DE3246864A1

DE3246864A1 - Verfahren zur verbesserung des wirkungsgrades bei der in vitro vermehrung von kulturpflanzen

Info

Publication number: DE3246864A1
Application number: DE19823246864
Authority: DE
Inventors: Tibor Dr. 6733 Szeged Farkas; Ferenc Dr. 6723 Szeged Föglein; Ibolya Dr. 6728 Szeged Horváth; Annamária 1147 Budapest Mészáros; János 6724 Szeged Nagy; István 3792 Sajóbábony Tóth; László Dr. 6728 Szeged Vigh
Original assignee: Eszakmagyarorszagi Vegyimuevek
Current assignee: Eszakmagyarorszagi Vegyimuevek
Priority date: 1981-12-18
Filing date: 1982-12-17
Publication date: 1983-06-30
Also published as: IL67506A; GB2112413B; US4554252A; PL132926B1; BG37679A3; HU187396B; FR2518531A1; AU9170882A; PL239589A1; CS239936B2; AU555018B2; DD208795A5; BE895365A; SU1417787A3; BR8207370A; CA1179858A; GB2112413A; PH20018A; NL8204874A; JPS58165714A

Description

fiszakmagyarororszägi Vegyimüvek Sajobäbony/Ungarn

VERFAHREN ZUR VERBESSERUNG DES WIRKUNGSGRADES
BEI DER IN VITRO VERMEHRUNG VON KULTURPFLANZEN

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung des Wirkungsgrades bei der In vitro Vermehrung von Kulturpflanzen, wobei gemäss der Erfindung die Verbesserung des Wirkungsgrades durch eine Behandlung mit wässerigen Lö-Bungen von Verbindungen der allgemeinen Formel

0 ·' ^R₁
R—C—-N (I)

2

oder _{0 H H 0}

Ii I II

R C N (CH₂ >g—N C R (II)

'

erzielt wird. In der allgemeinen Formel (i) haben die
Substituenten folgende Bedeutung: R kann für ein Methyl-, Chlormethyl-, Di chlorine thy 1- oder Trichlormethylradikal
stehen; R-, und R₂ können gleich oder verschieden sein und

ein Altey!radikal mit 1-10 Kohlenstoffatomen ,· ein Alkenylradikal mit 2-10 Kohlenstoffatomen«, ein Gycloalky!radikal mit 3-9 Kohlenstoffatomen, Phenylradikal oder Benzylradikal oder aber Wasserstoff bedeuten mit' der Bedingung, dass R₁ und Rp flicht gleichseitig Wasserstoff sein können? oder R^ und R₂ zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen 5- bis 8-gliedrigen gesättigten heterozyklischen Ring bilden ₉ der eln₉ zwei oder drei gleiche oder verschiedene weitere Heteroatome, vorzugsweise Stickstoff» oder Sauerstoffatome enthalten kann_e In der allgemeinen Formel (II) ist die Bedeutung von R die gleiche wie bei der allgemeinen Formel Cl) und η ist eine ganze Zahl zwischen 1 und 8.

Die unter In vitro Bedingungen durchgeführten Verfahren zur Gewebezucht-Pflanzenvermehrung fanden in den letzten swei Jahrzehnten in der Praxis weite Verbreitung· In. den Vereinigten Staaten von Amerika wurden mehr als zwanzig Laboratoriumsgrossbetriebe zur Vermehrung errichtet und . auch in Westeuropa gibt es zahlreiche Laboratorien, wo 100-200000 Pflanzen monatlich durch Gewebezucht-Mikrovermehrung hergestellt werden·-

Praktisch gesehen besteht das Wesen der Vermehrung durch Gewebezucht darin ₉ dass aus Meristemgeweben von pflanzlichen Triebspitzen und Wurselspitzen unter sterilen Bedingungen von jeglichen pflanzlichen Schädlingen freie Pflanzen mit einer die Geschwindigkeit von üblicher Vermehrungsstoffproduktion um mehrere Grossenordnungeη übertreffenden Geschwindigkeit, wesentlich weniger Flächenbedarf und folglich wirtschaftlicher vermehrt werden können«

In Ungarn findet das Verfahren zur Pflanzenvermehrung durch Gewebezucht in Grossbetrieben heutzutage Verbreitung« 35

Obwohl die Vermehrung durch Gewebezucht wirtschaftlicher

als die üblichen Vermehrungsmethoden ist, konnten die darin verborgenen Möglichkeiten wegen den unterschiedlichen Mängeln der bisherigen Verfahren doch nicht genutzt werden,

Der grösste Mangel der bisher bekannt gewordenen Verfahren besteht darin, dass während sich die Pflanzen unter ija vitro Bedingungen unbegrenzt vermehren, bisher beim Umpflanzen in den Boden - je nach der Pflanzenkultur - 20-60 % der unter sterilen Bedingungen gezüchteten Pflanzen, die nachteiliger als die früheren sind, zugrunde gehen /pBroome, Zimmermann; Hort.Science, 12» 151-153 (1978); Earle; Langhans; Hort.Science, 10, 608-610 (1975); Sutter, Langhans; J.Am.Soc. Hort.Science, 104, 494-496 (1979}?.

