KR101444418B1 - 난지형 목초 테프그라스의 조직 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 조직 배양 방법 - Google Patents

난지형 목초 테프그라스의 조직 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 조직 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테프그라스의 성숙 종자로부터 캘러스 유도 및 형성된 신초의 재분화를 통한 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법, 상기 방법에 의해 생산된 테프그라스 식물체 및 상기 테프그라스의 캘러스 유도 및 형성된 신초의 재분화를 위한 배지 조성물을 제공한다.

Description

난지형 목초 테프그라스의 조직 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 조직 배양 방법 {Medium composition for tissue culture of teff grass as warm season grass and tissue culturing method using thereof}
본 발명은 난지형 목초 테프그라스 (teff grass, Eragrostis tef)의 조직 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 테프그라스의 성숙 종자로부터 캘러스 유도 및 형성된 신초의 재분화를 통한 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법, 상기 방법에 의해 생산된 테프그라스 식물체 및 상기 테프그라스의 캘러스 유도 및 형성된 신초의 재분화를 위한 배지 조성물에 관한 것이다.
급속한 산업화와 인구증가에 의한 지구규모의 생태계 파괴는 21세기 인류생존의 최대 사회문제로 대두되고 있다. 특히, 무리한 개간과 가축의 방목 등에 의한 중국의 사막화는 심각한 속도로 전개되고 있으며, 우리나라에 막대한 산업적·환경적 피해를 가져다주고 있어 이에 대한 다각적인 대응책이 시급히 요구되고 있다.
테프그라스 (teff grass)는 에라그로스티스 (Eragrostis) 속에 속하는 초본식물이다. 원산지인 에티오피아에서 테프그라스의 작은 낱알은 곡식으로 이용된다. 이 식물의 중요한 특징은 다양한 기후 조건 및 토양에서 생육할 수 있다는 점이다. 가뭄이나 척박한 환경에 비교적 잘 적응하기 때문에 사막화가 진전되고 있는 지역의 토양 유실 및 황사 발생을 억제할 수 있는 지표면의 피복효과뿐만 아니라 높은 수준의 필수 아미노산을 함유하고 있어 양질의 건초로도 이용될 수 있는 중요한 사료작물이다.
따라서 척박한 토양과 건조지역에 잘 적응하는 테프그라스의 우수한 환경적응성을 분자수준에서 규명하고, 환경 스트레스에 보다 잘 견디는 새로운 테프그라스의 개발은 동북아시아 지역의 생태계 보전 및 복원을 위해서 매우 중요한 일이다. 아그로박테리움을 이용한 방법이나 유전자 총 기법에 의한 식물의 유전적 형질전환체의 생산은 조직배양에 의한 식물 세포의 재분화 능력에 의존한다. 그러나 현재까지 개발 진행중인 난지형 화본과 목초의 경우 조직배양 효율이 매우 낮아 스위치그라스 (switchgrass), 로즈그라스 (rhodesgrass)를 비롯한 소수의 작물에서만 형질전환 성공이 보고되었다 (Gondo T et al., J plant physiol ., 166:435-441, 2009). 식물의 조직배양 효율은 식물 생장 조절물질을 포함한 배지의 조성물 및 다양한 배양 조건에 의해 영향을 받는다. 본 발명은 테프그라스의 조직배양에 사용되는 식물호르몬의 효과를 검토하여, 테프그라스의 캘러스 유도 및 식물체 재분화 조건을 최적화하기 위해 수행되었다.
