Przedmiotem wynalazku sa srodki do stosowania w procesie namnazania roslin uprawnych w hodo¬ wli tkankowej in vitro.Metoda namnazania roslin w hodowli tkankowej in vifro szeroko rozpowszechnila sie w ostatnim 5 dwudziestoleciu. W Stanach Zjednoczonych fun¬ kcjonuje ponad 20 laboratoriów, w których otrzy¬ muje sie droga hodowli tkankowej od stu do dwus¬ tu tysiecy roslin miesiecznie, zas liczba takich laboratoriów w zachodniej Europie stale sie zwiek- 10 sza. Takze na Wegrzech metoda namnazania roslin w hodowlach tkankowych na wielka skale jest w trakcie intensywnego rozwoju.W praktyce zasada namnazania w hodowli tkan¬ kowej polega na tym, ze z tkanek stanowiacych 15 merysfeme, pobranych jalowo z konców pedów lub korzeni, mozna namnazac rosliny wolne od wszel¬ kich patogenów roslinnych z szybkoscia o kilka rzedów wielkosci wyzsza od osiaganej zwykla me¬ toda, na znacznie mniejszej powierzchni, a w rezul- 20 tacie w sposób znacznie bardziej ekonomiczny niz przy zwyklych metodach namnazania.Chociaz metoda namnazania roslin w hodowli tkankowej jest bardziej ekonomiczna niz zwykle metody namnazania, nie mozna osiagnac w pelni 25 zwiazanych z nia korzysci z powodu róznych jej wad.Glówna niekorzystna cecha metody namnazania roslin w hodowli tkankowej polega na tym, ze w warunkach in vitro namnazanie sie roslin zacho- 30 dzi bez ograniczen, natomiast po zasadzeniu w gle¬ bie, zaleznie od typu hodowli roslin, 210 do 60% roslin, które rozwijaly sie w warunkach jalowych, ulega uszkodzeniu w nowych, mniej sprzyjajacych warunkach in vivo [Broome, Zimermann: Hort.Science, 13; 151—153 (1978); Earle, Langhana: Hirt, Science, 10, 608^610 (1075); Sutfer, Langhans: J.Am. Soc. Hort. Science, 104, 49(4^496 (1979)].Chociaz czyniono szereg wysilków w celu polep¬ szenia wydajnosci namnazania przez ulepszenie technicznych warunków hodowli in vivo (mniejsze wahania temperatury, wzglednie wysoka wilgot¬ nosc), wspomniane srodki zaradcze nie daly poza¬ danych wyników.Celem badan dotyczacych namnazania w hodowli tkankowej, jest wykrycie przyczyny zlej adaptyw- nosci roslin pobranych z naczyn szklanych i nis¬ kiego stopnia przezycia roslin.W eksperymentach w szklarni i polowych badano sklad wosków i lipidów blony komórkowej, jak równiez biosynteze skladników komórki róznych roslin uprawnych (gozdzik, gerbera, winorosl, pa¬ proc). W efekcie tych eksperymentów stwierdzono znaczne modyfikacje i zmiany w strukturze wspom¬ nianych wyzej skladników komórkowych w rosli¬ nach naninazanych w hodowli tkankowej.Stwierdzono, ze zahamowaniu ulega synteza wos¬ ków pokrywajacych powierzchnie lisci roslin, które rozwijaly sie w kolbach. Stwierdzono równiez, ze wsród lipofilowych komponenfów blony komórko- 132 926132 926 Tablica 1 Kontrola Procentowy rozklad komponentów woskowych Kwas 31,13 42,56 Hydroksy- dwuketony 3,3B ilosci sladowe Alkohol pierwszo- rzedowy 19,44 3,24 Alkohol drugo- rzedowy 1,53 2,04 Aldehyd 14,38' 20,95 Ester 5,40 12,71 Weglo¬ wodór 24,84 28,46 Tablica 2 Liczba atomów wegla Liczba wiazan nienasy¬ conych Kontrola In vitro Procentowy sklad kwasów tluszczowych w lipidach Kwas palmitynowy 16 a , 14,72 35,8fl Kwas oleipalmi- tynowy 10 1- 0,79 3,52 Kwas stearynowy 18 0 0,59 7,11 Kwas oleinowy 18 1 5,53. 2,7,9)7 l Kwas linolowy 18 2 30^ 1)7,18 Kwas lindenowy 18 3 48,07 | 18,04 wej roslin hodowanych zwyklymi metodami synte¬ tyzowane sa wielonienasycone kwasy tluszczowe, podczas gdy w przypadku roslin namnazanych w hodowli tkankowej synteza wielonienasyconych kwasów tluszczowych jest zahamowana. W wyniku tego blona komórkowa staje sie krucha i nie moze spelniac róznych swoich funkcji.W seriach eksperymentów okreslono sklad wos¬ kowych komponentów roslin namnazanych, odpo¬ wiednio zwyklymi metodami i sposobem in vitro, za pomoca techniki izotopowej. Rosliny inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 25°C w roztworze znakowanego l-14C-octanu o aktywnosci 10 ^Ci fimol. a nastepnie oddzielano komponenty woskowe za po¬ moca chromatografii cienkowarstwowej i stosunki ilosciowe okreslano na podstawie aktywnosci wlas¬ ciwej.Wyniki powyzszej serii eksperymentów podano w tablicy 1.Powyzsze dane porównawcze wskazuja, ze w wos¬ kach roslin namnazanych in vitro rozdzial kompo¬ nentów rózni sie znacznie od wystepujacego