Obwohl die sich mit dem Thema beschäftigenden Forscher bestrebt waren, durch eine Verbesserung der technischen Bedingungen der iri vivo Zucht (niedrigere TemperatürSchwankungen, hohe relative Luftfeuchtigkeit usw.) die Wirksamkeit der Vermehrung zu verbessern, führten diese Maasnähmeη ■ .nicht zum gewünschten Erfolg.

Das Ziel unserer Forschungen zur Untersuchung des Vermehrungsverfahrens mit Gewebezucht bestand darin zu klären, was die schlechte Anpassungsfähigkeit der iji vitro vermehrten Pflanzen und das starke Zugrundegehen der umgepflanzten Pflanzen verursacht.

Ein weiteres Ziel unserer Forschungen war, ein Verfahren zu erarbeiten, mit dessen Hilfe die Wirksamkeit der Vermehrung wesentlich verbessert werden kann und der überwiegende Teil der unter i_n vitro Bedingungen vermehrten Pflanzen auch unter i_n vivo Bedingungen lebensfähig und sich schnell entwickelnd ist.

Bei unseren Forschungen wurden in Treibhaus- und Freilandversuchen die Zusammensetzung der Wachse und der Membran-

lipide mehrerer Kulturpflanzen (Nelke, Gerbera, Reben, Farn) sowie der Prozess der Biosynthese dieser Zellbestandteile studiert«, Als Ergebnis dieser "Versuche wurde festgestellt, dass bei den durch Gewebezucht vermehrten Pflanzen in der . Struktur der erwähnten Zellbestandteile bedeutende Veränderungen nachgewiesen werden können*

Es stellte sich heraus₉ dass die Synthese der die Oberfläche der Pflanzenblätter beziehenden Wachse gehemmt ist* Bs wurde festgestellt, dass während bei den wie üblich gezüchteten Pflanzen in den lipophilen Bestandteilen der Zellmembran die stärker ungesättigten Fettsäuren synthetisiert wurden, bei den durch Gewebezucht vermehrten Pflanzen die Synthese der stärker ungesättigten Fettsäuren gehemmt ist. Das führt dazu_f dass die Zellmembranen brüchig werden und die unterschiedlichen Membranfunktionen nicht entsprechend erfüllen können»

In einer Versuchsreihe wurde die Zusammensetzung der Wachskomponenten der mit dem üblichen Zuchtverfahreη und mit dem ■ iü vitro Vermehrungsverfahren gezüchteten Pflanzen durch Isotoptechnik untersucht· Die Pflanzen wurden mit einer 1-.14C- Acetatlösung mit einer Aktivität von 10 /uCiAuMol bei einer Temperatur von 25 ⁰G durch 4 Stunden Inkubation behandelt, dann wurden die Wachskomponenten durch Dünnschichtchromatographie getrennt und ihre Verhältnisse auf Grund der spezifischen Aktivität bestimmt·

Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst«

	Verteilung der Wachskomponenten in	Hydröxy- diketon	Primär Alkohol	Sekundär Alkohol	Prozent	Ester	,40	Kohlen hydrat
	Säure	3,32,	19,44	1,53	Alde hyd	5	,71	24,84
Kontrolle	3I₉13	42,56 in Spuren	3,24	2,04	14,33	2		28,48
in vitro ·	20,95

f I°f9 # * » ♦ · ♦ *

Aus diesen Messergebnissen kann festgestellt werden, dass in den Wachsen der unter in. vitro Bedingungen vermehrten Pflanzen die Verteilung der Komponenten deutlich von der der Kontrollpflanzen abweicht. Das Anhäufen der Säuren erhöht die Durchlässigkeit.der Oberfläche der Blätter und das Senken der Menge der primären Alkohole wirkt ähnlich.

Diese beiden Erscheinungen spielen sich gleichzeitig ab und auf ihre Wirkung hin können die unter ijn vitro Bedingungen gezüchteten Pflanzen ins Freie (in vivo) umgepflanzt den Wassergehalt der Zellen nicht aufrechterhalten.

Ebenfalls wurde bei den Versuchen die Fettsäurezusammensetzung der aus den auf zwei verschiedene Weisen gezüchte-. ten Pflanzen isolierten totalen Lipiden untersucht. Die Untersuchungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.

Fettsäurezusammensetzung der Lipide in %

Palmitin- Palmito- Stearin- öl- Linol- Lino-

säure leilsau- säure säii- säure len-

re re säure

25	Zahl der Koh lenstoffatome	16	,72	16	,79	18	,59	18	18	29	18	,07
	Zahl der ungesättigten Bindungen	0	,82	1	,52	0	,11	1	2	18	3	,04
30	Kontrolle	14	0	0	5,53	30,	48
	in vitro	25	3	7	27,97	17,	18

Die Änderung der Fettsäurezusammensetzung zeigt an, dass sich im Lipid der in vitro gezüchteten Pflanze die Ölsäure in hohem

Mass ansammelt. Vermutlich sind die von der ölsäure zu Linolensäure erfolgenden Desaturationssehritte aus irgendeinem Grund gehemmt· Die mehrfach ungesättigten Fettsäuren (so die Linol- und Linolensäure) spielen bei der Flexibilität der Zellmembranen und dadurch bei der Anpassungsfähigkeit der Pflanzen eine bedeutende Rolle«, Fehlen die ungesättigten Fettsäuren in den Zellmembranen₉ so führt das dazu, dass flie Anpassungsfähigkeit der Pflanzen bedeutend abnimmt·

