DE2935864C2 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung ausgewählter Metaboliten aus Pflanzenzellen. Die Ansprüche 2 bis 4 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens. Der Anspruch 5 betrifft die Verwendung des gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 hergestellten Produkts. Dieses Verfahren beinhaltet ein auf beliebige Pflanzen anwendbares Verfahren der Embryogenese "in vitro".

In der Vergangenheit wurden viele Anstrengungen unternommen, um Pflanzen aus einzelnen Zellen zu erzeugen. So offenbart beispielsweise die GB-PS 13 87 821 die Erzeugung chemischer Pflanzenmetaboliten durch Suspensionszucht und wendet das Verfahren der Organogenese an. Das Verfahren wird als schrittweise Differenzierung ausgeführt, d. h. durch Organregeneration, die stattfindet, indem die der Kultur zugeführte Nährlösung einen abnehmenden Auxin-Spiegel zeigt.

Während der Regeneration wird unter "gedämpftem Licht" gearbeitet, wobei die Temperatur der Nährlösung zwischen 15 und 35°C variiert. Das Verfahren erfordert eine Dauer von über einem Jahr. Dadurch und durch die relativ geringe Ausbeute an Pflanzenmetaboliten ist es zur praktischen Herstellung ausgewählter Metaboliten aus Pflanzenzellen unter Verwendung pflanzlicher Zellkulturen nicht geeignet.

Es wäre jedoch wünschenswert, ein Verfahren zur Herstellung ausgewählter Metaboliten aus Pflanzenzellen in die Hand zu bekommen, das die Gewinnung derartiger Metaboliten aus Zellkulturen anstelle ihrer Gewinnung aus geernteten vollständigen Pflanzen auf reproduzierbare Weise ermöglicht.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein derartiges Verfahren zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung ausgewählter Metaboliten aus Pflanzenzellen gelöst, das die im Kennzeichen des Patentanspruchs 1 wiedergegebenen Merkmale aufweist.

Bevorzugte Ausgestaltungen eines derartigen Verfahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 4 wiedergegeben.

Anspruch 5 betrifft die Verwendung eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Produkts zur Einleitung der Differenzierung der Zellen einer pflanzlichen Zellkultur.

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren ausführlich näher erläutert.

Obgleich es auf Pflanzen jeder Art und damit zur Herstellung ausgewählter Metaboliten der verschiedensten Art angewandt werden kann, wird es nachfolgend insbesondere im Hinblick auf die Gewinnung von Tropan-Alkaloiden beschrieben, die als Metaboliten in der Natur in verschiedenen Mitgliedern der Pflanzenfamilie Solanaceae und Erythroxylaceae vorkommen. Die vier wichtigsten Tropan-Alkaloide sind Atropin, Scopolamin (Hyoscin), Hyoscyamin (aus Solanaceae) und Kokain (aus Erythroxylaceae).

Traditionell werden diese Tropan-Alkaloide aus solchen Pflanzen durch Extraktion gewonnen, die diese Tropan-Alkaloide in ausreichend hohen Mengen enthalten. Die Tropan-Alkaloide haben wohlbekannte medizinische Eigenschaften. Derartige Alkaloide enthaltende Pflanzen wurden daher bereits seit frühgeschichtlichen Zeiten für kriminelle, magische oder medizinische Zwecke verwendet. Gegenwärtig sind Tropan- Alkaloide als Wirkstoffe, z. B. in Spasmolytika, Mytriatika, Arzneimitteln gegen Parkinsonismus und Beruhigungsmitteln enthalten.

Zur Herstellung ausgewählter Metaboliten aus Pflanzenzellen wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von demjenigen pflanzlichen Material ausgegangen, von dem bekannt ist, daß von ihm derartige Metaboliten erzeugt werden. Pflanzen, die Tropan-Alkaloide als Metaboliten enthalten, sind Pflanzen der Familie Solanaceae oder Erythroxylaceae. Vorzugsweise wird zur Gewinnung von Tropan-Alkaloiden das Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Familie Solanacaceae genommen, einschließlich einer der folgenden Pflanzengattungen: Solanae, Daturae, Salpiglossidae, Nicandrae und Cestrae (Klassifizierung von Wettstein (1887), Emberger (1960), Melchior (1964)), oder einer der Arten Hyoscyamus spp. und Duboisia spp. Besonders vorzuziehen sind Pflanzen der Arten Hyoscyamus spp. der Duboisia spp. Besonderer Erwähnung wert sind Hyoscyamus muticus L. und Hyoscyamus aureus L. Beispiele geeigneter Mitglieder der Arten Duboisia spp. sind Duboisia leichardtii, Duboisia hopwoodii, und Duboisia myoporoides. Wie bemerkt kann die Pflanze eine aus der Familie Erythroxylaceae sein, einschließlich der Gattungen Erythrolylen spp., Celastraceae, einschl. Trypterigium wilfordii, Putterlichia verrucosa, und Maytenus buchananii oder Apocynaceae, einschl. Catharanthus spp., Papveraceae, einschl. Papaver spp. und Scopolia spp., Solanum spp., Micotiana spp., auch aus der Solanaceae Familie.

Darüber hinaus hat die Erfindung allgemeine Anwendbarkeit auf Pflanzen einschließlich z. B. Karotten, Tomaten, Minze, Erdbeeren, Tulpen, Rudbeckia, Antirrhinum majus, Rittersporn, Rosen, Tabak, Phaseolus, Acer, Sojabohnen, Rizinus und Weizen.

Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Anlegen einer Kultur mitotischer Zellen. Dazu kann gemäß Verfahrensvariante a₂) wie an sich bekannt vorgegangen werden, indem man von einer Verpflanzung ausgeht, eine Kallusbildung herbeiführt und das entsprechende mitotische Gewebe in ein Kulturmedium einbringt. Das als Ausgangsmaterial gewählte Pflanzenmaterial kann den verschiedensten Pflanzenteilen entstammen, z. B. Blatt, Stengel, Wurzel, Staubbeutel, Pollenkorn, Blütenblatt, Haarmaterial, vegetativem Meristem von Schößlingen oder floralem Meristem von Schößlingen oder dem Wurzelmeristem. Zu dem für Verpflanzungen geeigneten Pflanzenmaterial gehört auch inter-nodales Stielmaterial, vorzugsweise von floralen Stielen.

Das bekannte Verfahren zur Herbeiführung einer Kallusbildung geht üblicherweise aus von Schnittmaterial von einer ganzen Pflanze, um die ausgewählte Verpflanzung mit einem geeigneten Kulturmittel in Verbindung zu bringen, vorzugsweise unter gesteuerten aseptischen Umgebungsbedingungen. Dieses Verfahren ist z. B. geeignet für die Anwendung bei Stielsegment-Verpflanzungen. Vorzugsweise werden inter-nodale Segment-Verpflanzungen genommen und mit dem Kulturmittel in Berührung gebracht. Inter-nodale florale Stielsegmente sind für diesen Zweck besonders geeignet. Unter günstigen Bedingungen bildet sich Kallus an den Schnittenden der Verpflanzungen. Wenn man florale Stielverpflanzungen verwendet, ist es nicht erforderlich irgendein Auxin, Cytokinin oder Gibberillin dem Kulturmittel zuzufügen. Wenn die Verpflanzung aus einem anderen Teil der Pflanze herstammt, wird es gewöhnlich wünschenswert sein, in das Kulturmittel während der Kallusbildung eine Mischung aus einem Auxin und einem Cytokinin in geringer Konzentration einzubringen.

Um beste Ergebnisse zu erzielen, sollte die Mutterpflanze, aus der die Verpflanzung entnommen wird, in guter physiologischer Verfassung sein. Ich ziehe es vor, die Mutterpflanze durch hydroponische Kultur zu züchten, unter Verwendung einer herkömmlichen mineralischen Lösung von reguliertem pH, d. h. ein pH von ungefähr 5.1 bis ungefähr 5.4. Ich ziehe es auch vor, die Temperatur und die Lichtbedingungen zu steuern. Feuchtigkeitsbedingungen von ungefähr 70% relativer Feuchtigkeit sind geeignet.

Die Kultur mitotischer Zellen kann jedoch auch durch ein neuartiges erfinderisches Verfahren gemäß a₁) erfolgen, bei dem man von Sämlingen ausgeht, die man zur Bildung eines Tumorgewebes veranlaßt. Nach diesem neuartigen Verfahren dürfen die Samen der Pflanze keimen und Sämlinge hervorbringen, deren Wachstum durch ein erstes Auxin modifiziert wird. Nach einer Wachstumsperiode unter dem Einfluß des gewählten ersten Auxins werden die Sämlinge danach dem Einfluß eines zweiten Auxins ausgesetzt. Wenn die beiden Auxine richtig ausgewählt sind, wird ein Tumor herbeigeführt innerhalb einer weiteren Wachstumsperiode nach dem Wechsel zu dem zweiten Auxin, ohne daß es nötig ist, den Sämling zu schneiden.

