DE4401388A1 - Verfahren zur Herstellung von gamma-Decalacton - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein stereospezifisches Verfahren zur Herstellung von γ-Decalacton aus 3-Decen-4-olid. γ-Decalacton, eine fast farblose Flüssigkeit mit einem intensiven fruchtigen Geruch, der an Pfirsiche erinnert, wird in der Parfümerie für schwere, fruchtige Blumendüfte und in der Aromaindustrie vorzugsweise für die Herstellung von Fruchtaromen, insbesondere von Pfirsicharomen, eingesetzt.

Fermentative Verfahren zur Herstellung von γ-Lactonen verwenden normalerweise Pflanzenöle als Substrate; vgl. R.G. Berger et al., Z. Naturforsch. 41c, 963-970 (1986); WO 83/1072 und EP-PS 258 993. So läßt sich beispielsweise γ-Decalacton fermentativ aus Rizinusöl herstellen (WO 83/1072); neben γ-Decalacton entsteht dabei durch Wasserabspaltung aus dem intermediär als Nebenprodukt anfallenden 3-Hydroxy-γ-Decalacton das 3-Decen-4-olid (I.L. Gatfield et al., Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm. 15 165-170 (1993)). Das 3-Hydroxy-γ-decalacton befindet sich im Destillationssumpf in beträchtlichen Mengen.

Es bestand also ein Bedürfnis nach einer vernünftigen Verwertung des 3-Decen-4-olids; insbesondere bestand ein Bedürfnis nach einem Verfahren zur Umwandlung von 3-Decen-4-olid in γ-Decalacton. Weil natürliche Produkte für die Aromaindustrie besonders wertvoll sind, sollte das gewünschte γ-Decalacton vorzugsweise in der R(+)-Konfiguration vorliegen.

Überraschenderweise haben wir gefunden, daß dieses Problem mit Hilfe von Saccharomyces cerevisiae (Bierhefe bzw. Bäckerhefe) gelöst werden kann. Dies war an sich nicht zu erwarten, weil Bäckerhefe zwar C=C-Doppelbindungen acyclischer α, β-ungesättigter Carbonylverbindungen (H.G. Davies et al., Biotrans­ formations in Preparative Organic Chemistry, Academic Press 1983, 127-136) und α, β-ungesättigter Lactone (EP-A 425 001 und Tetrahedron Letters 34 6467-6470 (1993)) hydriert, aber C=C-Doppelbindungen, die von Enon-, Enal- oder Enolstrukturen weiter entfernt sind, nicht reduziert (H.G. Davies a.a.O.), und weil an der Doppelbindung stehende Substituenten die Hydrierung erschweren (H.G. Davies a.a.O.).

Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von γ-Decalaton

aus 3-Decen-4-olid

in Gegenwart von Saccharomyces cerevisiae oder dessen Enzymen oder von Mikroorganismen mit genetischem Material aus Saccharomyces cerevisiae, das die Struktur- und Regulatorgene für die Enzyme kodiert, die in dieser Reaktion wirksam sind.

Das Ausgangsprodukt 3-Decen-4-olid kann auch in Mischung mit anderen Komponenten, beispielsweise mit 2-Decen-4-olid, eingesetzt werden. Da die. Hydrierung von 2-Decen-4-olid ebenfalls zum γ-Decalacton führt, kann also ohne weiteres das bei der γ-Decalacton-Herstellung anfallende Nebenproduktgemisch aus 2- und 3-Decen-4-olid als Ausgangsprodukt dienen. Der Gehalt an 3-Decen-4-olid in diesen Gemischen liegt im allgemeinen über 20, vorzugsweise über 50, insbesondere über 70 Gew.-%, bezogen auf die Summe von 2- und 3-Decen-4-olid.

Die erfindungsgemäß zu verwendende Hefe kann in üblichen Kulturmedien kultiviert werden. Diese Kulturmedien können synthetisch, halbsynthetisch oder komplex sein und können Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls Spurenelemente und Vitamine enthalten.

Als Kohlenstoffquellen können z. B. Zucker wie Glucose, Zuckeralkohole wie Glycerin, organische Säuren wie Zitronensäure oder komplexe Gemische wie Malzextrakt, Hefeextrakt, Casein oder Caseinhydrolysat dienen.

Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind anorganische Stickstoffquellen wie Nitrate und Ammoniumsalze und organische Stickstoffquellen wie Hefeextrakt, Sojamehl, Baumwollsaatmehl, Casein, Caseinhydrolysat, Weizengluten und Mais­ quellwasser.

Als organische Salze können beispielsweise u. a. Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate von Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Zink und Eisen verwendet werden.

Die Umsetzungen werden vorzugsweise bei solchen Hefekonzentrationen durchgeführt, daß die Hefe-Endkonzentration 5 bis 500, insbesondere 5 bis 50 g/l (Naßgewicht) beträgt.

Das Substrat kann zu Beginn der Inkubation, während oder nach Abschluß des Wachstums auf einmal oder über einen längeren Zeitraum verteilt zugegeben werden. Die Menge an 3-Decen-4-olid wird dabei vorteilhaft so bemessen, daß die Konzentration der Verbindung in der Kulturbrühe 30 g/l, vorzugsweise 5 g/l nicht überschreitet. Der Verlauf der Hydrierung kann durch Bestimmung des Ausgangs­ materials und der Produkte in der Kulturbrühe mittels Hochdruckflüssigkeits­ chromatographie verfolgt werden. Nachdem die optimale Menge des gewünschten γ-Decalactons entstanden ist, kann dieses durch bekannte physikalische Verfahren wie Extraktion, Destillation oder Chromatographie aus der Kulturbrühe isoliert und durch weitere Schritte gereinigt werden.

Nach einer bewährten Ausführungsform wird die Fermentationsbrühe abfiltriert, mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäureethylester extrahiert, der Extrakt getrocknet und vom Lösungsmittel befreit; danach kann das γ-Decalacton beispielsweise durch Destillation gereinigt werden.

Die Kultivierungstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 15 bis 37°C, besonders bevorzugt im Bereich von 27 bis 35°C. Der pH-Wert des Mediums beträgt bevorzugt 2,5 bis 7, insbesondere 3 bis 6. Die Kultivierung kann beispiels­ weise in geeigneten Schüttelapparaturen oder in Fermentern mit Mischeinrichtung erfolgen. Bei der Kultivierung ist für eine ausreichende Belüftung Sorge zu tragen. Die Kultivierung kann batchweise, halbkontinuierlich oder kontinuierlich durch­ geführt werden. Die Kulturdauer bis zum Erreichen einer maximalen Produkt­ menge liegt zwischen 4 und 240 Stunden.

Die Stereospezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens ist sehr hoch:

Der Anteil des R(+)-γ-Decalactons am erhaltenen γ-Decalacton liegt im allgemeinen über 95, vorzugsweise über 97%.

Die Prozentangaben der nachfolgenden Beispiele beziehen sich jeweils auf das Gewicht.

Beispiele

Das rohe 3-Decen-4-olid, das hier zum Einsatz kam, wurde destillativ gewonnen und bestand nach GC zu 91% aus 3-Decen-4-olid, 7% aus 2-Decen-4-olid und 2% aus γ-Decalacton.

Beispiel 1

2,5 g D-Glucose wurden in Leitungswasser (500 ml, pH 6,0) in einem 1 l Rundkolben gelöst und 10 g frische Bäckerhefe hinzugegeben. Der Kolben war mit einem Gärverschluß versehen. Nach einer Vorgärzeit von 45 Minuten wurde das rohe 3-Decen-4-olid (100 mg) zum magnetisch gerührten Ansatz hinzugegeben und die Umsetzung bei Zimmertemperatur (ca. 20°C) 24 Stunden weitergeführt. Nach der Extraktion des Ansatzes mit Essigester erhielt man 90 mg rohen Extrakt, der nach GC zu 88% aus γ-Decalacton bestand. Etwa 0,5% nicht umgesetztes Ausgangsmaterial war im GC noch nachweisbar.

Beispiel 2

Der Versuch, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde wiederholt:

Das rohe 3-Decen-4-olid wurde aber in zwei gleich großen Portionen von 100 mg nach 1 bzw. 11 Stunden hinzugegeben (Substratkonzentration = 0,4 g/l). Nach 24 Stunden wurde die Fermentationslösung mit Essigester extrahiert. Das so erhaltene rohe Produkt (190 mg) bestand zu 97% aus γ-Decalacton.