한편, 한국등록특허 제1055864호에는 '양초의 종자로부터 캘러스를 유도하는 배지'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2012-0053210호에는 '물억새의 배수체 생산방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 난지형 목초 테프그라스의 조직 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 배양 방법에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 테프그라스 (teff grass, Eragrostis tef)의 성숙 종자를 본 발명의 캘러스 유도용 배지에서 배양하여 높은 효율로 배발생 캘러스를 유도하고, 유도된 캘러스를 본 발명의 식물체 재분화용 배지에서 배양하여 효과적으로 재분화되는 것을 확인하였으며, 본 발명의 테프그라스 조직배양 방법이 테프그라스를 짧은 시간에 대량으로 생산할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 테프그라스의 성숙 종자로부터 캘러스 유도 및 형성된 신초의 재분화를 통한 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 테프그라스 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 테프그라스의 캘러스 유도 및 형성된 신초의 재분화를 위한 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 테프그라스 캘러스 유도 및 증식용 배지를 이용하여 테프그라스의 성숙 종자로부터 효율적으로 배발생 캘러스를 유도할 수 있고, 유도된 캘러스는 본 발명의 식물체 재분화용 배지를 이용하여 높은 효율로 재분화될 수 있다. 또한, 유도된 테프그라스의 캘러스는 형질전환 기법을 이용하여 환경 재해 내성이나 기능성 유전자의 도입이 가능하고, 유용 유전자가 도입된 캘러스의 재분화를 통해 신품종 테프그라스를 짧은 시간 내에 대량으로 생산할 수 있는 뛰어난 효과를 제공하며, 기능성이 부가된 신품종 테프그라스는 바이오에너지 작물 또는 사료작물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 테프그라스 성숙 종자 유래의 캘러스로부터 식물체의 재분화 과정을 나타낸다. A, 테프그라스 성숙 종자; B, 캘러스 유도 배지 상에 놓인 테프그라스 성숙 종자; C, 캘러스 유도 배지에서 7일간 배양된 성숙 종자 유래 캘러스; D, 캘러스 유도 배지에서 4주간 배양된 성숙 종자 유래 캘러스; E, 테프그라스 성숙 종자로부터 형성된 배발생 캘러스; F, 재분화 배지에서 2주간 배양된 배발생 캘러스로부터의 식물체 재분화; G, 재분화 배지에서 4주간 배양된 배발생 캘러스로부터의 식물체 재분화; H, 온실로 옮겨서 화분에 키운 테프그라스 전체 식물체.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 테프그라스 (Teff grass, cv. Tiffany)의 성숙 종자를 에탄올로 살균한 후, 소듐 하이포클로라이트 (sodium hypochlorite) 용액에서 교반하면서 표면 살균하는 단계;
(2) 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 또는 NAA (naphthaleneacetic acid), BA (benzyl adenine), 수크로오스, L-프롤린, 카제인 가수분해물 (casein hydrolysate) 및 젤라이트가 첨가된 MS 배지, N6 배지 또는 SH 배지에서 살균된 테프그라스의 성숙 종자로부터 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
(3) 2,4-D 또는 NAA, BA 또는 키네틴 (kinetin), 수크로오스, L-프롤린, 티아민-HCl 및 젤라이트가 첨가된 MS 배지, N6 배지 또는 SH 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재분화하는 단계; 및
(4) 수크로오스 및 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 테프그라스의 캘러스를 이용한 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법은 (1) 단계로서, 테프그라스 (Teff grass, cv. Tiffany)의 성숙 종자를 에탄올로 살균한 후, 소듐 하이포클로라이트 (sodium hypochlorite) 용액에서 교반하면서 표면 살균하는 단계를 포함한다.