w ros¬ linach kontrolnych. Akumulacja kwasów wzmaga przepuszczalnosc powierzchni lisci, a zmniejszona ilosc alkoholi pierwszorzedowych powoduje podob¬ ny efekt.Powyzsze dwie przyczyny wystepuja jednoczesnie i powoduja w rezultacie to, ze rosliny namnazane in vitro niezdolne sa do utrzymywania zawartej w komórce wody, gdy zostana umieszczone w wa¬ runkach polowych (in vivo).W dalszych eksperymentach badano sklad kwa¬ sów tluszczowych w calosci lipidów wyodrebnio¬ nych z roslin namnazanych zwyklymi metodami, (jak równiez z roslin namnazanych in vitro. Wyniki zamieszczono w tablicy 2.Porównanie skladu kwasów tluszczowych wska¬ zuje, ze w lipidach roslin namnazanych in vitro 35 40 45 50 55 60 65 akumuluje sie kwas oleinowy. Mozna przypuszczac, ze przeprowadzenie kwasu oleinowego w linoleno- wy przez dalsze nienasycenie jest z róznych przy¬ czyn zahamowane. Kwasy tluszczowe zawierajace wiecej niz jedno podwójne wiazanie, takie jak kwas linolowy i linolenowy, graja wazna role w nadawaniu blonie komórkowej elastycznosci, a przez to w adaptywnosci roslin. Jezeli blony komórkowe nie zawieraja nienasyconych kwasów tluszczowych adaptywnosc roslin obniza sie w znacznym stopniu.Powyzsze dane wskazuja, ze biosynteza wosków pokrywajacych powierzchnie lisci, a szczególnie biosynteza kwasów tluszczowych znajdujacych sie w blonie komórkowej, ulega w roslinach namnaza¬ nych in vitro zaburzeniom i w wyniku tego sadzon¬ ki przeniesione z kolby do gleby nie sa zdolne do utrzymania sie nawet przy niewielkich wahaniach temperatury i z powodu uszkodzen blony komórko¬ wej wysychaja nawet przy wzglednie wysokiej wlgofnosci. Tak wiec rosliny gina w znacznym pro¬ cencie.Bedac w posiadaniu powyzszych wiadomosci ukierunkowane eksperymenty tak, aby uzyskac wplyw na kompozycje komponentów woskowych, stosunek wzajemny kwasów tluszczowych w lipi¬ dach i ich biosynteze w czasie namnazania in vitro.W rezultacie stwierdzono, ze wydajnosc namna¬ zania roslin uprawnych w hodowli tJkankowej in vitro mozna znacznie polepszyc, zapewniajac rów¬ noczesnie zachowanie zywotnosci i bujnego rozwoju in vivo roslin namnozonych in vitro, dzieki zasto¬ sowaniu srodka wedlug wynalazku zawierajacego substancje czynna oraz nosnik i/lub rozcienczalnik.Cecha srodka wedlug wynalazku jest to, ze jako substancje czynna zawiera zwiazek o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza grupe metylowa, chlorometylowa, dwuchlorometylowa lub trójchlo- romelfylowa, Ri i R* sa jednakowe lub rózne i ozna-132 926 czaja grupe CrCs-alkilowa, grupe C^-Ce-alkenylowa, grupe Ct-C6-cykloalkilowa, grupe fenylowa, grupe benzylowa lub atom wodoru, przy czym gdy jeden z podstawników Ri i Ra oznacza atom wodoru, to wówczas drugi z tych podstawników ma wyzej po- 5 dane znaczenie z wyjatkiem atomu wodoru, wzgled¬ nie Ri i R« tworza wspólnie z atomem azotu, do którego sa przylaczone, grupe szesciometylenoimi- nowa, wzglednie gdy jeden z podstawników Ri i R2 oznacza atom wodoru, to wówczas drugi z tych 10 podstawników moze oznaczac grupe o ogólnym wzorze 2, w którym n oznacza liczbe calkowi¬ ta 1—8.Srodek wedlug wynalazku umozliwia realizacje sposobu zwiekszania wydajnosci namnazania roslin 15 uprawnych w hodowli tkankowej in vitro, polega¬ jacego na tym, ze na rosliny dziala sie podczas mi- kronamnazania i/lub podczas prowadzonej nastepnie hodowli wodnym roztworem zawierajacym w 1 lit¬ rze 1—100 mg zwiazku o wzorze1. 20 Zwiazki o wzorze 1 sa znane, wzglednie mozna je otrzymac sposobami opisanymi w podanym po¬ nizej pismiennictwie: Rez. Discl. (1976) 143—8; J.Agric. Food. Chem., 26, (1), 137—140 (1978) i J. Agric.Food. Chem., 27, (3), 543—547 (1979). Dotychczasowe 25 zastosowanie tych zwiazków bylo jednak zupelnie inne niz jako substancja czynna srodka do stosowa¬ nia w procesie namnazania roslin uprawnych w ho¬ dowli tkankowej in vitro. Mianowicie, zwiazki te byly znane jako odtrutki pestycydowe (opisane w J: 30 Agzic. Food. Chem. Jak wyzej), substancje chwas¬ tobójcze (wegierski opis patentowy nr 182729) i re¬ gulatory wzrostu roslin (wegierski opis patentowy nr 182177). Tak wiec skutecznosc tych zwiazków jako substancji czynnej srodka wedlug, wynalazku 35 byla calkowicie nieoczekiwana.Srodek wedlug wynalazku przyczynia sie do znacznego obnizenia uszkodzen roslin hodowanych in vitro.po ich zasadzeniu, jak równiez polepszenia adaptywnosciroslin. 