DE19527560B4

DE19527560B4 - Verfahren zur Herstellung virusfreier Hopfenwurzelstöcke

Info

Publication number: DE19527560B4
Application number: DE19527560A
Authority: DE
Inventors: Yutaka Itoga; Narushi Suda
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1994-07-28
Filing date: 1995-07-27
Publication date: 2009-01-02
Anticipated expiration: 2015-07-28
Also published as: CN1121766A; US5731201A; CN1165214C; DE19527560A1; CZ290248B6; JP3585050B2; CZ191995A3; JPH0837971A

Abstract

Verfahren zur Herstellung von virusfreien Hopfenwurzelstöcken, bei dem eine kultivierte virusfreie Hopfenlinie in einem Medium, das die Wurzelbildung ermöglicht, gezüchtet wird, so dass sie in dem Medium Wurzeln ausbildet, und anschließend in einem Hopfenwurzelstock-erzeugenden Medium kultiviert wird, das Monosaccharide in einer Konzentration von 0,15 bis 1 M oder Disaccharide in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 M enthält, wodurch es zur Bildung von Hopfenwurzelstöcken in dem Medium kommt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung virusfreier Wurzelstöcke von Hopfen (Humulus lupulus L.), die dauerhaft gelagert werden können und nach dem Einpflanzen Wurzeln und Sprosse bilden.
Es sind bisher keine Berichte bekannt, die die erfolgreiche Herstellung von vegetativem Hopfengewebe mit ruhenden Knospen (im folgenden als "Hopfenwurzelstöcke" bezeichnet) durch Züchtung beschreiben.
Bisher erfolgte die vegetative Vermehrung von Clonen einer Hopfenpflanze nach den folgenden Verfahren:
1. Verfahren unter Verwendung von Hopfenwurzelstöcken
Die im wesentlichen unterirdischen Stämme einer Hopfenpflanze, die ruhende Knospen tragen, werden im Herbst ausgegraben, gelagert und dann in einem Kulturbeet oder Pflanzen kulturfeld ausgepflanzt. Da der Wurzelstock ein vegetatives Gewebe ist, das ruhende Knospen besitzt, kann es gelagert werden und zeichnet sich dadurch aus, daß es nach dem Einpflanzen Wurzeln ausbildet und gut anwächst.
2. Verfahrung durch Pflanzung von Hopfenstecklingen:
Die knospentragenden Stämme, die im wesentlichen oberirdischen Stämme oder die Zweige einer Hopfenpflanze werden abgeschnitten, Stecklinge mit mindestens einem oder mit mehreren Knoten werden zur Wurzelbildung eingepflanzt und die bewurzelten Stecklinge werden in einem Kulturbeet für ein Jahr kultiviert. Die derart erzeugten einjährigen Pflanzen werden in ein Pflanzenkulturfeld umgesetzt.
3. Zellkulturverfahren:
Sproßspitzen einer Hopfenpflanze werden mit Hilfe von Techniken, die eine virusfreie Vermehrung ermöglichen, kultiviert und die kultivierten virusfreien Linien werden in vitro weiter gezüchtet und vermehrt. Die derart vermehrten Linien werden dann in Töpfe und in ein Kulturbeet umgesetzt und anschließend in ein Pflanzenkulturfeld, in der gleichen Weise, wie in dem oben beschriebenen Verfahren durch Pflanzung von Hopfenstecklingen.
Es wurde bereits vielfach über die Gefahr der Kontamination von Hopfenpflanzen durch verschiedene Viren während ihrer Kultivierung berichtet. Bei der vegetativen Vermehrung einer Hopfenpflanze durch Wurzelstöcke oder durch Pflanzen von Stecklingen werden die Viren, mit denen die Ausgangshopfenpflanze kontaminiert ist, zwangsläufig auf die derart vermehrten Hopfenpflanzen übertragen.
Zu derartigen, bisher in Japan bekannten Viren zählen der Apfelmosaik-Virus (ApMV), HLV ("hop latent virus", latentes Hopfenvirus), Hopfenmosaik-Virus (HMV) oder PNRV ("prunus necrotic ring spot virus").