Beispiel 3

In einem 2 l-Glasfermenter wurden 1300 ml Leitungswasser vorgelegt und mit 40 g frischer Bäckerhefe versehen. Folgende Parameter wurden eingestellt bzw. konstant gehalten:

Temperatur: 35°C
pH: 5,5
Belüftung: 4 l/Minute
Rührung: 100 U.p.m.

Über eine Schlauchpumpe wurde eine 50%ige wäßrige Glucoselösung kontinuier­ lich hinzugeführt (500 ml bei etwa 30 ml/Stunde). Nach etwa einer Stunde Vor­ garzeit kam 1,0 g des rohen 3-Decen-4-olids auf einmal hinzu und die Umsetzung lief insgesamt 20 Stunden (Substratkonzentration = 0,6 g/l).

Etwa 500 ml der Fermentationslösung wurden durch Kieselgur filtriert, mit NaCl gesättigt und mit Essigester extrahiert. Der rohe Extrakt (480 mg) wurde mittels GC analysiert und bestand zu 75% aus γ-Decalacton. Der Gehalt an nicht umgesetztem Ausgangsprodukt betrug 1,0%.

Beispiel 4

Das Beispiel 3 wurde mit einer Konzentration des 3-Decen-4-olides von 0,9 g/l wiederholt. Nach 2, 4, 6 und 24 Stunden wurden kleine Proben gezogen, mit Essigester extrahiert und die Extrakte mittels GC analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle wiedergegeben.

Die chirale Reinheit des γ-Decalactons wurde nach der Methode von Werkhoff et al. (1991, Chem. Mikrobiol. Technol. Lebensm. 13, 129) bestimmt. Das End­ produkt ergab nach 24 Stunden Inkubationszeit folgendes Ergebnis:

(+)-R- : (-)-S- = 95,5 : 4,5

Bei einer Wiederholung des Ansatzes wurde ein Verhältnis von (+)-R-:(-)-S-= 97,8 : 2,2 festgestellt.

Beispiel 5

Die Reduktion des rohen Decenolids wurde in einem 30 l-Fermenter durchgeführt. Dieser enthielt 20 l Leitungswasser sowie 900 g frische Bäckerhefe. Folgende Parameter wurden während der Umsetzung konstant gehalten:

Temperatur: 32°C
pH: 5,4-5,6
Belüftung: 7,5 l/Minute
Rührung: 200 U.p.m.

Über eine Schlauchpumpe wurden 10 kg einer 50%igen wäßrigen Glucoselösung kontinuierlich während 20 Stunden hinzugepumpt. Gleichzeitig wurde über eine zweite Schlauchpumpe das rohe 3-Decen-4-olid kontinuierlich hinzugegeben (ca. 3 g/Stunde; insgesamt 58 g oder ca. 2,0 g/l).

Nach Beendigung der Umsetzung nach 20 Stunden wurden 1,5 l der Fermentations­ lösung mit Essigester extrahiert. Die Ausbeute an Rohextrakt betrug 2,5 g, die nach GC zu 98% aus γ-Decalacton bestanden.

Vergleich

Beispiel 1 wurde so variiert, daß statt 3-Decen-4-olid 100 mg Angelicalacton (4-Hydroxy-3-pentensäure-γ-lacton) als Substrat eingesetzt wurden. Nach 24 Stunden Umsetzungszeit wurde die Fermentationslösung mit Essigester extrahiert. Das rohe Produkt (79 mg) enthielt nach GC kein α-Angelicalacton mehr und bestand zu 90% aus 4-Ketovaleriansäure und zu 5% aus γ-Pentalacton. Die Identität wurde mit Hilfe der GC-MS-Analyse bestätigt.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von γ-Decalacton aus 3-Decen-4-olid in Gegenwart von Saccharomyces cerevisiae oder dessen Enzymen oder von Mikroorganismen mit genetischem Material aus Saccharomyces cerevisiae, das die Struktur- und Regulatorgene für die Enzyme kodiert, die in dieser Reaktion wirksam sind.