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Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums ZN-6 und seiner Salze
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Zn-6 und seiner Salze.
Im Stammpatent Nr. 227384 ist ein Verfahren zur Herstellung des genannten Antibiotikums beschrieben, gemäss welchem der Pilz Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki unter aeroben Bedingungen so lange gezüchtet wird, bis eine wesentliche Menge von Antibiotikum ZN-6 gebildet worden ist, und hierauf das auf die angeführte Weise gebildete Antibiotikum gewonnen wird.
Die Erfindung bezieht sich auf abgeänderte bzw. verbesserte Verfahren von der in dem genannten Stammpatent Nr. 227384 beschriebenen Art und beruht insbesondere auf der Feststellung, dass für die technische Herstellung des Antibiotikums ZN-6 vorteilhaft Mutanten des Pilzes Fusidium coccineum Fuck K.
Tubaki verwendet werden können. Gewisse Mutanten bilden diese Verbindung mit höherer Ausbeute als der Mutterstamm.
Das Antibiotikum ZN-6 ist eine antibakteriell aktive Verbindung von einer in diesem Zusammenhang gänzlich neuen Struktur, nämlich ein Cyclopentanoperhydrophenanthren-Derivat mit wahrscheinlich der folgenden Formel
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Das Antibiotikum ZN-6 ist als solches in Wasser schwer löslich. Es ist jedoch eine schwache Säure mit einem pKa-Wert von etwa 5, 3 und kann mit einer grossen Anzahl von anorganischen oder organischen Basen Salze bilden.
Umfangreiche klinische Versuche, die in neuester Zeit durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass das
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Beim Verfahren gemäss der Erfindungwird ein Mutant des Pilzes Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki, der imstande ist, Antibiotikum ZN-6 zu bilden, unter aeroben Bedingungen in einer wässerigen Nährlösung, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie anorganische Salze enthält, so lange gezüchtet, bis diese Lösung eine wesentliche antibiotische Aktivität erreicht hat ; dann wird das auf diese Weise gebilidete Antibiotikum ZN-6 gewonnen.
Für das Verfahren gemäss der Erfindung hat sich eine grosse Anzahl von bekannten Kulturmedien als brauchbar erwiesen, doch werden vorzugsweise Medien verwendet, die als Stickstoffquellen Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Casein oder andere proteinhaltige Milchprodukte, und Fleisch- und Knochenmehl enthalten.
Die in dem Kulturmedium vorhandene Menge an verfügbarem Stickstoff kann vorteilhaft in dem Bereich von 0, 01 bis 1, 51o, bezogen auf das Kulturmedium, liegen und beträgt vorzugsweise etwa 0. 150/0 des Kulturmediums.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können insbesondere Saccharose und Glucose erwähnt werden.
Es ist ferner vorteilhaft, das Nährmedium durch einen Zusatz von Fetten oder Fettsäuren zu ergänzen, so dass diese einen Teil der Kohlenstoff- und Energiequelle bilden, da diese Stoffe hinsichtlich der Bildung
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bis 5, 0% des Kulturmediums verwendet werden.
Für diesen Zweck können vorteilhafterweise die Fettsäureglyceride und die in diesen enthaltenen freien Fettsäuren oder aber synthetische Ester dieser Fettsäuren verwendet werden. Insbesondere haben sich Fettsäuren mit 12 - 20 Kohlenstoffatomen in der Kohlenstoffkette oder Derivate von solchen Fettsäuren als fördernd wirkende Stoffe als brauchbar erwiesen.
Wenn die Bildung von Antibiotikum ZN-6 im Laufe der Fermentation aufhört oder eine zufriedenstellende Ausbeute erreicht ist, kann es durch eine grosse Anzahl von Verfahren gewonnen bzw. isoliert werden.
Vorzugsweise besteht der erste Schritt zur Gewinnung dieses Stoffes in einer Abtrennung des Mycels von der Kulturflüssigkeit, beispielsweise durch Filtration ; anschliessend kann das Antibiotikum ZN-6 dadurch konzentriert werden, dass die vom Mycel befreite Lösung mit einem festen Adsorptionsmittel in Berührung gebracht und hierauf das Antibiotikum aus dem Adsorptionsmittel eluiert wird.