Diese Versuche bestätigten, dass bei den in vitro vermehrten Pflanzen die Biosynthese der Wachse der Blattoberfläche und in erster Linie der in den Zellmembranen vorhandenen Fettsäuren Schaden nimmt, weshalb die aus dem Kolben ausgepflanzten Pflanzen nicht in der Lage sindj, selbst geringe Semperaturschwankungen zu ertragen^ und yjegen den Membranschäden selbst in einer Umgebung mit hohem Luftfeuchtigkeitsgehalt austrocknen und zu einem bedeutenden Teil zugrunde gehen· In Kenntnis dieser Tatsachen waren die Forschungsarbeiten darauf gerichtet herauszufinden ₉ wie die Zusammen-' setzung der Wachskomponente sowie das Verhältnis der Fettsäuren der Lipide und ihre Biosynthese bei der In vitro Vermehrung beeinflusst werden können,

Ziel unserer Forschungen war esj, ein Verfahren auszuarbeiten, mit dem die Schädigung der in vitro gezüchteten Pflanzen nach dem Auspflanzen bedeutend gesenkt und die Anpassungsfähigkeit der Pflanzen verbessert werden kann»

Im Laufe der weitreichend durchgeführten Forschungen wurde gefunden, dass wenn bei ansonst in an sich bekannter Weise durchgeführten Vermehrungsverfahren mit Gewebezucht die sich vermehrenden Pflanzen mit der wässrigen Lösung einer Verbindung der allgemeinen Formel (l) odex' (II) oder aber mit der wässrigen Lösung von zwei oder mehreren Verbindungen der allgemeinen Formel Cl) oder (II) oder mit der wässrigen Lösung

I* IMI

einer Mischung beider behandelt werden, nach dem Pflanzen der in, vitro gezüchteten Pflanzen das Pflanzensterben unter in_ vivo Bedingungen bedeutend abnimmt.und wesentlich mehr Pflanzen das Auspflanzen überleben und auch die Entwicklung der überlebenden Pflanzen stärker wird·

Die Behandlung mit der wässrigen Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) kann so erfolgen, dass die Verbindung in einer Konzentration von 1-20 mg/1 im wurzelnden Nährboden gelöst wird, aber auch so erfolgen, dass die auf dem wurzelnden Nährboden gezüchteten Pflänzchen vor dem Auspflanzen (d.h. das Wurzelwerk der Pflänzchen) in die wässrige Lösung (Konzentration 1-20 mg/l) der Verbindung der allgemeinen Formel· (I) oder (II) getaucht werden. - Die Behandlung kann auch so durchgeführt werden, dass die in vitro gezüchteten Pflänzchen in ein mit der wässrigen Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) durchtränktes Erdgemisch gepflanzt werden. Man kann auch so vorgehen, dass die in vitro gezüchteten Pflänzchen nach ' dem Auspflanzen gegebenenfalls auch mehrmals mit der wässrigen Lösung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) in einer Konzentration von 5-15 mg/1 besprüht werden.

In der allgemeinen Formel (I) können die Substituenten folgende Bedeutungen haben: R kann für ein Methyl-, Ohlormethyl-Dichlorine thy I- oder Trichlormethy!radikal stehen; R₁ und R₂ können gleich oder verschieden sein und ein Alky!radikal mit 1-10 Kohlenstoffatomen, ein Alkenylraäikal mit 2-10 Kohlenstoffatomen, ein Cycloalky!radikal mit 3-9 Kohlenstoffatomen, Pheny!radikal oder Benzylradikal oder aber Wasserstoff be-* deuten mit der Bedingung, dass R₁ und R₂ nicht gleichzeitig Wasserstoff sein können; oder R₁ und R~ zusammen mit dem benachbarten Stickstoff einen 5- bis 8-gliedrigen gesättigten heterozyklischen Ring bilden, der ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene weitere Heteroatome, vorzugsweise Stickstoff- oder Sauerstoffatome enthalten kann. '

ä -

Dieser gesättigte heterozyklische Ring kann insbesondere eine Hexamethylengruppe darstellen« Darüber hinaus können Morpholine-, Thiomorpholine- und Piperazinoringe z.B. erwähnt werden.

Der Älkylrest (R. und/oder R₃) kann somit insbesondere eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Amyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- oder Decy!gruppe darstellen.

Sofern R^ und/oder R„ einen Alkenylrest darstellen, handelt es sich um eine Ethenyl-, Propenyl-, Butenyl-, Amenyl-j, Hexenyl-, Heptenyl-₇ Octenyl-, Nonenyl-oder Decenylgruppe.

Soweit R₁ und/oder R„ eine Cycloalky!gruppe darstellen, handelt es sich um eine zyklische Propyl-, Butyl-, Amyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl- oder Nonylgruppe.

