DE19818665A1

DE19818665A1 - Verfahren zur biotechnologischen Oxidation von substituierten Trimethylcyclohexenylverbindungen

Info

Publication number: DE19818665A1
Application number: DE19818665A
Authority: DE
Inventors: Bernhard Hauer; Wolfgang Wohlleben; Peter Fischer; Sabine Lutz-Wahl; Claudia Schmidt-Dannert; Rolf D Schmid; Oliver Scherr
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1998-04-27
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 1999-10-28
Also published as: NO20005396L; NO321108B1; IL138413A; AU3815599A; US6432685B1; EP1073761A1; KR20010043034A; JP2002512806A; KR100542843B1; NO20005396D0; WO1999055897A1; IL138413A0; CN1298452A; CA2329992A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Oxidation von substituierten Trimethylcyclohexenylverbindungen in Gegenwart von Mikroorganismen der Ordung Actinomycetales und die Verwendung von Mikroorganismen in Oxidationsreaktionen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Oxidation von substi tuierten Trimethylcyclohexenylverbindungen in Gegenwart von Mi kroorganismen der Ordnung Actinomycetales und die Verwendung von Mikroorganismen in Oxidationsreaktionen.

Verbindungen mit einem Trimethylcyclohexenylring sind in der Na tur weit verbreitet. Sie sind wichtige Zwischenstufen im Terpeno idmetabolismus und treten beispielsweise bei der Carotinoidbio synthese auf. Sie lassen sich aus einer Reihe von natürlichen Quellen isolieren. Neben den Carotinoiden weisen beispielsweise viele Geruchs- und/oder Aromastoffe einen Trimethylcyclohexenyl ring auf. Auch in vielen Pflanzenölen sind sie enthalten.

In der Vergangenheit gab es verschiedene Ansätze zur biotechnolo gischen Oxidation von Verbindungen mit einem Trimethylcyclohexe nylring. So wird von Mikami et al. (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 41, No. 3, 1981: 610-617) die mikrobielle Transformation von β-Ionon und β-Methylionon mit dem Pilz Aspergillus niger be schrieben. Als Hauptprodukte der Reaktion mit β-Ionon als Edukt wurden (R)-4-Hydroxy-β-ionon und (S)-2-Hydroxy-β-ionon neben 2-Oxo-, 4-Oxo-, 3,4-Dehydro-, 2,3-Dehydro-4-oxo-, 3,4-Dehy dro-2-oxo-, (S)-2-Acetoxy-, (R)-4-Acetoxy-, 5,6-Epoxy-β-ionon und 4-(2,3,6-Trimethylphenyl)-but-3-en-2-on identifiziert. Analoge Transformationsprodukte wurden mit β-Methylionon als Edukt identi fiziert. Für eine technische Nutzung ist eine Reaktion mit derart vielen Nebenprodukten ungeeignet.

DE 32 43 091 beschreibt die Oxidation von β-Ionon zu (R)-4-Hy droxy-β-ionon mit dem Pilz Gongronella butleri. Bei dieser Reak tion entsteht als Hauptnebenprodukt das unerwünschte in 2-Posi tion hydroxylierte Produkt 2-Hydroxy-β-ionon.

Eine gegenüber Mikami et al. verbesserte Reaktion wird von Yama zaki et al. (Appl. Environ. Microbiol., Vol. 54, No. 10, 1988: 2354-2360) beschrieben. Yamazaki verwendet als Katalysator der Reaktion den Pilz Aspergillus niger JTS 191. Als Hauptprodukte wird ein cis-/trans-Isomerengemisch (= cis-3-Hydroxy-α-ionon und trans-3-Hydroxy-α-ionon) zusammen mit 3-Oxo-α-ionon beschrieben. Als weitere Nebenprodukte wurden 2,3-Dehydro-α-ionon, 3,4-Dehy dro-α-ionon und 1-(6,6-Dimethyl-2-methylen-3-cyclohexenyl)-bu ten-3-on identifiziet. Auch dieser Prozess ist technisch aufgrund des Haupt- und Nebenproduktespektrums speziell aufgrund des cis-/trans-Isomerengemischs nicht nutzbar. Auch das mit dem Pilz Mucor in FR 2 661 190 beschriebene Verfahren führt nicht zu be friedigenden Ergebnissen.

1995 hat Larroche et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 1995: 222-227) eine Fed-batch Biotransformation von β-Ionon mit Asper gillus niger beschrieben. Bei dieser Biotransformation entsteht neben 4-Hydroxy-β-ionon auch das unerwünschte 2-Hydroxy-β-ionon und 4-Oxo-β-ionon.

