DE3500637C2

DE3500637C2 -

Info

Publication number: DE3500637C2
Application number: DE3500637A
Authority: DE
Inventors: Tsutomu Tokio/Tokyo Jp Furuya
Original assignee: Showa Denko KK
Current assignee: Resonac Holdings Corp
Priority date: 1984-01-13
Filing date: 1985-01-10
Publication date: 1990-04-19
Also published as: JPS60149393A; JPS6314953B2; US4978617A; DE3500637A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her stellung von Tocopherolen durch Gewebekultur von Carthamus tinctorius.

Tocopherole kommen in der Natur in zahlreichen Arten von Pflanzenölen vor und umfassen analoge Verbindungen, wie α-, β-, γ- und δ-Tocopherole, denen die gleiche Chromanstruktur gemeinsam ist. Wenn auch diese analogen Verbindungen verschiedene Einzelwirkungen und Aktivi täten besitzen, haben alle Verbindungen gemeinsam die physiologische Wirkung als Vitamin E und eine Anti oxidationswirkung. Tocopherole werden daher als Bestand teile von Arzneimitteln und als Antioxidationsmittel für Nahrungsmittel eingesetzt. Kürzlich wurde jedoch gefunden, daß Tocopherole die physiologische Wirkung besitzen, die Verschlechterung des Körperzustands zu verhindern oder eine vorbeugende Wirkung gegen Alterskrankheiten zeigen. Aus diesem Grund steigt die Nachfrage nach Tocopherolen, die aus Pflanzen erhalten werden, rasch an.

Tocopherole werden normalerweise mit Hilfe eines Synthese verfahrens oder durch Extraktion aus pflanzlichen Ma terialien hergestellt. Wie vorstehend erläutert wurde, kommen Tocopherole in Pflanzenölen vor, wie in Soja bohnenöl, Weizenkeimöl, Baumwollsamenöl, Palmöl, Mais öl und dergleichen. Diese Pflanzenöle haben jedoch im allgemeinen einen niederen Gehalt an Tocopherolen. Aus diesem Grund werden Tocopherole mit pflanzlichem Ursprung normalerweise aus dem Schaum erhalten, der bei dem Verfahren Desodorierung bei der Ölproduktion gebildet wird, da dieser Schaum einen relativ hohen Tocopherolgehalt hat.

Das Verfahren zur Herstellung von Tocopherolen aus die sem Schaum ist jedoch mit Problemen behaftet, die darauf beruhen, daß dieser Schaum ein Nebenprodukt des Ölher stellungsverfahrens ist und daher die Menge des erhält lichen Schaums von der Menge des gebildeten Öls abhängt. Diese Menge reicht jedoch kaum aus, um die steigende Nachfrage nach Tocopherolen zu befriedigen. Diese Tatsache ist der Grund für die vielen Schwankungen des Preises für Tocopherole. Außerdem enthalten aus diesem Schaum hergestellte Tocopherole neben α-Tocopherol auch die anderen analogen Verbindungen, wie β-, γ- und w-Toco pherol, während jedoch α-Tocopherol physiologisch am wirksamsten ist.

Im Hinblick auf die vorstehenden Schwierigkeiten besteht ein starkes Bedürfnis nach einem neuen Verfahren zur Herstellung von Tocopherolen mit pflanzlichem Ursprung, mit dessen Hilfe Tocopherole mit hohem Gehalt an α-Toco pherol in großen Mengen und in wirtschaftlicher Weise gebildet werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit Hilfe eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Tocopherolen durch Gewebe kultur gelöst. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeich net, daß 1) Callus aus der Pflanze Carthamus tinctorius gewonnen wird, 2) das Callusgewebe in ein synthetisches Nährmedium eingeimpft und in diesem Medium unter Bildung von Tocopherolen gezüchtet wird und 3) die gebildeten Tocopherole gewonnen werden.

