NL8204874A

NL8204874A - Werkwijze voor de verbetering van de doelmatigheid van de vegetatieve vermenigvuldiging in vitro van cultuurplanten.

Info

Publication number: NL8204874A
Application number: NL8204874A
Authority: NL
Original assignee: Eszakmagyar Vegyimuevek
Priority date: 1981-12-18
Filing date: 1982-12-17
Publication date: 1983-07-18
Also published as: JPS58165714A; AU555018B2; PH20018A; PL132926B1; US4554252A; DD208795A5; IL67506A; BR8207370A; CA1179858A; IL67506A0; DE3246864A1; FR2518531A1; BG37679A3; CS239936B2; GB2112413A; SU1417787A3; PL239589A1; BE895365A; HU187396B; AU9170882A

Description

* N/31.260-Kp/Pf/cs ~ - 1 -

Werkwijze voor de verbetering van de doelmatigheid van de vegetatieve vermenigvuldiging in vitro van cultuurplanten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de verbetering van de doelmatigheid van de vegetatieve vermenigvuldiging in vitro van cultuurplanten.

Volgens de werkwijze van de onderhavige uitvinding 5 wordt deze verbetering bereikt door behandeling met een verbinding met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R staat voor methyl-, chloormethyl, dichloormethyl of tri-chloormethyl;

Rj en R2 hetzelfde of verschillend kunnen zijn en staan voor 10 C^Q-alkyl, C2_10-alkenyl, C^^-cycloalkyl, fenyl of benzyl; of waterstof met dien verstande dat tenminste één van de symbolen Rj^ en R2 anders is dan waterstof; of Rj^ en R2 tezamen met het stikstofatoom waaraan zij zijn gebonden een 5-8-ledige verzadigde heterocyclische ring vormen, 15 welke een, twee of drie identieke of verschillende verdere heteroatomen, bij voorkeur zuurstof- of stikstofatomen kunnen bevatten, vormen; of met een verbinding met de formule 2 van het formuleblad, waarin R als in formule 1 gedefinieerd is en 20 n een geheel getal tussen 1 en 8 is.

Vegetatieve plantenvermenigvuldigingsmethoden in vitro hebben de laatste twee decennia wijdverspreide toepassing gevonden. Reeds in de Verenigde Staten zijn meer dan twintig en in West-Europa zijn talloze vermenigvuldigingslabo-25 ratoria actief, waarin tussen honderdduizend en tweehonderdui-zend planten worden geproduceerd per maand door middel van het weefselkweekproces.

Vanuit een praktisch oogpunt zijn de belangrijkste aspecten van vermenigvuldiging door weefselkweek de volgende; 30 uit de meristeem-weefseis van de scheutpunten en wortelpunten kunnen onder steriele omstandigheden planten die vrij zijn van alle soorten plantpathogenen, worden gekweekt met een snelheid die enige orden van grootte hoger is dan die van de gebruike-· lijke vermenigvuldigingsmethode, met een significant geringere 35 oppervlaktebehoefte en bijgevolg op aanzienlijk economischere wijze dan volgens de gebruikelijke vermenigvuldigingesmethoden.

8204874 + \ - 2 -

In Hongerije is de grootschalige toepassing van de vegetatieve vemenigvuldigingsmethode van planten in ontwikkeling.

Hoewel de vermenigvuldiging door weefselkweek econo-5 mischer is dan de gebruikelijke vermenigvuldigingsmethoden, kunnen de inherente voordelen ervan vanwege verschillende nadelen niet worden benut.

, Het belangrijkste nadeel van de vermenigvuldigings- methode door weefselkweek ligt in het feit dat hoewel onder 10 in vitro-omstandigheden een onbeperkte vermenigvuldiging van de planten plaatsvindt, bij uitplanting in de aarde - afhankelijk van het soort van de plantcultuur - ongeveer 20-60% van de onder steriele omstandigheden opgegroeide planten verloren gaat onder de nieuwe, minder gunstige in vivo-omstandigheden 15 (Broome, Zimermann: Hort. Science, 13, 151-153 (1978); Earle, Langhans: Hort. Science, 10, 608-610 (1975); Sutter, Langhans: J. Am. Soc. Hort. Science, 104, 494-496 (1979)).

Hoewel vele pogingen werden ondernomen de doelmatigheid van vermenigvuldiging te verhogen door verbetering van de 20 technische omstandigheden van de in vivo-cultuur (kleinere temperatuurfluctuaties, relatief hoge vochtigheidsgraad), konden de genoemde maatregelen niet het gewenste resultaat verschaffen.

