                              生物素(mg/L)
JM109(pTrc 99A)                       0
JM109(pTrc EB1)                       2.03
JM109(pTrc EB1，pMW218)               2.61
JM109(pTrc EB1，pKNnif05)             4.00
JM109(pKNnif06)                       4.71
实施例8
NIFU和NIFS的分离
用1L含有100μg/ml氨苄青霉素的Terrific液体培养基将大肠杆菌JM109(pKTnif04)细胞在26℃需氧培养3小时。加入1mM IPTG后继续培养3小时以诱导NIFU和NIFS基因的表达。在8000xg离心20分钟收集细胞(湿重5.4g)，用含有0.1M NaCl和1mM EDTA的20mMTris-HCl/pH7.4洗涤，用不含1mM EDTA的同种缓冲液洗涤两次并贮存于-80℃直至使用。
除非另有说明，所有的柱操作均是在室温厌氧条件下进行，其它操作是在4-10℃厌氧条件下进行。NIFU和NIFS蛋白质在SDS-PAGE上被示踪为蛋白质带。将细胞用含有5mM二硫苏糖醇(下文称作DTT)的约40ml 20mM Tris-HCl/pH7.4解冻，并在0.5mM苯甲基磺酰氟，10μg/ml脱氧核糖核酸酶I，10μg/ml核糖核酸酶A和5mM磷酸吡哆醛的存在下通过弗氏破碎器进行破碎。7700xg离心30分钟除去细胞碎片并在48000xg离心30分钟除去不溶性组分。将溶液用同一种缓冲液增容至50ml，并加入硫酸链霉素至终浓度1％(w/v)。48000xg离心20分钟除去不溶性沉淀并向上清液中加入固体硫酸铵至30％饱和。室温下轻微搅动10分钟后，48000xg离心10分钟得到含有NIFU和NIFS蛋白质的沉淀物。将该沉淀物重新悬浮于含有5mM DTT的20mM Tris-HCl/pH7.4中，将48000xg离心30分钟得到的上清液加样至已用含5mMDTT的20mM Tris-HCl/pH7.4平衡过的RESOURCE Q(6ml，Pharmacia)上。用同一种缓冲液洗涤后，用150ml 0-0.5M线性梯度NaCl洗脱。NIFU和NIFS蛋白质在0.3M NaCl周围于20ml级分中共同洗脱出来，收集该级分，并用DM-30(Amicon)浓缩至3.5ml。将该浓缩的蛋白质溶液与含有5mM DTT和0.25M NaCl的20mM Tris-HCl/pH7.4一起通过HiPrep Sephacryl S-200 HR 26/60(Pharmacia)。全部的NIFS蛋白质以与NIFU蛋白质组成的蛋白质复合物的形式被收回，部分NIFU蛋白质以单体形式被回收。NIFU/S复合物在约140kDa分子量的位置被洗脱出来，NIFU单体在约35kDa分子量的位置被洗脱出来。将18ml含有NIFU/S复合物的级分和24ml含NIFU单体的级分用CentriPlus-30(Amicon)浓缩至3ml并贮存于-80℃。
实施例9
纯化的NIFU/S复合物和NIFU单体对生物素形成的影响
没有无细胞提取物的酶反应混合物在50μl的总体积中含有100μM脱硫生物素，1000μM SAM，200μM L-半胱氨酸，50μM脱氮核黄素，0.6μg/ml(16μM)BIOB蛋白质，100mM DTT和0.1MTris-HCl/pH7.5。通过在黑暗条件下重复的轻微吸气和氩气压力使300μl锥形玻璃试管中的酶反应混合物处于厌氧条件。在30℃用置于10cm远的20W荧光灯泡进行光照束启动反应。反应80分钟后，在95℃加热终止反应，所产生的生物素通过使用胚芽乳杆菌(ATCC 8014)的微生物检测来确定。
检测纯化的NIFU/S复合物和/或纯化的NIFU单体的加入对酶反应混合物的影响。加入13μM纯化的NIFU/S复合物或30μM NIFU单体显示生物素的产生提高了约4倍。同时加入13μM纯化的NIFU/S复合物和30μMNIFU单体显示生物素的产生提高了约9倍。(见表3)
表3
  13μM NIFU/S复合物     30μM NIFU单体     产生的生物素(ng/ml)
    -     -     54.15
    +     -     202.75
    -     +     203.51
    +     +     453.83

Claims (9)

1.一种从脱硫生物素生产生物素的方法，包括将脱硫生物素与含有BIOB以及NIFU和/或NIFS的酶反应混合物接触，并从反应混合物中分离所产生的生物素，其中BIOB得自大肠杆菌，NIFU和/或NIFS得自肺炎克雷伯氏菌。
2.根据权利要求1的方法，其中该酶反应混合物还含有S-腺苷甲硫氨酸，L-半胱氨酸和一种电子供应系统。
3.根据权利要求2的方法，其中该电子供应系统含有NADPH，铁氧化还原蛋白-NADP还原酶和黄素氧化还原蛋白。
4.根据权利要求2的方法，其中该电子供应系统含有脱氮核黄素或其功能等效组分。
5.根据权利要求1至4中任意一项的方法，其中反应是在pH6.0至8.5，温度范围为20-45℃的条件下进行的。
6.权利要求5的方法，其中反应是在pH7.0至8.5，温度范围为25-40℃的条件下进行的。
7.一种从脱硫生物素生产生物素的方法，包括在一种水性培养基中，在脱硫生物素的存在下培养一种选自埃希氏菌属的微生物，该微生物已被自身编码BIOB和NIFU和/或NIFS的DNA序列或包含于单个或互相独立的多个质粒中的这种DNA序列转化，并从培养基中分离所产生的生物素。
8.根据权利要求7的方法，其中培养进行1至5天，并且是在pH5至9，温度范围为10-45℃的条件下进行的。
9.根据权利要求7的方法，其中培养进行1至3天，并且是在pH6至8，温度范围为25-40℃的条件下进行的。
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