Somit umfaßt Variante a₁) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Behandlung von Sämlingen mit einem ersten Auxin, wobei sich die Wurzeln unter dem Einfluß des ersten Auxins entwickeln dürfen, die Behandlung der so behandelten Sämlinge mit einem zweiten Auxin, das sich von dem ersten Auxin unterscheidet, und das Erzwingen der Entwicklung mitotischen Gewebes (Tumor). Bei der Anwendung dieser bevorzugten zweifachen Auxin-Behandlung habe ich herausgefunden, daß der erforderliche Zeitraum zur Erzielung eines nützlichen Ergebnisses, wie es ein gewünschter Metabolit ist, z. B. ein tropanes Alkaloid, mit Samen als Ausgangspunkt, kürzer ist als wenn ich den Weg einschlage, der die Herbeiführung eines Kallus von einer Verpflanzung umfaßt (z. B. bei Verwendung einer inter-nodalen floralen Stiel- Segment-Verpflanzung). Obgleich beides mitotische Zellen sind, unterscheidet sich in Tumor von einem Kallus, besonders in Bezug auf die Teilungsstufe, und ich habe gefunden, daß ein Tumor leichter zu verjüngen und zu differenzieren ist.

Das Auxin kann ein natürlich vorkommendes Auxin sein, die Verwendung eines synthetischen Auxins ist jedoch vorzuziehen. Typische synthetische Auxine sind u. a. 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 2,4-D), 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure (2,4,5-T), 4-(2,4-Dichlorphenoxy)buttersäure (4-(2,4-DB)), 2-(2,4-Di­ chlorphenoxy)propionsäure (2-(2,4-DP)), Natrium-2,3,6-tri­ chlorphenylacetat, Natrium-2-(2,4-dichlorphenoxy)äthylsulfat, Natrium-3-(2,4,5-trichlorphenoxy)propionat, 3-Indol-buttersäure, 1-Naphthalinacetamid und 1-Naphthalinessigsäure (NAA), wobei diese Aufzählung nicht erschöpfend ist. Als Beispiel für ein natürlich auftretendes Auxin kann 3-Indolessigsäure (IAA) erwähnt werden.

Bei der Behandlung von Sämlingen mit einem Auxin ziehe ich es vor, auch ein Zytokinin zu verwenden. Beispiele von geeigneten Zytokininen sind Kinetin, Zeatin und Benzyladenin. Zu diesem Zweck verwendet man eine Zytokinin- Menge, die sich im Bereich von ungefähr 0,0001 µg bis zu ungefähr 0,01 mg pro Liter bewegt. Gewöhnlich reicht es aus, Zytokinin-Mengen im Bereich von ungefähr 0,001 mg bis ungefähr 0,004 mg pro Liter zu verwenden.

Zusätzlich zu dem gewählten Auxin und dem gewählten Zytokinin ist es auch möglich, ein Gibberillin in Art einer gibberillischen Säure miteinzuschließen. Wenn jedoch ein Gibberillin mitenthalten ist, dann sollten geringere Mengen an Auxin und Zytokinin verwendet werden als in der Abwesenheit des Gibberillins.

Wenn ein Zytokinin und möglicherweise auch in Gibberillin in dem Wachstumsmittel enthalten ist zusammen mit dem ersten Auxin, dann fand ich es wünschenswert, dieses oder diese auch dem Wachstumsmittel beizufügen, das das zweite Auxin enthält. Auf diese Art ist der einzige Wechsel, der an dem Medium während der Bildung der mitotischen Zelle - in diesem Fall Tumor - vorgenommen wird, der Wechsel des Auxins. Durch dieses erfinderische Verfahren werden kritische Oberflächenänderungen an der Zellmembrane herbeigeführt, da die endogenen Hormone stimuliert werden. Wenn der "vegetative Punkt" des Schößlings, der "wachsende Punkt" der Wurzel einer Pflanze z. B. aus der Familie Solanaceae, Erythroxylaceae, Papaveraceae, Apocynaceae, in irgendeinem Stadium seiner Ontogenesis sukzessiv hormonaler Einwirkung (Auxin-Tätigkeit) ausgesetzt wird durch zwei verschiedene Hormone, entsteht ein Tumor, der schnell wächst. Die Bildung dieses Tumors ist weniger abhängig von der Konzentration und der Art dieser Hormone, sondern ist vielmehr ein Ergebnis der Zweistufigkeit der Behandlung.

Wenn von Samen ausgegangen wird, dann sollten diese vorzugsweise zuerst desinfiziert werden nach irgendeiner der bekannten Techniken, z. B. durch Kontakt mit Bromwasser oder mit einer verdünnten Lösung aus Natrium oder Kalzium Hypochlorit. Man läßt die Samen dann auf einem Filterpapier keimen, das nur mit destilliertem Wasser getränkt ist, unter sterilen Bedingungen, vorzugsweise unter gesteuerten Umgebungsverhältnissen. Vorzugsweise wird doppelt-destilliertes Wasser verwendet. Nach einem Verfahren werden die entstehenden Sämlinge dann vorzugsweise auf ein geeignetes festes Mittel umgepflanzt. Die regulierten Umgebungsverhältnisse werden vorzugsweise auch nach der Umpflanzung aufrecht erhalten. Das verwendete Mittel sollte diejenigen Mineralsalze enthalten, die für die Entwicklung der Pflanze erforderlich sind, in angemessenen Mengen und gleichfalls das erste Auxin, z. B. NAA. Das Mittel sollte vorzugsweise auch Spuren von Vitaminen enthalten. Jedes herkömmliche feste Pflanzenwuchsmittel kann verwendet werden, dem das erste Auxin zugefügt wird.

Die Zeitdauer, während der die Sämlinge dem ersten Auxin ausgesetzt sind, kann von ungefähr 1 bis ungefähr 12 Tagen variieren, aber vorzugsweise sollte sie sich im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 10 Tagen bewegen. Acht Tage sind im allgemeinen geeignet unter ordnungsgemäß regulierten Umgebungsbedingungen, da während dieser Wachstumsperiode im allgemeinen eine kräftige Wurzelentwicklung beobachtet wird.

Nach dieser Wachstumsperiode in Gegenwart des ersten Auxins werden die Sämlinge dem zweiten Auxin ausgesetzt, z. B. 2,4-D. Dies kann bewirkt werden, indem man den Sämling auf ein ähnliches festes Medium umpflanzt, das im wesentlichen mit dem vorher benutzten identisch ist, mit Ausnahme des verschiedenen Auxins.

Flüssigkultur-Techniken können anstelle der Festkultur- Techniken für den Sämling angewandt werden. So können die Samen in einem Teströhrchen auf einer Filterpapier- "Brücke" keimen, die nur in destilliertes Wasser getaucht wird. Nachdem der Sämling eine geeignete Größe erreicht hat, wird das destillierte Wasser (vorzugsweise doppelt-destilliertes Wasser) durch ein geeignetes flüssiges Medium ersetzt, das das erste Auxin enthält. Der Wechsel des Auxins wird besonders einfach erreicht, wenn eine Flüssig­ kulturtechnik angewandt wird, da es in diesem Fall nur erforderlich ist, das flüssige Medium, das das erste Auxin enthält, ablaufen zu lassen und ein ähnliches flüssiges Medium einzuführen, das das zweite Auxin enthält.

Die ersten und zweiten Auxine können in Mengen von z. B. ungefähr 0,0001 mg bis zu ungefähr 1 mg pro Liter angewendet werden, gewöhnlich mehr in dem Bereich von ungefähr 0,0005 mg bis zu 0,2 mg pro Liter. Häufig genügt es, Mengen von Auxin innerhalb des Bereichs von ungefähr 0,0005 mg bis zu ungefähr 0,1 mg pro Liter zu verwenden. Eine Auxin- Menge von weniger als ungefähr 0,0005 mg pro Liter wird normalerweise keine bedeutsame Wirkung hervorbringen. Da Auxine von unterschiedlicher Potenz sind, wird sich die optimal zu verwendende Menge mit der Art der Pflanze und von Auxin zu Auxin ändern. Man muß darauf achten, nicht zu viel Auxin zu nehmen, da viele synthetische Auxine eine herbizide Wirkung bei höheren Konzentrationen haben.

Aus dem erläuterten Grund tritt die Tumorbildung im allgemeinen wenigstens bei einem Teil der Sämlinge nach einer weiteren Wachstumsperdiode unter dem Einfluß des zweiten Auxins auf. Dieser Zeitraum kann variieren je nach den Umgebungsverhältnissen, unter denen die Sämlinge gezüchtet werden, aber unter günstigen Bedingungen kann er sich innerhalb des Bereichs von ungefähr 5 Tagen bis zu ungefähr 10 Tagen bewegen. Nach der ersen Wahrnehmung einer Tumorbildung kann das Wachstum in Gegenwart des zweiten Auxins über einen weiteren Zeitraum von z. B. ungefähr 5 Tagen bis zu ungefähr 10 Tagen fortgesetzt werden, bis ein passendes Stadium für den nächsten Verfahrensschritt erreicht ist.

Der nächste Verfahrensschritt - Verjüngung - ist ein sehr wichtiger Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens. Verjüngung wird beim Abschneiden eines Explants von einer Mutterpflanze gleich welcher Art i. d. R. beobachtet, aber dieser Schritt zurück durch die Jugendlichkeit erzeugt keine embryonalen Zellen. Bis heute hat man immer gedacht, daß meristematische Zellen embryonale Zellen sind und daß man eine Pflanze aus einer meristematischen Zelle direkt in einer Kultur züchten könnte. Obgleich man auf diese Art Pflänzchen erhalten hat, geschah dies ohne Embryogenesis und als ein Ergebnis der Regeneration. Meristematische Zellen sind, wie Kallus-Zellen und Tumor-Zellen, mitotische Zellen mit verschiedenen Entdifferentiationshöhen. Ich habe entdeckt, daß mitotische Zellen zuerst umgebungsmäßig verjüngt werden müssen, um eine Embryogenesis zu erreichen.

