DE2853847C2

DE2853847C2 -

Info

Publication number: DE2853847C2
Application number: DE2853847A
Authority: DE
Inventors: Akira Taoka; Seiichi Urawa Saitama Jp Uchida
Original assignee: BIO RESEARCH CENTER Co Ltd TOKIO/TOKYO JP
Current assignee: BIO RESEARCH CENTER Co Ltd TOKIO/TOKYO JP
Priority date: 1977-12-14
Filing date: 1978-12-13
Publication date: 1987-09-24
Also published as: DE2853847A1; FR2411888B1; JPS5484092A; BE872680A; US4220720A; GB2010264B; GB2010264A; FR2411888A1; JPS5946598B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von geradkettigen Mono- und/oder Dicarbonsäuren mit 8 bis 18 Kohlenstoffstomen durch mikrobiologische Oxidation von Kohlenwasserstoffen und/oder Monocarbonsäuren derselben Kettenlänge.

Monocarbonsäuren mit langen, geraden bzw. linearen Kohlenstoffketten sind wertvolle Ausgangsmaterialien für die Herstellung von oberflächenaktiven Mitteln, Detergentien und Stabilisatoren. Ihr Einsatz ist jedoch begrenzt, da zur Herstellung der genannten chemischen Substanzen zumeist natürliche Fette, wie Rinderfett oder Palmöl, verwendet wurden.

Dicarbonsäuren mit langen, linearen Kohlenstoffketten stellen wertvolle Ausgangsmaterialien für die Herstellung von Weichmachern, Kunstharzen, synthetischen Schmiermitteln, Ölen und Parfums dar. Es besteht Bedarf an einem großtechnischen Verfahren zur Herstellung von Dicarbonsäuren mit einer unterschiedlichen Anzahl von Kohlenstoffatomen aus Rohmaterialien, die aus dem Erdöl erhalten werden.

Die Mikrobiosynthese von Monocarbonsäuren und Dicarbonsäuren ist bekannt. Bei den herkömmlichen Reaktionen werden in Erdöldestillaten enthaltene n-Paraffine als Substrat bzw. Ausgangsmaterial für die entsprechende Mono- oder Dicarbonsäure verwendet. So haben Van der Linden und Thÿsse in dem Artikel "The Mechanisms of Microbial Oxidations of Petroleum Hydrocarbons" in der Zeitschrift "Advances in Enzymology" Bd. 27 (1965), Seite 469ff, über die Verwendung von sowohl natürlichen als auch synthetischen Monocarbonsäuren als Ausgangsmaterialien für die mikrobielle Umwandlung zu Dicarbonsäuren berichtet.

Ferner ist aus der US-PS 37 93 153 ein Verfahren zur Erzeugung von Hefe in Gegenwart von Bakterien aus Kohlenwasserstoff- oder Kohlehydrat-Nährböden bekannt, bei dem neben den verschiedenartigsten Dicarbonsäuren erhöhte Mengen an mikrobiologischen Zellen erzeugt werden.

Aus der US-PS 38 43 466 ist schließlich ein Verfahren zur Herstellung von α,ω-Dicarbonsäuren mit 5 bis 18 Kohlenstoffatomen bekannt, bei dem die Hefestämme Candida und Pichia aus gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffen, Aldehyden, Alkohlen oder Monocarbonsäuren in geradkettigen Strukturen mit 9 bis 18 Kohlenstoffatomen Dicarbonsäuren unter anaeroben Bedingungen erzeugen. Nachteilig bei diesem Verfahren ist dabei u. a. die Tatsache, daß dabei in mehr oder weniger größeren Mengen die Ausgangsprodukte gespalten und damit auch kürzerkettige Dicarbonsäuren gebildet werden. Außerdem lassen sich mit diesem Verfahren keine Monocarbonsäuren erzeugen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das in gezielter und wirtschaftlicher Weise die Herstellung von geradkettigen Mono- und/oder Dicarbonsäuren mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen durch mikrobiologische Oxidation von Kohlenwasserstoffen und/oder Monocarbonsäuren derselben Kettenlänge gestattet.

Gelöst wird diese Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung durch den Einsatz eines zum Genus Debaryomyces gehörenden Hefestammes mit der Bezeichnung Debaryomyces phaffii ATCC 20499.

