Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Fusidinsäure und seiner Salze
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Fusidinsäure (Fusidic acid) und seiner Salé.
Gegenstand des Hauptpatcnts Nr. 458 624 ist ein Verfahren zur HersteIlLin des neuen Antibiotikums ZN-6 und seiner Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Pilz Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki unter aeroben Bcdhlgungell in einem Fcrmentationsmcdium gc- züchtet wird, das Stoffe, die für die Ernährung des Pilzes erforderlich sind, enthält, und dass das auf diese Weise gebildete Antibiotikum ZN-6 aus dem Fermentationsme- dium als freie Säure oder in Form eines Salzes isoliert und dass es in Form eines seiner Solvate mit organischen Lösungsmitteln gereinigt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Weitercntwick- lune des im Hauptpatent Nr. 458 624 beschriebenen Verfahrens dar. Bei der im Hauptpatent für das Antibiotikum ZN-6 angegebenen Formel war die genaue Konfigu- ration von einigen am Grundgerüst stehenden Gruppen noch nicht bekannt, wie dies in der dort angegebenen Forme) durch gewellte Bindungen veranschaulicht wurde.
Nunmehr wurde für das nach dem erfindungsgemäs- sen Verfahren hergestellte Antibiotikum die Konfiguration einiger fraglichen Substituenten sichergestellt, so dass das dabei erhaltene Antibiotikum als < /Fusidinsäure (in englischer Sprache auch als "Fusidic acid") bezeichnet wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Ver Fahren zur Herstellung des Antibiotikums Fusidinsäure und seiner Salze, das sich dadurch auszeichnet, dass Mutanten des Pilzes Fusidium coccincum Fuck K. Tubaki, die in der Lage sind Fusidinsäure zu bilden, unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Nährmedium, das eine Kohlenhydratiösung enthält, gezüchtet werden und die Fusidinsäure isoliert wird.
Gewisse Mutanten des Pilzes bilden nämlich diese Verbindung mit höherer Ausbeute als der Mutterstamm.
Das Antibiotikum Fusidinsäure ist eine anitbakterielle aktive Verbindung von einer in diesem Zusammenhang gänzlich neuen Struktur, nämlich ein Cyclopentanoper hydrophenanthren-Derivat mit wahrscheinlich der folgenden Formel
EMI1.1
Die Fusidinsäure ist als solche in Wasser schwer Iös- lich. Sie ist jedoch eine schwache Säure mit einem pKa- Wert von etwa 5,3 und kann mit einer grossen Anzahl von anorganischen oder organischen Basen Salze bilden.
Umfangreiche klinische Versuche, die in neuester Zeit durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass das Antibiotikum Fuisidinsäure und gewisse ihrer Salze die Anforderungen, die an pharmazeutisch annehmbare Antibiotika zu stelien sind, erfüllen und wertvolle Mittel für die Behandlung von Infektionskrankheiten darstellen, wie dies beispielsweise in der Zeitschrift "The Lancet" Band I, 1962, auf den Seiten 928 bis 937 beschrieben ist.
Für das Verfahren gemäss der Erfindung hat sich eine grosse Anzahl von bekannten Kulturmedien als brauch- bar erwiesen, doch werden vorzugsweise Medien verwendet, die als Stickstoffquellen einen oder mehrere Stoffe enthalten, die aus der Gruppe Maisquellwasser, Sojaboh- nenmehl, Casein oder andere proteinhaltige Milchprodukte und Fleisch-und Knochenmehl gebildet sind.
Die in dem Kulturmedium vorhandene Menge an ver fügbarem Stickstoff kann vorteilhaft in dem Bereich von 0,01 bis 1,5%, bezogen auf das Kulturmedium, liegen und beträgt vorzugsweise etwa 0, 15% des Kulturmediums.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können insbesondere Saccharose und Glucose erwärmt werden. Es ist ferner vorteilhaft, das Nährmedium durch einen Zusatz von Fetten oder Fettsäuren zu ergänzen, um mit diesen einen Teil der Kohlenstoff-und Energiequelle zu bilden, da diese Stoffe hinsichtlich der Bildung des Antibiotikums Fusidinsäure eine fördernde Wirkung auszuüben schei- nen, wenn sie in Mengen von etwa 0, 1 bis 5, 0% des Kul turmediums verwendet werden.
Für diesen Zweck können vorteilhafterweise die Fett säureglyceride und die in diesen enthaltenen freien Fettsäuren oder aber synthetische Ester dieser Fettsäuren verwendet werden. Insbesondere haben sich Fettsäuren mit 12 bis 20 Kohlenstoffatomen in der Kohlenstoffkette oder Derivate von solchen Fettsäuren a) s fördernd wirkende Stoffe als brauchbar erwiesen.