상기 테프그라스 성숙 종자의 살균에는 60~95% (v/v) 에탄올이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 65~80% (v/v) 에탄올이 사용될 수 있고, 더욱 바람직하게는 70% (v/v) 에탄올이 사용될 수 있다. 상기 테프그라스 성숙 종자의 표면 살균에는 2~10% (v/v) 소듐 하이포클로라이트 용액이 사용될 수 있고, 바람직하게는 5% (v/v) 소듐 하이포클로라이트 용액이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법은 (2) 단계로서, 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 또는 NAA (naphthaleneacetic acid), BA (benzyl adenine), 수크로오스, L-프롤린, 카제인 가수분해물 (casein hydrolysate) 및 젤라이트가 첨가된 MS 배지, N6 배지 또는 SH 배지에서 살균된 테프그라스의 성숙 종자로부터 캘러스를 유도 및 증식하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 캘러스 유도 및 증식용 배지에서, MS 배지, N6 배지 및 SH 배지는 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, 캘러스 유도에 사용되는 2,4-D 농도는 1~5 mg/L, 바람직하게는 1~2 mg/L, 더욱 바람직하게는 2 mg/L 일 수 있다. 상기 NAA의 농도는 1~5 mg/L, 바람직하게는 1~2 mg/L, 더욱 바람직하게는 2 mg/L 일 수 있다. 상기 BA의 농도는 0.05~1.0 mg/L, 바람직하게는 0.05~0.5 mg/L, 더욱 바람직하게는 0.05~0.2 mg/L 일 수 있다. 상기 수크로오스의 농도는 25~35 g/L, 바람직하게는 30 g/L 이며, L-프롤린의 농도는 0.4~0.6 g/L, 바람직하게는 0.5 g/L 이며, 카제인 가수분해물의 농도는 0.4~0.6 g/L, 바람직하게는 0.5 g/L 일 수 있다. 상기 젤라이트의 농도는 2~4 g/L, 바람직하게는 3 g/L 일 수 있으며, 상기 배지의 pH는 pH 5.6~6.0, 바람직하게는 pH 5.8로 조정될 수 있다.
본 발명의 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법은 (3) 단계로서, 2,4-D 또는 NAA, BA 또는 키네틴 (kinetin), 수크로오스, L-프롤린, 티아민-HCl 및 젤라이트가 첨가된 MS 배지, N6 배지 또는 SH 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재분화하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 유도된 캘러스로부터 형성된 신초의 재분화용 배지에서, MS 배지, N6 배지 및 SH 배지는 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, 신초 재분화에 사용되는 2,4-D 농도는 0.05~1.0 mg/L, 바람직하게는 0.05~0.5 mg/L, 더욱 바람직하게는 0.1 mg/L 일 수 있다. 상기 NAA의 농도는 0.05~1.0 mg/L, 바람직하게는 0.05~0.5 mg/L, 더욱 바람직하게는 0.1 mg/L 일 수 있다. 상기 BA의 농도는 0.05~1.0 mg/L, 바람직하게는 0.1~1.0 mg/L, 더욱 바람직하게는 0.5~1.0 mg/L 일 수 있다. 상기 키네틴의 농도는 0.05~1.0 mg/L, 바람직하게는 0.1~1.0 mg/L, 더욱 바람직하게는 0.8~1.0 mg/L 일 수 있다. 상기 수크로오스의 농도는 25~35 g/L, 바람직하게는 30 g/L 이며, L-프롤린의 농도는 0.4~0.6 g/L, 바람직하게는 0.5 g/L 이며, 카제인 가수분해물의 농도는 0.4~0.6 g/L, 바람직하게는 0.5 g/L 일 수 있다. 상기 티아민-HCl의 농도는 0.5~2.0 mg/L 이며, 바람직하게는 1.0 mg/L 이고, 젤라이트의 농도는 2~4 g/L, 바람직하게는 3 g/L 일 수 있으며, 상기 배지의 pH는 pH 5.6~6.0, 바람직하게는 pH 5.8로 조정될 수 있다.
본 발명의 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법은 (4) 단계로서, 수크로오스 및 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함할 수 있다.