40 Stwierdzono, ze jesli w czasie namnazania roslin w hodowli komórkowej w znany sposób, namnazane rosliny potraktuje sie wodnym roztworem zwiazku o wzorze 1, w którym R, R1 i R* maja wyzej podane znaczenie, to wówczas, znacznie mniej roslin hodo- 45 wanych in vitro ginie w warunkach in vivo po po¬ sadzeniu, znacznie wiecej roslin przezywa posadze¬ nie, a równiez rozwój przezywajacych roslin jest bujniejszy.Postacie srodka stosowane do zabiegów na rosli- 50 nach to np. podloze wzrostowe, roztwór odzywczy lub ciecz opryskowa.W celu sporzadzenia podloza wzrostowego zwia¬ zek o wzorze 1 rozpuszcza sie w tak zwanym pod¬ stawowym podlozu odzywczym (przykladowy sklad 55 podloza odzywczego podano w przykladzie I) do stezenia np. 1—50 mg/litr, po czym podloze odzyw¬ cze stosuje sie na korzenie roslin.Wodny roztwór odzywczy zawiera zwiazek o wzo¬ rze 1 w stezaniu np. 1—20 mg/ml. W roztworze tym M mozna przed posadzeniem zanurzac sadzonki, które rozwijaly sie w podlozu pobudzajacym tworzenie sie korzeni (to znaczy zanurza sie w roztworze uklad korzeniowy roslin). Traktowanie mozna takze przeprowadzic przez zasadzenie sadzonek hodowa- "5 nych in vitro w mieszaninie glebowej zwilzonej wodnym roztworem zwiazku o wzorze 1.Ciecz opryskowa, zawierajaca 5—15 mg/litr zwiaz¬ ku o wzorze 1,, stosuje sie na zasadzone sadzonki wyhodowane in vitro i jesli jest to niezbedne, oprys¬ kiwanie powtarza sie kilka razy.Przeprowadzono szereg badan w celu okreslenia zmian zachodzacych w glównych komponentach woskowych pod wplywem traktowania srodkiem wedlug wynalazku roslin namnozonych w hodowli komórkowej w (porównaniu z roslinami nie potrak¬ towanymi w ten sposób. Badano równiez wplyw potraktowania na sklad kwasów tluszczowych w calosci lipidów roslin.P*rzy prowadzeniu tych badan stosowano do ho¬ dowli roslin in vitro odzywcze podloze podstawowe o nastepujacym skladzie (T. Murashige, F. Skoog: Fhysiol. Plant., 15*473—497 <1£62)).CaCl2X2H|0 439,300 mg/litr CoCljX2H«0 0,025 mg/lifr CuS04X5H20 0,0(26 mg/ltfr FeNaEDTA 336,600 mg/litr HsBOs 6,200 mg/litr KHjP04 170,000 mg/litr KJ 0,830 mg/litr KNO3 1900,000 mg/litr MgS04X7 HaO 3170,000 mg/litr MnS04X4 HiO 22,300 mg/litr NaH,P04X2H20 96,000 mg/litr NaiMo04X2HfO 0,250 mg/litr NH4N03 1650,000 mg/litr ZnS04X7HjO 8,600 mg/litr cukier 3—46,000 gAitr inozyt 100,000 mg/lifr kwas nikotynowy 10,000 mg/litr chlorowodorek tiaminy 30,060 mg/litr chlorowodorek pirydoksyiny 10,000 mg/litr siarczan adeninyX<2HtO 0—80,000 mg/litr kwas indolilooctowy 0—10,000 mg/litr chinetyna 0—30,000 mg/litr agar 7—10,000 g/litr Powyzsze skladniki rozpuszcza sie w wodzie des¬ tylowanej, pH roztworu doprowadza sie do wartosci 5,8, dodaje agar, ogrzewa podloze odzywcze do chwali gdy stanie sie klarowne, a nastepnie napel¬ nia sie nim w warunkach jalowych kolby, których szyjke zamyka sie papierowym przykryciem. Kolby umieszcza sie w autoklawie i wyjalawia w tempe¬ raturze 121°C.Próba A. W pierwszej serii badan okresla sie wplyw jednego ze zwiazków o wzorze 1* *< i«^t dwuchloroacetyloszesciometylenoiminy na synteze glównych komponentów woskowych gozdzika. Ros¬ liny hoduje sie zwyklymi metodami oraz in vitro w hodowli komórkowej, w podlozu odzywczym o powyzszym skladzie i takim, do którego dodano przed jego wyjalowieniem dwuchloroacetyloszescio- metylenoimine do stezenia 6 mg/litr. Procentowa zawartosc dwóch najwazniejszych komponentów woskowych okresla sie w roslinach w tym samym stadium rozwoju melfoda opisana powyzej.Otrzymane wyniki podsumowano w tablicy 3L Powyzsze dane eksperymentalne jasno wykazuja, ze w wyniku potraktowania dwuchloroacetylofizes- ciometylenoimina, sklad komponentów woskowych7 132 926 8 Tablica 3 Metoda hodowli Zwykla (kontrola) In vitro 1 Sposób wedlug wynalazku in vitro Komponenty woskowe, % Kwasy 32,11 45,2)1 30,73 Alkohole pierwszo- rzedowe 20,55 3,05 | 22,18 roslin (gozdzik) hodowanych in vitro zbliza sie do poziomu oznaczonego w przypadku roslin hodowa¬ nych zwyklymi metodami.Próba B, W nastepnej serii eksperymentów ozna¬ cza sie wplyw róznych stezen dwuchloroacetyloszes- ciometylenoiminy na sklad kwasów tluszczowych w calosci lipidów w hodowanym in vifro roslinach (gozdzik). Sadzonki gozdzika