Blätter und Wurzeln sind ernährungsmäßig voneinander abhängig, der Austausch von wesentlichen Metaboliten zwischen ihnen erleichtert die Rückkoppelungssteuerung von Wachstum und Entwicklung. Diese Ergänzung ließ mit zu dem Schluß gelangen, daß nur differenzierte Zellen, die zu der Bildung einer neuen Pflanze unter Embryogenesis führen, die gleichen sekundären Metaboliten erzeugen können, die von der ganzen Pflanze synthetisch hergestellt werden. Z. B. Kohlehydrate, primäre Metabolite werden in dem Blatt durch Synthese aufgebaut, wohingegen N-Absorption durch die Wurzeln bewirkt wird, sein Metabolismus wird hauptsächlich in den Wurzeln erreicht. Knospen oder Wurzeln, die auf kultivierten Geweben sowohl Kallus als auch Zellensuspension entwickeln, machen charakteristische strukturelle Veränderungen durch in der Entwicklung der zytoplasmischen- Organellen - eine unvollständige morphogenetische Chlorplastentwicklung, wie es z. B. durch Elektron­ mikroskopische Studien enthüllt wurde - und anschließend in der Funktion dieser Organellen. Knospen und Wurzeln, die sich auf Kallus- oder Zellenkultur entwickeln, sind oft nicht durch Stranggewebe verbunden (weil die Wurzeln unter dem Einfluß der Knospe von benachbarten Zellen gebildet werden). Wenn aber die Wurzeln außerhalb der jungen Knospe gebildet werden (im Falle wenn ein Meristem einer vegetativen Mutterpflanze eingeimpft wird), werden Wurzeln gebildet und ein Pflänzchen entsteht, das sich zu einer reifen Pflanze entwickeln kann. Diese Technik, die zur Pflanzenvermehrung auf landwirtschaftlichem und gärtnerischem Gebiet angewandt wird, ist natürlich nicht für biochemische Zwecke geeignet.

Ich habe entdeckt, daß wenn mitotische Zellen verjüngt werden (Rejuvenation) und mittels gesteuerter Umgebungsfaktoren zum embryonalen Zustand zurückgebracht werden, daß ich dann von dem verjüngten Zellen normale gesunde Embryos und folglich Pflanzen erzeugen kann, wobei jede Zelle, entweder somatischen oder generativen Ursprungs, in der Lage ist, eine ganze Pflanze zu erzeugen. So nehme ich die mitotischen Zellen, ganz gleich ob sie von einer Verpflanzung oder von Sämlingen induziert wurden, und übertrage sie auf ein flüssiges Kulturmedium und vorzugsweise durch Schütteln oder irgendeine andere Art der Erschütterung verhindere ich das Absetzen oder "Klumpen" und erleichtere die Gasfreisetzung. Durch sorgfältige Regulierung der Umgebungsbedingungen werden die Zellen auf die embryonale Stufe verjüngt, und anschließend wird eine Differenzierung herbeigeführt. Auf diese Weise wird eine Zellkultur aus einzelnen embryonalen Pflanzenzellen von der gewählten Pflanze erzeugt. Verjüngung und Teilung schreiten günstig fort über eine Zeitdauer von ungefähr 10 Tagen bis ungefähr 14 Tagen, wonach die Zellen geerntet werden können zur Gewinnung ihres Metabolit-Gehalts, in Form eines Alkaloid-Gehalts. Alternativ kann die mitotische Kultur fortgepflanzt werden durch wiederholte Subkulturen, und nur ein Teil davon kann in zeitl. Abständen für die Schritte der Verjüngung und Differenzierung verwendet werden.

Die Differenzierung der Zellen kann spontan oder nicht spontan erfolgen. So können einige der Zellen teilweise differenziert werden, was zu der Entwicklung einer grünlichen oder rötlichen Tönung der Zelle führen kann (infolge der Bildung von Chlorophyll und einigen aromatischen Verbindungen). Ich habe jedoch entdeckt, daß eine Zellabtrennung positiv herbeigeführt werden kann durch eine geeignete Regulierung der Umgebungsverhältnisse, und insbesondere der Licht- und Temperaturbedingungen.

Es ist bekannt, daß die mitotischen Zellen nur Spuren von Metaboliten, solche wie Tropan-Alkaloide, enthalten, und ich habe die Richtigkeit dieser Tatsache festgestellt. Jedoch können Zellen Metaboliten, solche wie Tropan-Alkaloide, synthetisch herstellen, nachdem die Differenzierung stattgefunden hat. So wird gewöhnlich festgestellt, daß differenzierte Zellen einen Alkaloid-Gehalt zwischen ungefähr 0,8% und ungefähr 1% nach Gewicht haben, beruhend auf dem geernteten getrockneten Zellenkulturmaterial, d. h. von derselben Größenordnung wie der Alkaloid-Gehalt von ganzem Pflanzenmaterial. Ich habe weiterhin herausgefunden, daß wenn sich die differenzierten Zellen entwickeln um Embryoide zu bilden, der Tropan-Alkaloid Gehalt des geernteten Materials sich normalerweise steigert zu einem etwa höheren Prozentsatz als diesem. Wenn die Entwicklung der neuen Pflänzchen über die Embryo- und Sämlingsstufen hinaus fortgesetzt wird, fällt der Alkaloidgehalt des geernteten Materials wieder auf einen niedrigeren Prozentsatz zurück. Indem ich von Hyoscyamus muticus L. oder Hyoscyamus aureus L. ausging, habe ich von Embryoide enthaltenen Zellkulturen Alkaloid-Ausbeuten erhalten, die sich zwischen ungefähr 1% und ungefähr 5% nach Gewicht auf der Basis von getrocknetem geerntetem Pflanzenzellmaterial bewegten. Im Fall von Embryoide enthaltenen Kulturen, die man erhält, wenn man von Duboisia leichardtii oder Duboisia myoporoides ausgeht, kann die Alkaloid Ausbeute so hoch sein wie ungefähr 8% bis ungefähr 10% nach Gewicht, basierend auf getrocknetem geerntetem Zellenmaterial.

Das Ernten findet deshalb am besten kurz nach Eintritt der Differenzierung statt, und insbesondere wenn die Embryos vollständig ausgebildet sind.

Tropan-Alkaloide können gewöhnlich sehr leicht erhalten werden, wenn sich die Mehrheit der Zellen im embryoiden Stadium befindet, d. h. wenn torpedoförmige Embryoide sichtbar sind, aber vor der vollen Entwicklung des Sämlings (d. h. nach der Bildung von zwei Keimblättern). Wenn sich die Mehrzahl der differenzierten Zellen über die Embryo- und Sämlingsstufen hinaus entwickeln und Pflänzchen produzierenkann, wird die Rückgewinnung der Alkaloide im allgemeinen etwas komplizierter. Gewöhnlich ändert sich das Muster der gebildeten Alkaloide etwas, wenn sich die Pflänzchen entwickeln. Größere Alkaloide herrschen in den frühen Entwicklungsstufen vor, wenn kleinere Alkaloide ihren höchsten Stand in den Embryo- und Sämlingsstufen erreichen und allmählich abnehmen, wenn die Pflanze weiterwächst. Zusätzlich erscheinen sekundäre Metaboliten in den Embryos und werden leicht gewonnen bei guten Erträgen. Bei späteren Stufen umfaßt der Extraktionsprozess mehr Schritte (z. B. Fett, Pigment Eliminierung), und folglich je mehr Schritte erforderlich sind, um so geringer wird die Ausbeute an dem gewünschten Metabolit sein.

Die Extraktion von Alkaloiden ist deshalb am einfachsten in dem Embryoid- oder Sämlingsstadium. Jedoch hängt der optimale Zeitpunkt für die Ernte in einem gewissen Maße von dem speziell interessierenden Metabolit ab. Es kann besser sein, das Ernten über die embryoide Stufe hinaus zu verzögern, wenn der interessierende Metabolit in einem späteren Stadium höhere Proportionen erreicht, aber dieser Bestfall kann leicht bestimmt werden durch herkömmliche Forschung.

Bei meiner Arbeit an den Pflanzen der Gattung Hyoscyamus spp. und Duboisia spp. habe ich gefunden, daß das Wachstum der Pflanzen außerordentlich vom Licht beeinflußt wird, und in einem geringeren Ausmaß von Temperatur und Feuchtigkeit. Auf ähnliche Weise hat Licht einen Einfluß auf die mitotische Gewebebildung und -wachstum, und auf das Wachstum und die Entwicklung von Zellen in flüssiger Zellkultur. Die Temperatur ist auch von Bedeutung in dieser Hinsicht. Insbesondere kann die Differenzierung der Zellen bedeutend beeinflußt werden durch geeignete Steuerung, unter anderem der Beleuchtungsbedingungen.