Het doel van het onderhavige onderzoek, gericht op 25 het vermenigvuldigingsproces door weefselkweek, is de oorzaak te ontdekken van het slechte aanpassingsvermogen van de uit de fles genomen planten alsmede de oorzaak van de geringe mate van overleving van de planten.

Het doel van de onderhavige uitvinding is een werk-30 wijze te verschaffen, welke op significante wijze de doelmatigheid verbetert van de weefselkweekmethode alsmede verzekert dat in overgrote meerderheid de in vitro vermenigvuldigde planten levenskrachtig blijven en sterk ontwikkelen onder in vivo-omstandigheden.

35 Bij experimenten in broeikassen en in het open veld werden de samenstelling van wassen en membraanlipiden en tevens de biosynthese van de celcomponenten van uiteenlopende cultuurplanten (anjer, gerbera, druif, varen) onderzocht. Samenvattend werden bij deze experimenten significante modificaties en ver- 8204874 - 3 - * anderingen gevonden in de structuur van de bovengenoemde cel-componenten van planten die door weefselkweek waren vermenigvuldigd.

Gevonden werd dat de synthese van de wassen, die het 5 oppervlak van de bladeren van de in flessen opgegroeide planten bekleden,wordt geremd. Tevens werd gevonden dat, terwijl in het lipofiele bestanddeel van het celmembraan van volgens gebruikelijke methoden gekweekte planten sterk onverzadigde .vetzuren worden gesynthetiseerd, in het geval van door weef-10 selkweek vermenigvuldigde planten de synthese van sterk onverzadigde vetzuren wordt geremd. Als gevolg hiervan worden de celmembranen bros en kunnen deze de verschillende membraan-functies niet uitvoeren.

Volgens een serie experimenten werd de samenstelling 15 van de wascomponenten van planten, die volgens de gebruikelijke methode respectievelijk volgens de in vitro-vermenigvul-digingsmethode waren vermenigvuldigd, bepaald door middel van een isotooptechniek. De planten werden geïncubeerd in een gemerkte l-^C-acetaatoplossing met een activiteit van 10 )J.Ci/ 20 junol gedurende 4 h bij 25°C, waarop de wasachtige componenten werden gescheiden door middel van dunne-laag-chromatografie en hun onderlinge verhouding werd bepaald op basis van de specifieke activiteit.

De resultaten van de genoemde serie experimenten wor-25 den samengevat in tabel A.

Tabel A

Percentuele verdeling van de wasachtige componenten

Zuur Hydroxy- Primair Secundair Aldehyde Ester Kool- diketon alcohol alcohol water- _______stof ' '

Controle 31,13 3,32 19,44 1,44 14,33 5,40 24,84 30 In vitro 42,56 s^en 3,24 2,04 20,95 2,71 28,48

Deze vergelijkingsgegevens tonen aan dat in de wassen van in vitro vermenigvuldigde planten de verdeling van de componenten aanzienlijk afwijkt van die van de controleplanten.

De ophoping van de zuren verhoogt de permeabiliteit van het 35 oppervlak van de bladeren en de geringe hoeveelheid primaire alcoholen veroorzaakt een eender effect.

8204874 - 4 -

Beide oorzaken treden tegelijkertijd op en hebben als resultaat dat de in vitro vermenigvuldigde planten niet in staat zijn het watergehalte van de cellen vast te houden, wanneer ze in het veld worden uitgezet (in vivo).

5 In een volgend experiment werd de vetzuursamenstel- ling van de totale lipiden geïsoleerd van planten gekweekt volgens de gebruikelijke methode, alsmede van in vitro vermenigvuldigde planten bepaald. De resultaten worden vermeld in tabel B.

10 Tabel B

Naam Percentuele vetzuursamenstelling van de lipiden palmitine- palmito- stearine- olie- linol- linoleen-zuur leylzuur zuur zuur zuur zuur aantal koolstof- atomen 16 16 18 18 18 18 aantal onverzadigde bindingen 0 1 0 12 3 15 controle 14,72 0,79 0,59 5,53 30,29 48,07 in vitro 25,82 3,52 7,22 27,97 16,18 18,04

Vergelijking van de vetzuursamenstelling leert dat in de lipiden van in vitro vermenigvuldigde planten oliezuur wordt opgehoopt. Aangenomen kan worden, dat dehydrogenering 20 van oliezuur tot linoleenzuur voor bepaalde redenen wordt geremd. Vetzuren die meer dan één onverzadigde binding bevatten (bijvoorbeeld linolzuur en linoleenzuur) spelen een belangrijke rol in de flexibiliteit van de celmembranen en dus in het aanpassingsvermogen van de planten. Indien de celmembranen 25 geen onverzadigde vetzuren bevatten, wordt het aanpassingsvermogen van de planten in significante mate verlaagd.