hoduje sie in vltro w podlozu o skladzie ujawnionym powyzej (kazdo¬ razowo 250 ml) oraz w podlozach zawierajacych rózne ilosci dwuchloroacetyloszesciometylenoiminy.Sklad kwasów tluszczowych w calosci lipidów okresla sie w roslinach w tym samym stadium rozwoju metoda ujawniona powyzej. Wyniki pod¬ sumowano w tablicy 4: Z powyzszych danych wyraznie wynika, ze po¬ traktowanie TÓznymi stezeniami dwuchloroacetylo- szesciometylenoiminy zmienilo sklad kwasów tlusz¬ czowych ze zwiekszeniem ilosci nienasyconych kwasów (tluszczowych.Prób* C. Otrzymywanie materialu do namnazania gozdzika w hodowli tkankowej.Wyodrebnia sie w warunkach jalowych tkanki stanowiace merysteme ze skrawków gozdzika hodo¬ wanego zwyklymi metodami w szklarni i namnaza w podlozu Murashige-Skoog ujawnionym powyzej.Merystema gozdzika zaczyna rosnac z nastepujacym pózniej namnazaniem sie- przez podzial. W ciagu 6 tygodni od umieszczenia na podlozu odzywczym z konca kazdego pedu rozwija sie 10-^16 odrosli.Po rozdzieleniu sa one zdolne do dalszego namna¬ zania sie na nowym swiezym podlozu odzywczym.Szybkosc namnazania sie wynosi 10-h15 odrosli/ /miesiac.Poza namnazaniem sie odrosli gozdzika zostaje zakonczona pobudzeniem tworzenia sie korzeni, które zachodzi w oddzielnym podlozu odzywczym.Uzywa sie w tym celu pieciokrotnie rozcienczonego podstawowego podloza odzywczego, do którego do- 5 daje sie kwas indolilooctowy do stezenia 0,1 mg/ /litr.Przygotowuje sie serie podlóz odzywczych o róz¬ nym stezeniu przez dodanie róznych ilosci dwu- chloroacetyloszesciometylenoiminy i przy uzyciu tak otrzymanych podlóz prowadzi sie hodowle. Kie¬ dy tworzenie sie korzeni osiagnie pozadany stopien, sadzonki gozdzika umieszcza sie w szklarni i hoduje w warunkach in vivo. Zasadzone sadzonki adaptuja sie do warunków hodowli in vivo w róznym stop¬ niu. Niektóre z nich przejawiaja dobra adaptacje, przezywaja zasadzenie i dobrze sie rozwijaja.Podczas hodowli in vivo liczy sie martwe i prze¬ zywajace rosliny hodowane na róznych podlozach odzywczych., Wartosci procentowe ujawnione w tablicy 5.Powyzsze dane wskazuja, ze przez dodanie do podloza odzywczego dwuchloroszesciometylenoimi- ny do stezenia 6 mgAitr mozna podwyzszyc stopien przezycia sadzonek gozdzika w szklarni dk 9j6%, to jeslf wydajnosc procesu namnazania mozna zwiek¬ szyc o ponad 100% (to znaczy podwójnie), co znacz¬ nie polepsza ekonomike procesu.Mozna zaobserwowac, ze sadzonki hodowane z uzyciem srodka wedlug wynalazku wykazuja Tablica 5 Zawartosc dwuchloroacety- loszesciometylenoiminy w podlozu odzywczym (mg/litr) 1 2 4 6 8 10 12 14 20 | 0 (Kontrola) Zuzycie, % 45 46 04 ae 87 715 70 50 43 46 glebszy odcien zieleni, ich lodygi i liscie sa silniej¬ sze od lodyg i lisci kontrolnych sadzonej, a po- Tablica 4 Stezenie przy traktowaniu mg/litr 0,00 15,60 30,80 61,60 l|54y00 308JOO Kwasy tluszczowe, % Kwas palimitynowy 25,82 25,16 aa,08 24,61 21,131 26,571 Kwas oleopalmi- tynowy 3,8(9 — — — — —.Kwas stearynowy 7,11 3,09, 4,3(7 2,50 3,,38 4,00 Kwas oleinowy 27,97 18,94 18,53 16,68 19,15 25,7,1 Kwas linolowy 117,18 32,85 25;18 3A80 £9,20 25,29 Kwas linolenowy 18,04 2)3,96 28,85 23,26 27,04 18,43 10 20 . i m U OJ X 50 55 65132 926 10 wierzchnia lisci jest pokryta grubsza warstwa wos¬ ku.Próba D. Material do namnazania gozdzików otrzymuje sie w sposób analogiczny do opisanego w próbie C. Tkanki stanowiace merysteme namna- 5 za sie na podlozu odzywczym Murashige-Skoog, którego sklad podano powyzej. W celu pobudzenia tworzenia sie korzeni rosliny przenosi sie do piecio¬ krotnie rozcienczonego podloza podstawowego za¬ wierajacego kwas jndoliolooctoWy o stezeniu 0,1 mg/ 10 /litr. Sadzonki hodowane in vitro sadzi sie w szklar¬ ni w mieszaninie glebowej zwilzonej roztworem dwuchloroacetyloszesciometylenoiminy, otrzymanym w nastepujacy sposób: 5 g dwuchloroacetyloszescio- metylenoiminy rozpuszcza sie w 500 ml 70% etanolu 15 i roztwór miesza sie z 20 litrami wody. 20 litrów tak otrzymanego roztworu dodaje sie do 1 m* mie¬ szaniny glebowej mieszanej przez wykonanie kilku obrotów. Rosliny hodowane in vitro z jednej strony sadzi sie w tak potraktowanej glebie, a z drugiej 20 strony w 'glebie nie poddanej traktowaniu. Wzrost in vivo obserwuje sie w szklarni.Stwierdzono, ze podczas gdy w glebie nie podda¬ nej