In der allgemeinen Formel (II) ist die Bedeutung von R die gleiche wie bei der allgemeinen Formel (I) und η ist eine ganze Zahl zwischen 1 und 8. Die Bedeutung von n, die zwischen 1 und 8 schwanken kann, kann somit. 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 oder 8 darstellen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und (II) sind aus den folgenden Literaturstellen bekannt beziehungsweise können gemäss den in diesen Literaturstellen beschriebenen Methoden hergestellt werden: Res· Disci· (1976) 143 - 148; J. Agric.'Food. Chem. (1978), 26, 1, 137 .- 140; J. Agric. Pood. Chem. (1979), 27, 3, 543.- - 547; und Houben—Weil: "Methoden der organischen Chemie", Band XI/2,0, 3-37 (1958). ·

Weiterhin wurde bei unseren Forschungen untersucht, wie sich die wichtigsten Wachskomponenten der mit der wässrigen Lösung der Verbindungen der allgemeinen Pormel (I) oder (II) behandelten und mit "±ιι vitro Gewebezuchttechnik vermehrten Pflanzen im Vergleich zu unbehandelten Pflanzen ändern sowie welchen Einfluss die Behandlung auf die Pettsäurezusammensetzung der totalen Lipide der Pflanze ausüben,

Bei den Versuchen wurde Nährboden mit folgender Zusammensetzung zur iji vitro Zucht der Pflanzen verwendet Murashige, T. Skoog, P.: Physiol. Plant. 1£, 473-497 (1962) :

CaCl₂ . 2H₂O
CoGl

₂ .

PeHaEDl¹A
H₃BO₃

KH₂PO₄

KJ

KlTO.

439,300 mg/1 0,025 mg/1 0,025 ml/1

336,600 mg/1 6,200 mg/1

170,000 mg/1

0,830 mg/1 1900,000 mg/1

8,600 mg/1 3-45,000 g/l 100,000 mg/1 10,000 mg/1

salzsaures Salz 30,000 mg/1 von Thiamin

Zn₂SO₄ χ 7H₂O
Zucker :
Inozit
Nikotinsäure

salzsaures
Salz von
Pyridoxin
Adeninsulfat
. 2H₂O ·

Indolessigsäure

10,000 mg/1

0-80,000
0-10,000

mg/1 mg/1

BAD ORIGINAL

	7H₂O	— IEt	J"2L	Kinetin	3246864
MgSO. .	4H₂O	φ 370,000	/(ο· mg/1	Agar-agar	0-30,000 mg/1
	• 2H₂O	22,300	mg/1		7-10,000 g/1
NaH₂PO₄	. 2H₂O	■ 96,,0OO	mg/1
Na₂MoO₄		0,250	mg/1
NH₄NO₃	165O₁OOO	mg/1«

Die aufgezählten Stoffe werden in destilliertem Wasser gelöste der pH-Wert der Lösung wird auf 5»8 eingestellt, dann wird der Agar-ager zugesetzt und der Nährboden wurde bis zum Abklären gekocht, dann unter sterilen Bedingungen in die Kolben gefüllt, deren Öffnung mit einem Papierstöpsel verschlossen wurde,, Die Kolben wurden dann in einen Autoklav gelegt und der Nährboden wurde bei einer Temperatur von 12.1 ⁰G sterilisiert,, In der ersten Versuchsreihe wurde von den Verbindungen der allgemeinen Formel Cl) die Wirkung von. Dichloracetyl-hexamethylenimin auf die Synthese der wichtigsten Wachskomponenten der Nelkenpflanze untersucht«, Parallel wurden, mit traditioneller Technik die Pflanzen sowie mit vitro GewebeZuchttechnik auf einem Nährboden mit der vo~ · rigen Zusammensetzung bzw, auf einem Nährboden, dem 6 mg/1 Dichloracetat-hexameth^lenimin vor der Sterilisation des Nährbodens zugesetzt, wurden^ gezüchtet· Beim gleichen Entwicklungsabschnitt der Pflanzen wurde die prozentuale Menge der zwei wichtigsten Wachskomponenten mit der schon früher beschriebenen Methode bestimmte Die gemessenen Werte sind in der folgenden Tabelle enthalten·

	Zuchtmethode	Wachskomponenten-	%
30		Säuren	Primäre Alkohole
	traditionell (Kontrolle)	.'32,U	2O_f55
35	in vitro	45,21	3,05
		30,73	22,18
	erfindutfgflge- mäss in vitro

Die Versuchsergebnisse zeigen deutlich, dass sich auf die V/irkung von Dichloracetyl-hexamethylenimin in der jji vitro gezüchteten Nelkenpflanze die Zusammensetzung der Wachskomponenten auf ein Niveau einstellt, das dem der traditionell gezüchteten Pflanzen ähnelt.

In einer folgenden Versuchsreihe wurde untersucht, wie unter den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) die Anwendung von Dichloracety!-hexamethylenimin in unterschiedlichen Konzentrationen die Fettsäurezusammensetzung der totalen Lipide der i_n vitro gezüchteten Nelkejipflanze beeinflusst. Bei den Versuchen wurden auf dem schon beschriebenen Nährboden sowie auf einer Menge von jeweils 250 ml davon, der unterschiedliche Mengen von Dichloracetyl-hexamethylenimin eingewogen wurden, 5ji vitro Nelkenpflanzeη gezüchtet, in denen bei gleichem Entwicklungsstadium mit der schon früher beschriebenen Methode die Fettsäurezusammensetzung der totalen Lipide untersucht wurde. . ·

Die Messergebnisse sind in der folgenden Tabelle enthalten«

Behandlungs- Fettsäure %

konzentra- ■ ■ ■ ' ' ■ ■ . ■ . ■ . ■

tion Cmg/lJ Palmitin- Palmito- Stea- Öl- Linol- Linole: säure leil- rin- säure säure säure säure säure