Wenn die Bildung von Fusidinsäure bei dem Fermentationsverfahren aufhört oder eine zufriedenstellende Ausbeute erreicht ist, kann die Säure durch eine grosse Anzahl von Verfahren gewonnen bzw. isoliert werden.
Vorzugsweise besteht der erste Schritt zur Gewinnung dieses Stoffes in einer Abtrennung des Mycels von der Kulturflüssigkeit, beispielsweise durch Filtration ; an schliessend kann das Antibiotikum Fusidinsäure dadurch konzentriert werden, dass die vom Myccl befreite Lösung mit einem festen Adsorptionsmittel in Berührung gebracht und hicrauf das Antibiotikum aus dem Adsorp tionsmittel eluiert wird.
Das Antibiotikum kann jedoch auch vortei) haft mit Hi) fe eines Amins. das als solches oder in Form eines seiner Salze eingesetzt wird, oder einer Säure gewonnen werden, wobei diese Stoffe der Nährlösung in ausreichenden Mengen zugesetzt werden, um wesentliche Mcngen des in dem Kulturmedium vor handenen Antibiotikums Fusidinsäure in eine in organischen Liisungsmitteln Iislichc Form überzufiihrcn, worauf dann das Antibiotikum mit einem organischen Lö sungsmittel extrahiert wird, das, wie beispielsweise ein Ester, ein Keton oder ein Halogenkohlenwasserstoff, mit Wasser nicht mischbar oder im wesentlichen nicht mischbar ist.
Bei der zuletzt genannten günstigen Arbeitsweise für die Gewinnung des Antibiotikums wird eine organische Phase erhalten, die Fusidinsäure als solche oder in Form eines Aminsalzes in verhältnismässig hohen Konzentrationen enthätt. Die gewünschte Verbindung kann dann anschliessend mit Hilfe von bekannten Verfahren mit einem Reinheitsgrad isoliert werden, der für die Herstellung der Verbindung in einer pharmazeutisch annehmbaren Quali- tät ausreichend ist.
Für die Gewinnung eines Stammes des Pilzes Fusidium coccineum Fuck K. Tubaki, der für das Verfahren gemäss der Erfindung brauchbar ist, kann eines der be kannten Mutationsverfahren, bei welchem die Sporen des Pilzes eine Einwirkung erfahren, angewendet werden.
So kann beispielsweise eine Sporensuspension mit ionisierenden oder nichtionisierenden Strahlen bestrahlt werden oder die Sporen können der Einwirkung von mutagenen Chemikalien, wie Diäthylsulfat oder Senfgas, unterworfen werden.
Es wurde jedoch festgesteilt, dass die Mutation des Pilzes auf sehr zweckmässige Weise durch Bestrahlen einer Sporensuspension mit UV-Licht über einen Zeitraum, der einen Überlebungsprozentsatz vorzugsweise in dem Bereich von 0,05 bis 5, 0% gewährleistet, bewirkt werden kann.
Für eine genauere Definition der für den Erhalt von geeigneten Mutanten erfordertichen Bestrahlungsintensität sind die im folgenden beschriebenen Versuche als nähere Erläuterung aufzufassen.
Bei diesen Versuchen wurden Suspensionen von Sporen des Pilzes, die 2. 10 pro Millimeter enthielten und in Quarzrohren eingeschlossen waren, mit dem Licht einer Hanovia-Steril-Lampe (85% dieses Lichtes hatten eine Wellenlänge von 2357 ) aus einer Entfernung von 18, 5 cm während der in Spalte A der nachstehenden Ta- belle angeführten Zeiträume bestrahlt ; in dieser Tabelle geben die Zahlen in der Spathe B die entsprechenden Überlebungsprozentsätze der Sporen an.
Zeit in Sekunden Übertebungsprozentsatz Versuch) Versuch) t
A 1 1 s 27 36, 7 30 5. 8 4,3 45 1. 0 1,2
60 0,3 0,3
75 0. 06 0,04
Die bei den oben beschriebenen Mutationsversuchen gebildeten Sporen wurden auf Agarplatten aufgebracht, um Kolonien der einzelnen Sporen für die Untersuchung zu erhaften. Die genauere Prüfungsmethode bestand darin, dass die neuen Stämme zum Teil in Schüttelkolben gezüchtet wurden, um ihre Fähigkeit zur Bildung des Antibiotikums ZN-6 wertmässig zu erfassen,
und zum Teil ihr Bedarf an besonderen Nährmitteln ermittelt wurde.
Die Zusammensetzung der Agarplatte, die zum Zwekke des Erhaltens von Kolonien der einzelnen Sporen der bestrahiten Suspension verwendet wurde, war wie folgt : (Substrat 25 :
Gfycerin 7. 5 g/l
Maisquellwasser 2,5 gel
MgSO, 7H20 0, 05 gel KH. PO, 0,06 gil
Pepton 5,0 g/l
NaCI 4,0 g/l
FeSO, O 0, 005 gil CuSO, 5H, 0 0, 004 gl I
Glucose 10, 0 g/i
Caseinhydrolysat 1, 5 gel
Agar 30,0 g/l Vitamintösung*'10 m) Der pH-Wert der Agarplatte war 7,0.