traktowaniu 58% sadzonek ginie (to znaczy tyl¬ ko 42% przezywa zasadzenie), to w glebie potfrakto- 25 wanej dwuchloroacetyloszesctometylenoimina tylko 8% sadzonek zostaje uszkodzonych przezycia wynosi do 92%, a rosliny te rozwijaja sie bujnie).Próba E. Material do namnazania gozdzików przy- 30 gotowuje sie w sposób analogiczny do opisanego w próbie D i sadzonki po rozwinieciu sie ukladu korzeniowego sadzi sie w nie poddanej traktowaniu glebie w szklarni w celu hodowli in vivo.Polowe posadzonych sadzonek traktuje sie ciecza 35 do oprysku zawierajaca dwuchloroacetyloszesciome- tylenoimina. Czyni sie to po posadzeniu, a nastepnie trzy razy w odstepach 3~4-dniowych.Ciecz do oprysku zawiera 10 mg dwuchloroacety- loszesciometylenoiminy, 0,1 ml Tween 80 (jednoole- ^ inian polioksyetyleno (20) sorbitanu) jako emulsy- fikatora i 0,05 M buforu Tris-HCl (roztwór bufo¬ rujacy zawierajacy tróXhydroksymetylo)aminome- tan w stezeniu 24£ g/litr i HC1 w stezeniu 0,1 n) na litr; pH cieczy wynosi 6,5. Ciecz do oprysku 45 przygotowuje sie przez rozpuszczenie dwuchloroa- cetyloszesciometylenoiminy w kilku kroplach 70% etanolu, dodanie tego roztworu do mieszaniny wo¬ dy i buforu, a nastepnie dodanie emulsyfikatora.Stwierdzono, ze gdy 88% potraktowanych sadzo- 5Q nek przezywa posadzenie, w grupie nie poddanej traktowaniu stopien przezycia wynosi do 4j2%.\ Próba F. Otrzymywanie materialu do namnazania gerbery w hodowli tkankowej.Rosliny (gerbera) namnaza sie in vitro znana me- 55 toda namnazania i pobudzania tworzenia sie ko¬ rzeni Murashagi i wsp. [J. Hort. Sci., 9, 175^180 (1974)]. Do czesci podloza odzywczego pobudzajace¬ go tworzenie sie korzeni dodaje sie dwuchloroace- tyloszesciometylenoimine do stezenia 10 mg/litr 60 i polowe sadzonek hoduje sie w tym podlozu od¬ zywczym.Sadzonki hodowane in vitro sadzi sie w szklarni i dalej hoduje w warunkach in vivo. Liczy sie martwe i przezywajacerosliny. « Stwierdzono, ze rosliny, których korzenie moczy sie w podlozu odzywczym zawierajacym dwuchlo- roacetyloszesciometylenoimine w stezeniu 10 mg/litr, wykazuja stopien przezycia do 98r-il00%, podczas gdy rosliny kontrolne nie poddane traktowaniu tylko 65^70%, Stan roslin hodowanych w butli zmienia sie znacznie, poniewaz w przypadku potraktowanych roslin staja sie one mocniejsze, a ich liscie tward¬ sze i bardziej rozwiniete.Próba G. Material do namnazania gozdzika otrzy¬ muje sie w hodowli tkankowej w sposób analogicz¬ ny do opisanego w próbie C, z tym wyjatkiem, ze w celu pobudzenia tworzenia sie korzeni uzywa sie pieciokrotnie rozcienczonego podstawowego podloza odzywczego zawierajacego kwas p-chlorofenoksy- octowy w stezeniu 0*1 mgAitr, zamiast kwasu indo- lilooctowego w stezeniu 0,1 mg/litr.Nastepnie do podloza odzywczego dodaje sie zwia¬ zek o wzorze 1 do stezenia 2, 5, 10 lub 20 mg/litr.Rosliny hoduje sie w tych podlozach odzywczych az do rozwiniecia sie ukladu korzeniowego. Gdy uklad korzeniowy osiagnie wielkosc odpowiednia do sadzenia, sadzonki umieszcza sie w szklarni i ho¬ duje. Sadzonki adaptuja sie do warunków in vivo w rózny sposób.Pb osiagnieciu jednolitego i nalezytego stadium rozwoju liczy sie martwe i przezywajace sadzonki i ustala ich stosunki ilosciowe.Wyniki podsumowano w tablicy 6.Powyzsze dane wskazuja, ze z jednej strony zas¬ tapienie kwasu indolilooctowego kwasem p-chloro- fenoksyoctowym zwieksza stopien przezycia sadzo¬ nek gozdzika z 46% do 61%, a z drugiej strony uzy¬ cie zwiazku o wzorze 1 dalej polepsza zywotnosc po zasadzeniu.Stwierdzono równiez, ze lodygi i liscie sadzonek hodowanych z uzyciem srodka wedlug wynalazku sa silniejsze i maja glebsze zielone zabarwienie niz w przypadku roslin kontrolnych nie poddanych traktowaniu.Próba H. Material do namnazania gerbery otrzy¬ muje sie w hodowli tkankowej w sposób opisany w próbie F,. Nazwy chemiczne zastosowanych zwiaz¬ ków o wzorze 1, uzyte stezenia i stopien przezycia zamieszczono w tablicy 7. ^ Próba L Sposobu opisanego w próbie G uzywa sie w odniesieniu do maliny bez kolców. Wyniki za¬ mieszczono w tablicy & Próba J. Material do namnazania winorosli otrzy¬ muje sie w hodowli tkankowej w sposób opisany w próbie G. Nazwy chemiczne zwiazków o wzorze 1, uzyte stezenia i stopien przezycia zamieszczono w tablicy 9: Próba K. Sposobu opisanego