상기 재분화된 신초를 식물체로 분화시키기 위한 배지에서, 1/2 MS 배지는 MS 염류와 비타민을 포함할 수 있으며, 당업계에서 일반적으로 사용되는 MS 배지 양의 1/2이 사용될 수 있다. 상기 수크로오스는 25~35 g/L, 바람직하게는 30 g/L 이며, 젤라이트는 2~4 g/L, 바람직하게는 3 g/L 일 수 있으며, 상기 배지의 pH는 pH 5.6~6.0, 바람직하게는 pH 5.8로 조정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 더욱 바람직하게는
(1) 테프그라스 (Teff grass, cv. Tiffany)의 성숙 종자를 70% (v/v) 에탄올로 1분간 살균한 후, 5% (v/v) 소듐 하이포클로라이트 용액에서 30분간 교반하면서 표면 살균하는 단계;
(2) 1~2 mg/L 2,4-D, 0.05~0.2 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.4~0.6 g/L 카제인 가수분해물 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 MS 배지 또는 N6 배지에 살균된 테프그라스의 성숙 종자로부터 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
(3) 0.1 mg/L NAA, 0.5~1.0 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.5~2.0 mg/L 티아민-HCl 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 MS 배지 또는 N6 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재분화하는 단계; 및
(4) 25~35 g/L 수크로오스 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 테프그라스의 캘러스를 이용한 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 테프그라스 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 1~2 mg/L 2,4-D 또는 1~2 mg/L NAA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.4~0.6 g/L 카제인 가수분해물 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 또는 N6 배지를 유효 성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 옥신이 단용 처리된 테프그라스 식물의 캘러스 유도 및 증식용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 1~2 mg/L 2,4-D, 0.05~0.2 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.4~0.6 g/L 카제인 가수분해물 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 또는 N6 배지를 유효 성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 옥신 및 사이토키닌이 혼용 처리된 테프그라스 식물의 캘러스 유도 및 증식용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 0.5~1.0 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.5~2.0 mg/L 티아민-HCl 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 또는 N6 배지를 유효 성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 사이토키닌이 단용 처리된 테프그라스 식물의 신초 재분화용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 0.1 mg/L NAA, 0.5~1.0 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.5~2.0 mg/L 티아민-HCl 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 또는 N6 배지를 유효 성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 옥신 및 사이토키닌이 혼용 처리된 테프그라스 식물의 신초 재분화용 배지 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 종자 소독
테프그라스(Teff grass, cv. Tiffany) 성숙종자를 70% (v/v) 에탄올에 1분간 살균한 후, 5% (v/v) 소듐 하이포클로라이트 용액에서 30분간 교반하면서 표면살균 하였다. 살균된 종자는 멸균수로 3회 이상 세정한 다음 멸균된 여과지로 옮겨 물기를 완전히 제거한 후, 캘러스 유도배지에 치상하였다.
2. 테프그라스 성숙 종자로부터 캘러스의 유도
테프그라스 성숙 종자로부터 캘러스를 유도하기 위한 캘러스 유도 배지는 MS 배지, N6 배지 또는 SH 배지를 기본 배지로 사용하여 1~5 mg/L 2,4-D 또는 1~5 mg/L NAA를 단용 처리하거나, 1~5 mg/L 2,4-D 또는 1~5 mg/L NAA와 0.1~1.0 mg/L BA를 혼용 처리하고, 30 g/L 수크로오스, 0.5 g/L L-프롤린, 0.5 g/L 카제인 가수분해산물 및 3 g/L 젤라이트를 첨가하여 제조된 pH 5.8의 배지를 사용하였다. 제조된 캘러스 유도용 배지에 테프그라스 성숙 종자를 치상하여 24±2℃의 생장실에서 4주간 암배양한 후 동일한 조성의 새로운 배지에 옮겨 2주 동안 배양하였다.
3. 식물체 재분화
6주 동안 배양하여 발아된 테프그라스의 종자로부터 캘러스만을 취하여 MS, N6 또는 SH 기본 배지에 0.1~1.0 mg/L BA 및 0.1~1.0 mg/L 키네틴을 단용 처리하거나 0.1mg/L 2,4-D 또는 0.1mg/L NAA와 0.1~1 mg/L BA 또는 0.1~1 mg/L 키네틴을 혼용 처리하고, 30 g/L 수크로오스, 0.5 g/L L-프롤린, 1 mg/L 티아민-HCl 및 3 g/L 젤라이트를 첨가하여 제조된 pH 5.8의 배지에 캘러스를 이식하였다. 이식한 테프그라스 캘러스는 24±2℃, 16시간 명배양/8시간 암배양 조건으로 3주간 배양한 다음 동일한 새 배지에 1회 계대 배양하여, 총 7주 동안 배양하였다. 사이토키닌 단용 처리 및 옥신과 사이토키닌을 혼용 처리하여 제조한 배지 각각의 처리구에서 1 cm 이상으로 자란 신초를 재분화 개체로 조사하였다.