Werden virusfreie Hopfenlinien, die durch die Kultur von Stammspitzen erhalten wurden, aus dem verwendeten Kulturgefäß entnommen und anschließend in Töpfe oder in ein Feld gepflanzt, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß die derart gezüchteten Pflanzen mit Viren kontaminiert werden durch Überträger wie z. B. Blattläuse, Nematoden usw. oder durch den Saft, der heruntertropft, wenn die Pflanzen beschnitten werden. Die Bereitstellung eines isolierten, absolut virusfreien Feldes, das es erlaubt, die kultivierten virusfreien Hopfenlinien vor einer Kontaminierung durch Viren zu schützen, erfordert einen hohen Arbeitsaufwand, ebenso wie die drastische Bekämpfung und Kontrolle von Überträgern und die regelmäßige Durchführung von Untersuchungen, um sicherzustellen, daß keine Viren in den Linien vorhanden sind, und diejenigen zu entfernen, die kontaminiert sind, falls solche vorhanden sind. Werden Hopfenpflanzen auf internationaler Ebene transportiert, um neue Varietäten einzuführen oder für einen versuchsweisen Anbau, müssen diese unter Quarantänebedingungen gestellt werden, um zu verhindern, daß Pflanzen importiert werden, die mit schädlichem Ungeziefer usw. kontaminiert sind. Viele Länder haben erst kürzlich eigene gesetzliche Regelungen zum Import von Hopfenpflanzen erlassen, gemäß denen für die zu importierenden Hopfenpflanzen nachgewiesen werden muß, daß sie frei sind von Viren der angegebenen Arten.
Der Nachweis der gegebenenfalls in Hopfenpflanzen vorhandenen Viren erfolgt durch ein ELISA-Verfahren. Allerdings ist die Viruskonzentration in Hopfenpflanzen, die erst kurz zuvor kontaminiert wurden, häufig nur gering, so daß die Virusuntersuchung der Pflanzen ein negatives Resultat ergibt. Daher ist es oft schwierig, nachzuweisen, daß Hopfenpflanzen, die durch die herkömmlichen Methoden durch Hopfen- Wurzelstöcke oder Hopfenstecklinge erzeugt wurden, im wesentlichen virusfrei sind.
Theoretisch könnte dieses Problem gelöst werden, indem man virusfreie Pflanzen verwendet, die in Kulturgefäßen gezüchtet wurden, und die durch die Kultivierung von Sproßspitzen erhalten wurden. Die Verwendung derartiger gezüchteter, virusfreier Hopfenpflanzen bringt allerdings wiederum andere Probleme mit sich. Ein Problem besteht darin, daß bestimmte Vorrichtungen erforderlich sind, wenn die auf internationaler Ebene transportierten Pflanzen oder die kleinen gezüchteten Pflanzen in Töpfe oder in ein Pflanzenkulturfeld gepflanzt werden. Ein weiteres Problem besteht darin, daß die kultivierten virusfreien Hopfenpflanzen bei dem internationalen Transport, der lange Zeiträume in Anspruch nimmt, einem erheblichen Streß ausgesetzt sind, was dazu führt, daß die kleinen Pflanzen, die aus den kultivierten Pflanzen gezüchtet wurden, nicht in der Lage sind, in Töpfen oder in einem Pflanzenkulturfeld anzuwachsen.