w próbie G uzywa sie do namnazania jabloni z linii wolnej od wiru¬ sów. Nazwy chemiczne zwiazków o wzorze 1, uzyte stezenia i stopien przezycia zamieszczono w tablicy 10: Próba L. Podobnie jak w próbie G otrzymuje sie w hodowli tkankowej material do namnazania goz¬ dzika. Wyniki badan, którym poddaje sie rosliny podano w tablicy 11.Próba M. Sposobem z próby G otrzymuje sie w hodowli tkankowej material do namnazania gerbe-11 12 Zwiazek o wzorze 1 Kontrola nie poddana traktowaniu N-acetyloszesciometylenoimina N-(chloroacetylo)-szesciome- tylenoimina N-(dwuchloroacetylo)^szescio- metylenoimina N-(1frójchlaroacetylo)- nszesciometylenoimiria N^(dwuchloroacetylo)-izobu- tyloamina Nn(dwuchloroacetylo)- -izopropyloamina N-(dwuchloroacetylo)- III rzad. butyloamina Nt,N'nbis szesciometylenodwuamina N^dwuchloroacetylo) heksyloamina Procentowa liczba przezywajacych sadzonek z utworzonymi korzeniami , Stezenie zwiazku o wzorze 1 (mgAitr) Z 61 80 76 100 69 68 72 71 95 94 5 61 81 76 100 65 66 71 72 1O0 95 10 61 80 76 100 63 77 71 72 100 98 20 61 81 70 1O0 63 61 | 71 1 72 | 95 | 100 1 Tablica 7 Zwiazek o wzorze 1 Kontrola nie poddana traktowaniu N-acetylo^esciometylenoiinina N-(chloroacetylo)- szesciometylenoimina N-(dwuchloroacetylo)- szesciometylenoimina N^trójchloroacetylo)- szesciometylenoimina N-(dwuchloroacetylo)- dwuizobutyloamioa N-(dwuchloroacetylo)- izopropyloamina N-(dwuchloroacetylo)- III.rzed.butyloamina N,N'-bis szesciometylenodwuamina N-(dwuchloroacetylo)- heksyloamina Procentowa liczba przezywajacych sadzonek z utworzonymi korzeniami Stezenie zwiazku o wzorze 1 1 (mg/litr) 2 63 83 78 100 70 73 75 76 100 100 5 63 84 82 100 69 72 73 78 100 100 10 63 83 79 100 68 70 74 76 100 100 20 63 82 80 | 100 | 68 | 70 | 73 j 75 | 100 | 100 1132 926 13 14 Tablica 8 Zwiazek o wzorze 1 Kontrola nie poddana traktowaniu N-acetyloszesciometylenoimina N-(chloroacetylo)- szesciotmetylenoimina N-(dwuchloroacetylo)- szesciometylenoimina N-(tr6jchloroacetylo)- szesciometylenoimina N^(dwuchloroacetylo)- dwuizobutyloamina N-(dwuchloroacetylo)- , izopropyloamina N-(dwuchloroacetylo)- Ill.rzed.butyloamina N,N'-bis(dwuchloroacetylo) szesciometylenodwuamina N-(dwuchloroacetylo)- heksyloamina ; Procentowa liczba przezywajacych isadzonek z utworzonymi korzeniami Stezenie zwiazku o wzorze 1 (mg/litr) 2 65 85 80 100 70 70 75 75 100 100 5 65 86 82 100 70 68 76 75 100 100 10 65 86i 8il 100 70 65 75 75 100 100 20 65 86 80 100 70 65 74 7.2 100 100 Tablica 9 Zwiazek o wzorze 1 Kontrola nie poddana traktowaniu N-acetyloszesciometylenoimina N-(chloroacetylo)- szesciometylenoimina N-(dwuchloroacetylo)- szesciometylenoimina N-(trójchloroacetylo)- szesciometylenoimina N-(dwuchloroacetylo)- dwuizobutyloamina 1 N-(dwuchloroacetylo)- izopropyloamina N-(dwuchloroacetylo)- Ill.rzed.butyloamina N,N'-bis(dwuchloroacetylo) szesciometylenodwuamina 1 N- | heksyloamina Procentowa liczba przezywajacych sadzonek z utworzonymi korzeniami Stezenie zwiazku o wzorze 1 (mg/litr) 2 62 81 73 100 65 72 72 72 !li00 100 5 62 84 72 roo 65 710 12 78 1O0 1O0 10 62 84 70 100 63 68 71 TO 100 100 20 62 85 68 100 1 63 66 69 70 100 100132 926 15 16 Tablica 10 Zwiazek o wzorze 1 Kontrola nie poddana traktowaniu N-acetyloszesciometylenoimina N-(chloroacetylo)- szesdometylenoimina N^(dwuchloroacetylo)- szesciometylenoimina Nn(trójchloroacetylo)- szesciometylenoiraina N-(dwuchloroacetylo)- dwuizobutyloamina N-(dwuchloroacetylo)- izopropyloamina N-(dwuchloroacetylo)- Ill.rzed.butyloamina N,N'-bis szesciometylenodwuamina N- heksyloamina Procentowa liczba przezywajacych sadzonek z utworzonymi korzeniami Stezenie zwiazku o wzorze 1 (mg/litr) | 2 70 83 83 100 74 80 80 90 100 100 5 70 as 79 100 78 82 81 91 100 100 ' 10 70 85 79 100 78 80 8*1 90 100 100 20, | 70 | 85 75 | 100 | 72 | 80 | 79 | 89 | 100, | 100 | Tablica 11 Zwiazek o wzorze 1 Kontrola nie pod¬ dana traktowaniu JHdwuchloroace- tylo)-cykkheksylo- amina N- tylo)-alliloamina N-(dwuchloroace- tylo)-anilina N- tylo)-n-butyloami- na N^(dwuchloroace- tylo)-dwu-n-bufylo- amina *Hdwuchloaroace- tylo)-benzylo- amma N-(dwuchloroace- tylo)-N-metylo-N- -benzylo-amina Procentowa liczba przezywajacych sadzonek z utworzonymi korzeniami Stezenie zwiazku o wzorze 1 (mg/litr) 2 6)1 93 74 80 75 63 ^88 91 5 61 94 15 81 76 65 87 