Bovenvermelde gegevens tonen aan dat in de in vitro vermenigvuldigde planten de biosynthese van wassen die het oppervlak van de bladeren bekleden, en in het bijzonder die van 30 in het celmembraan voorkomende vetzuren wordt gehinderd en dat daardoor de zaailingen die vanuit de fles in de aarde worden geplant, niet meer in staat zijn om zelfs een geringe tempera- 8204874 * -::-5- tuurfluctuatie te weerstaan en vanwege de scheuringen van het membraan de planten zelfs onder relatief hoge vochtigheidsgraad uitdrogen, en een significant percentage van de planten verloren gaat.

5 Met deze wetenschap werden de experimenten gericht op het beïnvloeden van de samenstelling van de wasachtige componenten, de onderlinge verhouding van de vetzuren in lipiden en hun biosynthese gedurende de in vitro-vermenigvuldiging.

Een doel van de onderhavige uitvinding is een werk-10 wijze te verschaffen, waarmee het mogelijk is in significante mate na uitplanting optredende schade aan in vitro gekweekte planten te verlagen en tevens het aanpassingsvermogen van de planten te verbeteren.

Gevonden werd, dat wanneer in de loop van het bekende 15 vermenigvuldigingsproces door weefselkweek de vermenigvuldigde planten worden behandeld met een waterige oplossing van een verbinding met de formule 1 of 2 (waarin R, Rj, R2 en n de reeds vermelde betekenis hebben) of een mengsel daarvan, significant minder in vitro gekweekte planten na uitplanting 20 onder in vivo-omsi:andigheden verloren gaan, significant meer planten de uitplanting overleven en tevens de ontwikkeling van de overlevende planten sterker wordt.

De verbindingen met de formule 1 en 2 zijn bekend en kunnen worden bereid volgens de volgende literatuurbronnen: 25 Res.Disci. (1976) 143-8; J. Agric. Food. Chem., 26, (1) 137-140 (1978) en J. Agric. Food. Chem., 27, (3), 543-547 (1979).

De planten kunnen worden behandeld met de verbindingen met formule 1 of 2 volgens de volgende methoden:

De verbinding met formule 1 of 2 wordt opgelost in 30 het aan de wortels te verschaffen voedingsmedium in een concentratie van 1-20 mg/1. Ook kan men de in een wortelvormend voedingsmedium opgegroeide zaailingen onderdompelen in een waterige oplossing van een verbinding met de algemene formule 1 of 2 in een concentratie van 1-20 mg/1 voorafgaande aan uit-35 planting (d.w.z. het wortelsysteem van de planten wordt in de oplossing gedompeld). De behandeling kan ook worden uitgevoerd door de in vitro gekweekte zaailingen te planten in een aarde-mengsel dat is gedrenkt met een waterige oplossing van een verbinding met formule 1 of 2. Volgens een andere uitvoerings-40 vorm van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding worden 8204874 - 6 - de in vitro gekweekte en geplante zaailingen besproeid met een waterige oplossing van een verbinding met formule 1 of 2 in een concentratie van 5-12 mg/1 en wordt indien noodzakelijk deze besproeiingsbehandeling enige malen herhaald.

5 Verdere proeven zijn uitgevoerd ter bepaling van de veranderingen in de belangrijkste wasachtige componenten in de volgens de weefselkweekmethode vermenigvuldigde en aan behandeling met een waterige oplossing van een verbinding met formule 1 of 2 onderworpen planten in vergelijking met de onbe-10 handelde planten. Het effect van de behandeling op de vetzuur-samenstelling van het totale lipidegehalte van de planten werd ook onderzocht.