Eigene Arbeiten mit verschiedenen Pilzen als Katalysator zeigten, daß die Oxidation von Verbindungen mit einem Trimethylcylohexe nylring zu einer Vielzahl von Haupt- und Nebenprodukten führt.

Es bestand daher die Aufgabe ein Verfahren zur Oxidation von Ver bindungen mit einem Trimethylcyclohexenylring zur Verfügung zu stellen, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist und se lektiv zu Oxidationsprodukten führt.

Die Aufgabe wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Oxida tion von Verbindungen der allgemeinen Struktur I

zu Verbindungen der allgemeinen Struktur II

wobei die Substituenten in den Formeln I und II folgende Bedeu tung haben:

R¹ = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unver zweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes C₁-C₈-Alkyl-,
R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, Oxo- oder Hydroxyl-, wobei mindestens ein Rest R² oder R³ ungleich Wasserstoff ist

dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxidation der Verbindungen der allgemeinen Struktur I in Gegenwart von Bakterien der Ordnung Actinomycetales durchführt, gelöst.

Bevorzugt werden im erfindungsgemäßen Verfahren Verbindungen der allgemeinen Struktur Ia

zu Verbindungen der allgemeinen Struktur IIa

in Gegenwart von Bakterien der Ordnung Actinomycetales oxidiert, wobei der Substituent R¹ in den Formeln Ia und IIa die oben ge nannte Bedeutung hat und R² Oxo- oder Hydroxyl- bedeutet.

R¹ bezeichnet in den Verbindungen der Formeln I, Ia, II und IIa substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unver zweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes C₁-C₈-Alkyl-.

Als gesättigte Alkylreste seien substituierte oder unsubsti tuierte verzweigte oder unverzweigte C₁-C₈-Alkylketten wie beispielsweise Methyl, Ethyl, n-Propyl, 1-Methylethyl, n-Butyl, 1-Methylpropyl-, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, n-Hexyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethyl butyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethyl propyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, n-Heptyl oder n-Octyl genannt.

Als ungesättigte Alkylreste seien substituierte oder unsubsti tuierte, verzweigte oder unverzweigte C₂-C₈-Alkenylketten, wie beispielsweise Ethenyl, Propenyl, 1-Butenyl, 2-Butenyl, 3-Butenyl, 2-Methylpropenyl, 1-Pentenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-1-butenyl, 2-Methyl-1-butenyl, 3-Methyl-1-butenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Dimethyl-1-pro penyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 1-Hexenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-1-pentenyl, 2-Methyl-1-pen tenyl, 3-Methyl-1-pentenyl, 4-Methyl-1-pentenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pen tenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pen tenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 2-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl- 2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl-1-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl- 1-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-1-butenyl, 2,3-Dimethyl- 2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 3,3-Dimethyl-1-butenyl, 3,3-Dimethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-1-butenyl, 1-Ethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-me thyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-methyl-1-propenyl, 1-Ethyl-2-me thyl-2-propenyl, 1-Heptenyl, 2-Heptenyl, 3-Heptenyl, 4-Heptenyl, 5-Heptenyl, 6-Heptenyl, 1-Octenyl, 2-Octenyl, 3-Octenyl, 4-Octenyl, 5-Octenyl, 6-Octenyl oder 7-Octenyl.

Als ungesättigte Alkylreste seien weiterhin substituierte oder unsubstituierte, verzweigte oder unverzweigte C₂-C₆-Alkinylketten, wie beispielsweise Ethinyl-, Prop-1-in-1-yl, Prop-2-in-1-yl, n-But-1-in-1-yl, n-But-1-in-3-yl, n-But-1-in-4-yl, n-But-2-in-1-yl, n-Pent-1-in-1-yl, n-Pent-1-in-3-yl, n-Pent-1-in-4-yl, n-Pent-1-in-5-yl, n-Pent-2-in-1-yl, n-Pent-2-in-4-yl, n-Pent-2-in-5-yl, 3-Methyl-but-1-in-3-yl, 3-Methyl-but-1- in-4-yl, n-Hex-1-in-1-yl, n-Hex-1-in-3-yl, n-Hex-1-in-4-yl, n-Hex-1-in-5-yl, n-Hex-1-in-6-yl, n-Hex-2-in-1-yl, n-Hex-2- in-4-yl, n-Hex-2-in-5-yl, n-Hex-2-in-6-yl, n-Hex-3-in-1-yl, n-Hex-3-in-2-yl, 3 -Methyl-pent-1-in-1-yl, 3-Methyl-pent-1- in-3-yl, 3-Methyl-pent-1-in-4-yl, 3-Methyl-pent-1-in-5-yl, 4-Methyl-pent-1-in-1-yl, 4-Methyl-pent-2-in-4-yl oder 4-Methyl-pent-2-in-5-yl.