4. 식물체 분화 및 식물체의 재배
재분화 된 신초는 1/2 MS배지에 이식하여 뿌리발생을 유도하여 완전한 식물체로 분화시킨 후 토양에 이식하여 온실에서 재배하였다. 발근이 정상적으로 된 재분화 식물체는 토양에 이식하여 일주일 동안 순화시킨 후 온실에서 재배하였다.
실시예 1. 성숙종자로부터 캘러스 유도에 대한 옥신 단용 처리의 영향
테프그라스 성숙종자를 2,4-D 및 NAA가 각각 0, 1, 2, 3, 4 및 5 mg/L의 농도로 첨가된 캘러스 유도배지에서 3주간 배양한 결과, 종자로부터의 캘러스 유도율은 2 mg/L의 2,4-D가 91.9%로 가장 높게 나타났고 1 mg/L의 2,4-D가 86.7%로 두 번째로 효율이 높았다. 또한, NAA 단용 처리시에는 2 mg/L의 NAA 처리가 81.4%로 캘러스 유도 효율이 가장 높았다. 따라서 테프그라스 성숙종자의 캘러스 유도에는 1~2 mg/L 농도의 2,4-D 또는 NAA 첨가가 적정한 것으로 판단되었다. 동일한 농도의 식물생장 호르몬 처리시 2,4-D가 NAA에 비해 더 높은 캘러스 유도율을 보였으며, 캘러스 생체중도 더 높게 나타나 2,4-D 처리가 테프그라스 캘러스 유도에 더 효율적임을 확인할 수 있었다 (표 1).
옥신 농도
(mg/L)		 테스트된
종자의 수		 유도된
캘러스의 수		 캘러스
형성 (%)		 캘러스
생체중 (mg)
2,4-D 0 60 0 0 0
1 120 104.0±1.7 86.7 ± 1.4 8.0 ± 1.7
2 120 110.3 ± 3.1 91.9 ± 2.5 10.7 ± 1.5
3 120 98.7 ± 4.2 81.1 ± 2.5 9.0 ± 1.0
4 120 93.3 ± 4.2 77.8 ± 3.5 7.0 ± 1.0
5 120 94.7 ± 4.5 78.9 ± 3.8 5.7 ± 1.5
NAA 0 60 0 0 0
1 120 99.7 ± 2.3 80.5± 6.3 7.3 ± 1.5
2 120 101.0 ± 1.0 81.4 ± 4.1 8.3 ± 0.6
3 120 88.7 ± 3.2 73.6 ± 3.2 6.3 ± 2.1
4 120 80.7 ± 2.1 64.4 ± 3.2 5.0 ± 1.0
5 120 79.7 ± 1.5 63.1 ± 5.7 6.0 ± 1.0
실시예 2. 성숙종자로부터 캘러스 유도 및 캘러스 생체중에 대한 옥신 및 사이토키닌 혼용 처리의 영향
2,4-D가 각각 0, 1, 2, 3, 4 및 5 mg/L의 농도로 첨가된 옥신 단용 처리 배지에서 4주간 배양한 캘러스를 옥신(2,4-D)과 사이토키닌(BA)이 혼용 처리된 캘러스 유도배지에 옮겨 3주간 배양하였다. 총 7주 동안 배양된 테프그라스 성숙 종자의 캘러스 유도율 및 캘러스의 생체중을 조사한 결과, 2 mg/L의 2,4-D 단용 처리구와 2 mg/L의 2,4-D에 0.1 mg/L의 BA를 첨가하여 배양한 처리구에서 각각 90.7%와 90.0%로 가장 높은 캘러스 형성율을 나타내었다 (표 2). 또한, 2 mg/L의 2,4-D에 0.1 mg/L의 BA를 혼용 처리하였을 경우, 캘러스 생체중이 41.7 mg으로 가장 높게 나타나 캘러스 증식에 가장 효율적임을 확인할 수 있었다 (표 2).