In Bhojwani, S. S. und Razdan, M. K. (Plant Tissue Culture/Developments in Crop Science 5, Kapitel 14, S. 287–312, 1983, Elsevier Science Publishers, Amsterdam) wird darüber berichtet, daß sich die Apikalmeristemkultur(„meristem-tip culture")-Technik zur effizientesten Technik zur Erzeugung vollständig virusfreier Pflanzen entwickelt hat. DE 691 16 044 T2 beschreibt ein Verfahren zur Produktion von Kartoffelknollen, bei dem ein Nährmedium mit hoher Saccharosekonzentration (5 bis 10%) verwendet wird. Ferner beschreibt EP 0 563 423 A1 in Verfahren zur Adaptierung von durch Gewebekultur vermehrten Pflanzen für unmittelbares Auspflanzen in das Freiland, das unter anderem das Züchten der Pflanzen auf Nährböden mit einem osmotischen Druck entsprechend einem Saccharosegehalt von 0,2 bis 0,4 M umfasst. Ein in vitro-Verfahren zur Herstellung virusfreier Hopfenwurzelstöcke wird jedoch in keiner dieser Druckschriften beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, die Gefahr der Kontaminierung von kultivierten virusfreien Hopfenlinien durch Viren auszuschließen, und virusfreie Hopfenwurzelstöcke zur Verfügung zu stellen, die dauerhaft gelagert werden können und nach dem Einpflanzen gut anwachsen und Wurzeln und Sprosse bilden, wodurch die obengenannten Probleme, mit kultivierten virusfreien Hopfenlinien überwunden werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruch 1 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Im Verlauf von langjährigen Züchtungs- und Kulturversuchen mit Hopfenpflanzen im Rahmen von Untersuchungen zur in vitro-Produktion von Hopfenwurzelstöcken, insbesondere im Hinblick auf die Wachstumsbedingungen für Hopfenwurzelstöcke, wurde gefunden, daß es möglich ist, virusfreie Hopfenwurzelstöcke ohne die oben erläuterten Nachteile herzustellen, indem man eine kultivierte virusfreie Hopfenlinie zunächst in einem die Wurzelbildung ermöglichenden Medium ausreichend Wurzeln ausbilden läßt und anschließend in einem Medium mit einer hohen Saccharidkonzentration zur Bildung von Hopfenwurzelstöcken kultiviert (im folgenden "Hopfenwurzelstock-erzeugendes Medium" genannt).
Somit stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von virusfreien Hopfenwurzelstöcken zur Verfügung, bei dem eine kultivierte, virusfreie Hopfenlinie in einem die Wurzelbildung ermöglichenden Medium gezüchtet wird, um sie in dem Medium Wurzeln ausbilden zu lassen, und anschließend in einem Hopfenwurzelstock-erzeugenden Medium mit hoher Saccharidkonzentration kultiviert wird, wodurch es in dem Medium zur Bildung von Hopfenwurzelstöcken kommt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das Hopfenwurzelstock-erzeugende Medium ein oder mehrere Saccharid(e) aus der Gruppe Glucose, Fructose und Saccharose. Enthält das Medium ein oder mehrere Monosaccharide, vorzugsweise Glucose, so liegt deren Konzentration vorzugsweise im Bereich von 0,15 bis 1 M. Bei der Verwendung von Disacchariden liegt deren Konzentration vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 0,5 M. Vorzugsweise enthält das Hopfenwurzelstock-erzeugende Medium als Basismedium ein MS-Medium. Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete virusfreie Hopfenlinie wird vorzugsweise durch Meristemkultur erhalten.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete virusfreie Hopfenlinie kann erhalten werden durch die Kultivierung von Hopfenpflanzen, selbst von solchen, die durch Viren kontaminiert wurden, bei ca. 35°C für 10 bis 18 Tage und anschließender Isolierung von 1 bis 5 cm langen Stammspitzen und deren Kultivierung. Eine einfachere und genauere Methode zum Erhalt der Linie besteht jedoch darin, das Gewebe des Vegetationspunktes der Spitzen von Hopfensprossen zu isolieren und in Meristemkultur zu kultivieren, um so die gewünschte kultivierte virusfreie Hopfenlinie zu erhalten.
Um sicherzustellen, daß die derart erzeugte Hopfenlinie frei von Viren ist, wird die Linie auf das Vorhandensein von Viren mittels eines wie oben beschriebenen ELISA-Verfahrens untersucht.
Endständige und achselständige Knospen einer Pflanze besitzen stets meristematisches Sproßspitzengewebe, das als Vegetationspunkt oder Sproßscheitelgewebe bezeichnet wird. Die Kultur des Vegetationspunktgewebes oder Sproßscheitelgewebes wird als Meristemkultur bezeichnet.
Das Sproßscheitelgewebe liegt gewöhnlich im innersten Teil von Knospen und ist weitgehend von Blättern oder Schuppen umhüllt, wodurch es von Keimen frei ist. Weiterhin wird beschrieben, daß in dem Teil dieses Gewebes, der 0,3 mm unterhalb der Spitze liegt, praktisch keine Viren vorkommen. Es ist daher möglich, ein virusfreies Hopfengewebe zu erzeugen, indem man diesen Teil des Gewebes isoliert und kultiviert. Mit Hilfe einer derartigen Meristemkultur ist es nicht nur möglich, Viren aus dem kultivierten Gewebe zu entfernen, sondern sie ermöglicht es auch, ein steriles Gewebe, das weder Pilze noch Bakterien enthält, zu erzeugen.