Als Substituenten der oben genannten Reste von R¹ kommen prinzi piell alle denkbaren Substituenten in Frage beispielsweise ein oder mehrere Substituenten wie Oxo-, Acyl-, CHR⁴OR⁵- (= Acetal), Ha logen wie Fluor, Chlor oder Brom, Cyano, Nitro, Amino, Hydroxy, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Alkoxy, Benzyloxy, Phenyl oder Benzyl, bevorzugt Oxo, Hydroxy-, Acyl- oder CHR⁴OR⁵- (= Acetal), Alkyl, Cy cloalkyl. R⁴ und R⁵ bedeuten in den Resten unabhängig voneinander C₁-C₄-Alkyl- oder C₃-C₈-Cycloalkyl-.

Es können auch mehrfach ungesättigte substituierte oder unsubsti tuierte, verzweigte oder unverzweigte C₂-C₈-Alkylketten als Reste R¹ vorteilhaft in den Formeln I, Ia, II oder IIa vorhanden sein. Dabei können mehrere Doppelbindungen konjugiert oder nichtkonju giert in der Kette enthalten sein oder es können gleichzeitig Doppelbindungen und Dreifachbindungen in der Kette sein. Bei spielhaft seien die bevorzugten Reste 3-Methyl-1,4-Dipenten-1-yl- oder 3-Methyl-Pent-1-in-4-en-(5)-yl- genannt.

Als weitere bevorzugte Reste R¹ seien Reste wie Ethinyl-, Hydroxy methyl-, Formyl-, 3-Methyl-3-Hydroxy-1, 4-Dipenten-1-yl- oder 3-Hydroxy-3-Methyl-Pent-1-in-4-en-5-yl genannt.

R² und R³ bezeichnen unabhängig voneinander in den Verbindungen der Formeln II und IIa Wasserstoff, Oxo oder Hydroxyl-, wobei mindestens ein Rest R² oder R³ ungleich Wasserstoff ist und R² in der Formel IIa nicht Wasserstoff bedeutet. Oxo bedeutet in jedem Fall einen über eine Doppelbindung gebundenen Sauerstoff.

In den Verbindungen der allgemeinen Struktur I, Ia, II und IIa ist eine Doppelbindung enthalten, die an zwei Positionen lokali siert sein kann, entweder in 4- oder in 5-Stellung des Cyclohe xanringes.

Für das erfindungsgemäße Verfahren sind prinzipiell alle Bakte rien der Ordnung Actinomycetales geeignet. Es handelt sich bei dieser Ordnung um gram-positive Bakterien, für die es charakteri stisch ist, daß sie verzweigte Filamente bilden. Diese Bakterien lassen sich wie alle geeigneten Mikroorganismen leicht in dem Fachmann bekannterweise beispielsweise aus Boden-, Kompost- oder Gewässerproben isolieren oder von Stammsammlungen wie der ATCC oder DSMZ bestellen. Methoden zur Isolierung dieser Bakterien sind beispielsweise aus den Lehrbüchern The Prokaryotes (Eds. Mortimer T. Starr, Heinz Stolp, Hans G. Trüper, Albert Balows, Hans G. Schlegel, Springer Verlag, 1981, 2. Auflage, Chapter 147, ISBN 3-540-08871-7) oder Mikrobiologisches Praktikum (Eds. Drews, 3. Auflage, Springer Verlag, Seite 47 bis 48, 1976) zu entnehmen. Vorteilhaft werden für das erfindungsgemäße Verfahren Bakterien ausgewählt aus der Gruppe Nocardia, Rhodococcus, Mycobacterium, Micrococcus, Proactinomyces und der Familie Streptomycetaceae mit den Gattungen Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia, Mi croellobosporia und Kitasatoa.

Bevorzugt werden Bakterien der Familie Streptomycetaceae mit den Gattungen Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia, Microello bosporia und Kitasatoa benutzt, besonders bevorzugt werden Bakte rien der Gattung Streptomyces im erfindungsgemäßen Verfahren ver wendet. Ganz besonders bevorzugt werden Bakterien der Gattung und Art wie Streptomyces arenae, Streptomyces antibioticus, Strepto myces griseus, Streptomyces violaceoniger, Streptomyces exfolia tus, Streptomyces griseoviridis, Streptomyces, fradiae, Strepto myces tendae oder Streptomyces hygroscopicus verwendet.