y 94 10 61 96 75 83 78 68 90 97 20 61 98 76 85 80 73 90 99 50 61 100 76 " | 85 80 | 75 1 90 100 1132 926 17 Tablica 12 Zwiazek o wzorze 1 Procentowa liczba przezywajacych sadzonek z utworzonymi korzeniami Stezenie zwiazku o wzorze 1 {mg/litr) | 2 Kontrola nie pod¬ dana traktowaniu | 63 N-(dwuchloroace- tylo)-cykloheksylo- amina N^dwuchloroace- tylo)-alliloamina N-(dwuchloroace- tylo)-anilina N-(dwuchloroace- tylo)-n-butyloami- na N-(dwuchloroace- tylo)-dwu-n-bufylo- amina N-(dwuchloiroace- tylo)-benzylo- amina 1 N-(dwuchloroace- tylo)-N-metylo^N- -benzylo-amina 94 75 82 77 75 83 95 5 63 96 77 83 79 77 85 98 10 63 100 80 83 82 78 90 100 20 63 100 78 85 83 78 95 100 50 63 | 100 | 76 | 85 | 83 | 80 | , | 100 sie material do namnazania malin bez kolców, wi¬ norosli i jabloni (z linii wolnej od wirusów). Sto¬ suje sie zwiazki o wzorze 1 w stezeniach 2, 5, 10, 35 20 i 50 mg/litr. Obserwuje sie, ze procentowa licz¬ ba przezywajacych sadzonek z utworzonymi korze¬ niami nie zalezy od stezenia, w zwiazku z czym w tfablicy 13 podano wyniki badan dla poszczególnych rodzajów sadzonek z pominieciem stezen. 40 Tak wiec, ogólnie mozna stwierdzic, iz srodek wedlug wynalazku (np. w postaci preparatów opi¬ sanych w przykladach I—VII) mozna stosowac z po¬ wodzeniem w celu polepszenia wyników namnaza¬ nia w hodowli tkankowej roslin uprawnych (np., 45 jabloni, grusz, malin, itd.) i roslin ozdobnych (np. gerber, gozdzików), a takze w celu polepszania zdol¬ nosci przezycia sadzonek po ich zasadzeniu. Liscie i lodygi poddanych zabiegowi roslin sa lepiej roz¬ winiete, maja zywsze zabarwienie, a warstwa wo- so sku na lisciach jest grubsza niz w przypadku roslin nie poddanych dzialaniu srodka wedlug wynalaz¬ ku. Ponadto, sadzonki roslin potraktowanych srod¬ kiem wedlug wynalazku zaczynaja wczesniej ros¬ nac po wysadzeniu i osiagaja wymiary handlowe 55 w okolo 2 tygodnie wczesniej od roslin kontrolnych nie poddanych zabiegowi.Wynalazek ilustruja ponizsze przyklady.Przyklad I. Srodek wedlug wynalazku w po¬ staci podloza wzrostowego. 60 Podstawowe srodowisko wzrostowe wytwarza sie z nizej podanych skladników uzytych w nizej po¬ danych ilosciach: CaClaX2H«0 439,300 mg/litr CoCl2X2H20 0,025 mg/lifr *5 CuS04X5H«0 0,025 mg/lifr ry. Wyniki badan, którym poddaje sie rosliny po¬ dano w tablicy 12.Próba N. Postepujac jak w próbie K, wytwarza Tablica 13 Zwiazek o wzorze 1 Kontrola nie pod¬ dana traktowaniu N-(dwuchloroace- tylo)-cykloheksylo- amina 1 N-(dwuchloroace- tyk)-alliloamina 1 N-(dwuchloroace- tylo)-anilina N-(dwuchloroace- tylp)-n-butyloami- na N-(dwuchloroace- tyloj-dwunn-bufylo- amina N-(diwuchlo tylo)-benzylo- amina N-(dwuchloroace- tylo)-N-metylo-N- | -benzylo-amina Procentowa liczba prze¬ zywajacych sadzonek z utworzonymi korzenia¬ mi malina 65 100 75 79 78 80 ¦ M 100 winorosl 68 100 78 80 05 100 100 100 jablon 70 | 100 1 85 90 96 100 100 10019 132 926 20 4 FeNa EDITA ZnS04X7 HzO cukier inozyt H8B03 KH2P04 KJ KN03 MgS04X7 HaO MnS04X4 H20 NaHaF04X2HaO Na2Mo04X2H20 NI^NOa chlorowodorek tiaminy chlorowodorek pirydoksyny dwuwodzian siarczanu adeniny kwas indolilooctowy benzyloadenina agar 336,660 mg/litr 8,6100 mg/litr 3^5,000 mg/litr 100,000 mg/litr 6,200 mg/iltr 170,000 mg/litr 0,830 mg/litr 1900 mg/litr 370,600 mg/litr 2&300 mg/litr 96,000 mg/litr 0,250 mg/litr 1650 mg/litr 0,500 mg/litr 10,000 mg/litr 0-80,000 mg/litr 0-10,000 mg/litr 0,2-2,000 mg/lir 7-10,000 mg/litr Powyzsze skladniki rozpuszcza sie w wodzie des¬ tylowanej, pH roztworu doprowadza do wartosci 5,8, dodaje agar, ogrzewa podloze do chwili gdy stanie sie ono klarowne, a nastepnie napelnia sie nim w warunkach jalowych kolby, których szyjki za¬ myka sie papierowym przykryciem. Kolby umiesz¬ cza sie w autoklawie i podstawowe podloze wzros¬ towe wyjalawia sie w temperaturze 1(211°C.Przygotowane jak powyzej podstawowe podloze wzrostowe rozciencza sie pieciokrotnie woda des¬ tylowana, a potem do porcji o objetosci 1 litra dodaje sie po 0yl mg kwasu indolilooctowego oraz 1, 2, 4^ 6, 8, 10, 12, 14 albo 20 mg Nn(dwu-chloro- acefylo)szesciometylenoiminy. Otrzymuje sie w ten sposób srodek wedlug wynalazku w postaci podlo¬ za wzrostowego zawierajacego odpowiednio 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12,, 14 i 20 mg/litr substancji czynnej. Pod¬ loze to stosuje sie do namnazania gozdzików i ger¬ ber w hodowli tkankowej.Przyklad II. Srodek wedlug wynalazku w pos¬ taci roztworu odzywczego. 