Bij deze proeven werd een voedingsmedium met de volgende samenstelling gebruikt voor de in vitro kweek van de 15 planten: (Murashige, T., Skoog, F.: Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962))

CaCl2-2H20 439,300 mg/1 Zn2S04.7H20 8,600 mg/1

CoCl2.2H20 0,025 mg/1 suiker 3-45,000 g/1

CuS04.5H20 0,025 mg/1 inositol 100,000 mg/1 20 FeNa EDTA 336,600 mg/1 nicotinezuur 10,000 mg/1 H- BO« 6,200 mg/1 thiaminehydro- 30,000 mg/1 chloride KH9PO. 170,000 mg/1 pvridoxinehvdro- 10,000 mg/1 chloride KJ 0,830 mg/1 adeninesulfaat. 0-80,000 mg/1 2H20 N03 1.900,000 mg/1 indolvlazijn- 0-10,000 mg/1 zuur 25 Mg S04-7H20 370,600 mg/1 chinetine 0-30,000 mg/1

MnS04.4H20 22,300 mg/1 agar-agar 7-10,000 g/1

NaH2P04.2H20 96,000 mg/1

Na2Mo04.2H20 0,250 mg/1 NH4N03 1.650,000 mg/1 30 Bovengenoemde componenten werden opgelost in gedestil leerd water, de pH van de oplossing werd gesteld op 5,8, agar-agar werd toegevoegd, het voedingsmedium werd opgewarmd totdat het helder werd, waarna het onder steriele omstandigheden in flessen werd afgevuld, waarvan de opening met papieren proppen 35 werd afgesloten. De flessen werden in een autoclaaf geplaatst en gesteriliseerd bij een temperatuur van 121°C.

8204874 ,- 7 - pr

In de eerste serie proeven werd het effect van di-chlooracetylhexamethyleenimine {een verbinding met formule 1) op de synthese van de belangrijkste wasachtige componenten van anjers bepaald. Planten werden gekweekt volgens de gebrui-5 kelijke methode aan de ene kant en volgens de in vitro weef-selkweekmethode aan de andere kant op voedingsmedia met bovengenoemde samenstelling en op soortgelijke waaraan 6 mg/1 di-chlooracetylhexamethyleenimine was toegevoegd voorafgaande aan sterilisatie van de voedingsmedia. In identieke groeistadia 10 van de planten werd de percentuele hoeveelheid van de twee belangrijkste wasachtige componenten bepaald volgens bovenvermelde methode. De verkregen resultaten worden opgesomd in tabel C.

Tabel C

15 Vetcomponenten, %

Kweekmethode ----

Zuren Primaire alcoholen

Gebruikelijk (controle) 32,11 20,55

In vitro 45,21 3,05

Werkwijzé volgens de onderhavige uit- 20 vinding (in vitro) 30,73 22,18

Bovenstaande experimentele gegevens tonen duidelijk aan dat als resultaat van de behandeling met dichlooracetyl-hexamethyleenimine de samenstelling van de wasachtige componenten van in vitro gekweekte anjerplanten terugkeert tot 25 het niveau dat werd bepaald in planten die volgens de gebruikelijke methoden waren gekweekt.

In de volgende serie proeven werd het effect van uiteenlopende concentraties aan dichlooracetylhexamethyleenimine op de vetzuursamenstelling van het totale lipidegehalte van in 30 vitro gekweekte anjerplanten bepaald. Anjerzaailingen werden in vitro gekweekt in voedingsmedia met de reeds vermelde samenstelling (250 ml telkens), welke bovendien uiteenlopende hoeveelheden dichlooracetylhexamethvleenimine bevatten. De vetzuursamenstelling van het totale lipidegehalte werd in hetzelf-35 de groeistadium van de planten volgens de reeds vermelde me- 8204874 - 8 - thoden bepaald.

De resultaten worden opgesomd in tabel D.

_Tabel D_

Behande- lingscon- Vetzuur, % centratie - 5 (mg/1) Palmitine- Palmito- Stearine- Olie- Linol- Lino- zuur ley1zuur zuur zuur zuur leenzuur 0,00 25,82 3,89 7,11 27,97 17,18 18,04 15.60 25,16 - 3,09 18,94 32,85· 23,96 30,80 23,08 - 4,37 18,53 25,18 28,85 61.60 24,61 - 2,50 16,68 32,85 23,26 10 154,00 21,13 - 3,38 19,15 29,20 27,04 308,00 26,57 - 4,00 25,71 25,29 18,43

Uit deze gegevens blijkt duidelijk dat de met verschillende concentraties aan dichlooracetylhexamethyleenimine uitgevoerde behandeling de vetzuursamenstelling naar de onver-15 zadigde vetzuren verschoof.

Nadere details van de onderhavige uitvinding kunnen worden gevonden in de volgende voorbeelden, waarbij evenwel de beschermingsomvang niet tot deze voorbeelden is beperkt.