Mit Hilfe dieses Mikroorganismus werden erfindungsgemäß er zeugt:

(1) Dicarbonsäuren oder ein Gemisch aus Dicarbonsäuren und Monocarbonsäuren, welche den als Substrat verwendeten Kohlenwasserstoffen mit langen, linearen Kohlenstoffketten entsprechen;
(2) Dicarbonsäuren, welche den als Ausgangsmaterialien verwendeten, sowohl natürlichen als auch synthetischen Monocarbonsäuren entsprechen;
(3) Dicarbonsäuren, welche einem als Substrat verwendeten Gemisch aus Kohlenwasserstoffen mit langen, linearen Kohlenstoffketten und Monocarbonsäuren mit ähnlicher bzw. gleicher Kettenlänge entsprechen.

Der erfindungsgemäß eingesetzte, Carbonsäuren erzeugende Mikroorganismus Debaryomyces phaffii wurde aus dem Erdboden in der Nähe einer in Japan gelegenen Erdölraffinerie im Regierungsbezrk Akita gewonnen und für den Gebrauch isoliert. Der Mikroorganismus wurde aufgrund der nachstehend angegebenen mikrobiologischen Eigenschaften als Debaryomyces phaffii identifiziert. Ein mit "BR-151" bezeichneter Stamm dieses Mikroorganismus wurde sowohl beim Institut für Fermentationsforschung der Industrie- und Handelskammer, Japan (Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Trade and Industry, Japan) unter "FERM-P No. 4300" als auch bei der American Type Culture Collection unter der Nr. "ATCC-20499" hinterlegt.

Der Stamm ATCC 20499 hat folgende Eigenschaften:

1) Form und Größe:
Wachstum in Malzextrat: nach 3 Tagen bei 25°C sind die Zellen oval oder lang-oval, (1, 5-5,5) × (3,5-13,5) µm; einzeln oder in Paaren. Es bilden sich ein Sediment und ein dünnes, mattes, kriechendes Häutchen (Pellikel). Wachstum auf Malzagar: nach 7 Tagen bei 25°C ist die Kolonie weißlich oder dunkel-gelblich, matt oder glänzend, glatt mit einem schwach gekrümmten Rand. Objektträger(slide)-Kultur auf Kartoffel- und Maismehlagar: es bildet sich kein Pseudomyzel.
2) Bildung von Ascosporen:
Ascosporen bilden sich auf ⅛ m Van't Hoff-Gipsblöcken und V 8-Agar. Die Sporen sind sphärisch mit einer warzigen Wand und einem Öltropfen im Inneren.
3) Fermentation von Zuckern: Glucose+ Galactose+ (schwach oder langsam) Rohrzucker+ Maltose+ Lactose-
4) Assimilation von Kohlenstoffverbindungen:
siehe Tabelle I.
5) Spaltung von Arbutin: positiv.
6) Assimilation von KNO₃: negativ.
7) Wachstum in vitaminfreiem Medium: positiv.
8) Wachstum bei 37°C: positiv.

Tabelle 1 Assimilation von Kohlenstoffverbindungen

Glucose+ Galactose+ L-Sorbose+ Rohrzucker+ Maltose+ Cellobiose+ Trehalose+ Lactose- Melibiose+ lösliche Stärke+ D-Xylose+ Äthanol+ Glyzerin+ Salicin+ Inosit-

Erfindungsgemäß geeignete Ausgangsmaterialien (Substrate) für die Synthese von Dicarbonsäuren oder Gemischen von Di- und Monocarbonsäuren sind Kohlenwasserstoffe mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, insbesondere Kohlenwasserstoffe mit 11 bis 16 Kohlenstoffatomen. Als Ausgangsmaterialien für die selektive Herstellung von Dicarbonsäuren eignen sich Monocarbonsäuren und Kohlenwasserstoffe mit einer Gerüstlänge von jeweils 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, wobei Kohlenwasserstoffe mit einer Gerüstlänge von 11 bis 16 Kohlenstoffatomen bevorzugt werden.

Die erfindungsgemäß vorgenommene Oxidationsreaktion ist ein typisches Ruhezellenphänomen und kann in einer wäßrigen Pufferlösung, z. B. einer Phosphatpufferlösung vom pH 7, durchgeführt werden.

Man kann die Reaktion auch in einem Nährstoffe für die Hefe enthaltenden Wachstumsmedium vornehmen. Die Umsetzung wird dann zu einer Kultivierungs-Oxidations-Reaktion. Bei dieser Arbeitsweise soll das Medium die üblichen Nährstoffe einschließlich assimilierbarer Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie geeignete Vitamine und Mineralien des am einschlägigen Gebiet bekannten Typs enthalten.