5 g N- rozpuszcza sie w 500 ml 70% efanolu i mieszanine miesza sie z 19,5 litra wody. Tak otrzymany roz¬ twór odzywczy dodaje sie do 1 m* mieszaniny gle¬ bowej, która miesza sie potem kilkakrotnie i sto¬ suje do hodowli in vivo sadzonek otrzymanych przez namnazanie roslin w hodowli tkankowej. Roz¬ twór odzywczy mozna takze stosowac jako taki, nasycajac nim korzenie roslin namnozonych w ciek¬ lym podlozu wzrostowym przed ich zasadzeniem.Przyklad III. Srodek wedlug wynalazku w postaci cieczy opryskowej. 10 mg N^(dwuchloroacetylo)-szesciometylenoimi- ny rozpuszcza sie w kilku kroplach 70% etanolu, po czym mieszanine dodaje sie do 1 litra destylowanej wody zawierajacej 0,05 mola buforu Tris-HCl, po czym do powstalej mieszaniny dodaje sie 0,1 ml emulgatora Tween 80. Stezenie substancji czynnej w tej cieczy opryskowej wynosi 10 mgAitr. Ciecz opryskowa stosuje sie do opryskiwania zasadzonych roslin namnozonych w hodowli tkankowej. Zabieg opryskiwania mozna przeprowadzac raz lub wielo¬ krotnie.Przyklad IV. Srodek wedlug wynalazku w postaci podloza wzrostowego.Podstawowe podloze wzrostowe otrzymane jak w przykladzie I rozciencza sie pieciokrotnie woda destylowana i do porcji o objetosci 1 litra dodaje sie po 0,1 mg kwasu p-chlorofenoksyoctowego oraz 5 2, 5, 10 lub 20 mg N^acetyloszesciometylenoiminy.Otrzymuje sie w ten sposób srodek wedlug wyna¬ lazku w postaci podloza wzrostowego zawierajacego substancje czynna w stezeniu odpowiednio % 5„ 10 i 20 mg/litr. Podloze to stosuje sie dla zwiekszania io zdolnosci do przezycia sadzonek róznych roslin namnozonych w hodowli tkankowej.Przyklad V. Stosujac tok postepowania z przykladu IV„ lecz z uzyciem innych zwiazków o wzorze 1, zamiast N-acetyloszesciometylenoiminy, 15 otrzymuje sie podloza wzrostowe o stezeniu sub¬ stancji czynnej 2, 5, 10 lub 20 mg/litr, zawierajace jako te substancje czynna N-(chloroacetylo)szescio- metylenoimine, lub N-(dwuchloroacetylo)szesciome- tylenoimine, lub N-{trójchloroacetylo)szesciometyle- 20 noimine, lub Nn(dwuchloroacefylo) dwuizobiityloa- mine, lub N-(dwuchloroacetylo)izoropyloamine, lub N-(dwuchloroacetylo)-III-rzed. butyloamina, lub N,N'-.bis mine, lub N^dwuchloroacetylo)-hefcsyloamine. 26 Przyklad VI. Srodek wedlug wynalazku w .postaci podloza wzrostowego.Podstawowe podloze wzrostowe otrzymane jak w przykladzie I rozciencza sie pieciokrotnie woda destylowana i do porcji o objetosci 1 litra dodaje ?0 sie 2, 5, 10, 20 lub 50 mg/litr N-(dwuchloroacetylo)- -cykloheksyloaminy. Otrzymuje sie podloze wzros¬ towe o stezeniu substancji czynnej wynoszacym odpowiednio 2, 5, 10, 20 lub 50 mg/litr.Przyklad VII. Stosujac fok postepowania 35 z przykladu VI, lecz z uzyciem innych zwiazków o wzorze 1 zamiast N-(dwuchloroacetylo)cyklohek- syloaminy, otrzymuje sie podloza wzrostowe o ste¬ zeniu substancji czynnej 2, 5, 10, 20 lub 50 mg/litr, zawierajace jako te substancje czynna N-(dwuchlo- 40 roacetylo)alliloamine, lub N-(dwuchloroacefylo)ani- line, lub N-(dwuchloroacetylo)-n-butyloamine, lub N^(dwuchloroacetylo)dwu-n-butyloamine, lub N- -(dwuchloroacetylo)benzyloamine.Zastrzezenie patentowe 43 Srodek do stosowania w procesie namnazania roslin uprawnych w hodowli fkankowej* in vitro, zawierajacy substancje czynna oraz nosnik i/lub rozcienczalnik, znamienny tym, ze jako substancje 50 czynna zawiera zwiazek o ogólnym wzorze 1, w któ¬ rym R oznacza grupe metylowa, chlorometylowa, dwuchlorometylowa lub trój chlorometylowa Rx i R2 sa jednakowe lub rózne i oznaczaja grupe C^-Ca- -alkilowa, grupe C2-C6-alkenylowa, grupe C$-C6- 55 -cykloalkilowa, grupe fenylowa, grupe benzylowa lub atom wodoru, przy czym gdy jeden z podstaw¬ ników Rj i R2 oznacza atom wodoru, to wówczas drugi z tych podstawników ma wyzej podane zna¬ czenie z wyjatkiem atomu wodoru, wzglednie Ri 60 i R2 tworza wspólnie z atomem azotu, do którego sa przylaczone, grupe szesciometylenoiminowa, wzglednie gdy jeden z podstawników Rx i R2 ozna¬ cza atom wodoru, fo wówczas drugi z tych podstaw¬ ników moze oznaczac grupe o ogólnym wzorze 2, 63 w którym n oznacza liczbe calkowita 1—8.132 926 O R R-C-N^ R2 Wzór 1 H O CH^p-N- C-R Wzór Z PL