Das Antibiotikum kann jedoch auch vorteilhaft mit Hilfe eines Amins, das als solches oder in Form eines seiner Salze eingesetzt wird, oder einer Säure gewonnen werden, wobei diese Stoffe der Nährlösung in ausreichenden Mengen zugesetzt werden, um wesentliche Mengen des in dem Kulturmedium vorhandenen Antibiotikums ZN-6 in eine in organischen Lösungsmitteln lösliche Form überzuführen, worauf dann das Antibiotikum mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, das, wie beispielsweise ein Ester, ein Keton oder ein Halogenkohlenwasserstoff, mit Wasser nicht mischbar oder im wesentlichen nicht mischbar ist.
Bei der zuletzt genannten günstigen Arbeitsweise für die Gewinnung des Antibiotikums wird eine organische Phase erhalten, die das Antibiotikum ZN-6 als solches oder in Form eines Aminsalzes in verhältnismässig hohen Konzentrationen enthält. Die gewünschte Verbindung kann dann anschliessend mit Hilfe von bekannten Verfahren mit einem Reinheitsgrad isoliert werden, der für die Herstellung der Verbindung in einer pharmazeutisch annehmbaren Qualität ausreichend ist.
Für die Gewinnung eines Stammes des Pilzes Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki, der für das Verfahren gemäss der Erfindung brauchbar ist, kann eines der bekannten Mutationsverfahren, bei welchem die Sporen des Pilzes eine Einwirkung erfahren, angewendet werden.
So kann beispielsweise eine Sporensuspension mit ionisierenden oder nichtionisierenden Strahlen bestrahlt werden oder die Sporen können der Einwirkung von mutagenen Chemikalien, wie Diäthylsulfat oder Senfgas, unterworfen werden.
Es wurde jedoch festgestellt, dass die Mutation des Pilzes auf sehr zweckmässige Weise durch Bestrahlung einer Sporensuspension mit UV-Licht über einen Zeitraum, der einen Überlebungsprozentsatz vorzugsweise in dem Bereich von 0, 05 bis 5, 00/0 gewährleistet, bewirkt werden kann.
Für eine genauere Definition der für den Erhalt von geeigneten Mutanten erforderlichen Bestrahlungs- intensität sind die im folgenden beschriebenen Versuche als nähere Erläuterung aufzufassen.
Bei diesen Versuchen wurden Suspensionen von Sporen des Pilzes, die 2. lu Sporen pro Milliliter enthielten und in Quarzrohren eingeschlossen waren, mit dem Licht einer Hanovia-Steri-Lampe (85% dieses Lichtes hatten eine Wellenlänge von 2537 A) aus einer Entfernung von 18. 5 cm während der in Spalte A der nachstehenden Tabelle angeführten Zeiträume bestrahlt ; in dieser Tabelle geben die Zahlen in der Spalte B die entsprechenden ÜberlebungsprozeÌ1tsätze der Sporen an.
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<tb>
<tb>
Zeit <SEP> in <SEP> Sekunden <SEP> Überlebungsprozentsatz
<tb> Versuch <SEP> I <SEP> Versuch <SEP> II
<tb> A <SEP> B
<tb> 15 <SEP> 27 <SEP> 36, <SEP> 7
<tb> 30 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP> 4, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 45 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP>
<tb> 60 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> 75 <SEP> 0, <SEP> 06 <SEP> 0, <SEP> 04 <SEP>
<tb>
Die bei den oben beschriebenen Mutationsversuchen gebildeten Sporen wurden auf Agarplatten aufgebracht, um Kolonien der einzelnen Sporen für die Untersuchung zu erhalten. Die genauere Prüfungmethode bestand darin, dass die neuen Stämme zum Teil in Schüttelkolben gezüchtet wurden, um ihre Fähigkeit zur Bildung des Antibiotikums ZN-6 wertmässig zu erfassen, und zum Teil ihr Bedarf an besonderen Nährmitteln ermittelt wurde.
Die Zusammensetzung der Agarplatte, die zum Zwecke des Erhaltens von Kolonien der einzelnen Sporen der bestrahlten Suspension verwendet wurde, war wie folgt : (Substrat 25 A) :
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<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7,5 <SEP> g/l
<tb> Maisquellwasser <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g/l
<tb> MgSO.., <SEP> 7H2O <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KH2PO4 <SEP> 0,06 <SEP> g/l
<tb> Pepton <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> FeSO4. <SEP> mO <SEP> 0, <SEP> 005gA <SEP> ! <SEP>
<tb> CuS0. <SEP> 5H, <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP> g/l
<tb> Glucose <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Caseinhydrolysat <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Agar <SEP> 30, <SEP> 0 <SEP> g/l
<tb> Vitaminlösung <SEP> *) <SEP> 10 <SEP> ml
<tb>
Der pH-Wert der Agarplatte war 7, 0.