Im folgenden wird ein spezielles Beispiel einer Meristemkultur beschrieben. Ein Teil eines Hopfengewebes, das endständige oder achselständige Knospen umfaßt, wird in geeigneter Größe isoliert und gesammelt. Danach wird Schuppen- und Blattgewebe, das das Sproßscheitelgewebe bedeckt, an einer sterilen Arbeitsfläche unter einem stereoskopischen Mikroskop entfernt, um das Sproßscheitelgewebe freizulegen. Das derart freigelegte Sproßscheitelgewebe wird dann mit einem sterilen scharfen Schneidegerät, wie z. B. einem Skalpell oder ähnlichem, in 0,15 mm bis 0,3 mm dicke Stücke zerschnitten, und diese Stücke werden gesammelt.
Die Stücke werden gesammelt, wenn sie sich auf der Spitze des Messers befinden und werden unmittelbar auf ein Medium übertragen. Bei diesem Medium kann es sich um ein gängiges Medium handeln, das in der Regel für Pflanzengewebekultur verwendet wird, einschließlich beispielsweise Murashige-Skoog-Medium (im folgenden als MS-Medium bezeichnet), White-Medium, Linsmaier-Skoog-Medium, Nitsch-Medium usw. Üblicherweise wird ein MS-Agarmedium verwendet, dem Phytohormone wie z. B. Auxin, Cytokinin usw. zugesetzt wurden. Vorzugsweise wird ein Medium verwendet, das aus einem Basis-MS-Medium besteht, dem 2,0 mg/l Benzyladenin (BA), 0,2 mg/l Giberellinsäure (GA₃) und 20 g/l Glucose zugesetzt wurden (pH 5,8; Agargehalt 8 g/l).
Die Kultivierung des auf dem Medium plazierten Sproßscheitelgewebes wird bei Raumtemperatur für ca. 1 Monat durchgeführt, wodurch ein Sproßscheitelgewebe soweit heranwächst, daß es in ca. 10 Clone geteilt werden kann (d. h. das Gewebe wächst zu einer kultivierten Linie mit ca. 10 endständigen oder achselständigen Knospen). Nach einer Kultivierung für einen weiteren Monat haben sich die aufgeteilten Clone wiederum derart vermehrt, daß sie in je ca. 10 Clone aufgeteilt werden können. Die Vermehrungskultur kann solange fortgesetzt werden, bis die erforderliche Anzahl von Clonen erreicht ist. Werden beispielsweise 1000 Clone benötigt, muß das Sproßscheitelgewebe auf dem Medium für ca. 3 Monate kultiviert werden. Werden 10 000 Clone benötigt, muß es für ca. 4 Monate kultiviert werden.
Die derart erhaltenen Gewebe werden mit Hilfe eines ELISA-Tests auf Viren untersucht, um sicherzustellen, daß sie virusfrei sind.
Die vermehrten Clone werden weiterkultiviert und für einen weiteren Monat gezüchtet. Anschließend werden sie in Wachstumskultur gebracht.
Durch die anschließende Kultivierung des virusfreien Gewebes in der Wachstumskultur wird das Wachstum der dominanten apikalen Spitze verstärkt. Insbesondere wird die frühzeitige Verzweigungsphase in der kultivierten Linie effizient in eine Phase der Apikaldominanz überführt. Für diese Kultur wird vorzugsweise das oben beschriebene MS-Agarmedium verwendet, dem 0,2 mg/l Indolessigsäure und 20 g/l Glucose zugesetzt wurden (pH 5,8; Agargehalt 8 g/l).
Diese Kultur wird für ca. 2 Monate bei Raumtemperatur durchgeführt. Nachdem der Übergang zur Phase der Apikaldominanz in dem derart kultivierten Gewebe sichergestellt wurde, wird das Gewebe einer Kultivierung zur Wurzelbildung unterzogen.
Für die Kultivierung zur Wurzelbildung wird ein MS-Agarmedium verwendet, dem 0,2 mg/l Indolbuttersäure und 20 g/l Glucose zugesetzt wurden (pH 5,8, Agargehalt 8 g/l). Das kultivierte Gewebe wird auf dem Medium plaziert und wiederum bei Raumtemperatur für 2 Wochen bis zu ca. einem Monat darauf kultiviert, wodurch das Gewebe ausreichend Wurzeln ausbildet.