성장 조절제 (mg/L) 테스트된
종자의 수		 캘러스 형성 (%) 종자당
캘러스 생체중 (mg)
2,4-D BA
0 0 50 0 0
1 0 100 86.3 ± 2.5 30.0 ± 2.6
2 0 100 90.7 ± 2.5 35.0 ± 3.0
3 0 100 83.0 ± 3.0 28.7 ± 4.7
5 0 100 80.7 ± 3.1 24.7 ± 7.6
2 0.1 100 90.0 ± 2.0 41.7 ± 3.5
2 0.5 100 77.3 ± 3.2 37.7 ± 1.5
2 1 100 71.0 ± 2.6 29.3 ± 2.5
실시예 3. 식물체 재분화에 대한 사이토키닌 단용 처리의 영향
2 mg/L의 2,4-D, 0.1 mg/L의 BA가 첨가된 캘러스 유도 배지에서 7주간 형성된 캘러스를 BA 또는 키네틴이 각각 0.1, 0.5, 1 mg/L의 농도로 첨가된 재분화 배지에서 배양한 결과, 0.5 mg/L의 BA가 첨가된 배지에서 배양한 경우 37.5%로 가장 높은 재분화 효율을 나타내었다 (표 3). 따라서 테프그라스 식물체 재분화에 대한 사이토키닌 단용 처리는 BA가 키네틴보다 더 효율적인 것으로 확인되었다.
성장 조절제 (mg/L) 식물체 재분화 (%)
BA 　
0.1 25.3±1.5
0.5 37.3 ± 2.1
1 36.0 ± 2.0
키네틴 　
0.1 17.3 ± 1.5
0.5 29.3 ± 2.5
1 32.7 ± 2.1
실시예 4. 식물체 재분화에 대한 옥신 및 사이토키닌 혼용 처리의 영향
옥신 (2,4-D, NAA)과 사이토키닌 (BA, 키네틴)을 혼용 처리하였을 경우는 0.1 mg/L의 NAA에 1 mg/L의 BA를 첨가한 배지에서 배양하였을 때 47%로 가장 높은 재분화 효율을 나타내었다 (표 4). 즉, 테프그라스 캘러스로부터 식물체의 재분화에는 사이토키닌 단용 처리보다 옥신 및 사이토키닌 혼용 처리가 더 높은 재분화 효율을 나타낸다.
성장 조절제 (mg/L) 식물체 재분화 (%)
2,4-D BA 　



0.1		 0.1 17.7 ± 1.5
0.5 26.0 ± 2.6
1 33.7 ± 1.5
키네틴 　
0.1 15.7 ± 2.1
0.5 26.0 ± 3.0
1 34.7 ± 2.1
NAA BA 　



0.1		 0.1 28.7 ± 2.5
0.5 36.7 ± 2.1
1 47.0 ± 2.6
키네틴 　
0.1 30.7 ± 1.5
0.5 39.7 ± 1.5
1 38.0 ± 2.6
실시예 5. 식물체 재분화에 대한 배양 배지의 영향
캘러스 유도와 식물체 재분화에 대한 기본 배지의 종류에 따른 배양효과를 규명하기 위하여 MS 배지, N6 배지 및 SH 배지에 본 발명에서 확립된 최적 배지 조성물을 첨가하여 조사한 결과, SH 배지에서 배양한 경우에 비해서 MS 배지 및 N6 배지에서 배양한 경우에 캘러스 형성율 및 식물체 재분화 효율이 더 높게 나타났다. 또한, MS 배지와 N6 배지 간의 캘러스 형성율 및 식물체 재분화 효율에는 큰 차이가 없는 것으로 관찰되었다 (표 5).