*) Die Zusammensetzung der zugesetzten Vitaminlösung war wie folgt :
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<tb>
<tb> Thiamin <SEP> 100 <SEP> mg/l
<tb> Riboflavin <SEP> 50 <SEP> mg/l
<tb> Pyridoxin. <SEP> HCI <SEP> 61 <SEP> mg/l
<tb> Calciumsalz <SEP> der <SEP> Pantothensäure <SEP> 220 <SEP> mg/l
<tb> p-Aminobenzoesäure <SEP> 50 <SEP> mg/l
<tb> Nicotinsäureamid <SEP> 200 <SEP> mg/l
<tb> Cholin. <SEP> HCl <SEP> 129 <SEP> mg/l
<tb> Inosit <SEP> 400 <SEP> mg/l
<tb>
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bung seiner Kolonien von weiss zu rosa ; ferner hatten die Kolonien des Mutanten Leo-U 79 auf Agarplatten der oben erwähnten Zusammensetzung eine ausserordentlich stark gekräuselte Oberfläche.
Der als Fc-U 404 bezeichnete Mutant war im grossen und ganzen vom Mutterstamm nur dadurch unterscheidbar, dass seine Wachstumgeschwindigkeit unmassgeblich verringert war, wobei jedoch diese Verringerung, soweit sie auf die Brauchbarkeit des Mutanten von Einfluss ist, durch dessen Fähigkeit, wesentlich höhere Mengen von Antibiotikum ZN-6 zu bilden, wettgemacht wurde.
Von diesen Mutanten sind insbesondere der Aminosäuren erfordernde Stamm Leo-U 42 und der Stamm Fc-U 404 für kontrollierte Fermentationsverfahren in industriellem Massstab von Interesse.
Die Erfindung ist jedoch keineswegs auf eine Verwendung der oben erwähnten Mutanten beschränkt, da auch eine grosse Anzahl von andern Mutanten erhalten werden konnte, die in ähnlicher Weise imstande sind, Antibiotikum ZN-6 zu bilden.
Die zuletzt erwähnten brauchbaren Mutanten können vom Mutterstamm durch ihre Wachstumgeschwindigkeit in flüssigen Kulturmedien, durch die Menge an gebildeten Sporen und durch die Form und Farbe ihrer Kolonien auf Agarplatten unterschieden werden und sie können ferner einen Bedarf an besonderen Nährstoffen zum Bewirken des optimalen Wachstums haben.
Es ist jedoch für die beim Verfahren gemäss der Erfindung verwendbaren Mutanten charakteristisch, dass sie bei einer mikroskopischen Prüfung keine Unterschiede gegenüber dem Mutterstamm erkennen lassen. Den Mutterstamm hatte K. Tubaki, der ihn auch in der Zeitschrift "Mycological Journal of Nagao Institut", Nr. 4, S, -ptember 1954, beschrieben hat, vom Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland, erhalten.
Das Mycel ist hyalin und hat einen Durchmesser von etwa 1 bis 1, 6 Mikron, die Konidien sind spindelförmig, und aus den Konidienträgern entstehen hyaline einzelne Zellen, die eine lange Kette bilden, von der das äusserste Glied im reifen Zustand abgestossen wird.
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den Grössen des Mutterstammes.
Aus Gründen der besseren Anschaulichkeit sind im folgenden die Grössen der Konidien angeführt, die von den oben erwähnten Mutanten isoliert wurden :
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<tb>
<tb> Fc-U <SEP> 404 <SEP> Leo-U <SEP> 42 <SEP> Leo-U <SEP> 79
<tb> 6, <SEP> 4. <SEP> 1, <SEP> 6p <SEP> 6, <SEP> 4. <SEP> 1, <SEP> 6p <SEP> 4, <SEP> 8. <SEP> 1, <SEP> 4p <SEP>
<tb> 6, <SEP> 4. <SEP> 2, <SEP> 0p <SEP> 4, <SEP> 8. <SEP> 1, <SEP> 8p <SEP> 4, <SEP> 8. <SEP> 1, <SEP> 6p <SEP>
<tb> 6, <SEP> 7. <SEP> 2, <SEP> 0p <SEP> 5, <SEP> 6. <SEP> 1, <SEP> 6p <SEP>
<tb> 4, <SEP> 8. <SEP> 1, <SEP> 6p <SEP> 6, <SEP> 4. <SEP> 1, <SEP> 6p <SEP>
<tb>
Es ist ferner für die gebräuchlichen Mutanten kennzeichnend, dass sie, wie der Mutterstamm, nicht imstande sind, Lactose zu assimilieren, und dass sie Biotin brauchen und sich folglich auf Czapek-Agarplatten nicht entwickeln.