Die Vielzahl der für die Reaktion in Frage kommenden Bakterien spiegelt die sehr wechselvolle taxonische Historie der Ordnung Actionomycetales wieder. Die taxonomische Stellung der aufgeführ ten Organismen unterlag in den letzten Jahren einem starken Wan del und befindet sich noch immer im Fluß, da falsche Gattungs- und Artnamen korrigiert werden und bestehende Stämme in neue Gat tungen sortiert werden. Innerhalb dieser Gattungen und Arten be stehen enge verwandtschaftliche Beziehungen. Bakterien, die das erfindungsgemäße Verfahren durchführen, sind mit einer guten Wahrscheinlichkeit unter den oben genannten Mikroorganismen zu finden. So wurden beispielsweise 215 Bakterien der bevorzugten Gattung Streptomyces auf die erfindungsgemäße Reaktion getestet. 15 dieser Organismen führten die Reaktion aus. 15 dieser Organis men oxidierten das spezielle Substrat β-Ionon, wovon 6 Organismen auch in der Lage waren α-Ionon zu oxidieren. Das heißt ca. 6% der getesteten Bakterien führten die gewünschte Umsetzung von β-Ionon und ca. 3% die von α-Ionon durch. Der Fachmann kann also mit einer guten Wahrscheinlichkeit (ca. 3 bis 6%) beliebige Mi kroorgansimen der Ordnung Actinomycetales und speziell der Gat tung Streptomyces auf die Reaktion hin prüfen.

Fünf Organsimen der getesteten Bakterien, die die erfindungsge mäße Reaktion besonders gut durchführen wurden bei der DSMZ unter folgenden Nummern DSM 12134 (= Streptomyces arena Tü495), DSM 12133 (= S. antibioticus Tü46), DSM 12135 (= S. griseus ATCC 13273), DSM 12131 (= S. fradiae Tü27) und DSM 12132 (= S. violaceoniger Tü38) hinterlegt.

Vorteilhafterweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren Bakte rien verwendet, die schon eine gegenüber den Wildtypisolaten ge steigerte Produktivität aufweisen. Solche Mikroorgansimen erhält man zweckmäßigerweise durch Mutation von Wildstämmen, die die Fä higkeit zur erfindungsgemäßen Biotransformation (siehe Schema I) besitzen.

Zur Erzeugung solcher Mutanten können bekannte mikrobiologische Techniken eingesetzt werden. Zur Auslösung von Mutationen können alle gängigen Methoden verwendet werden wie die Anwendung von mu tagenen Substanzen, z. B. Nitrosoguanidin, Ethylmethansulfonat, Natriumnitrit, oder die Einwirkung von elektromagnetischer Strah lung wie UV-, Gamma- oder Röntgenstrahlung. Weiterhin können zur Mutagenese auch transponierbare genetische Elemente wie Transpo sons oder IS-Elemente verwendet werden. Zur Isolierung der Mutan ten kann beispielsweise ihre Eigenschaft die Biotransformation in erhöhtem Maß durchzuführen (Messung per GLC-Analyse siehe Bei spiele), benützt werden.

Solche Organismen lassen sich jedoch auch in kontinuierlicher Kultur aus einer Population von weniger adaptierten Individuen selektionieren, indem dem zufließenden Medium in angemessener Weise steigende Edukt/Produktkonzentrationen zugefügt werden.

Die Biotransformation des erfindungsgemäßen Verfahren kann mit wachsenden Zellen, ruhenden Zellen, Zellextrakten oder gereinig ten Enzymen vorteilhafterweise in Gegenwart von natürlichen oder artifiziellen Reduktionsäquivalentdonoren und/oder -akzeptoren durchgeführt werden. Bevorzugt wird die Reaktion mit wachsenden Zellen durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Oxidation von Verbindungen der Formel I oder Ia zu Verbindungen der Formel II oder IIa eignet sich vorteilhaft zur selektiven Oxidation von α- oder β-Iononen (siehe Schema I). Hierbei entstehen bevorzugt monooxidierte Pro dukte. In der Reaktion entstehen Nebenprodukte kaum oder gar nicht.