Gemäß der Erfindung wird zunächst Callusgewebe aus der Pflanze Carthamus tinctorius zubereitet, die zu den Compositae gehört und einjährig ist. Zur Zubereitung des Callusgewebes können die Wurzeln, Blätter, Stengel, Keimlinge, Schößlingsspitzen, Knospen, Blüten, Samen, einzelne Zellen oder gezüchtete Zellen oder gezüchtetes Gewebe als Ausgangsmaterialien verwendet werden. Bei der praktischen Anwendung werden jedoch vorzugsweise die Blütenknospen, Samen oder Sämlinge oder gezüchtete Zellen oder differenzierte gezüchtete Gewebe einge setzt, da diese Ausgangsmaterialien Tocopherole in relativ hohen Mengen enthalten, in synthetischen Medien kräftig wachsen und leicht sterilisiert werden können.

Zur Herstellung des Callusgewebes wird eines der vorstehend beschriebenen Ausgangsmaterialien in ein synthe tisches Nährmedium eingeimpft, welches identisch mit einem der später ausführlicher beschriebenen Medien zur Herstellung von Tocopherolen sein kann. Die Kulturbedingungen zur Herstellung des Callusgewebes können ebenfalls die gleichen wie die der Züchtung zur Herstellung sein, wie sie nachstehend ausführlicher beschrieben werden. Das Callusgewebe kann im wesentlichen unbegrenzt durch Subkultur in beispielsweise dreiwöchigen Intervallen aufrechterhalten werden. Für diese Subkultur werden das gleiche Kulturmedium und die gleichen Kulturbedingungen wie für die Callus-Herstellung angewendet.

Zur Herstellung der Tocopherole wird dann das Callus gewebe in ein Produktionsmedium eingeimpt.

Gemäß der Erfindung kann als Medium zur Herstellung und Aufrechterhaltung des eingeimpften Callus und für die Herstellung der Tocopherole ein übliches synthetisches Medium für eine Pflanzengewebekultur eingesetzt werden. Das vorstehend angegebene Medium enthält eine Stickstoff quelle, Kohlenstoffquelle, anorganische Salze, Vitamine und Pflanzenwachstums-Regler und gegebenenfalls das Wachstum stimulierende Substanzen und andere organische Substanzen. Die Stickstoffquelle ist vorzugsweise ein Nitrat, wie Ammoniumnitrat oder Kaliumnitrat. Die Kohlen stoffquelle ist vorzugsweise Saccharose oder Glucose.

Zu geeigneten anorganischen Salzen gehören beispielsweise Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumdiphosphat, Ferro sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Kobaltchlorid, Kupfer sulfat, Natriummolybdat, Kaliumiodid, Borsäure und das Natriumsalz von Ethylendiamintetraessigsäure. Zu geeigneten Vitaminen gehören beispielsweise Nicotin säure, Nicotinsäureamid, Pyridoxin (Hydrochlorid), Thiamin (Hydrochlorid), Pantothenat, Biotin, Folsäure, Vitamin B₁₂, Riboflavin, Cholin und Myoinositol. Zu geeigneten Pflanzenwachstumsregulatoren gehören Auxine, wie 2,4- Dichlorphenoxyessigsäure, Indolbuttersäure, Naphthalin essigsäure; Cytokinine, wie Adenin, Kinetin, Benzyl adenin, Zeatin und Zeatinribosid; sowie Gibberelin. Zu wachstumsstimulierenden Substanzen gehören beispiels weise Hefeextrakt, Malzextrakt, Kokosnußmilch und Casein hydrolysat. Beispiele für die vorstehend erläuterten organischen Substanzen sind Aminosäuren, wie Glycin und Glutaminsäure.

Das Medium enthält einige der vorstehend angegebenen Materialien. Repräsentative Medien sind beispielsweise Murashige und Skoog-Medium, White-Medium, Heller-Medium, Linsmaier und Skoog-Medium, Nitsch-Medium, Gamborg- Medium und auf den vorstehenden Medien basierende modi fizierte Medien. Ein modifiziertes Medium nach Murashige und Skoog (B2KC-Medium), das nachstehend aus führlich erläutert wird, wird für die Herstellung von Tocopherolen bevorzugt.