Die derart kultivierte virusfreie Hopfenlinie (die Wurzeln angesetzt hat) wird in einem Hopfenwurzelstock-erzeugenden Medium weiter gezüchtet, um virusfreie Hopfenwurzelstöcke zu erzeugen. Als Basismedium für das Hopfenwurzelstock-erzeugende Medium kann jedes der obengenannten herkömmlichen Flüssigmedien zur Pflanzengewebekultur verwendet werden, wie z. B. flüssiges MS-Medium. Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Hopfenwurzelstock-erzeugende Medium enthält ein oder mehrere Saccharid(e) in hoher Konzentration. Im einzelnen enthält es ein oder mehrere Saccharid(e) aus der Gruppe Glucose, Fructose, Saccharose usw. Die Saccharidkonzentration in dem Medium kann im Bereich von 0,15 bis 1 M, vorzugsweise im Bereich von 0,2 bis 0,4 M liegen, wenn Monosaccharide, wie z. B. Glucose oder Fructose, verwendet werden. Wenn Disaccharide, wie z. B. Saccharose, verwendet werden, kann die Saccharidkonzentration im Bereich von 0,1 bis 0,5 M, vorzugsweise von 0,1 bis 0,2 M liegen. Liegt die Saccharidkonzentration unterhalb der angegebenen Bereiche, nimmt die Produktivität des angestrebten Hopfenwurzelstocks in dem Medium merklich ab, selbst wenn die kultivierte Linie am Leben bleibt. Liegt die Saccharidkonzentration dagegen oberhalb der angegebenen Bereiche, wird das Wachstum der kultivierten Linie verzögert oder die Linie stirbt ab.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Medium flüssiges MS-Medium mit einem pH-Wert von 5,8, das 0 bis 2,0 mg/l, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 mg/l, Indolbuttersäure und 30 bis 150 g/l, vorzugsweise 40 bis 60 g/l, Glucose enthält.
Der pH-Wert des Mediums kann im Bereich von 5,5 bis 6,0, vorzugsweise im Bereich von 5,7 bis 5,8, liegen.
Die Kultivierung wird in einem Kulturgefäß, das eine Größe von ca. 10 × 80 mm bis 30 × 200 mm, vorzugsweise von ca. 15 × 90 mm bis 25 × 120 mm hat, durchgeführt. Dies ist erforderlich, da in kleineren Kulturgefäßen ein ausreichendes Wachstum der kultivierten Hopfenlinie nicht möglich ist, und eine unzureichend gewachsene Linien lediglich kleine Hopfenwurzelstöcke erzeugt, selbst wenn sie ausgepflanzt wird. Andererseits ist die Produktivität der angestrebten Hopfenwurzelstöcke gering, wenn die kultivierte Hopfenlinie in Kulturgefäßen gezüchtet wird, die größer sind als oben angegeben.
Erfindungsgemäß werden die kultivierten, virusfreien Hopfenlinien auf das Medium in einem Kulturgefäß übertragen und darauf bei 20 bis 30°C, vorzugsweise 25°C, unter Dauerlicht mit 3 000 bis 25 000 Lux, vorzugsweise 15 000 bis 20 000 Lux, weiter gezüchtet. Alternativ können sie auf dem Medium weiter gezüchtet werden bei 20 bis 30°C, vorzugsweise 25°C, unter Licht mit 3 000 bis 25 000 Lux für die ersten 14 bis 20 Stunden und anschließend bei 10 bis 20°C, vorzugsweise 15°C, im Dunkeln für die nächsten 4 bis 10 Stunden. Unter diesen Bedingungen werden die Linien für 1 bis 3 Monate kultiviert, wobei im letzteren Fall der Hell-Dunkel-Rhythmus wiederholt wird. Die kultivierten virusfreien Hopfenlinien sollten auf das Medium übertragen werden, nachdem das Medium zur Wurzelbildung vollkommen von den Linien entfernt wurde.
Nach einer derartigen Kultivierung für ca. 1 Monat zeigen die Linien ein Dickenwachstum überall oberhalb der Basis des Hauptstammes. Nach ca. 2 Monaten bilden fast alle kultivierten Linien Wurzelstöcke. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Stammspitzen und Blätter der kultivierten Linien abzusterben, wohingegen die derart erzeugten Wurzelstöcke weiterhin an Umfang zunehmen. Nach ca. 3 Monaten kann kein weiteres Wachstum der ruhenden Sämlinge festgestellt werden und die Kultur wird beendet.