	0,00	25,82	3,89	7,11	27,97	17,18	18,04
30	15,60	25,16	-	3,09	18,94	32,85	23,96
	30,80	23,08	-	4,37	18,53	25,18	28,85
	61,60	24,61	-	2,50	16,68	32,85	23,26
35	154,00	21,13	-	3,38	19,15	29,20	27,04
	30,00	26,57	-	4,00	25,71	25,29	18,43

Die Messergebnisse- veranschaulichen gut., dass sich auf die Wirkung des in unterschiedlichen Konzentrationen angewendeten Dichloracetyl-hexamethylenimins die Fettsäurezusammensetzung in Richtung' der ungesättigten Fettsäuren verschob.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht,-ohne den Schutzumfang auf diese Beispiele einzuschränken»

Beis£i£l_l

Herstellung von Nelkenvermehrungsstoff durch Gewebezucht·

Die Meristemgewebe von nach einem an sich bekannten Verfahren im Treibhaus gezüchteten Helkenstecklingen wurden unter sterilen Bedingungen vorbereitet und auf dem schon beschriebenen Murashige-Skoog-lährboden vermehrt® Die ÜTelkenmeristeme begannen zuerst zu wachsen® dann sich zu teilen. Aus jeder Triebspitze wuchsen 6 Wochea nach dem Einbringen in den Nährboden 10-15 Triebe, die - wenn sie getrennt auf neuen frischen Nährboden gesetzt werden - für Weitervermehrung geeignet sind„ Die Vermehrungsgeschwindigkeit der Triebe betrug monatlich 10-15 Triebe·

Nach der Teilungsphase der Nelkentriebe erfolgte auf gesondertem Nährboden die Induktion der Wurzelbildung_f wozu Grundnährboden mit einer auf das Fünffache verdünnten Konzentration verwendet wurde mit dem Unterschieds, dass dem Mahrboden in einer Konzentration von O₁₁I mg/1 Indolessigsäure zugesetzt wurde»

Aus dem Nährboden wurde durch das Zusetzen von unterschiedlichen Mengen Dichloracety!-hexamethylenimine eine .Kon^entrationsreihe hergestellt, und die Zucht erfolgte auf diesen Nährböden. ·

Als die Würze!bildung das gewünschte Mass erreicht hatte, wur-

den die Nelkenpflanzchen zur Setzlingszucht unter in vivo Bedingungen in ein Treibhaus umgesetzt.

Die ungesetzten Pflänzchen passten sich in unterschiedlichem Mass den Bedingungen der ±ja vivo Zucht an, es gab Pflanzen, die zugrunde gingen, und Pflanzen, die sich anpassten,, das Umpflanzen überlebten und sich entwickelten.

Bei der i_n vivo Vermehrung wurden von den auf unterschiedliehen Nährböden gezüchteten Pflänzchen die Anzahl der zugrundegegangenen bzw. überlebenden gezählt, die prozentual in der folgenden Tabelle zusammengefasst sind:

Dichloracetyl- -hexamethylenimin- -Gehalt des Nähr bodens (mg/13	Überleben in {%)
1	45
2	48
4	64
6	96
8	87
10	75
12	70
14	50
20	43
0 (Kontrolle)	46

Aus den Messangaben geht hervor, dass bei Heiken durch das Zusetzen von Mchloracetyl-hexamethylenimin zum Nährboden das Treibhausüberleben der Nelkensetzlinge bei einer Konzentration von 6 mg/1 auf 96 % erhöht werden kann, also

■ ■

die V/irkung der Vermehrungstechnik um mehr als 100 % (um das Doppelte) gesteigert werden kann₉ was die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens stark verbessert.

Ss konnte beobachtet werden ₉ dass die grüne Farbe der mit dem erfindungsgemässen Verfahren gezüchteten Pflanzen einen dunkleren Ton aufwies und ihre Stiele und Blätter stärker als die der Kontrollpflänzchen waren und ausseräem eine dickere Y/achsschicht die Oberfläche ihrer Blätter bedeckte,,

Beispiel 2

Ahnlich wie im vorherigen Beispiel wurde Helkenvermehrungsstoff hergestellt, wobei die Meristemgewebe ebenfalls auf dem beschriebenen Murashige-Skoog-Hahrboden vermehrt wurden und dann zur Induktion der Würze!bildung auf auf das Fünffache verdünnten, O₈I mg/1 Indolessigsäure enthaltenden Nährboden umgepflanzt wurden« Die so jura vitro gezüchteten Pf!ansehen wurden in ein solches Erdgemisch in einem Treibhaus umgepflanzt_s das von den erfindungegemässen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit einer Lösung von Dichloracety!-hexamethylenimin wie folgt durchtränkt wurde, 5 g Dichloracety!-hexamethylenimin wurden in 500 ml 70 %igem Äthylalkohol gelöst, dann in 19»5 1 Wasser gerührt« Die so hergestellten 20 1 Lösung wurden unter mehrfachem Umschau-

fein 1 m Erdgemisch zugesetzt, - In den so hergestellten Boden sowie in die genannte Verbindung der allgemeinen Formel (l) nicht enthaltenden Boden wurden die ^n vitro gezüchteten Pflänzchen gesetzt und im Treibhaus wurde ihr in vivo Wachsen beobachtet»

Es wurde festgestellt, dass während auf dem unbehandelten · Boden 58 % der Pflänzchen zugrunde gingen (also 42 % das Umpflanzen überlebten), auf dem Dichloracetyl-hexamethylejaimln enthaltenden Boden nur 8 % der Pflänzchen zugrunde

¹ « 1 - * ι

■ Μ-

gingen, 92 % entwickelten sich kräftig weiter,

Beispiel 3

Ahnlich wie im vorigen Beispiel wurde ITelkenvennehrungsstoff hergestellt, und die Pflanzen wurden nach Entwicklung der Wurzeln in ein Treibhaus zur ijn vivo Zucht in unbehandelten Boden gesetzt.