Die Mutanten Leo-U 42, Leo-U 79 und Fc-U 404 sind im Commonwealth Mycological Institut in Grossbritannien unter den angeführten Bezeichnungen aufbewahrt und können aus dieser Sammlung zum Zwecke einer Identifikation erhalten werden.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert :
Beispiel 1 : Sporen von 14 Tagen alten Kolonien von Leo-U 42, die in einem Kolben entwickelt worden waren, der das Substrat 25 A der oben erwähnten Zusammensetzung enthielt, wurden als Impfstoff für einen Schüttelkolben mit einem Inhalt von 500 ml, der 50 ml eines sterilen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt, verwendet :
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<tb>
<tb> Glycerin <SEP> 7,5 <SEP> g/l
<tb> Maisquellwasser <SEP> 2, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Fleisch- <SEP> und <SEP> Knochenmehl <SEP> 15, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgSO. <SEP> TH <SEP> O <SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> g/l <SEP>
<tb> NaCl <SEP> 4, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> PH <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP>
<tb>
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Der Schüttelkolben wurde in eine hin-und hergehende Schüttelvorrichtung eingebracht und die Bebrütung erfolgte bei einer Temperatur von 260C während eines Zeitraumes von 72 h, um ein vegetatives Wachstum zu erhalten.
Ein Teil dieser Kultur wurde als Impfgut für einen Fermentationsversuch verwendet, der in einem 1000 mI-Kolben durchgeführt wurde, der 125 ml eines sterilen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 20, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> KHPO <SEP> 10, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> MgS0407l\O <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/l <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 50, <SEP> 0 <SEP> g/l <SEP>
<tb> PH <SEP> des <SEP> Mediums <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP>
<tb>
Das angeimpfte Kulturmedium wurde bei 250C 120 h lang auf einem rotierenden Schütteltisch be- brütet ;
die Konzentration an Antibiotikum ZN-6 in dem Filtrat des Kulturmediums betrug in einem Agarschalentest, bei welchem Staphylococcus aureus als Teststamm verwendet wurde, 116 mg/l. Eine weitere chemische Prüfung zeigte, dass die erhaltene Verbindung mit dem Antibiotikum ZN-6 identisch ist.
Beispiel 2 : Ein Glasfermenter mit einem Arbeitsvolumen von 5 l wurde mit einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung gefüllt :
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<tb>
<tb> Maisquellwasser <SEP> 40, <SEP> 0 <SEP> g
<tb> Saccharose <SEP> 55, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> KH <SEP> 5, <SEP> 0 <SEP> g <SEP>
<tb> Mgs04. <SEP> 7H20 <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g <SEP>
<tb> Leitungswasser <SEP> ad <SEP> 1000 <SEP> ml
<tb>
Nach dem Sterilisieren wurde der pH-Wert auf 7, 2 eingestellt und das Medium wurde mit 5 Vol.-% einer 48 h alten vegetativen Kultur von Fc-U 404, der in einem flüssigen Medium der gleichen Zusammensetzung wie das oben erwähnte Substrat 25 A, jedoch mit l, 5% Staley's SpecialNutrient ergänzt, gezüchtet worden war, angeimpft.
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 250C bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 470 Umdr/min durchgeführt, wobei eine Belüftung mit 0, 2 Volumina steriler Luft pro Volumen Kulturlösung pro Minute erfolgte. Um ein Schäumen zu verhindern, wurde, wenn dies erforderlich war, Specköl in Mengen von jeweils 0, 25 ml zugesetzt, wobei die Gesamtmenge an während der Fermentation zugesetztem Specköl 40 ml betrug.
Zur Ermittlung der Menge an gebildetem Antibiotikum ZN-6 wurden nach 40, 64, 88 und 112 h Proben entnommen und dabei zeigte sich, dass diese Proben 10,85, 185 und 335 mg/l Kulturmedium an Antibiotikum ZN-6 enthielten ; die zuletzt angeführte Ausbeute wurde durch Gewinnung dieses Stoffes in reiner Form bestätigt.
Wenn der Mutterstamm auf die gleiche Weise einer Fermentation unterworfen wird, beträgt der Gehalt der Kulturflüssigkeit an Antibiotikum ZN-6 nach. einer Fermentationsdauer von 112 h nur 240 mg/l.