Voorbeeld I

20 Bereiding van vermenigvuldigingsmateriaal uit anjers door weefselkweek.

Meristeemweefsels van anjerstekken die waren gekweekt volgens gebruikelijke methoden in broeikassen werden onder steriele omstandigheden geïsoleerd en vermenigvuldigd in het 25 reeds vermelde voedingsmedium volgens Murashige-Skoog. Direct begonnen de anjermeristemen te groeien en later zich te vermenigvuldigen door tweedeling. Uit iedere scheutpunt ontwikkelden zich 10-15 uitlopers binnen zes weken na plaatsing in het voedingsmedium. Na te zijn afgescheiden waren deze uit-30 lopers geschikt voor verdere vermenigvuldiging in een nieuw vers voedingsmedium. De vermenigvuldigingssnelheid van de uitlopers bedroeg 10-15 uitlopers per maand.

Toen de vermenigvuldigingsfase van de anjeruitlopers 8204874 - 9 - W ' ' ” ' was voltooid, vond de inductie van wortelvorming plaats in een gescheiden voedingsmedium, voor welk doel een vijfvoudig verdund basisvoedingsmedium werd gebruikt, waaraan 0,1 mg/1 indo-lvlazijnzuur was toegevoegd.

5 Oit het voedingsmedium werd een concentratiereeks be paald door toevoeging van verschillende hoeveelheden dichloor-acetylhexamethyleenimine; het kweken werd uitgevoerd op de zo verkregen voedingsmedia.

Toen de wortelvorming het gewenste niveau had bereikt, 10 werden de anjerzaailingen geplaatst in een broeikas en onder in vivo-omstandigheden gekweekt.

De uitgeplante zaailingen pasten zichzelf in uiteenlopende mate aan de omstandigheden van in vivo kweken aan.

Enige vertoonden een goede aanpassing, overleefden de uitplan-15 ting en ontwikkelden zich goed.

In de loop van de in vivo kweek werden de afgestorven en overlevende planten die op verschillende voedingsmedia waren opgekweekt, geteld en het percentage wordt vermeld in tabel E.

20 _;_Tabel E__ .

Dichlooracetylhexamethyleen- Overleving, % iminegehalte van het voedingsmedium (mg/1) 1 45 2 48 4 64 25 6 96 8 87 10 75 12 70 14 50 30_________.20 . _______________________43_________________ 0 (controle) 46

De bovenvermelde gegevens tonen aan, dat bij toevoeging van 6 mg/ml dichlooracetylhexamethyleenimine aan het voedingsmedium het overlevingspercentage in de broeikas van anjer-35 zaailingen kon worden verhoogd tot 96%, dat wil zeggen de doelmatigheid van de vermenigvuldigingsmethode met meer dan 100% 8204874 - 10 - (dat wil zeggen tot- het dubbele) kon worden verhoogd, hetgeen in significante mate de economische voorwaarden van de werkwijze verbetert.

Waargenomen kon worden, dat de volgens de werkwijze 5 volgens de onderhavige uitvinding gekweekte zaailingen een dieper groene toonzetting vertoonden, sterkere stengels en bladeren dan de controlezaailingen hadden en met een dikkere wasachtige laag op het oppervlak van de bladeren bedekt waren.

Voorbeeld II

10 Anjervermenigvuldigingsmateriaal werd bereid op een wijze analoog aan die van het voorgaande voorbeeld. De meri-steemweefsels werden vermenigvuldigd op het reeds vermelde voedingsmedium volgens Murashiga-Skoog. Ter inductie van de wortelvorming werden de planten uitgeplant in een vijfvoudig 15 verdund voedingsmedium bevattende 0,1 mg/1 indolylazijnzuur.

De in vitro gekweekte zaailingen werden uitgeplant in een broeikas in een aardemengsel dat was gedrenkt met een oplossing van dichlooracetylhexamethyleenimine: 5 g dichlooracetyl-hexamethyleenimine werd opgelost in 500 ml 70% ethanol en de 20 oplossing werd vermengd met 20 1 water. De zo verkregen oplos- 3 sing (20 1) werd toegevoegd aan 1 m aardemengsel, dat tevoren verscheidene malen was gekeerd. De in vitro gekweekte planten ♦ werden enerzijds in de zo behandelde aarde uitgeplant en anderzijds in onbehandelde aarde en de in vivo-groei in een 25 broeikas werd waargenomen.

Gevonden werd, dat terwijl in onbehandelde aarde 58% van de zaailingen verloren ging (dat wil zeggen slechts 42% de overplanting overleefde), in de met dichlooracetylhexamethyleen-imine behandelde aarde slechts 8% van de zaailingen afstierf 30 (dat wil zeggen het overlevingspercentage 92% bedroeg) en deze planten ontwikkelden in sterke mate.