Was die Beleuchtungsbedingungen betrifft, die in meinem Verfahren angewandt wurden, so sind drei Parameter von besonderer Bedeutung, nämlich das Spektrum, die Energiestufe und die Tageslänge.

Das Gesamtspektrum des Lichts, dem die Pflanzen, Samen, Sämlinge, mitotisches Gewebe, Zellen und Embryos ausgesetzt sind, kann gesteuert werden durch Wahl eines Lampentyps, der für Bestrahlungen verwendet wird, indem man für diesen Zweck die Spektraldaten benutzt, die von den Herstellern veröffentlicht wurden. Geeignete Lampen kann man von Leuchtstoffröhren der verschiedensten Typen auswählen, sowie Glühlampen, insbesondere Wolframfaden, Xenon und Joddampflampen.

Filter können verwendet werden, um, falls gewünscht, das Spektrum zu regulieren. Ich ziehe es vor, ein Licht zu verwenden, daß den Lichtbedingungen, die in der normalen Umgebung der Pflanzen vorherrschen, so nahe wie möglich kommt. So bevorzuge ich für die Pflanze Hyoscyamus muticus L. ein Licht, das dem tropischen Sonnenlicht nahekommt, wie man es in der Sahara und in ähnlichen Subwüsten-Regionen antrifft.

Um ein Licht zu erhalten, das dem tropischen Sonnenlicht nahekommt, verwendet man eine Mischung von Leuchtstoff- und Wolframfaden-Glühlampen.

Licht das reicher fern-rot als rot ist, kann erzeugt werden bei der alleinigen Verwendung der Wolframglühlampen, bei Verwendung von Xenonlampen oder Joddampflampen, oder bei Verwendung von "Grolux" Röhren.

In einem ersten bevorzugten System wird die Bestrahlung so ausgeführt, daß sie lange Tage tropischen Sonnenlichts nachahmt, z. B. Bestrahlung mit simuliertem tropischen Sonnenlicht über Zeiträume von ungefähr 16 Stunden, mit eingestreuten Nachtperioden, die z. B. ungefähr 8 Stunden dauern. Diese Pflanzen sind tagneutrale Pflanzen, die lange Tag- Perioden bevorzugen.

In einem alternativen zweiten System können lange Tage simuliert werden durch Bestrahlung mit nachgeahmtem tropischen Sonnenlicht über Zeiträume von z. B. 9 Stunden tropischen Lichts gefolgt von 15 Stunden Nacht, von denen 7 Stunden Glühlampenlicht sind, das reicher fern-rot als rot ist und von Wolframfadenlampen geliefert wird, und die verbleibenden 8 Stunden herrscht Dunkelheit.

Bei einem dritten System folgt auf eine 9-stündige Periode tropischen Lichts eine 15-stündige Periode von Glühlicht (und keine Dunkelheitsperioden).

Bei einem vierten System folgt auf 16 Stunden Tag, geliefert von einer Decke, die aus einer Mischung von Leuchtstoffröhren "Grolux" und Wolframglühfadenlampen besteht, eine 8-stündige Nacht.

Die Photoperiode wird ausgewählt gemäß den Erfordernissen der ganzen Pflanze in ihrer natürlichen Heimat, wie z. B. bei Gewebe oder Zellen der Hyoscyamus muticus L., eine Photoperiode von vorzugsweise 16 Stunden oder mehr, aber weniger als 24 Stunden pro 24-Stunden-Tag. Wenn die Aufzucht bei einer Photoperiode von 24 Stunden durchgeführt wird, entsteht eine physiologische "Ermüdung". Für Hyoscyamus aureus L. in Kultur ist eine Photoperiode von 16 Stunden optimal (dies ist eine strikte Langtagspflanze in ihrer Heimat); Papaver bracteatum L. erfordert eine Photoperiode von 9 Stunden; und Trypterigium wilfordii benötigt auch eine Photoperiode von 9 Stunden.

Die Energiestufe kann verschieden sein innhalb weiter Grenzen, z. B. von 2000 bis zu 400 000 erg. pro cm² pro Sekunde oder mehr. Ich haben jedoch herausgefunden, daß Energiestufen innerhalb des Bereichs von 100 000 bis 200 000 erg. pro cm² pro Sekunde, z. B. ungefähr 140 000 erg. pro cm² pro Sekunde, für Pflanzen (und davon abgeleitetes Pflanzenmaterial), die Mitglieder der Gattung Duboisia spp. und Hyoscyamus spp. sind, vorzuziehen sind.

Während jeder meiner Verfahrensstufen ist die Temperatur von großer Bedeutung, und jede Pflanze hat ihre eigenen Temperatur Erfordernisse, im allgemeinen wird eine lauwarme und konstante Temperatur (27°C.) für die Stufen der Keimung und Tumorherbeiführung aufrechterhalten. Nach Erzielung der mitotischen Zellen werde diese einer geänderten Temperatur unterworfen. Auf diese Art wird die Verjüngung herbeigeführt. Wenn man Pflanzenmaterial von Hyoscyamus muticus spp. verwendet, wird eine Temperatur von 27°C während der Keimung und Tumorherbeiführung aufrechterhalten, und die mitotischen Zellen werden einem geänderten System von 27°C/17°C (Tag/Nacht) unterworfen.

Während des Wachstums von Pflanzen, Verpflanzungen, Zellen, Tumore, ist es wünschenswert, die Feuchtigkeit auf einem Stand von ungefähr 70% relativer Feuchtigkeit zu halten.

Jedoch kann die Feuchtigkeit zwischen ungefähr 40% bis zu ungefähr 70% relativer Feuchtigkeit variieren.

Das Ernten und Extrahieren kann nach irgendeinem bekannten Verfahren durchgeführt werden, z. B. Gefriertrocknung für Ernten, gravimetrische Techniken, Abteilungs-Chromatographie (Kieselguhr), deren Schichten-Chromatographie für die Extraktion.

Bei der Entwicklung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde festgestellt, daß als neuartiger Metabolit ein Zimtderivat auftritt, daß als "Bote" wirkt und eine Reihe interessanter Eigenschaften aufweist.

Das Pflanzenmaterial, aus dem man den "Boten", ein Zimtderivat, gewinnen kann, kommt von den Solanaceae und Erythroxylaceae Familien, z. B. die Gattungen Hyoscyamus spp. oder Duboisia spp. sind die reichsten. Die Gattung Hyoscyamus spp. schließt Hyoscyamus niger ein, die in Europa gefunden wird, sowie die tropischen Pflanzen Hyoscyamus muticus L. und Hyoscyamus aureus L. Die Gattung Duboisia spp. enthält die Pflanzen Duboisia leichardtii und Duboisia myoporoides.

Dieses neuartige Zimtderivat müßte auch durch Extraktion aus ganzen Pflanzen der genannten Arten unter Anwendung irgendeiner bekannten Extraktionstechnik für Zimtderivate oder Glucoproteide gewinnbar sein. Dieses Zimtderivat wird jedoch auf vorteilhafte Weise auch nach den erfindungsgemäßen Verfahren der Embryogenesis "in vitro" erhalten. D. h. Pflanzenmaterial der Gattung Duboisia spp. oder Hyoscyamus spp. wird veranlaßt, einen Tumor zu erzeugen und wird davon verjüngt. Die Zellkultur wird mit einem ausgewählten Lichtspektrum behandelt, um qualitative und quantitative Änderungen des metabolischen Musters herbeizuführen.

Ich habe herausgefunden, daß wenn die aktive Form des Phytochroms erregt wird, im Falle dieser Pflanzen das Wachstum reguliert wird, während im Falle mitotischer Zellen die Differenzierung herbeigeführt wird. So habe ich entdeckt, daß bei Bestrahlung der Zellkultur mit Licht reicher an fern-rot als an rot (max. Einwirkung bei 730 nm), die aktive Form des Phytochroms erregt wird, und die entsprechenden physiologischen Wirkungen werden in der Zellkultur beobachtet, und das Zimtderivat wird in großer Ausbeute erzeugt. Dies trifft auch für die ganze Pflanze zu.

Monochromatore oder Filter können dabei verwendet werden, um das Spektrum in den entfernt roten und infraroten Regionen zu vergrößern.

Besonders gute Ausbeuten werden erhalten, wenn Lichtsysteme verwendet werden, die Photoperioden liefern.

In einem ersten bevorzugten System wird die Bestrahlung mit künstlichem tropischen Tageslicht (tropisches Licht) (Decke (1)) ungefähr 9 Stunden lang durchgeführt, sofort gefolgt von 7 Stunden monochromatischen fern-rot Lichts oder Licht von Wolframfadenglühlampen, gefolgt von 8 Stunden Dunkelheit, um den Tag von 24 Stunden zu vervollständigen.

In einem zweiten System folgen auf eine 9-stündige Periode von künstlichem tropischen Tageslicht (Decke (1)) 15 Stunden mit monochromatischem fern-rot Licht oder Licht von Wolfram­ fadenglühlampen, um den Tag von 24 Stunden zu vervollständigen.

In einem dritten System folgt auf eine 16-stündige Photoperiode (Tropisches Licht), das von einer der Decken (2) bis (5) oben geliefert wird, eine 8-stündige Dunkelheit.

In einem vierten System wird eine der obigen Decken (2) bis (5) für eine fortgesetzte Beleuchtung (24 Stunden pro 24-Stundentag) verwendet.