*'Die Zusammensetzung der zugesetzten Vitaminlösung war wie folgt : Thiamin 100 mg/l
Riboflavin 50 mg/l Pyridoxin. HCI 61 mg/l Pyridoxin HCI 61 mg/l
Calciumsalz der
Pantothensäure 220 mg/t p-Aminobenzoesäure 50 mg/1
Nicotinsäureamid 200 mg/l
Cholin HCI 129 mg/l
Inosit 400 mgJt
Bei Anwendung der oben beschriebenen Vorgangsweise für die Mutation und die Auswahl wurden drei Mutanten, die von besonderem Interesse sind, isoliert.
Einer dieser Mutanten, der im folgenden als Leo-U 42 bezeichnet wird, wurde aus einer Sporensuspension isoliert, die 45 Sekunden lang bestrahlt worden war, und zwei Mutanten, die im folgenden als Leo-U 79 bzw. Fc-U 404 bezeichnet werden, wurden aus einer 60 Sekunden lang bestrahlten Sporensuspension isoliert.
Was die Eigenschaften des Mutanten Leo-U 42 betrifft, so waren seine Wachstumsgeschwindigkeit, die Färbung seiner Kolonien, seine Sporenbildungsgeschwindigkeit und Morphologie im Vergleich zu den betreffenden Eigenschaften des Mutterstammes unverändert, wogegen für ihn die Anwesenheit von Methionin oder Cystein in dem Kulturmedium für das Wachstum erforderlich war und er sich in dieser Hinsicht eindeutig vom Mutterstamm unterschied.
Die Prüfung des Mutanten Leo-U 79 ergab im Vergleich zum Mutterstamm eine verringerte Sporenbildungsgeschwindigkeit, eine Herabsetzung der Wachstumsgeschwindigkeit und eine Änderung der Färbung seiner Kolonien von weiss zu rosa ; ferner hatten die Kolonien des Mutanten Leo-U 79 auf Agarplatten der oben erwähnten Zusammensetzung eine ausserordentlich stark gekräuselte Oberfläche.
Der als Fc-U 404 bezeichnete Mutant war im grossen und ganzen vom Mutterstamm nur dadurch unterscheidbar, dass seine Wachstumgeschwindigkeit unmassgeblich verringert war, wobei jedoch diese Verringerung, soweit sie auf die Brauchbarkeit des Mutanten von Einfluss ist, durch dessen Fähigkeit, wesentlich höhere Mengen von Antibiotikum ZN-6 zu bilden, wettgemacht wurde.
Von diesen Mutanten sind insbesondere der Aminosäuren erfordernde Stamm Leo-U 42 und der Stamm Fc-U 404 für kontrollierte Fermentationsverfahren in in dustriellem Massstab von Interesse.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch keineswegs auf eine Verwendung der oben erwähnten Mutanten beschränkt. da auch eine grosse Anzahl von anderen Mutanten erhalten werden konnte, die in ähnlicher Weise imstandc sind, Antibiotikum ZN-6 zu bilden.
Die zuletzt erwähnten brauchbarcn Mutanten kön- nen vom Mutterstamm durch ihre Wachstumgeschwindig- keit in flüssigen Kulturmedien, durch die Menge an gebildeten Sporen und durch die Form und Farbe ihrer Ko lonien auf Agarplatten untcrschieden werden und sie können ferner cinen Bedarf an besonderen Nährstoffen zum Bewirken des optimalcn Wachstums haben.
Es ist jedoch für die beim Verfahren gemäss der Erfindung verwendbaren Mutanten charakteristisch, dass sie bei einer mikroskopischen Prüfung keine Unterschiede ge genüber dem Mutterstamm erkennen lassen. Den Mutterstamm hatte K. Tubaki, der ihn auch in der Zeitschrift Mycological Journal of Nastao Institub), September 1954, No. 4, beschrieben hat, vom Bureau voor Schimmelcul- tures, Baarn, Holland, erhalten.
Das Mycel ist hyalin und hat einen Durchmesser von etwa 1 bis 1, 6 Mikron, die Konidien sind spindelförmig, und aus den Konidienträgern entstehen hyaline einzelne Zellen, die eine lange Kette bilden, von der das äusserste Glied im reifen Zustand abgestossen wird.
Die Grosse der Konidien der Mutanten betragen etwa 4,6 bis 6,8 . 1,4 bis 2,0 Mikron, entsprechen also den Grosse des Mutterstammes.