Schema I

Biotechnologische Oxidationsreaktion

Bei der Oxidation von β-Ionon entsteht im erfindungsgemäßen Ver fahren bevorzugt mit 4-Hydroxy-β-Ionon nur ein Produkt in guten Ausbeuten. Die Bakterien bilden in Gegenwart von Edukt (= β-Ionon) und Produkt (4-Hydroxy-β-Ionon) nur ein noch nicht identifiziertes Produkt in so geringen Mengen, das es sich nicht analytisch iden tifizieren läßt. Ob diese Verbindung ein Reaktionsnebenprodukt darstellt ist unklar. Diese Verbindung wird bezogen auf die Sum menparameter der GLC-Analyse (Edukt + Produkt) in Mengen ≦ 4%, be vorzugt ≦ 2%, besonders bevorzugt ≦ 1% gefunden (siehe Schema II).

Schema II

Oxidation von β-Ionon

Bei der Oxidation von α-Ionon entsteht im erfindungsgemäßen Ver fahren bevorzugt mit 3-Hydroxy-α-Ionon nur ein Produkt in guten Ausbeuten. Die Bakterien bilden in Gegenwart von Edukt (= α-Io non) und Produkt (3-Hydroxy-α-Ionon) nur ein noch nicht identifi ziertes Produkt in so geringen Mengen, das es sich nicht analy tisch identifizierten läßt. Ob diese Verbindung ein Reaktionsne benprodukt darstellt ist unklar. Diese Verbindung wird bezogen auf die Summenparameter der GLC-Analyse (Edukt + Produkt) in Men gen ≦ 6%, bevorzugt ≦ 4%, besonders bevorzugt ≦ 3% ganz besonders be vorzugt ≦ 1% gefunden (siehe Schema IIIa).

Schema IIIa

Oxidation von α-Ionon

Die erfindungsgemäße Oxidation von Verbindungen der allgemeinen Struktur I oder Ia führt vorteilhaft zu Verbindungen der allge meinen Struktur II oder IIa, bei denen die Substituenten R¹ und R² bezogen auf die Ringebene in trans-Stellung stehen. Das erfin dungsgemäße Verfahren führt damit bevorzugt zu regio- und ste reoselektiven Oxidationen.

Schema IIIb

Oxidation von α-Ionon zu tans-Isomeren

Dies ist beispielhaft aus Schema IIIb für die Oxidation von α-Io non (= spezielle Verbindung der Struktur Ia) zu trans-3-Hy droxy-(6R)-α-ionon und/oder trans-3-Hydroxy-(6S)-α-ionon (= spe zielle Verbindungen der Struktur IIa) zu entnehmen. Es entstehen kein cis-Isomere.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Bakterien in einem Medium, das das Wachstum dieser Organismen ermöglicht, angezüchtet. Die ses Medium kann ein synthetisches oder ein natürliches Medium sein. Je nach Organismus werden dem Fachmann bekannte Medien ver wendet. Für das Wachstum der Mikroorganismen enthalten die ver wendeten Medien eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an Vitamine und Spurenelemente.

Vorteilhafte Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker wie Mono-, Di- oder Polysaccharide wie Glucose, Fructose, Mannose, Xylose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose, komplexe Zucker quellen wie Melasse, Zuckerphosphate wie Fructose-1,6-bisphosp hat, Zuckeralkohole wie Mannit, Polyole wie Glycerin, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, Carbonsäuren wie Citronensäure, Milch säure oder Essigsäure, Fette wie Sojaöl oder Rapsöl, Aminosäuren wie Glutaminsäure oder Asparaginsäure oder Aminozucker, die auch gleichzeitig als Stickstoffquelle verwendet werden können.

Vorteilhafte Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispiele sind Ammoniumsalze wie NH₄Cl oder (NH₄)₂SO₄, Nitrate, Harnstoff, oder komplexe Stickstoffquellen wie Maisquell wasser, Bierhefeautolysat, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeex trakt, Fleischextrakt, Caseinhydrolysat, Hefe oder Kartoffelpro tein, die häufig auch gleichzeitig als Stickstoffquelle dienen können.

Beispiele für anorganische Salze sind die Salze von Calcium, Ma gnesium, Natrium, Mangan, Kalium, Zink, Kupfer und Eisen. Als An ion dieser Salze sind besonders das Chlor-, Sulfat- und Phospha tion zu nennen. Ein wichtiger Faktor zur Steigerung der Produkti vität im erfindungsgemäßen Verfahren ist der Zusatz von Fe²⁺- oder Fe³⁺-Salzen und/oder Kaliumsalzen zum Produktionsmedium.