Bei Pflanzen, die reich an diesem "Boten" sind, ergibt sich der Differenzierungsprozeß automatisch, indem man einfach einen täglichen Rythmus herbeiführt, oder indem man in den Zellen eine physiologische Uhr stellt, z. B. mit vorgewählter Tag/Nacht Temperatur, Photoperiode.

Es ist günstig, alle Stufen des Pflanzenwachstums und/oder der Zellkultur in einer gesteuerten Umgebung auszuführen, wie es z. B. ein sogenanntes "Phytotron" bieten kann. Die Energiestufe und Feuchtigkeit werden in der bereits beschriebenen Art gesteuert.

Wie bereits erwähnt scheint das Zimtderivat der Erfindung in der Lage zu sein, eine Differenzierung von Zellen in einer großen Vielzahl von Pflanzen herbeizuführen. So liefert die Erfindung in weiterer Hinsicht ein Verfahren zur Herbeiführung der Differenzierung in Pflanzenzellen in einer Kultur derselben, was das Züchten der Pflanzenzellen in Anwesenheit von differenzierten Zellen einschließt, die das Zimtderivat enthalten, wie diejenigen, die man aus der Gattung Hyoscyamus spp. oder Duboisia spp. gewinnt. Ganz oder teilweise differenzierte Zellen, die man aus der Gattung Hyoscyamus spp. oder Duboisia spp. gewonnen hat, können der Kultur derjenigen Zellen hinzugefügt werden, in denen man eine Differenzierung herbeizuführen wünscht.

In noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren geliefert zur Herbeiführung der Differenzierung in Pflanzenzellen in einer Kultur derselben, bei dem der Kultur eine physiologisch wirksame Menge des Zimtderivates beigefügt wird, und die Kultur wird unter geeigneten Bedingungen für das Zellwachstum gehalten.

Das Verfahren der Embryogenesis "in vitro" kann auch auf Pflanzen angewandt werden, die nicht Mitglieder der Spezies Hyoscyamus spp. oder Duboisia spp. sind, praktisch auf jegliche Pflanzenquellen. Typischer Vertreter dieser Pflanzenquellen sind Angehörige der Spezies Papaver spp., Catharantus spp., Rauwolfia spp., Cassia spp., Ricinus spp., Agave spp. und Piptadenia spp. Diese Gattungen sind von besonderer Wichtigkeit, da deren Mitglieder wichtige medizinische Verbindungen hervorbringen, unter denen man Alkaloide, Anti- Tumormittel, Immunität verhindernde Mittel, Saponine, Steroide und Herz-Glykoside usw. erwähnen könnte.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die Fig. näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 das relative Fluoreszenzspektrum der Verbindungen eines gemäß Beispiel 1 gewonnenen Extraktes,

Fig. 2 ein entsprechendes Ultraviolettspektrum,

Fig. 3 (photographische Darstellung a) die Abfolge der Stufen des Beispiels 1 anhand photographischer Darstellungen,

Fig. 4 (photographischer Darstellung b) die Abfolge der Stufen bei der Durchführung des Verfahrens gemäß Beispiel 2,

Fig. 5 (photographische Darstellung c) die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Variante gemäß Beispiel 3,

Fig. 6 und 7 photographische Darstellung der stufenweisen Zelldifferenzierung von einzelnen Zellen zu Pflänzchen.

Das synthetisches Standardmedium, das in den Beispielen verwendet wird (modifiziertes Medium von Wood und Braun), ist aus den folgenden Vorratslösungen hergestellt:

(a) Lösung I von White (Mengen in 2 Liter Lösung)
Ca(NO₃)₂ · 4H₂O|5,96 g
Na2SO₄ · 10 H₂O	9,16 g
KCl	1,30 g
NaH₂PO₄ · 2 H₂O	0,628 g
MgSO₄ · 7 H₂O	14,96 g
MnSO₄ · 4 H₂O	0,132 g
ZnSO₄ · 4 H₂O	0,054 g
H₃BO₃	0,030 g
KI	0,015 g
H₂O	bis 2 Liter

(b) Lösung II von White (Mengen in 2 Liter Lösung)
Glyzin|0,30 g
Nikotinsäure	0,05 g
Thiamin-Hydrochlorid	0,01 g
Pyridoxin-Hydrochlorid	0,01 g
H₂O	bis 2 Liter

(c) Lösung von Wood und Braun (Mengen in 2 Liter Lösung)
KCl|16,90 g
NaNO₃	36,00 g
MgSO₄ · 7 H₂O	20,00 g
NaH₂PO₄ · 2 H₂O	6,93 g
H₂O	bis 2 Liter

Um 1 Liter des synthetischen Standartmediums herzustellen, werden die folgenden Bestandteile gemischt:

Lösung I von White|100 ml
Lösung II von White	10 ml
Lösung von Wood und Braun	100 ml
(NH₄)₂SO₄ (0,79 g/Liter)	10 ml
Glukose	30 g (oder Saccharose 20 g)
Agar	10 g
1 M Inosit Lösung	10 ml
Fe EDTA Komplexlösung	1 ml
H₂O	bis 1 Liter

(EDTA ist Äthylendiamintetraessigsäure; die Fe EDTA Komplex Lösung enthält 7,84 mg des Komplexes pro Liter).

Beispiel 1

Hyoscyamus muticus L.-Pflanzen werden aus Samen in Wasserkultur gezogen unter Verwendung einer Mineralsalzlösung (siehe P. Chouard und M. Tran Thanh Van, C. R. Acad, Sc. Paris, 259 (1964), S. 4783-4786), bei einem pH von 5,1 bis 5,4 unter bestimmten Licht-, Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen. Das Spektrum des verwendeten künstlichen Lichts ist so vollständig wie möglich um tropisches Tageslicht zu simulieren. Das Infrarot/Rot Verhältnis ist ungefähr 1. Die Tageslänge wird auf 16 Stunden gesteuert, gefolgt von einer Nachtperiode von 8 Stunden. Das tropische Licht wird von einer künstlichen Beleuchtungsdecke phytotronischen Typs geliefert, die sich aus einer Mischung von Leuchtstofffröhren, d. h. "Atlas" Tageslichtröhren, und Wolframfadenglühlampen zusammengesetzt. Die Energiestufe des künstlichen Tageslichtes wird auf ungefähr 140 000 erg pro cm² Sekunde gesteuert. Die Temperatur wird bei 27°C gehalten. Die relative Feuchtigkeit ist 70%.

Wenn die Pflanzen zu einem geeigneten Stadium herangewachsen sind, werden Blütenstengel oder meristematisches Gewebe als Explant verwendet und unter sterilen Bedingungen in einen 250 ml Erlenmeyerkolben gesetzt, der ungefähr 50 ml eines festen Nährstoffes enthält, der aus dem synthetischen Standardmedium (abgeändertes Medium von Wood und Braun) besteht, dem 7 bis 10 Gewichtsprozente von Agar zugefügt sind. Diesem Nährstoff wird kein Phytohormon zugefügt. Der pH des Mediums ist 5.1 und 5.4. Wenn das Explant anderen Ursprungs ist, wird Phytohormon dem Nährstoff beigefügt mit einer Endkonzentration von 0,001 mg/l Kinetin und 0,2 mg/l von 2,4-D. Die gleichen Beleuchtungs- und Temperaturbedingungen und die gleiche Photoperiode werden beibehalten. Zur gegebenen Zeit kann die Kallusbildung beobachtet werden.

Dieses mitotische Gewebe wird in einen frischen ähnlichen Nährboden übertragen und kann dann wachsen unter den gleichen gesteuerten Beleuchtungsbedingungen und einem System der Tag und Nacht Temperatur von 27°C/17°C.

Einige kleine Teile dieses embryonalen Gewebes werden in eine Anzahl von 250 ml Erlenmeyerkolben übertragen, von denen jeder ungefähr 50 ml des flüssigen Nährstoffs (modifizierter Wood und Braun) enthält. Die Kolben werden fortwährend leicht geschüttelt, um den Gasaustausch oder dessen Feilassung zu fördern und um ein "Klumpen" oder Absetzen der Zellen zu verhindern. Die Kulturen werden dann den gleichen zuletzt erwähnten Temperatur- und Lichtbedingungen unterworfen.

Die Zellen multiplizieren sich und nehmen eine grünliche, rötliche oder rosa Färbung an, was anzeigt, daß schon etwas Differenzierung stattgefunden hat. Durch Änderung der spektralen Lichtqualität: 9 Stunden tropisches Licht unmittelbar darauffolgend 7 Stunden Glühlichtversorgung, erhält man während 1 bis 8 Tagen eine vollständige Rückdifferenzierung mit Embryobildung bei verschiedenen Entwicklungsstufen, ungefähr 100 000 pro Kolben. Zur Durchführung des Ernte- oder Extraktionsprozesses wird der Differenzierungsprozeß auf dieser Stufe angehalten. Die Gesamtdauer beträgt weniger als vier Monate.

Wird die Ausbildung vollständiger neuer Pflanzen gewünscht, kann der Differenzierungsprozeß weiter fortgeführt werden.