Voorbeeld III

Anjervermenigvuldigingsmateriaal werd verkregen op een wijze analoog aan die van voorbeeld II en nadat het wortel-35 systeem was ontwikkeld, werden de zaailingen uitgeplant in onbehandelde aarde in een broeikas voor in vivo-kweek.

De helft van de uitgeplante zaailingen werd behandeld met een sproeivloeistof, welke dichlooracetylhexamethyleenimine 8204874 nil* - 11 - bevatte, direct na uitplanting en nog eens driemaal met intervallen van 3-4 d.

De sproeivloeistof bevatte 10 mg dichlooracetylhexa-methyleenimine, 0,1 ml Tween 80-emulgeermiddel en 0,05 M TRIS-5 HCl-buffer per liter; de pH bedroeg 6,5. De sproeivloeistof werd bereid door het dichlooracetylhexamethyleenimine op te lossen in enige druppels 70% ethanol, de oplossing toe te voegen aan het mengsel van water en de buffer en tenslotte het emulgeermiddel toe te voegen.

10 Gevonden werd, dat terwijl 88% van de behandelde zaailingen de overplanting overleefden, in de onbehandelde groep het overlevingspercentage slechts 42% bedroeg.

Voorbeeld IV

Bereiding van vermenigvuldigingsmateriaal uit gerbera 15 door weefselkweek.

Gerberaplanten werden in vitro vermenigvuldigd volgens de bekende vermenigvuldings- en wortelingsmethode volgens Murashiga e.a. (J. Hort. Sci. 9, 175-180 (1974)). Gedeeltelijk werd aan het wortelvormende voedingsmedium dichloorace-20 tylhexamethyleenimine toegevoegd in een concentratie van 10 mg/1 en de helft van de zaailingen werd gekweekt op dit voedingsmedium.

De in vitro gekweekte zaailingen werden geplant in een broeikas en verder gekweekt onder in vivo-omstandigheden.

25 De afgestorven en overlevende zaailingen werden geteld.

Gevonden werd, dat bij planten, waarvan de wortels gedrenkt we.rden met een voedingsmedium bevattende 10 mg/1 di-chlooracetylhexamethyleenimine, het overlevingspercentage 98-100% bedroeg, terwijl dat van de onbehandelde controleplanten 30 slechts 65-70% was.

De habitus van de in de fles gekweekte gerberaplant was in significante mate veranderd, omdat de planten sterker gedrongen werden, en hun bladeren harder en sterker ontwikkelden in het geval van behandelde planten.

35 Voorbeeld V

Anjervermenigvuldigingsmateriaal werd bereid door weefselkweek op een wijze analoog aan die van voorbeeld I, met dien verstande dat voor de inductie van de wortelvorming 8204874 - 12 - aan het vijfvoudig verdunde basisvoedingsmedium in plaats van 0/1 mg/1 indolylazijnzuur 0,1 mg/1 p-chloorfenoxyazijnzuur werd toegevoegd.

Daarna werden uiteenlopende concentraties van verbin-5 dingen met formule 1 of 2 (2,5; 5; 10 en 20 mg/1) toegevoegd aan het voedingsmedium en werden de planten op het voedings-medium gekweekt totdat het wortelsysteem zich had ontwikkeld.

Zodra het wortelsysteem een afmeting had bereikt die geschikt is voor uitplanting, werden de zaailingen in de 10 broeikas uitgezet en daar gekweekt.

De zaailingen pasten zichzelf aan de in vivo-omstan-digheden op verschillende wijze aan.

Na een gelijkmatige en veilige ontwikkeling werd het aantal afgestorven en overlevende zaailingen geteld en werd 15 hun verhouding bepaald.

De resultaten worden opgesomd in tabel F.

Tabel F

Percentuele verhouding van de gewor-Verbinding volgens telde en overlevende zaailingen formule 1 of 2 terwijl de concentratie van de ver binding met formule 1 of 2 respectievelijk bedroeg: 2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1 20 Onbehandelde controle 61 61 61 61 N-acetylhexamethyleen- imine 80 81 80 81 N-(chlooracetyl)hexa- methyleenimine 76 76 76 70 N-(dichlooracetyl)- hexamethyleenimine 100 100 100 100 N-(trichlooracetyl)- hexamethyleenimine 65 65 63 63 N-(dichlooracetyl)- 25 diisobutylamine 68 66 77 61 N-(dichlooracetyl)- isopropylamine 72 71 71 71 N-(dichlooracetyl)- tertbutylamine 71 72 72 72 N/N1-bis-(dichlooracetyl)- hexamethyleendiamine 95 100 100 95 N-(dichlooracetyl)- hexylamine 94 95 98 100 8204874 -13 -

Deze gegevens bewijzen enerzijds dat, als gevolg van vervanging van indolylazijnzuur door p-chloorfenoxyazijnzuur het overlevingspercentage van anjerzaailingen wordt verhoogd van 46% tot 61%, terwijl anderzijds het gebruik van verbin-5 dingen met de formule 1 of 2 verder de levenskrachtigheid na overplanting verbeterde.