Aus Gründen der besseren Anschaulichkeit sind im folgenden die Grössen der Konidien angeführt, die von den oben erwähnten Mutanten isoliert :
Fc-U 404 Leo-U 42 Leo-U 79 6,4 . 1,6 6.4 . 1,6 4,8 . 1,4
6,4 . 2,0 4.8 . 1,8 4,8 . 1,6
6, 7.), 0 5. 6.). 6
4,8 I, 6t, 6, 4 I 61'
Es ist ferner für die gebräuchlichen Mutanten kenn zeichnend, dass sie, wie der Mutterstamm, nicht imstande sind, Lactose zu assimilieren, und dass sie Biotin brauchen und sich folglich auf Czapek-Agarplatten nicht entwickeln.
Die Mutanten Leo-U 42, Leo-U 79 und Fc-U 404 sind im Commonwealth Mycological Institut in Grossbritannien unter den angeführten Bezeichnungen aufbewahrt und können aus dieser Sammlung zum Zwecke einer Identification erhalten werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert : Beispiel I
Sporen von 14 Tage alten Kolonicn von Leo-U 42, die in einem Kolben entwickelt worden waren, der das Substrat 25A der oben erwähnten Zusammensetzung ent hielt, wurden als Impfstoff für einen Schüttelkolben mit einem Inhalt von 500 ml, der 50 ml eines sterilen Kul- turmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt, verwendet :
Glycerin 7, 5 g/l
Maisquellwasser 2, 5 gli Fleisch-uncl Knochenmehl 15, 0 g/l Glucose 20, 0 gel MgSO, 714 O 0, 05 gel
NaCI 4, 0 gui pH = 7, 0
Der Schüttelkolben wurde in eine hin-und hergehende Schüttelvorrichtung eingebracht und die Bebrütung erfolgte bei einer Temperatur von 26 C während eines Zeitraumes von 72 Stunden, um ein vegetatives Wachstum zu erhalten.
Ein Teil dieser Kultur wurde als Impfstoff für einen Fermentationsvcrsuch verwendet, der in einem 1000-ml- Kolben durchgeführt wurde, der 125 ml eines sterilen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt :
Maisquellwasser 20,0 g/1 KH.
P04 10, 0 g/l
MgSO, 7H.. O 0, 5g/1
Saccharose 50, 0 g/1 pH des Mediums = 6. 7
Das angeimpfe Kulturmedium wurde bei 25 C 120 Stunden lang auf einem rotierenden Schütteltisch bebrü- tet ; die Konzentration an Antibiotikum ZN-6 in dem Filtrat des Kulturmediums betrug bei einem Agarschalentest, bei welchem Staphylococcus aureus als Testsubstanz verwendet wurde, 116 mg/l. Eine weitere chemische Prüfung zeigte, dass die erhaltene Verbindung mit dem Antibiotikum ZN-6 identisch ist.
Beispiel 2
Ein Glasfermenter mit einem Arbeitsvolumen von 51 wurde mit einem Nährmedium der folgenden Zusammen aetzung gefüllt :
Maisquellwasser 40, 0 g
Saccharose 55,0 g KH¯PO, 5, 0 g
MgSO4 7H. O 0, 5 g
Leitungswasser ad 1000 ml
Nach dem Sterilisieren wurde der pH-Wert auf 7,2 eingestellt und das Medium wurde mit 5 Vol-% einer 48 Stunden alten vegetativen Kultur von Fc-U 404, der in einem flüssigen Medium der gleichen Zusammensetzung wie das oben erwähnte Substrat 25 A, jedoch mit 1,5 Staley's Special Nutrient ergänzt, gezüchtet worden war, angeimpft.
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 25 C bei einer Rotationsgeschwindigkeit von 470 Um drehungen/Min. durchgeführt, wobei eine Belüftung mit 0, 2 Volumina steriler Luft pro Volumen Kulturlösung pro Minute erfolgte. Um ein Schäumen zu verhindern, wurde, wenn dies erforclerlich war, Specköl in Mengen von jeweils 0, 25 ml zugesetzt, wobei die Gesamtmenge an während der Fermentation zugesetztem Spcckiil 40 ml bc- trug.
Zur Ermittfung der Menge an gebildetem Antibiotikum Fusidinsäure wurden nach 40, 64, 88 und 112 Stunden Proben entnommen und dabei zeigte sich, dass diese Proben 10, 85,185 und 335 mg/I Kulturmedium an Fusi dinsäure enthielten ; die zuletzt angeführte Ausbeute wurde durch Gewinnung dieses Stoffes in reiner Form be stätigt.
Wenn der Mutterstamm auf die gleiche Weise einer Fermentation unterworfen wird, beträgt der Gehalt der Kulturflüssigkeit an Antibiotikum Fusidinsäure nach einer Fermentationsdauer von 112 Stunden nur 240 mg/i.