Der gewonnene Extrakt wurde UV-spektroskopisch sowie dünn­ schichtchromatographisch auf seine Inhaltsstoffe untersucht. Die Fig. 1 und 2 zeigen das Ultraviolettspektrum bzw. die relative Fluoreszenz der Verbindungen des Extrakts sowie von 5-Hydroxyferulasäure (5HFA), die als bekannte Bezugssubstanz dient. Kurve 1 stammt von einer neuartigen Steroidverbindung, die bei der Dünnschicht-Zellulose-Chromatographie einen Rf-Wert in Aceton von 0,01 zeigt und im UV-Licht hellblau fluoresziert. Bei der Dünnschicht-Kieselgel-Chromatographie mit dem Lösungsmittelsystem Äthylazetat/Petroläther (7 : 3) weist sie einen Rf-Wert von 0,01 auf. Kurve 4 ist die Kurve für 5-Hydroxyferulasäure (5HFA). Kurve 3 ist die Kurve für einen neuartigen nichtzytotoxischen Zimtderivat-Metaboliten, dessen Biosynthese offensichtlich von PAL (Phenylalanin- Ammoniak-Lyase) des Pflanzenmaterials der Spezies Hyoscyamus und Duboisia abhängig ist; dieser neue Metabolit erwies sich als Wachstumsregler und als wirksam für die Herbeiführung der Zelldifferenzierung in Pflanzenzellen und weist möglicherweise Antitumor-Eigenschaften auf; dieser Metabolit scheint ein der 5-Hydroxyferulasäure (5HFA) chemisch verwandtes Zimtderivat zu sein, dessen Chromophor bei der Dünnschicht-Kieselgel-Chromatographie einen Rf- Wert in Äthylacetat/Petroläther (7 : 3) von ungefähr 0,7 zeigt und eine gelbe Fluoreszens im UV-Licht. Kurve 2 ist die Kurve eines weiteren neuartigen Metaboliten (Zimtderivat), der ebenfalls PAL-abhängig ist und einen Rf-Wert von 0,4 und eine stark blaue Fluoreszenz im UV- Licht aufweist. Bei der Dünnschicht-Zellulose-Chromatographie mit Aceton als Lösungsmittel weisen die Substanzen der Kurven 3 und 2 einen Rf-Wert von 0,4 bzw. von 0,7 auf.

Das vorliegende Beispiel wird durch die Fotographien gemäß Fig. 3 weiter illustriert. Fig. 3 zeigt dabei die Keimung der Hyoscyamus muticus L. Samen auf der mit 1 bezeichneten Stufe. Stufe 2 zeigt die Wasserkultur der Mutterpflanze. Stufe 3 illustriert den Beginn der Kallusbildung aus einer Blütenstielverpflanzung unter sterilen Bedingungen auf einem Agar Nährboden. Das Wachstum von teilweise differenzierten mitotischen Zellen auf einem Agar Nährboden unter sterilen Bedingungen ist in Stufe 4 gezeigt.

Eine Zellen-Suspensionskultur, die nach dem erfingungsgemäßen Verfahren der in vitro-Embryogenese verjüngte und differenzierte Zellen enthält, ist in Stufe 5 gezeigt, während Stufe 6 ein Dünnschicht-Chromatogramm von verschiedenen Alkaloidproben zeigt, die aus den differenzierten Zellen gewonnen wurden, wobei Scopolamin als Norm (linker Fleck) genommen wurde. Das gezeigte Chromatogramm wurde nach der in J. Chromatog., 31 (1967), 252-254, beschriebene Technik angefertigt.

Beispiel 2

Samen von Hyoscyamus muticus L. werden sterilisiert durch ein kurzes Eintauchen in 10%igem Bromwasser. Sie werden dann auf feuchtes (doppeldestilliertes Wasser) Filterpapier übertragen, das in einer Petrischalte enthalten ist, die dann in eine auf 27°C gehaltene Wachstumskammer gesetzt wird und nach einem System bestrahlt, das aus 9 Stunden von simuliertem tropischen Tageslicht besteht, unmittelbar darauffolgend eine 7-stündige Beleuchtung mit Wolframfadenglühlampen, und dann eine 8-stündige Dunkelheitsperiode. Das Licht, das verwendet wird, um das simulierte Tageslicht zu bieten, wird von einer künstlich beleuchteten Decke des phytotronischen Typs geliefert, die sich aus "Atlas" Tageslicht-Leuchstoffröhren und Wolframfadenglühlampen zusammensetzt. Die Energiestufe beträgt ungefähr 140 000 erg pro cm² Sekunde. Innerhalb von 24 Stunden nach Beginn dieser Behandlung keimen die meisten der Samen. Die Petrischale wird dann einem Normalbeleuchtungssystem von 16 Stunden tropischen Lichts gefolgt von 8 Stunden Dunkelheit ausgesetzt. Nach 7 Tagen sind die Sämlinge ausreichend entwickelt für die Verpflanzung.

Immer noch unter sterilen Bedingungen werden die Sämlinge auf ein synthetisches festes Medium verpflanzt, das aus dem in Beispiel 1 verwendeten Standard-Mineralsalznährstoff besteht und 10 Gewichtsprozent an Agar enthält, dem 0,01 mg NAA pro Liter und 0,001 mg Kinetin pro Liter zugefügt werden.

Die Beleuchtung der Sämlinge wird wie vorher fortgesetzt und die Temperatur wird konstant auf 27°C gehalten.

Nach 10 Tagen dieses Systems haben die Sämlinge ein kräftiges Wurzelwachstum entwickelt und werden dann auf ein ähnliches festes Medium verpflanzt, das aber 0,02 mg an 2,4-D pro Liter anstatt der 0,01 mg NAA pro Liter enthält. Nach 3 Tagen weiteren Wachstums, immer noch unter den gleichen Umgebungsbedingungen, wird eine tumoröse Gewebebildung sichtbar. Dieses Gewebewachstum setzt sich 7 Tage lang fort. In diesem Stadium werden die Wurzeln des Pflänzchens mit einem weißlichen flockigen Tumor bedeckt. Wenn einige der Tumorzellen auf eine andere Portion des gleichen 2,4-D enthaltenden festen Nährstoffes übertragen werden, fahren sie fort sehr schnell zu wachsen.

Einige der Tumorzellen werden danach auf ein abgeändertes Wood und Braun Medium übertragen, mit oder ohne Auxin, und nach dem Verfahren des Beispiels 1 aufgezogen. Das Ernten nach dem Verfahren des Beispiels 1 ergibt ähnlich Resultate.

Die photographische Darstellung gemäß Fig. 4 zeigt bei 1 keimende Samen, und die daraus resultierenden Sämlinge werden in Stufe 2 auf ein festes Medium verpflanzt, das ein erstes Auxin enthält. Eine weitere Verpflanzung auf ein festes Medium, das ein zweites Auxin enthält, führt zu einer Tumorbildung (Stufe 3). Eine Übertragung derartiger Tumorzellen auf einen anderen Teil des festen Mediums, das das zweite Auxin enthält, ermöglicht das weitere Wachstum der Zellen (Stufe 4). Stufe 5 zeigt flüssige Zellkulturen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren der in vitro-Embryogenese verjüngte und differenzierte Zellen enthalten, während Stufe 6 die Ergebnisse der Alkaloid-Extraktion und Identifizierung zeigt.

Beispiel 3

Die Beispiele 1 und 2 wurden wiederholt mit Hyoscyamus aureua, bei Verwendung einer Photoperiode von 16 Stunden pro 24-Stunden Tag und einer Tag/Nacht-Temperatur von 22°C/17°C und erzielten bessere Ergebnisse.

Beispiel 4

Samen der Duboisia myoporiodes, die durch ein kurzes Eintauchen in 10%igem Bromwasser sterilisiert wurden, werden einzeln auf Filterpapier-"Brücken" gesetzt, die so angeordnet sind, daß sie in doppeltdestilliertes Wasser in entsprechenden Teströhrchen tauchen unter sterilen Bedingungen. Die Samen werden bei 27°C bestrahlt bei einer Energiestufe von 140 000 erg pro cm² pro Sekunde, mit künstlichem tropischen Tageslicht von der Art wie in Beispiel 1 beschrieben, während 9-stündigen Photoperioden, unterbrochen von 15-stündigen Dunkelheitsperioden. Sämlinge entwickeln sich, und nach 7 Tagen wird das destillierte Wasser in jeder Röhre ausgeschüttet und ersetzt durch eine Menge des synthetischen flüssigen Nährstoffes (abgeänderter Wood und Braun Nährstoff), der 0,01 mg NAA pro Liter und 0,001 mg Kinetin pro Liter enthält. Dieselben Temperatur- und Beleuchtungsbedingungen werden für weitere 7 Tage beibehalten, und darauffolgend wird der Nährstoff durch einen ähnlichen flüssigen Nährstoff ersetzt, der 0,02 mg 2,4-D pro Liter enthält anstelle des NAA, aber sonst mit dem NAA enthaltenen Nährstoff identisch ist. Tumorzellen bilden sich und das Wachstum wird unter den gleichen Bedingungen für weitere 14 Tage aufrechterhalten.

Die Tumorzellen werden dann in einem flüssigen Nährstoff gemäß den in Beispiel 1 angewandten Beleuchtungsbedingungen und einer Tag/Nacht-Temperatur von 22°C/12°C gezüchtet. Die Zellen werden dabei verjüngt und differenziert und danach nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren geerntet. Ähnliche Ergebnisse werden erzielt.