Für die Züchtung können übliche Bedingungen für Pflanzen gewebekulturen angewendet werden. Die Züchtungstemperatur beträgt 15 bis 35°C, vorzugsweise 20 bis 30°C. Der pH- Wert des Mediums ist 4 bis 8, vorzugsweise 5 bis 6. Das Callusgewebe kann auf einem festen Medium oder in einem flüssigen Medium unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden.

Zu bevorzugen ist eine Suspensionskultur in einem flüssigen Medium. Im Fall einer flüssigen Kultur wird das Kulturgefäß geschütttelt oder unter mechanischem Rühren belüftet. Die Züchtung bzw. Kultur kann im Dunkeln oder unter Bestrahlung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge und Intensität durchgeführt werden.

Die Züchtung wird fortgesetzt, bis die Menge der gebil deten Tocopherole den Maximalwert erreicht, beispiels weise während 3 bis 40 Tagen, vorzugsweise 10 bis 20 Tagen.

Die in den gezüchteten Zellen gebildeten Tocopherole können mit Hilfe von üblichen Methoden gewonnen und ge reinigt werden. So werden beispielsweise die Tocopherole mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels, welches Toco pherole löst, wie n-Hexan, oder eines Gemisches aus Chloroform und Methanol, aus den Zellen extrahiert. Der Extrakt wird dann von dem Callusgewebe und einer gege benenfalls vorliegenden wäßrigen Phase abgetrennt. Anschließend werden die Tocopherole von dem Lösungsmittel abgetrennt und mit Hilfe einer üblichen Methode gereinigt, wie durch Adsorptionschromatographie oder Molekulardestillation.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden Bei spiele erläutert.

Beispiel 1 1) Züchtung

Blütenknospen von Carthamus tinctorius wurden sterilisiert, indem sie während 5 Minuten mit 70%igem Ethanol und während 5 bis 10 Minuten mit einer 10%igen Lösung von Chlorkalk (der unlösliche Anteil wurde durch Filtration entfernt) behandelt wurden. Die äußeren Hüllen wurden von den sterilisierten Knospen entfernt, wobei die unreifen Blütenblätter erhalten wurden. Die Blütenblätter wurden in kleine Stücke geschnitten, welche mit sterilisiertem Wasser gewaschen wurden. Die gewaschenen Stücke wurden zur Callusbildung auf Basal-Agarmedium nach Murashige und Skoog (abgekürzt DK-Medium) in einen 100-ml-Erlenmeyer- Kolben gegeben. Der Kolben wurde dann bei einer Tempera tur von 26°C drei Wochen lang in einer dunklen Umgebung stehengelassen. Die Blütenblätterstücke bildeten in einer Rate von etwa 95% Callus. Das Callusgewebe wurde durch Subkultur in dreiwöchigen Intervallen aufrechterhalten.

Die Zusammensetzung des DK-Mediums ist in Tabelle 1 an gegeben.

Tabelle 1

Zusammensetzung des DK-Mediums (mg/l)

anorganische Bestandteile

organische Bestandteile
Nicontinsäure
0,5
Pyridoxin·HCl	0,5
Thiamin·HCl	0,1
Myoinositol	100
Kinetin	0,1
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure	1,0

Die in Tabelle 1 angegebenen Bestandteile wurden in gereinigtem Wasser gelöst und die Lösung wurde durch Zugabe einer 5%igen Kaliumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 5,6 bis 5,7 eingestellt. Dann wurden 3% Saccharose und gegebenenfalls 0,9% Agar zur Bildung eines festen Mediums zugefügt. 40 ml des Mediums wurden dann in einen 100-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben.

Ein Teil des in dem Kolben aufrechterhaltenen Callus gewebes wurde entfernt und in frisches PDK-Medium und in B2KC-Medium eingeimpft. Die Subkultur für das Callus gewebe in jedem Medium wurde mit einem 3 Wochen-Intervall durchgeführt.