70% bis 100% der Linien, die nach dem oben beschriebenen Kulturverfahren kultiviert werden, bilden verdickte Wurzelstöcke überall oberhalb der Basis des Hauptstammes.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Das Meristem (Vegetationspunktgewebe) von Stammspitzen einer Hopfenpflanze wurde in Form von 0,2 mm dicken Stücken isoliert und auf einem Medium plaziert, das ein Basis-MS-Medium umfaßte und sich in einem 17 × 105 mm großen Kulturgefäß befand. Das Medium hatte folgende Zusammensetzung: 370 mg/l MgSO₄·7H₂O, 440 mg/l CaCl₂·2H₂O, 1900 mg/l KNO₃, 1650 mg/l NH₄NO₃, 170 mg/l KH₂PO₄, 27,8 mg/l FeSO₄·7H₂O, 37,3 mg/l Na₂-EDTA, 22,3 mg/l MnSO₄·4H₂O, 8,6 mg/l ZnSO₄·7H₂O, 0,025 mg/l CuSO₄·5H₂O, 0,025 mg/l CoCl₂·6H₂O, 0,83 mg/l KI, 6,2 mg/l H₃BO₃, 0,25 mg/l Na₂MoO₄·2H₂O, 100 mg/l Myoinosit, 0,5 mg/l Nicotinsäure, 0,5 mg/l Pyridoxinhydrochlorid, 0,1 bis 1 mg/l Thiaminhydrochlorid und 2 mg/l Glycin. Diesem Medium wurden ferner 2,0 mg/l Benzyladenin, 0,2 mg/l Giberellin säure und 20 g/l Glucose zugesetzt. Das Medium besaß einen pH-Wert von 5,8 und einen Agargehalt von 8 g/l. Auf diesem Medium wurden die Stammspitzen in Form einer Meristemkultur unter Licht/Dunkel-Rhythmus für ca. 3 Monate kultiviert. Ein Kulturzyklus bestand jeweils darin, daß die Spitzen bei 25°C für 16 Stunden im Licht (bei 5 000 bis 20 000 Lux) und anschließend für 8 Stunden im Dunkeln kultiviert wurden. Während der Kultivierung wurde durch ELISA-Tests sichergestellt, daß die kultivierten Linien frei von Viren sind. Die derart kultivierten virusfreien Hopfenlinien wurden jeweils zweimal geteilt, umgesetzt und sub-kultiviert, wodurch 100 virusfreie Hopfenclone erzeugt wurden. Diese wurden zum weiteren Wachstum für einen weiteren Monat kultiviert.
Anschließend wurden diese 100 virusfreien Hopfenclone auf einem Medium plaziert, das aus dem oben beschriebenen Basis-MS-Medium bestand, dem 0,2 mg/l Indolessigsäure und 20 g/l Glucose zugesetzt worden waren. Dieses Medium hatte einen pH-Wert von 5,8 und einen Agargehalt von 8 g/l. Die virusfreien Hopfenclone wurden daraufhin bei Raumtemperatur für ca. 2 Monate gezüchtet, wodurch das Wachstum des dominanten Apikalmeristems verstärkt wurde.
Die derart gezüchteten 100 Clone wurden auf einem Medium plaziert, das das Basis-MS-Medium umfaßte, dem 0,2 mg/l Indolbuttersäure und 20 g/l Glucose zugesetzt worden waren. Dieses Medium hatte einen pH-Wert von 5,8 und einen Agargehalt von 8 g/l. Die Clone wurden auf dem Medium bei Raumtemperatur für 2 Wochen bis zu ca. 1 Monat weiterkultiviert, wobei sie ausreichend Wurzeln ausbildeten.