Die photographische Darstellung gemäß Fig. 5 zeigt die neuartige Filterpapier-"Brücken"-Technik zur Keimung von Samen. Der Samen (Stufe 1) kann auf einer "Brücke" aus Filterpapier in einem Reagenzglas keimen, das doppelt destilliertes Wasser enthält. Nach der Keimung wird das Wasser durch ein synthetisches flüssiges Wachstumsmedium ersetzt, das das erste Auxin enthält (Stufe 2). Indem man ein ähnliches Medium, das ein zweites Auxin enthält, substituiert, kommt es zur Bildung von Tumorzellen (Stufe 3). Eine Subkultur der Tumorzellen kann auch auf einer Filterpapier- "Brücke" gezüchtet werden (Stufe 4). Die Darstellungen von Stufe 5 und Stufe 6 entsprechen denen der vorausgehenden Fig. 4. Die Photographien gemäß Fig. 6 und Fig. 7 zeigen in den Stufen (a) bis (d) verschiedene Stadien der Zelldifferenzierung, und zwar vom Stadium der einzelnen Zellen zu Pflänzchen (vollständige Embryogenese) über die Zwischenstadien der kugelförmigen Embryoide, der torpedoförmigen Embryoide bis zu Embryos.

Beispiel 5

Eine Weizen-Zellkultur wird in einem auxinfreien flüssigen Medium nach herkömmlichen Methoden vorbereitet. Ungefähr 10 ml der Lösung, die man aus derjenigen Reihe in Beispiel 1 entnimmt, die das Zimtderivat enthält, wird der Weizen- Zellkultur hinzugefügt. Die sich ergebende Kultur wird bei 25°C und fortwährend Schütteln gehalten und wird gemäß dem folgenden System beleuchtet: 24 Stunden unter einer Decke des phytotronischen Typs. Nach 4 bis 6 Wochen wird eine große Anzahl torpedoförmiger Embryos sichtbar.

Beispiel 6

Eine Weizen-Zellkultur wird in einem auxinfreien flüssigen Medium nach herkömmlichen Methoden vorbereitet. Diesem werden differenzierte Zellen von Hyoscyamus aureua L. zugefügt. Die Kultur wird dann gemäß den in Beispiel 5 verwendeten Bedingungen gezüchtet, mit Ausnahme eines anderen Systems von 9 Stunden "Atlas" Tageslicht-Leuchtstofflampen und Wolframglühlampen, gefolgt von 7 Stunden mit nur Wolframfadenglühlampen, gefolgt von 8 Stunden Dunkelheit. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt.

Beispiel 7

Eine Zellkultur in einem auxinfreien flüssigen Nährstoff wird nach herkömmlichen Methoden von Catharanthus roseus L. hergestellt. Differenzierte Zellen von Hyoscyamus muticus L. werden der Kultur hinzugefügt, die dann gemäß den Bedingungen des Beispiels 6 gezüchtet wird. Nach einigen Wochen können differenzierte Zellen unter einem Mikroskop beobachtet werden.

Ferner kann in einem ultravioletten Mikroskop die Gegenwart von fluoreszierenden Alkaloiden (folglich andere Alkaloide als Tropan-Alkaloide) festgestellt werden. Diese Alkaloide werden ferner durch TLC identifiziert, was eine positive Reaktion in der Dragendorf-Reaktion gibt, und so eine Bestätigung der Rückdifferenzierung der Catharanthus roseus/Zellen L. liefert.

Beispiel 8

Man nimmt eine Sykomore-Zellkultur (5 Jahre alt), die auf herkömmliche Weise in einem flüssigen auxinfreien Nährstoff präpariert wird. Zellen von Hyoscyamus muticus L. werden hinzugefügt, und die Kultur wird gemäß den Bedingungen des Beispiels 6 gezüchtet. Nach einigen Wochen können phenolische Verbindungen in den Medien festgestellt werden, was anzeigt, daß wenigstens einige der Sykomore-Zellen zur Rückdifferenzierung veranlaßt wurden.

Beispiel 9

10 ml des chromatographisch teilweise gereinigten Zimtderivats aus Beispiels 1 wird dem Nährboden einer epidermoidalen Gewebekultur von Thorenia furnieri zugefügt, und in einem anderen Fall 100 ml des teilweise gereinigten Zimtderivats des Beispiels 1. Im ersten Fall macht ein hoher Prozentsatz der Zellkerne nach 24 Stunden eine Mitrose durch. Im zweiten Fall wurde keine Aktivität beobachtet.

Beispiel 10

Die in Beispiel 1 isolierte Lösung des Zimtderivats wird bakteriziden Versuchen unterworfen. Es zeigt sich eine bakteriostatische Aktivität in Bezug auf E. coli, B. Linchiformis und Azotobacter, B. aureus.

Beispiel 11

Das Verfahren des Beispiels 2 wird unter Verwendung von Duboisia leichardtii wiederholt. Ähnliche Ergebnisse werden erzielt.

Beispiel 12

Hyoscyamus muticus L. Pflanzen werden in einem Raum mit geregelter Temperatur aus Samen in Wasserkultur gezüchtet, unter Verwendung einer Mineralsalzlösung (siehe P. Chouard und M. Tran Thanh Van, C. R. Acad, Sc. Paris, 259 (1964), S. 4783-4786), bei einem pH von 5.1 bis 5.4, gemäß spezifierten Licht-, Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen. Das Spektrum des verwendeten künstlichen Lichts ist so vollständig wie möglich, um tropisches Tageslicht nachahmen zu können. Die Tageslänge wird auf 16 Stunden pro Tag von 24 Stunden geregelt. Die Decke wird von einer künstlichen Beleuchtung phytotronischen Typs geliefert, und besteht aus einer Mischung von Leuchtstoffröhren, d. h. "Atlas" Tageslichtröhren, und Wolframfadenglühlampen. Die Energiestufe des künstlichen Tageslichtes wird auf ungefähr 140 000 erg pro cm² Sekunde gesteuert. Die Temperatur wird bei 27°C gehalten. Die relative Feuchtigkeit ist 70%.

Wenn die Pflanzen zu einer geeigneten Stufe herangewachsen sind, werden Verpflanzlinge abgenommen und unter sterilen Bedingungen in einen 250 ml Erlenmeyerkolben gesetzt, der ungefähr 50 ml eines festen Nährstoffes enthält, der aus dem synthetischen Standardmedium (abgeändertes Wood und Braun'sches Medium) besteht, dem 7 bis 10 Gewichtsprozent an Agar zugefügt werden. Wenn Blütenstiel- oder meristematisches Gewebe verwendet werden, ist, wie bereits erklärt, ein Zusatz von Hormonen zu dem Nährstoff nicht erforderlich. Wenn das Explant anderen Ursprungs ist, wird Phytohormon dem Medium zugefügt bei einer Endkonzentration von 0,001 mg/l Kinetin und 0,02 mg/l von 2,4-D. Die gleichen Beleuchtungs- und Temperaturbedingungen und die gleiche Tageslänge werden beibehalten. Zum geeigneten Zeitpunkt kann Kallusbildung beobachtet werden.

Einige der Kalluszellen werden unter sterilen Bedingungen auf einen weiterem 250 ml Erlenmeyerkolben übertragen, der eine weitere ähnliche Menge des festen Nährstoffes enthält. Das mitotische Gewebe setzt das Wachstum unter denselben regulierten Beleuchtungs- und Temperaturbedingungen fort.

Teile des resultierenden Kallus werden auf 250 ml-Erlenmeyerkolben übertragen, von denen jeder ungefähr 50 ml des flüssigen Kulturmediums (abgeändertes Wood und Braun'sches Medium) enthält. Die Kolben werden verschlossen und fortwährend leicht geschüttelt, um den Gasaustausch oder dessen Freisetzung zu fördern, und um ein "Klumpen" oder Absetzen der Zellen zu verhindern. Diese Kolben werden dann verschiedenen Verfahren unterworfen.

a) Einige Kolben werden in Dunkelheit bei 27°C gehalten, und die Zellkultur wird in der Dunkelheit 10 Tage lang durchgeführt. Die Zellkultur ist während dieser Periode nicht durch die Lieferung von Sauerstoff begrenzt. Nach 10-tägigem Wachstum wird die Extraktion ausgeführt, wie dies von W. C. Evans und M. W. Partridge in dem Journal of Pharmacy and Pharmacology, Band 4, S. 769 (1952) beschrieben ist. Man erhält eine sehr kleine Menge einer Mischung von Tropan- Alkaloiden, die durch herkömmliche Methoden identifiziert werden können, z. B. durch Dünnschicht-Chromatographie auf aktivierter Tonerde. Die Ausbeute an Alkaloiden entspricht weniger als 0,1 Gewichtsprozent, basieren auf getrocknetem geernteten Zellmaterial, und besteht hauptsächlich aus Atropin und Hyoscyamin.

b) Eine zweite Kolbengruppe wird auch 10 Tage lang bei 27°C in Dunkelheit gehalten, und die resultierende Kalluszellenkultur wird viermal multipliziert durch Subkultur in Abständen von 10 Tagen. Eine ähnliche Ausbeute an Tropan-Alkaloiden wird aus der letzten Subkultr gewonnen, nach dem Ernten gemäß der in Beispiel 12(a) oben beschrieben Methode.