Das PDK-Medium ist das gleiche wie das DK-Medium mit der Abänderung, daß 1 ppm N-Phenyl-N′-(4-Pyridyl)-harnstoff zugesetzt ist.

Das B2KC-Medium ist das gleiche wie das DK-Medium, mit der Abänderung, daß die organischen Bestandteile des DK-Mediums durch die in Tabelle 2 aufgeführten organischen Bestandteile ersetzt sind.

Organische Bestandteile des B2KC-Mediums
(mg/l)
Nicotinsäureamid
2,0
Pyridoxinphosphat	1,0
Thiamin·HCl	1,0
Calciumpantothenat	1,0
Biotin	1,0
Riboflavin	0,5
Folsäure	0,5
Cholin·HCl	1,0
Vitamin B₁₂	0,0015
Inositol	5500
Casaminosäure	1000
Indolbuttersäure	2
Kinetin	0,1

Die Ergebnisse der Gewebekultur von Carthamus tinctorius, die auf den vorstehend erwähnten Medien, dem DK-, PDK- und B2KC-Festmedium (Agarmedium) durch statische Kultur erhalten wurden, sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3

Wachstum des Callusgewebes auf den verschiedenen festen Medien in statischer Kultur

Außerdem wurde eine Schüttelkultur unter Verwendung der flüssigen B2KC- und DK-Medien durchgeführt. Die Zusammen setzung des flüssigen B2KC-Mediums und des flüssigen DK-Mediums ist die gleiche wie für das entsprechende feste B2KC-Medium und DK-Medium, mit der Äbänderung, daß die flüssigen Medien keinen Agar enthalten.

Die Schüttelkultur wurde unter Schütteln der verwendeten 500-ml- oder 1000-ml-Kolben durchgeführt, die jeweils 250 ml des flüssigen Mediums enthielten und mit einem Stück des Callus angeimpft waren. Das Schütteln erfolgte auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung mit 140 Upm oder einer Linearschüttelvorrichtung (mit hin- und her gehender Schüttelbewegung) mit 80 Spm. Die anderen Be dingungen waren die gleichen wie für die statische Kultur auf dem festen Medium.

Die Ergebnisse der Schüttelkultur sind in Tabelle 4 auf geführt.

Tabelle 4

Wachstum des Callus in verschiedenen flüssigen Medien in Schüttelkultur

2) Abtrennung von Tocopherol

Das gebildete Callusgewebe wurde filtriert, getrocknet und zerkleinert. Das erhaltene Callusgewebepulver wurde mit n-Hexan extrahiert und der Extrakt wurde von dem Rückstand durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wurde dann der Hochleistung-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unterworfen. Bei der HPLC-Analyse wurden folgende Bedingungen eingehalten:

Kolonne:
ZORBAX SIL (Shimadzu und Co.) Durchmesser 4,6 mm×25 cm
Temperatur:	Raumtemperatur (etwa 25°C)
Lösungsmittel:	n-Hexan/Dioxan/Ethanol (97,6 : 2,0 : 0,4)
Nachweis:	Fluoreszenz EX 289 nm, EM 325 nm
Fließrate:	1,5 ml/min

Das Ergebnis ist in Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Menge des Tocopherols

Aus Tabelle 5 geht hervor, daß zur Herstellung von Toco pherolen B2KC-Medium zu bevorzugen ist, und daß der größte Anteil der im Callus von Carthamus tinctorius gebildeten Tocopherole aus α-Tocopherol besteht, welches unter den Tocopherol-Analogen die wirksamste Verbindung als Vitamin E ist. Das bedeutet, daß das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafter als die üblichen Verfahren ist.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Tocopherolen durch Gewebe kultur, dadurch gekennzeichnet, daß man
- 1) Callusgewebe der Pflanze Carthamus tinctorius herstellt,
- 2) das Callusgewebe in ein synthetisches Nährmedium einimpft und in dem Medium züchtet und
- 3) die gebildeten Tocopherole gewinnt.