Beispiele für Kohlenstoffquellen, welche sich für ein Wachstumsmedium eignen, sind Glucose, Rohrzucker, Maltose und die als Substrat dienenden Kohlenwasserstoffe oder Monocarbonsäuren.

Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind anorganische Stickstoffverbindungen, wie Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat, und organische stickstoffhaltige Substanzen, wie Pepton, Maisquellwasser oder Aminosäuren.

Beispiele für die zum Wachstum benötigten Vitamine und Mineralien sind Natriumphosphat, Calciumphosphat, Magnesiumsulfat, Zinksulfat, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat (als Mineralien) sowie Hefeextrakt (als vitaminhaltiger Zusatz).

Wenn die Oxidation als Ruhezellenreaktion durchgeführt wird, muß vor der Oxidation eine gesunde Zellenmasse herangezüchtet werden. Man erzeugt diese Zellenmasse am besten dadurch, daß man die Hefekultur vor der Oxidation im vorgenannten Wachstumsmedium züchtet. Die gesamte, Zellen und Nährstoffe enthaltende Zellenkultur kann bei der Oxidation eingesetzt werden. Man kann die Zellenmasse jedoch auch vor der Zugabe zum Substrat vom verbrauchten Nährmedium abzentrifugieren oder abfiltrieren.

Erfindungsgemäß wird somit der Stamm des carbonsäureerzeugenden Mikroorganismus Debaryomyces phaffii ATCC 20499, eine Kultur davon oder Zellen des vorher kultivierten Stammes zu dem das Substrat enthaltenden Medium gegeben. Die Reaktion wird dann unter Bewegen, Belüften durch eine Düse oder Schütteln durchgeführt, so daß ein gründlicher Kontakt des Mikroorganismus mit dem Mediumbestandteilen gewährleistet ist.

Die Reaktionstemperatur wird bei 25 bis 35°C gehalten und der pH-Wert auf 3 bis 9 (vorzugsweise 4 bis 8) eingeregelt. Die Reaktionsdauer hängt vom verwendeten Substrat ab; gewöhnlich ist für den vollständigen Reaktionsablauf jedoch eine Zeitspanne von 24 bis 120 Stunden erforderlich.

Mit Vorteil wird ein mindestens einen bestimmten Anteil an Monocarbonsäure enthaltendes gemischtes Substrat verwendet, weil die Monocarbonsäure dazu tendiert, die Löslichkeit des Substrats im wässrigen Reaktionsgemisch zu erhöhen und die Ansammlung von zusätzlicher Monocarbonsäure während der Oxidation zu unterdrücken.

Eine leicht verfügbare Quelle für die Monocarbonsäure dieses gemischten Substrats besteht in der bei vorangehenden Reaktionen angesammelten Säure.

Wenn die Kultivierung (Reaktion) in der vorgenannten Weise durchgeführt wird, wird ein beträchtlicher Anteil von Dicarbonsäuren oder eines Monocarbonsäuren enthaltenden Gemisches von Dicarbonsäuren erzeugt und angereichert. Diese Carbonsäuren werden nach herkömmlichen Methoden, wie durch Extraktion, Feststoff/Flüssigkeits-Trennung, Neutralisation-Extraktion und fraktionierende Destillation, abgetrennt oder gereinigt und anschließend in Form von Mono- oder Dicarbonsäuren oder eines Gemisches von beiden ge wonnen.

Wie aus der nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform hervorgeht, erzeugt der erfindungsgemäß verwendete neue Mikroorganismus unter Anwendung an sich bekannter Kultivierungsmethoden Monocarbonsäuren und Dicarbonsäuren in hohen Ausbeuten. Die Erfindung liefert daher einen wichtigen Beitrag für die Synthese von Carbonsäuren mit langen, geraden Kohlenstoffketten.

Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Es wird folgendes Medium für eine Kolbenkultur zubereitet:

Rohrzucker30 g NH₄Cl4 g KH₂PO₄2 g MgSO₄·7H₂O0,6 g ZnSO₄·7H₂O0,01 g FeSO₄·7H₂O0,01 g mykologisches Pepton0,5 g Hefeextrakt0,5 g

Die Komponenten für die Vorkultivierung werden in so viel destilliertem Wasser gelöst, daß ein Gesamtvolumen von 1 Liter erhalten wird. Die Lösung wird auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. 100 ml des erhaltenen Mediums werden dann in einen 500 ml-Kolben gegeben und 15 Minuten bei 115°C im Autoklaven sterilisiert. Dann beimpft man das sterile Medium mit Zellen von Debaryomyces phaffii ATCC 20499 (3 Ösen), welche einen Monat bei 30°C auf Malzextrakt gezüchtet wurden. Die anschließende Kultivierung erfolgt während 29 Stunden bei 28°C an einem sich hin- und herbewegenden Schüttelapparat.

Man stellt dann ein Gär- bzw. Fermentationsmedium folgender Zusammensetzung her:

KH₂PO₄10 g NH₄Cl5 g MgSO₄·7H₂O0,6 g FeSO₄·7H₂O0,01 g ZnSO₄·7H₂O0,008 g mykologisches Pepton0,5 g Hefeextrakt0,5 g

Man löst die vorgenannten Bestandteile des Fermentationsmediums in so viel destilliertem Wasser, daß ein Gesamtvolumen von 1 Liter erhalten wird, und sterilisiert die Lösung 15 Minuten bei 115°C. Dann werden 800 ml des Mediums und 110 g der aus Tabelle II ersichtlichen Kohlenwasserstoffe oder Carbonsäuren 15 Minuten bei 115°C im Autoklaven sterilisiert.

In einen 2 Liter-Fermenter werden 100 ml des Vorkultivierungsmediums, 800 ml des Fermentationsmediums und 110 g des sterilisierten Reaktantensubstrats gegeben. Das Gemisch wird unter Belüften und Bewegen bei 30°C während 96 bis 120 Stunden bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,5 reagieren gelassen. Für die pH-Einstellung verwendet man 2 n-Kalilauge. Wenn während der Kultivierung eine Schaumbildung erfolgt, gießt man in das Kulturmedium geringe Mengen einer zuvor 15 Minuten bei 115°C im Autoklaven behandelten 15%igen Lösung eines Schauminhibitors (Handelsprodukt von Toshiba Silicone Co.; TSA 730). Am Ende der Kultivierung wird die Kulturbrühe durch Zugabe von festem Kaliumhydroxid auf einen pH-Wert von 10 eingestellt, aus dem Fermenter ausgeleert, bei vermindertem Druck unter Verwendung eines Filterhilfsmittels filtriert und gewaschen. Die Produkte werden mit Äther extrahiert, nach der Ätherabdampfung mit Diazomethan methyliert und gaschromatographisch analysiert.

Tabelle II zeigt die Ergebnisse.

Tabelle II

Beispiel 2

Man löst die in Beispiel 1 beschriebenen Fermentationsmediumkomponenten sowie 50 g Rohrzucker in 1 Liter destilliertem Wasser und stellt den pH-Wert auf 5,5 ein. 50 ml des erhaltenen Mediums werden in einen 500-ml-Schüttelkolben gegeben und mit zwei Ösen des in Beispiel 1 verwendeten Stammes von Debaryomyces phaffii beimpft. Die Kultur wird 26 Stunden bei 30°C gehalten. Die gewonnene Kulturbrühe wird zur Abtrennung der Zellen (etwa 1 g Trockengewicht) zentrifugiert. Man stellt dann eine Reaktionslösung her, indem man 100 ml 0,5 m Phosphatpuffer (pH 7,0) mit 10 ml n-Dodekan vermischt. Diese Reaktionslösung und die filtrierten Zellen werden dann 72 Stunden bei 30°C reagieren gelassen. Die Umsetzungsprodukte werden mit Kalilauge auf einen pH-Wert von 10 eingestellt und nach derselben Methode wie in Beispiel 1 analysiert. Es zeigt sich, daß im Reaktionsmedium 5,3 mg/Liter Laurinsäure und 4,1 mg/Liter 1,10-Dekandicarbonsäuren gebildet werden. In diesem Versuch werden das Medium, das Substrat und die Vorrichtung zuvor im Autoklaven behandelt, damit der Versuch unter sterilen Bedingungen erfolgen kann.

Claims

Verfahren zur Herstellung von geradkettigen Mono und/oder Dicarbonsäuren mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen durch mikrobiologische Oxidation von Kohlenwasserstoffen und/oder Monocarbonsäuren derselben Kettenlänge, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Debaryomyces phaffii ATCC 20499 einsetzt.