Dann wurde die Hälfte der Pflanzen nach dem Auspflanzen mit von den Verbindungen der allgemeinen Formel (i) Dichloracety !-hexamethylenimin enthaltendem Sprühmittel behandelt, dann noch dreimal mit Pausen von 3-4 Tagen.

Ein Liter des Sprühmittels enthielt 10 mg Dichloracetyl- -hexamethylenimin, 0,1 ml Emulgator der Marke Tween 80 und 0,05 M Tris HCl-Puffer, sein pH-Wert betrug 6,5. Bei seiner Herstellung wurde so verfahren, dass das Dichloracety!-hexamethylenimin in einigen Tropfen 70 %igem Alkohol gelöst, dann dem den Puffer enthaltenden Wasser zugesetzt und der Emulgator der Mischung beigerührt wurde.

Die Versuche zeigten, dass 88 % der durch Besprühen behandelten Pflanzen das Umpflanzen überlebten, während nur 42 % von den nichtbehandelten überlebten.

Beispiel 4

Herstellung von Gerbera-Vermehrungsstoff durch Gewebezucht· 30

Die Gerberapflanzen wurden in, vitro nach der schon bekannten, von Murashige et al. (j. Hort. Sei. ^, 175-180 (1974)3 ausgearbeiteten Methode zur Vermehrung und Wurzelbildung vermehrt. Einem Teil des wurzelnden Nährbodens wurde in

einer Konzentration von 10 mg/1 Dichloracetyl-hexamethylen imin zugesetzt, und die Hälfte der Pflanzen fasste auf die sem KTährboden Wurzeln· Die JLn vitro gezüchteten Pflanzen wurden dann in ein Treibhaus gesetzt, und bei den unter ifi vivo Bedingungen weitergezüchteten- Pflanzen wurden die zugrundegegangenen bzw„ überlebenden Pflänzlinge gezählt· Es wurde festgestellt, dass 98-100 % der auf dem Dichloraeety!-hexamethylenimin in einer Konzentration von 10 mg/1 enthaltenden lährboden Wurzel fassenden Pflanzen das Umsetzen überlebten» während 30-35 % der auf dem unbehandelt.en Kontrollnährboden Wurzel fassenden Pflanzen zugrunde gingen» · .

Das Verhalten der Gerbera-Kolbenpflanze wies auch eine bedeutende Änderung auf^ die behandelten Pflanzen waren gedrungener₉ ihre Blätter härter und entwickelter·

Wie in Beispiel 1 wurde Melkenvermehrungsstoff durch Gewebezucht hergestellt, mit dem Unterschied,, dass dem auf das Fünffache verdünnten Grundnährboden zur Anregung der Wurzelbildung statt Indolessigsäure mit einer Konzentration von O₉I mg/1 p-Chlorphenoxyessigsäure in einer Konzentration von OyI mg/1 zugesetzt wurde«,

Dann wurden die unterschiedlichen Verbindungen der allgemeinen Pormel (l) oder (II) in verschiedenen Konzentrationen (2j, 5j 10, oder 20 mg/l) dem Hährboden beigemischt und die Pflanzen bis zur Entwicklung der Wurzeln auf dem Nährboden gezüchtet·

Als die Wurzeln gross genug zum Auspflanzen waren, wurden die Pflanzen in ein Treibhaus gesetzt und gezüchtet. " _v "

Die Pflanzen passten sich unterschiedlich den ijn vivo

• ·

Bedingungen an· · 50 *

Nach der gleichmässigen und sicheren Entwicklung wurde die Zahl bzw. das Verhältnis der zugrundegegangenen und überlebenden Pflanzen untersucht und gezählt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:

Chemische Bezeichnung Anteil der -entsprechend Wurzel fassender Verbindung der den bzw. überlebenden Pflanzen in % allgemeinen Formel .(I)

oder (II) wenn die Konzentration der Verbindung

der Formel" (i) oder (II) wie folgt ist;

2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1 15

unbehandelte Kontrolle	61	61	61	61
N-Acety1-hexamethyIe n- imin	80	81	80	81
N- Chloracetyl -hexa methylenimin	76	76	76	70
N- Dichloracetyl -hexa methylenimin	100	100	100	100
N- Trichloracetyl -hexa methylenimin .	65	65	' 63	63
N- Dichloracetyl -di- isobutylamid	68	66	77	61
N- Dichloracetyl -iso- propylamid	72	71	71	71
N- Dichloracetyl -tert- butyl-amid	71	72	72	72
NjN'-bisfDichlor-ace- tyl^hexamethylendiamin	95	100	100	100
N- Dichloracetyl-hexyl- amin	94	95	98 .	100

Aus den Tabellenangaben ist gut ersichtlich, dass die statt

Indolessigsäure angewendete p-Chlorphenoxyessigsäure den Anteil

«34·

der überlebenden Heikenpflänzlinge von 46 auf 61 % erhöhte, andererseits, dass die Anwendung der Lösungen der erfindungsgemüssen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) die Lebensfähigkeit nach dem Auspflanzen weiter steigerte. 5