Gegebenenfalls werden dem Nährmedium weitere Wachstumsfaktoren zugesetzt, wie beispielsweise Vitamine oder Wachstumsförderer wie Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nicotinsäure, Pantothenat oder Py ridoxin, Aminosäuren wie Alanin, Cystein, Asparagin, Asparagin säure, Glutamin, Serin, Methonin oder Lysin, Carbonsäuren wie Ci tronensäure, Ameisensäure, Pimelinsäure oder Milchsäure oder Substanzen wie Dithiothreitol.

Die Fermentation der Bakterien bzw. die Biotransformation kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. In der Regel wird die Oxidation mit aktiven Bakterien durchgeführt, sie gelingt je doch auch mit ruhenden Bakterien, allerdings mit wesentlich ge ringerer Geschwindigkeit.

Das Mischungsverhältnis der genannten Nährstoffe hängt von der Art der Fermentation ab und wird im Einzelfall festgelegt. Die Mediumkomponenten können alle zu Beginn der Fermentation vorge legt werden, nachdem sie falls erforderlich getrennt sterilisiert oder gemeinsam sterilisiert wurden, oder aber je nach Bedarf wäh rend der Fermentation kontinuierlich oder diskontinuierlich nach gegeben werden.

Die Züchtungsbedingungen werden so festgelegt, daß die Organismen optimal wachsen und daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht wer den. Bevorzugte Züchtungstemperaturen liegen bei 15°C bis 40°C. Besonders vorteilhaft sind Temperaturen zwischen 25°C und 37°C'. Vorzugsweise wird der pH-Wert in einem Bereich von 3 bis 9 fest gehalten. Besonders vorteilhaft sind pH-Werte zwischen 5 und 8. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von wenigen Stunden bis zu einigen Tagen bevorzugt von 8 Stunden bis zu 21 Tagen, beson ders bevorzugt von 4 Stunden bis 14 Tagen ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge an Produkt im Medium an.

Vorteilhafte Medien und Anzuchtsbedingungen für das erfindungsge mäße Verfahren können beispielsweise dem genannten Lehrbuch "The Prokaryotes" oder Stammsammlungskatalogen wie dem der DSMZ oder dem der ATCC entnommen werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Oxidation kann kontinuierlich oder in batch- oder fed-batch-weise durchgeführt werden. Wobei das Edukt zu Beginn der Fermentation vorgelegt werden kann oder aber kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgegeben werden kann. Die Eduktkonzentration liegt dabei vorteilhaft in einem Be reich von 0,1 bis 5 g/l, bevorzugt sind Konzentrationen von 0,5 bis 2 g/l. Das Edukt kann auch in verdünnter wäßriger oder orga nischer Lösung zugegeben werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu vorteilhaften Produktaus beuten von mindestens 10, bevorzugt 20, besonders bevorzugt 30% bezogen auf eingesetztes Edukt.

Die Eduktkonzentration wird vorteilhafterweise in einem Bereich gesteuert, der sicher stellt, daß keine wachstumshemmende Kon zentrationen des Edukts erreicht werden. Diese läßt sich für eine bestimmtes Edukt und einen gegebenen Mikroorganismus durch dem Fachmann geläufige einfache Vorversuche leicht ermitteln. Bei spielsweise werden hierfür Wachstumskurven der Organismen aufge nommen und so analysiert bei welchen Eduktkonzentrationen eine deutliche Abnahme der Wachstumsgeschwindigkeit eintritt.

Der Reaktionsumsatz kann leicht durch Probenentnahme und deren Untersuchung (GLC) verfolgt und kontrolliert werden. Die Isolie rung und Reinigung der Produkte aus der Kulturflüssigkeit kann nach bekannten Methoden erfolgen (siehe Beispiele). Zweckmäßiger weise trennt man die feste Biomasse vom Nährmedium oder Trans formationsmedium ab, extrahiert den Wertstoff z. B. mit einem or ganischen Lösungsmittel und isoliert den Wertstoff aus der extra hierten Phase. Auch säulenchromatographische Verfahren sind für die Aufarbeitung zweckmäßig.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veran schaulicht.

Beispiele

Für die Anzucht der Bakterien und Biotransformationsreaktionen (speziell der α- und β-Ionone wurden drei Komplexemedien und ein synthetisches Medium verwendet.

Medium A:
Sojamehl: 20 g/l
Mannitol: 20 g/l
pH 7,5.

Medium B:
Nutrient broth: 8 g/l
Hefeextrakt: 10 g/l
Glucose: 5 g/l
pH 7,0.