Anschließend wurde das an den Wurzeln und anderen Teilen der bewurzelten virusfreien Hopfenclone haftende Medium unter sterilen Bedingungen vorsichtig entfernt. Diese 100 Clone wurden im nächsten Schritt dazu verwendet, um virusfreie Hopfenwurzelstöcke zu erzeugen. Dazu wurden die virusfreien Clone in Kulturgefäße (Größe: 17 × 105 mm) überführt, die jeweils 4 ml eines Flüssigmediums (pH 5,8) enthielten, das aus dem Basis-MS-Medium bestand, dem 0,2 mg/l Indolessigsäure und 40 g/l Glucose zugesetzt worden waren. In diesen Gefäßen wurden die Clone unter Licht/Dunkel-Rhythmus kultiviert. Ein Kulturzyklus umfaßte dabei die Kultivierung bei 25°C im Licht für 16 Stunden (bei 5 000 bis 20 000 Lux) und anschließend bei 15°C im Dunkeln für 8 Stunden.
Nach einer derartigen Kultivierung für 1 Monat setzte bei den Clonen ein Dickenwachstum überall oberhalb der Basis des Hauptstammes ein. Nach ca. 2 Monaten hatten 82 der 100 Clone (82%) Wurzelstöcke gebildet. Zu diesem Zeitpunkt begannen die Stammspitzen und Blätter der kultivierten Clone abzusterben, wohingegen die gebildeten Wurzelstöcke weiter an Umfang zunahmen. Nach ca. 3 Monaten konnte kein weiteres signifikantes Wachstum der Wurzelstöcke beobachtet werden, und die Kultivierung wurde beendet. Die derart produzierten Wurzelstöcke wurden gesammelt. Das Frischgewicht der erzeugten Wurzelstöcke betrug im Durchschnitt 0,26 g (der kleinste wog 0,14 und der größte 0,42 g).
Beispiel 2
Das gleiche wie in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit dem Unterschied, daß die Sproßscheitelkultur in Kulturgefäßen mit einer Größe von 25 × 120 mm und die Kultivierung zur Erzeugung von Hopfenwurzelstöcken ebenfalls in Kulturgefäßen mit einer Größe von 25 × 120 mm durchgeführt wurde. Als Folge davon bildeten 79% der kultivierten Clone innerhalb von 3 Monaten Hopfenwurzelstöcke, und das Frischgewicht der Hopfenwurzelstöcke betrug im Durchschnitt 0,51 g.
Beispiel 3
Das gleiche wie in Beispiel 1 beschriebene Verfahren, wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Sproßscheitelkultur in Kulturgefäßen mit einer Größe von 30 × 200 mm und die Kultur zur Erzeugung von Hopfenwurzelstöcken ebenfalls in Kulturgefäßen mit einer Größe von 30 × 200 mm durchgeführt wurde. Als Folge davon bildeten 26,7% der kultivierten Clone innerhalb von 3 Monaten Hopfenwurzelstöcke, und das Frischgewicht der derart gebildeten Hopfenwurzelstöcke betrug im Durchschnitt 0,79 g.
Vorstehend wurde die vorliegende Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere im Hinblick auf ihre bevorzugten Ausführungsformen. Bei virusfreien Hopfenwurzelstöcken, die in Anbaufeldern gesammelt werden, besteht eine gewisse Wahrscheinlichkeit, daß sie wieder mit Viren kontaminiert werden durch Überträger oder während ihrer Kultivierung. Virusfreie Hopfenwurzelstöcke, die unter sterilen Bedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, sind dagegen geschützt vor der Kontamination durch Viren, pathogene Schädlinge oder Parasiten und sind somit hochgradig sicher. Ferner können diese Wurzelstöcke gut gelagert werden und bilden Wurzeln und Sprosse, wenn sie eingepflanzt werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von virusfreien Hopfenwurzelstöcken, bei dem eine kultivierte virusfreie Hopfenlinie in einem Medium, das die Wurzelbildung ermöglicht, gezüchtet wird, so dass sie in dem Medium Wurzeln ausbildet, und anschließend in einem Hopfenwurzelstock-erzeugenden Medium kultiviert wird, das Monosaccharide in einer Konzentration von 0,15 bis 1 M oder Disaccharide in einer Konzentration von 0,1 bis 0,5 M enthält, wodurch es zur Bildung von Hopfenwurzelstöcken in dem Medium kommt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem in dem Medium enthaltenen Saccharid um ein oder mehrere Saccharid(e) aus der Gruppe Glucose, Fructose und Saccharose handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Monosaccharid Glucose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Hopfenwurzelstock-erzeugende Medium als Basis-Medium ein MS-Medium enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die kultivierte virusfreie Hopfenlinie durch Meristemkultur erhalten wird.