Weiterhin wurde beobachtet,, dass die Stiele und Blätter der mit dem erfindungsgemässen Verfahren gezüchteten Heiken stärker waren und ihre grüne Farbe einen dunkleren Ton· aufwies als bei den unbehandelten Kontrollpflanzeji. ·

Beispiel 6

Gerberavermehrungsstoff wurde durch Gewebezucht wie in Beispiel 5 hergestellt® Die Bezeichnung der angewendeten Verbindungen der allgemeinen Formel (i) oder (II), ihre angewendete Konzentration und der Prozentsatz der das Umpflanzen überlebenden Pflanzen wurden in der folgenden Tabelle zusammengefassts

Chemische ..Bezeichnung Anteil der entsprechend Wurzel fasder Verbindung der senden bzw*, überlebenden Pflanzen in %, allgemeinen Formel
(I) oder (II) ; wenn die Konzentration der Verbindung

der allgemeinen Formel (i) oder (II) ' wie folgt ists

2 mg/1 5mg/l IQ mg/1 20 mg/1

Unbehandelte Kontrolle	63	63	• 63	63
1!-Ace ty !-hexamethylen imin	83	84	83	82
H- Chloracetyl -hexame thylenimin	78	82	79	SO
H- Dichloracetyl -hexa methylenimin	100	100	100	100
H- Trichloracetyl -hexa methylenimin	70	69	68'	68
H- Dichloracetyl -diiso- butylamid	73	72	70 ν	70

BAD ORIGINAL

.73	74	73
75	75	72
100	100	100
100	100	100

Portsetzung von Seite 20:

Ei- Dichloracetyl -isopropylamid 75

IT- Dichloracetyl -tert* butylamid 75 .

IT,B"»-bis (Dichloracetyl )- -hexamethylendiamin 100

IT- Dichloracetyl-hexylamin 100

Beispiel 7 '

Das Verfahren nach Beispiel 5Wurde für stachellose Brom-

beeren verwendet. Die Messergebnisse sind in der folgenden

Tabelle zusammengefasst:

Chemische Bezeichnung Anteil der entsprechend Wurzel fas-

• der Verbindung der senden bzw. überlebenden Pflanzen in %, allgemeinen lOrmel (I) wenn die Konzentration der Verbindung oder (H) der allgemeinen Formel (i) oder (il)

wie' folgt ist:
2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1 ,

Unbehandelte Kontrolle 65 65 65 65

11-Acet.yl-hexameth.y Ie n-

imin 85 86 86 86

H- Chloracetyl -hexamethylenimin 80 82 81 80

IT- Dichloracetyl -hexamethylenimin 100 100 100 100

IT- Trichloracetyl -hexa-

methylen-imin 70 70 70 70

IT- Dichloracetyl -diiso-

butylamid 70 6C 65 65

IT- Dichloracetyl -iso
propyl-amid 75 76 75 74

78	76	75
100	100	100
100	100	100

Portsetsung von Seite 21s

IT- Dichloracetyl -tert„ butyl-amifl . 76

IT _s IT^f-bis (Dichloracetyl )- -hexamethylendiamin · χοο

3J- Dichloracetyl-hexyl-.amin 100

Beispiel 8

Wie in Beispiel-5 wurde Traubenvermehrungsstoff durch Gewebezucht hergestellt» ■ Die angewendeten Yerbindunge.n der allgemeinen Formel Cl) oder (U)₉ ihre Konzentrationen und der Prozentsatz der überlebenden Pflanzen sind der folgenden Tabelle zu entnehmen,,

Chemische Bezeichnung . Anteil der entsprechend Wurzel fassender Verbindung der den bzw«, überlebenden Pflanzen in %, allgemeinen lOrmel (l) der Formel (i) oder (II). wie folgt ist; oder (II) · . _{2 mg/l 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1}

Unbehandelte Kontrolle	62	72	62-	62	62
IT-Ac e tyl-he-xame thy le n- imin	81	100	84	'. 84	85
IT- Chloracetyl -hexa- . methylenimin	73	100	72	70	68
IT- Dichloracetyl -hexa methylenimin	100	BAD	100	100	100
IT- Trichloracetyl hexa methylenimin	65	65	63	63
IT- Dichloracetyl -diiso- butylamid	72	70	68	. 66
IT- Dichloracetyl -i sop ro py lamid 72	72	71	69
IT- Dichloracetyl -tert. butylamid	72	70	70
lT,lT'-bis(Dichloracetyl)- -hexaroe tky Ie ndiamin	100	100	100
IT- Dicliloracetyl-hexyl- amin	100	100	100
	ORfGiNiAL

Beispiel 9

. Das Verfahren nach Beispiel 5 wurde auch zur Vermehrung Von virusfreien Apfel-Pfröpflingen verwendet. Die angewendeten Verbindungen, ihre Konzentrationen und der Prozentsatz der überlebenden Pflanzen sind der folgenden Tabelle zu entnehmen. ■

Chemische Bezeichnung Anteil der entsprechend Wurzel fas-

, aer Verbindung der senden bzw, überlebenden Pflanzen in %,

allgemeinen Formel (I) wenn die Konzentration der Verbindung

oder (II) - der Formel (i) oder (II) wie folgt ist:

: ' .- 2 mg/1 5 mg/1 10 mg/l .20 mg/1

Unbehandelte Kontrolle
15

Unbehandelte Kontrolle	70	70	70	70
IT-Ace tyl-hexaraethylen- imin .	83	85	85	85
IT- ChIo race ty I -hexame thylenimin	83 .	79	79	75
U- Dich.loracet.yl -hexa methylenimin	100	100	100	100
IT- Trichloracetyl -hexa methylenimin	74	78	78	72
N- Dichloracetyl -diiso- butylamid	80	82	80	80
11- Dichloracetyl -iso- propylamid	80	81	80	79
Έ- Dichloracetyl -tert. butylamid	90	.91	90	89
NjlT'-bisiDichloracetyl )- -hexamethylendiamin	100	100	100	100
U- Dichloracetyl-hexyl- amin	100	100	100	100

Das erfindungsgemässe Verfahren kann erfolgreich zur Verbesserung des Wirkungsgrades· bei der Vermehrung von sowohl Kulturpflanzen als auch Zierpflanzen durch Gewebezucht sowie 3'5 zur Erhöhung der Überlebensfähigkeit nach dem Aussetzen der

324B&64

Pflänzchen eingesetzt werden· Ausaerdem sind die Stiel© und Blätter der behandelten Pflänzchen stärker, sind weiter entwickelt, ihre Farbe ist stärker als die der unbehandelten Pflanzen und die Wachsschicht der Blätter ' ist dicker·

Das erfindungsgemässe Verfahren besitzt auch den Vorteil, dass die mit der Lösung der Verbindungen der allgemeinen Pormel Cl) oder (II) behandelten Pflanzen nach dem Aus-IQ setzen schneller begonnen zu wachsen und insgesamt zwei Wochen früher das für den Handel notwendige Mass erreichten.

Claims

37 942 u/wa Eszakmagyaroroszägi Vegyimüvek Sajoobäbony/Ungarn VERFAHREN ZUR VERBESSERUNG DES WIRKUNGSGRADES BEI DER IN VITRO VERMEHRUNG VON KULTURPFLANZEN PATENTANSPRÜCHE s

1. Verfahren zur Verbesserung des Wirkungsgrades bei der
in vitro Vermehrung von KuIturpflanzen, dadurch gekennzeichnet! dass bei der Mikrovermehrüng und/oder dem darauffolgenden Aussetzen der flüssige
Nährboden oder die Pflanzen oder der Boden, in welchen die Pflanzen gepflanzt werden, mit der wässrigen Lösung einer Verbindung oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formel

τη OR

ji y 1

R—G—N (I),

worin R kann für ein Methyl-, Chlormethyl-, Dichlormethyl- oder Trichlormethy!radikal stehen; R, und R«

können gleich oder verschieden sein und ein Alkylradikal mit 1-10 Kohlenstoffatomen, ein Alkeny!radikal mit 2-10

f. 2 —

• * e ·

324686A

Kohlenstoffatomen, ein Cycloalkylradikal mit 3-9 Kohlenstoffatomen, Phenylradikal, oder Beηzy!radikal oder aber Wasserstoff bedeuten mit der Bedingung, dass R₁ und R₂ nicht gleichzeitig Wasserstoff sein können; oder R₁ und R₂ zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom einen 5- bis 8-gliedrigen gesättigten heterozyklischen Ring bilden, der ein, zwei oder drei gleiche oder verschiedene weitere Heteroatome, vorzugsweise Stickstoff- oder Sauerstoffatome enthalten kann, oder der allgemeinen Formel

OH HO

« I [ Κ

worin die Bedeutung von R die gleiche wie bei der allgemeinen Formel (i) und η eine ganze Zahl zwischen 1 und 8 ist, oder Gemischen beider behandelt wird oder werden·

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, dass die wässrige Lösung 1 - 100 mg/1 Wirkstoff enthält.

3· Verfahren .nach Anspruch 1 oder 2 dadurch g e k e η η zeichnet, dass bei der Vermehrung auf flüssigem Nährboden der flüssige Nährboden neben den bekannten Komponenten eine Verbindung oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) - worin die Substituenten wie oben definiert sind - oder Gemische beider in einer Konzentration von 1-20 mg/1 enthält·

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass die Wurzeln der auf flüssigem Nährboden vermehrten Pflanzen vor dem Aussetzen in der wässrigen Lösung einer Verbindung oder mehreren Verbindungen

. . 3- ■ ■ ■

der allgemeinen Formel Cl) oder (II) - worin die Substituenten wie oben definiert sind - oder Gemischen beider mit einer Konzentration von 20-70 mg/1 getränkt werden·

5, Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet 9 dass die in vitro vermehrten Pflanzen in einen Boden gepflanzt werden, der eine Verbindung oder mehrere Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II) - worin die Substituenten wie oben definiert sind - oder Gemische beider in einer Konzentration von 20-10 mg/1 enthält.

6, Verfahren nach Anspruch 1 oder 2₉ dadurch gekennzeichnet ₉ dass die jji vitro vermehrten Pflanzen nach dem Ansetzen mit der Lösung einer Verbindung oder mehrerer Verbindungen der allgemeinen Formel (i) oder (II) - worin die Substituenten wie oben definiert sind oder Gemischen beider in einer Konzentration von 1-20 mg/1 besprüht werden^