Medium C:
(NH₄)₂SO₄: 5,0 g/l
MgSO₄.7H₂O: 0,5 g/l
MnSO₄.H₂O: 0,05 g/l
K₂HPO₄: 3,6 g/l
KH₂PO₄: 1,5 g/l
Glucose: 2 g/l
FeSO₄.H₂O: 0,2 g/l
ZnSO₄.7H₂O: 10 mg/l
MnCl₂.4H₂O: 3 mg/l
H₃BO₃: 30 mg/l
CaCl₂.6H₂O: 20 mg/l
CuCl₂.2H₂O: 1 mg/l
NiCl₂.6H₂O: 2 mg/l
Na₂MoO₄.2H₂O: 3 mg/l
TitriplexIII: 500 mg/l
pH-Wert: 7,0.

Medium D:
Sojamehl: 15 g/l
NaCl: 5 g/l
Maisquellwasser: 5 g/l
CaCl₂: 2 g/l
Glucose: 15 g/l
pH 7,0.

In einer ersten Screeningrunde auf Hydroxylierungsaktivitäten ge genüber β-Ionon als Edukt wurden verschiedene Streptomyces-Stämme getestet. Dazu wurden Vorkulturen der Stämme in 5 ml Medium A von Schrägagarröhrchen aus angeimpft und zwei Tage bei 28 bis 30°C in kubiert. Anschließend wurden 100 ml Medium A mit 3 ml der Vorkul tur angeimpft und bei 28 bis 30°C/150 rpm auf einem Schüttler inku biert. Nach zwei Tagen Anzucht wurden 0,1% β-Ionon (w/v) zu den Kulturen gegeben und die Inkubation für weitere 5 Tage fortge setzt. Danach wurden die Zellen durch Filtration abgetrennt und 2 ml Aliquots des Filtrats wurden mit Ethylacetat/Hexan (3 : 2) oder Diethylether extrahiert. Der Extrakt wurde per Dünnschichtchroma tographie (= TLC) analysiert. Zur Kontrolle wurden analoge Kultu ren ohne Edukt erstellt und analysiert. Die Stabilität des Edukts wurde in Medium A unter identischen Inkubationsbedingungen ermit telt und bestätigt.

Zwei der Umsatz zeigenden Streptomyces-Stämme (ATCC 13273 und Lu1537) wurden in einer zweiten Screeningrunde auf ihre Fähigkeit hin β-Ionon unter gleichen Bedingungen zu oxidieren näher unter sucht. Es wurden 1 ml Aliquots jeden Tag genommen, filtriert und wie unter Beispiel 1 beschrieben extrahiert und mit TLC oder Flüssiggaschromatographie analysiert (= GLC). Nach 10 bis 12 Tagen wurden die Kulturen komplett wie beschrieben aufgearbeitet und analysiert. Die Biotransformation und Aufarbeitung mit α-Ionon als Edukt wurde analog durchgeführt.

Größere Kulturvolumen (z. B. < 100 ml) wurden nach Filtration zwei mal mit Diethylether (50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit gesättigter wässriger NaCl-Lösung gewaschen und mit MgSO₄ oder Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum auf ein Volumen von 1 bis 2 ml (Rotationsverdampfer, 42°C) eingeengt.

Für die TLC-Analytik wurden Proben der Extrakte auf TLC-Platten (0,2 mm, Silika 60 F₂₅₄, Merck Darmstadt) aufgebracht und an schließend mit Hexan/Ethylacetat (3 : 2) entwickelt. Die Produkte wurden über ihr Fluoreszenzquenching bei 254 nm nachgewiesen und/oder über Ansprühen mit 2,5% (w/v) Vanillinlösung in 95% EtOH/H₂SO₄ und anschließendem Aufheizen. α- und β-Iononstandards sowie Standards von 3- und 4-Hydroxy-β-Ionon wurden mit aufgetragen. Entsprechend wurde auch bei α-Ionon vorgegangen.

Die GC-Analytik (= GLC) wurde mit einem Carlo Erba MEGA 5300 mit einem Flammenionisationsdetektor (= FID) mit einem Spectra Phy sics Labnet Version 3.5 Integratorsystem und einer 20 m Glaska pillarsäule, die mit einer chiralen Polysiloxan Phase modifiziert mit chemisch gebundenen α-oder β-Cyclodextrin (0,38 und 0,34% je weils) war, durchgeführt. Es wurden folgende Bedingungen verwen det:
Temperaturprogramm: 100°C (1 min isotherm) - 100-220°C (4°C/min)
Druck: 0,4 bar H₂. Die Proben wurden in CH₂Cl₂-Lösung aufgebracht.

NMR-Spektren wurden in CDCl₃-Lösungen mit einem Bruker (Karlsruhe-Forch heim, Deutschland) ARX 500 Spektrometer (Frequenz 500.13 MHz für ¹H und 125.77 MHz für ¹³C) aufgenommen.