Tevens werd gevonden, dat de stengels en bladeren van de anjerzaailingen, die volgens de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding waren gekweekt, sterker waren en een 10 dieper groene kleur hadden dan die van de onbehandelde controleplanten.

Voorbeeld VI

Vermenigvuldigingsmateriaal uit gerbera werd bereid door weefselkweek volgens voorbeeld V. De chemische naam van 15 de gebruikte verbinding met formule 1 of 2, de toegepaste concentratie en het overlevingspercentage worden opgesomd in tabel G.

Tabel G_

Percentuele verhouding van de gewor-Verbinding volgens telde en overlevende zaailingen formule 1 of 2 terwijl de concentratie van de ver binding met formule 1 of 2 respectievelijk bedroeg: 20 2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1

Onbehandelde controle 63 63 63 63 N-acetylhexamethyleen- imine 83 84 83 82 N-(chlooracetyl)-hexa- methyleenimine 78 82 79 80 N-(dichlooracetyl)- hexamethyleenimine 100 100 100 100 N-(trichlooracetyl)- 25 hexamethyleenimine 70 69 68 68 N-(dichlooracetyl)- diisobutylamine 73 72 70 70 N-(dichlooracetyl)- isopropylamine 75 73 74 73 N-(d ichlooracety1)- tertbutylamine 75 75 75 72 N,N'-bis-(dichlooracetyl)- hexamethyleendiamine 100 100 100 100 N-(dichlooracetyl)- 30 hexylamine 100 100 100 100 8204874 - 14 -

Voorbeeld VII

De in voorbeeld V beschreven werkwijze werd toegepast voor de doornloze braam. De resultaten worden weergegeven in tabel H.

5 _Tabel H_

Percentuele verhouding van de gewor-Verbinding volgens telde en overlevende zaailingen formule 1 of 2 terwijl de concentratie van de ver binding met formule 1 of 2 respectievelijk bedroeg 2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1

Onbehandelde controle 65 65 65 65 N-acetylhexamethyleen- imine 85 86 86 86 N-(chlooracetyl)- 10 hexamethyleenimine 80 82 81 80 N-(dichlooracetyl)- hexamethyleenimine 100 100 100 100 N-(trichlooracetyl)- hexamethyleenimine 70 70 70 70 N-(dichlooracetyl)- diisobutylamine 70 68 65 65 N-(dichlooracetyl)- isopropylamine 75 76 75 74 N-(dichlooracetyl)- 15 tertbutylamine 75 75 75 72 N,N'-bis-(dichlooracetyl)- hexamethyleenamine 100 100 100 100 N-(dichlooracetyl)- hexylamine 100 100 100 100

Voorbeeld VIII

Vermenigvuldigingsmateriaal uit de druif werd bereid 20 met de weefselkweekmethode volgens voorbeeld V. De chemische naam van de verbinding met formule 1 of 2, de toegepaste concentratie en het overlevingspercentage worden vermeld in de volgende tabel I.

8204874 - 15 - ______Tabel I_

Percentuele verhouding van de gewor-Verbinding volgens telde en overlevende zaailingen formule 1 of 2 terwijl de concentratie van de ver binding met formule 1 of 2 respectievelijk bedroeg: 2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1

Onbehandelde controle 62 62 62 62 N-acetylhexamethyleen- 5 imine 81 84 84 85 N-(chlooracetyl)hexamethyleenimine 73 72 70 68 N-(dichlooracetyl)- hexamethyleenimine 100 100 100 100 N-(trichlooracetyl)- hexamethyleenimine 65 65 63 63 N-(dichlooracetyl)- diisobutylamine 72 70 68 66 N- (dichloor-acetyl)- 10 isopropylamine 72 72 71 69 N-(dichlooracetyl)- tertbutylamine 72 72 70 70 N,N'-bis-(dichlooracetyl)- hexamethyleenamine 100 100 100 100 N-(dichlooracetyl)- hexylamine 100 100 100 100

Voorbeeld IX

15 De werkwijze volgens voorbeeld V werd gebruikt voor de vermenigvuldiging van een virusvrij gemaakt appelras. De chemische naam van de verbindingen met formule 1 of 2, de toegepaste concentratie en het overlevingspercentage worden weergegeven in tabel J.