c) Eine weitere Kolbengruppe wird bei 27°C dem gleichen Beleuchtungssystem (d. h. simuliertes tropisches Sonnenlicht und 16 Stunden Tageslänge) unterworfen, wie dies während des Pflanzenwachstums angewandt wird. Die Energiestufe ist wiederum 140 00 erg pro cm² pro Sekunde. Das Zellenwachstum ist etwas schneller, als wenn man das Verfahren des Beispiels 12(a) anwendet, und einige der Zellen machen spontan eine Differenzierung durch, was durch die rötliche oder grünliche Tönung dieser Zellen festgestellt werden kann. Beim Ernten gemäß dem in Beispiel 1(a) beschriebenen Verfahren nach einem 10-tägigen Wachstum ist die Ausbeute an Tropan-Alkaloiden wiederum ungefähr 0,1 Gewichtsprozent auf der Basis von getrocknetem Erntematerial.

d) Noch eine andere Kolbengruppe wird einer Tag/Nacht Temperatur von 27°C/17°C und dem folgenden Beleuchtungssystem unterworfen: 9 Stunden simuliertes tropisches Sonnenlicht, 7 Stunden Bestrahlung durch Wolframglühlampen allein, 8 Stunden Dunkelheit. Dieses System wird 7 Tage lang beibehalten. Nach 24 Stunden haben sich schon eine bedeutende Anzahl der Zellen verjüngt und differenziert, und nach 7 Tagen hat sich die Mehrzahl der Zellen in Embryoide entwickelt. Die Spektralqualität des Lichts wird eine Woche lang auf eine normale Decke abgeändert. Nach dem Ernten gemäß der Methode des Beispiels 12(a), ist die Ausbeute an Alkaloiden (hauptsächlich Atropin und Hyosciamin) ungefähr 250 mg (oder ungefähr 3 Gewichtsprozent auf der Basis getrockneten Erntematerials).

Beispiel 13

Die Beispiele 12(a) bis 12(d) werden wiederholt, indem man Samen der Pflanze Hyoscyamus aureus L. nimmt. Ähnliche Ausbeuten an Tropan-Alkaloiden werden in jedem Fall erhalten, die aber vorwiegend aus Scopolaminen bestehen.

Beispiel 14

Die Beispiele 12(a) bis 12(d) werden wiederholt unter Verwendung von Samen der Pflanze Duboisia leichardtii oder Duboisia myoporoides, mit der Ausnahme, daß Tag und Nacht Temperaturen von 22°C und 12°C angewandt werden. Die (a) bis (c) Verfahren ergeben minimale Alkaloid Ausbeuten; das (d) Verfahren ergibt ungefähr 9%.

Beispiel 15

Samen der Hyoscyamus muticus L. werden sterilisiert durch kurzes Eintauchen in 10%igem Bromwasser. Sie werden dann auf feuchtes Filterpapier, das sich in einer Petrischale befindet, übertragen, welche dann in einen sterilen Schrank, der auf 27°C gehalten wird, gesetzt und dann während eines Zeitraums von 9 Stunden mit tropischem Licht bestrahlt wird, unter Verwendung der ersten Decke des Beispiels 12, darauf folgt eine Periode von 7 Stunden Glühlicht und eine 8- stündige Dunkelheitsperiode. Die Energiestufe beträgt ungefähr 140 000 ergs pro cm² pro Sekunde. Nach einem Tag keimen die meisten der Samen. Die spektrale Qualität des Lichts wird abgeändert, und eine Photoperiode von 16 Stunden tropischen Lichts wird angewendet mit 8 Stunden Dunkelheit. Nach 7 Tagen sind die Sämlinge groß genug für die Verpflanzung.

Immer noch unter sterilen Bedingungen werden die Sämlinge auf einen synthetischen festen Nährstoff verpflanzt, der aus dem in Beispiel 12 verwendeten Standart-Mineralsalzmedium hergestellt wird und 10 Gewichtsprozent an Agar enthält, dem man 0,01 mg pro Liter an NAA und 0,01 mg pro Liter an Kinethin hinzufügt. Die Beleuchtung der Sämlinge wird wie vorher fortgesetzt, und die Temperatur wird bei 27°C konstant gehalten.

Nach 7 Tagen dieses Systems haben die Sämlinge ein kräftiges Wurzelwachstum entwickelt und werden auf einen ähnlichen festen Nährstoff übertragen, der aber 0,02 mg an 2,4-D pro Liter und die gleiche Menge an Kinetin enthält. Nach 5 Tagen weiteren Wachstums immer noch unter den gleichen Umgebungsbedingungen wird die Tumorbildung sichtbar. Tumoröses Gewebewachstum wird 7 Tage lang fortgesetzt. In diesem Stadium werden die Wurzeln der Pflänzchen von einem weißlichen flockigen Tumor bedeckt. Wenn etwas von dem Tumorgewebe auf eine andere Portion des gleichen, 2,4-D enthaltenden festen Mediums übertragen wird, fährt dies fort sehr schnell zu wachsen.

Einiges von dem Tumorgewebe wird danach auf eine auxinfreien synthetischen flüssigen Nährstoff (das abgeänderte Wood und Braun'sche Medium) übertragen und nach den in den Beispielen 12(a) bis 12(d) beschriebenen Verfahren gezüchtet; ähnliche Ergebnisse werden erzielt.

Beispiel 16

Das Verfahren des Beispiels 15 wird wiederholt unter Verwendung von Samen des Hyoscyamus aureus L. Ähnliche Ergebnisse werden erreicht.

Beispiel 17

Das Verfahren des Beispiels 15 wird wiederholt unter Verwendung von Samen der Duboisia leichardtii und der Duboisia myoporoides. In jedem Fall ist die Ausbeute wie folgt, basierend auf getrockneten geernteten Zellen oder Embryoid- Material:

Verfahren des Beispiels 12(a)
ungefähr 0,1%
Verfahren des Beispiels 12(b)	ungefähr 0,1%
Verfahren des Beispiels 12(c)	ungefähr 0,1%
Verfahren des Beispiels 12(d)	ungefähr 9%.

Beispiel 18

Samen der Duboisia myoporiodes, die eine Kurztagspflanze ist, werden wie in Beispiel 12 gezüchtet, wobei aber eine 9-stündige Photoperiode tropischen Lichts verwendet wird. Verjüngung und Differenzierung werden bei einer Tag/Nacht Temperatur von 22°C/12°C durchgeführt.

Die resultierende Zellkultur, geerntet nach den in den Beispielen 12(a) bis 12(d) beschriebenen Verfahren, gibt Ausbeuten, die denen in Beispiel 17 erhaltenen ähnlich sind.

Beispiel 19

Indem man entweder die Techniken des Beispiels 12 (Verpflanzlinge) oder des Beispiels 5 (Samen) anwendet, gibt jede der folgenden höheren Pflanzen Typterigium wilfordii, Putterlichia verrucosa und Maytenus buchananii embryonale Zellen und die Metaboliten, die von der betreffenden ganzen Pflanze synthetisch hergestellt werden. Die Bedingungen sind die gleichen, außer daß der verwendete Temperatur 22/14°C ist und ein kurzer Tag (9 Stunden).

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung ausgewählter Metaboliten aus Pflanzenzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man

• a) eine Kultur mitotischer Zellen, induziert von einer Verpflanzung oder von Sämlingen, dadurch anlegt, daß man
  • a₁) durch 1- bis 12tägige Behandlung eines wachsenden Punktes eines Sämlings mit einem ersten Hormon, das Auxinaktivität zeigt, und nachfolgende Behandlung desselben wachsenden Punktes mit einem zweiten anderen Hormon, das Auxinaktivität zeigt, eine Tumorbildung unter dem Einfluß des zweiten Hormons, das Auxinaktivität zeigt, bewirkt und die Tumorzellen in ein flüssiges Kulturmedium einbringt, oder
  • a₂) auf an sich bekannte Weise, ausgehend von einer Verpflanzung, eine Kallusbildung herbeiführt und das entstehende mitotische Gewebe in ein Kulturmedium einbringt,
• b) die Kultur der mitotischen Zellen unter Lichtbedingungen, die so nahe wie möglich den in der normalen Umgebung der Pflanzen vorherrschenden Lichtbedingungen kommen, und Änderung der Temperatur von 27°C, die bei den Stufen der Keimung und Tumorherbeiführung aufrechterhalten worden ist, so behandelt, daß die mitotischen Zellen in den embryonalen Zustand zurückgebracht werden,
• c) in den gewählten Umgebungsbedingungen eine Teilung der embryonalen Zellen abwartet und dann Pflanzenembryos oder Sämlinge gewinnt und
• d) aus den geernteten Produkten die entsprechenden Metaboliten abzieht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen b) und c) von 10 bis 14 Tage dauern.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man mitotische Zellen von Pflanzen der Familien Solanaceae oder Erythroxylaceae herstellt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Pflanzenmaterial von einer Pflanze der Spezies Hyoscyamus oder Duboisia stammt.

5. Verwendung des gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 hergestellten Produkts zur Einleitung der Differenzierung der Zellen einer pflanzlichen Zellkultur.