Beispiel 1

Im ersten Versuch wurden 215 verschiedene Streptomyceten-Stämme auf ihre Fähigkeit hin β-Ionon zu oxidieren getestet. Von den 4 verschiedenen Medien erwies sich Medium A als besonders geeignet. 13 der Stämme zeigten in der TLC-Analytik polarere Produkte. Diese Stämme wurden nochmals in größerem Maßstab angezogen und die Biotransformation über 10 bis 12 Tage wie oben beschrieben verfolgt. Anschließend wurden die Ansätze komplett aufgearbeitet (siehe oben) und per GLC analysiert (siehe Tabelle I). Neben 4-Hydroxy-β-ionon als Produkt wurde nur eine weitere nichtidenti fizierbare Komponente gefunden (siehe Tab. I, Spalte 4, Kompo nente X).

Tabelle I

Biotransformation von β-ionon

Die meisten Stämme zeigten nur geringe Umsatzraten mit Ausnahme von S. antibioticus und S. arenae (22 und 33% jeweils). Als Pro dukt wurde nur 4-Hydroxy-β-Ionon (Nachweis: GLC und NMR) gefunden. Auch wurde kein komplexes Produktgemisch wie mit den Pilzen wie Aspergillus niger gefunden.

Beispiel 2

Biotransformationsversuche Analog den in Beispiel 1 beschriebenen mit α-Ionon zeigten, daß 6 der Stämme α-Ionon hydroxylieren kön nen. Als Produkt wurde 3-Hydroxy-α-Ionon per GLC und NMR identi fiziert. In der chiralen GC wurden zwei Produktpeaks gefunden, die den beiden trans-Isomeren (siehe Schema IIIb) entsprechen. Die Hydroxylierung erfolgt also regio- und stereoselektiv. Auch im Falle von α-Ionon wird im Gegensatz zu Aspergillus niger kein Produktgemisch erhalten. Auch im Falle von α-Ionon gibt es, mit Ausnahme von S. arenae Tü495 (2 weitere Nebenprodukte), nur ein unbekanntes Nebenprodukt (= Tab. II, Spalte 4, Komponente X). Tabelle II gibt die Ergebnisse der Versuche wieder.

Tabelle II

Oxidation von α-Ionon

Für die NMR-Analyse wurden die Extraktionsrückstände in 1 ml CDCl₃ aufgenommen mit einem Molekularsieb getrocknet, filtriert und vermessen. In beiden Fällen wurden die Produkte der Oxidation klar im NMR mit 4-Hydroxy-β-Ionon und 3-Hydroxy-α-ionon identifi ziert.

Claims

1. Verfahren zur Oxidation von Verbindungen der allgemeinen Struktur 1
zu Verbindungen der allgemeinen Struktur II
wobei die Substituenten in den Formeln I und II folgende Be deutung haben:
R¹ = substituiertes oder unsubstituiertes, verzweigtes oder unverzweigtes, gesättigtes oder ungesättigtes C₁-C₈-Al kyl-,
R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff, Oxo- oder Hydra xyl-, wobei mindestens ein Rest R² oder R³ ungleich Was serstoff ist

dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxidation der Verbindun gen der allgemeinen Struktur I in Gegenwart von Bakterien der Ordnung Actinomycetales durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, der Ver bindungen der allgemeinen Struktur Ia
zu Verbindungen der allgemeinen Struktur IIa
in Gegenwart von Bakterien der Ordnung Actinomycetales oxi diert und
wobei der Substituent R¹ in den Formeln Ia und IIa die gemäß Anspruch 1 genannte Bedeutung hat und R² Oxo- oder Hydroxyl bedeutet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, das als Produkt Verbindungen der Formel II oder IIa entstehen de ren Substituenten R¹ und R² oder R³ bezogen auf die Ringebene in trans-Stellung stehen.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeich net, daß die Reaktion mit wachsenden Zellen durchgeführt wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeich net, daß die Reaktion in Gegenwart von Bakterien ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Nocardia, Rhodo coccus, Mycobacterium, Micrococcus, Proactinomyces und der Familie Streptomycetaceae wie den Gattungen Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia, Microellobosporia und Kitasatoa durchgeführt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeich net, daß die Reaktion in Gegenwart von Bakterien der Gattung Streptomyces durchgeführt wird.

7. Verwendung von Bakterien der Ordnung Actinomycetales zur Oxi dation von Verbindungen der allgemeinen Struktur I gemäß An spruch 1.