배지 테스트된
종자의 수		 캘러스 형성 (%) 이식된
캘러스의 수		 식물체 재분화 (%)
MS 120 91.8 ± 1.3 100 48.3 ± 1.5
N6 120 90.5 ± 2.5 100 48.7 ± 0.6
SH 120 76.4 ± 1.3 100 36.3 ± 2.5

Claims (12)

  1. (1) 테프그라스 (Teff grass, cv. Tiffany)의 성숙 종자를 에탄올로 살균한 후, 소듐 하이포클로라이트 (sodium hypochlorite) 용액에서 교반하면서 표면 살균하는 단계;
    (2) 2,4-D (dichlorophenoxyacetic acid) 또는 NAA (naphthaleneacetic acid), BA (benzyl adenine), 수크로오스, L-프롤린, 카제인 가수분해물 (casein hydrolysate) 및 젤라이트가 첨가된 MS 배지, N6 배지 또는 SH 배지에서 살균된 테프그라스의 성숙 종자로부터 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
    (3) 2,4-D 또는 NAA, BA 또는 키네틴 (kinetin), 수크로오스, L-프롤린, 티아민-HCl 및 젤라이트가 첨가된 MS 배지, N6 배지 또는 SH 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재분화하는 단계; 및
    (4) 수크로오스 및 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 테프그라스의 캘러스를 이용한 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (2)단계의 캘러스 유도에 사용되는 2,4-D 농도는 1~2 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (2)단계의 캘러스 유도에 사용되는 NAA 농도는 1~2 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (2)단계의 캘러스 유도에 사용되는 BA 농도는 0.05~0.2 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (3)단계의 캘러스로부터 신초 재분화에 사용되는 BA 농도는 0.5~1.0 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (3)단계의 캘러스로부터 신초 재분화에 사용되는 키네틴 농도는 0.5~1.0 mg/L인 것을 특징으로 하는 대량 생산 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    (1) 테프그라스 (Teff grass, cv. Tiffany)의 성숙 종자를 70% (v/v) 에탄올로 1분간 살균한 후, 5% (v/v) 소듐 하이포클로라이트 용액에서 30분간 교반하면서 표면 살균하는 단계;
    (2) 1~2 mg/L 2,4-D, 0.05~0.2 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.4~0.6 g/L 카제인 가수분해물 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 MS 배지 또는 N6 배지에 살균된 테프그라스의 성숙 종자로부터 캘러스를 유도 및 증식하는 단계;
    (3) 0.1 mg/L NAA, 0.5~1.0 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.5~2.0 mg/L 티아민-HCl 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가되고, pH 5.6~6.0으로 조절된 MS 배지 또는 N6 배지에서 상기 증식된 캘러스로부터 신초를 재분화하는 단계; 및
    (4) 25~35 g/L 수크로오스 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 1/2 MS 배지에서 상기 재분화된 신초의 뿌리를 유도하여 식물체로 분화시키는 단계를 포함하는 테프그라스의 캘러스를 이용한 테프그라스 식물체의 대량 생산 방법.
  8. 삭제
  9. 1~2 mg/L 2,4-D 또는 1~2 mg/L NAA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.4~0.6 g/L 카제인 가수분해물 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 또는 N6 배지를 유효 성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 옥신이 단용 처리된 테프그라스 식물의 캘러스 유도 및 증식용 배지 조성물.
  10. 1~2 mg/L 2,4-D, 0.05~0.2 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.4~0.6 g/L 카제인 가수분해물 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 또는 N6 배지를 유효 성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 옥신 및 사이토키닌이 혼용 처리된 테프그라스 식물의 캘러스 유도 및 증식용 배지 조성물.
  11. 0.5~1.0 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.5~2.0 mg/L 티아민-HCl 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 또는 N6 배지를 유효 성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 사이토키닌이 단용 처리된 테프그라스 식물의 신초 재분화용 배지 조성물.
  12. 0.1 mg/L NAA, 0.5~1.0 mg/L BA, 25~35 g/L 수크로오스, 0.4~0.6 g/L L-프롤린, 0.5~2.0 mg/L 티아민-HCl 및 2~4 g/L 젤라이트가 첨가된 MS 배지 또는 N6 배지를 유효 성분으로 함유하며, pH가 5.6~6.0으로 조절된, 옥신 및 사이토키닌이 혼용 처리된 테프그라스 식물의 신초 재분화용 배지 조성물.
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