20 _|_ Tabel J ___

Onbehandelde controle 70 70 70 70 N-acetylhexamethyleen- 25 imine 83 85 85 85 N-(chlooracetyl)hexamethyleenimine 83 79· 79 75 8204874 - 16 - _Tabel J (vervolg)___

Percentuele verhouding van de gewor-Verbinding volgens telde en overlevende zaailingen formule 1 of 2 terwijl de concentratie van de ver binding met formule 1 of 2 respectievelijk bedroeg: 2 mg/1 5 mg/1 10 mg/1 20 mg/1 N-(dichlooracetyl)- hexamethyleenimine 100 100 100 100 N-(trichlooracetyl)- 5 hexamethyleenimine 74 78 78 72 N-(dichlooracetyl)- diisobutylamine 80 82 80 80 N-(dichlooracetyl)- isopropylamine 80 81 80 79 N-(dichlooracetyl)- tertbutylamine 90 91 90 89 N,N'-bis-(dichlooracetyl)- hexamethyl eenamine 100 100 100 100 N-(dichlooracetyl)- 10 hexylamine 100 100 100 100

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kan doelmatig worden gebruikt voor de verbetering van de doelmatigheid van de vegetatieve vermenigvuldiging van cultuur- en sierplanten en ook voor de verhoging van het overlevingspercentage 15 van de zaailingen na overplanting. Een verder voordeel van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding ligt in het feit, dat de stengels en bladeren van de zo vermenigvuldigde planten sterker en beter ontwikkeld zijn, hun kleur een donkerder toonzetting heeft en de waslaag op de bladeren dikker is dan 20 bij volgens gebruikelijke methoden vermenigvuldigde planten.

Een volgend voordeel van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding is het feit, dat de met een oplossing van een verbinding met formule 1 of 2 behandelde zaailingen sneller beginnen te groeien en het gewenste formaat vroeger berei-25 ken dan bij gebruikelijke vermenigvuldiging.

8204874

Claims

1. Werkwijze voor de verbetering van de doelmatigheid van in vitro vegetatieve vermenigvuldiging van cultuurplanten, met het kenmerk, dat de planten gedurende micro-vermenigvuldiging en/of daaropvolgende uitplanting met een 5 waterige oplossing bevattende 1-100 mg/1 van een of meer verbindingen) met de formule 1 van het formuleblad, waarin R staat voor methyl, chloormethyl, dichloormethyl of tri-chloormethyl; en R2 hetzelfde of verschillend kunnen zijn en staan voor

10 VlO-*1**1' C2-10_alken^1, C3.9-oycloaXkyl, fenyl of ben- zvl; of waterstof met dien verstande dat tenminste een van de symbolen R^ of R2 anders dan waterstof is; of Rj^ en R2 tezamen met het stikstofatoom waaraan zij zijn gebonden een 5-8-ledig verzadigde heterocyclische ring, die een, twee of 15 drie al dan niet verschillende heteroatomen, bij voorkeur zuurstof- of stikstofatomen, kan bevatten, vormen; of van een of meer verbinding(en) met formule 2 van het formuleblad, waarin R als boven gedefinieerd is en 20 n een geheel getal tussen 1 en 8 is, worden behandeld.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 voor de vermenigvuldiging op vloeibare voedingsmedia, met het kenmerk, dat een vloeibaar voedingsmedium wordt gebruikt, dat naast de 25 gebruikelijke componenten 1-20 mg/1 van een of meer verbinding (en) met formule 1 of 2 bevat.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken- m e r k, dat het wortelsysteem van op vloeibare voedingsmedia vermenigvuldigde planten voorafgaande aan uitplanting in een 30 oplossing bevattende 20-70 mg/1 van een of meer verbinding(en) met formule 1 of 2 wordt gedrenkt.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat de in vitro vermenigvuldigde zaailingen worden uitgeplant in aarde welke 2-10 mg/1 van een of meer verbin- 35 ding(en) met formule 1 of 2 bevat.

5. Werkwijze volgens conclusie 1., met het ken merk, dat de in vitro vermenigvuldigde zaailingen na uitplanting worden besproeid met een oplossing bevattende 1-20 mg/ 1 van een of meer verbinding(en) met formule 1 of 2. 8204874