CZ290248B6

CZ290248B6 - Způsob výroby chmelových oddenků neobsahujících viry

Info

Publication number: CZ290248B6
Application number: CZ19951919A
Authority: CZ
Inventors: Yutaka Itoga; Narushi Suda
Original assignee: Sapporo Breweries Limited
Priority date: 1994-07-28
Filing date: 1995-07-25
Publication date: 2002-06-12
Also published as: DE19527560B4; JP3585050B2; JPH0837971A; US5731201A; CN1121766A; DE19527560A1; CZ191995A3; CN1165214C

Abstract

Zp sob v²roby chmelov²ch oddenk neobsahuj c ch viry spo v v tom, e se bezvirov chmelov populace kultivuje v zako°e ovac m m diu a po vyhn n ko°en do zako°e ovac ho m dia se kultivuje v produk n m m diu pro chmelov oddenky s vysok²m obsahem sacharidu za vzniku chmelov²ch oddenk .\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby chmelových oddenků neobsahujících viry. Oddenky chmele (Humulus lupulus L.) vyrobené způsobem podle vynálezu vykazují stabilitu při skladování a po zasazení dobře vyhánějí kořeny a výhony.

Dosavadní stav techniky

Není známa žádná zpráva, která by se vztahovala k úspěšné produkci vegetativní tkáně s dormantními očky chmele (která je dále označována názvem chmelové oddenky) kultivací.

Vegetativní propagace klonů chmele byla až dosud prováděna následujícími metodami:

1. Metoda za použití chmelových oddenků

Na podzim se odříznou hlavní podzemní lodyhy chmele s dormantními očky, skladují se a potom vysadí ve školce nebo na poli, kde má být chmel pěstován. Vzhledem ktomu, že oddenek představuje vegetativní tkáň s dormantními očky, je možno jej skladovat a po tomto skladování vysadit, přičemž z vysazených oddenků aktivně rostou výhony a kořeny a celá rostlina dobře roste.

2. Metoda za použití sázení chmelových řízků

Odříznou se hlavní nadzemní části chmelové lodyhy nebo větve s očky a řízky s jedním nebo více očky se zasadí, aby vyhnaly kořeny. Zakořeněné řízky se pěstují jeden rok ve školce a jednoleté rostliny se přesadí na pole pro pěstování chmele.

3. Metoda s tkáňovou kulturou

Vrcholky chmelových výhonů se kultivují bezvirovou technologií anapěstované bezvirové populace se dále kultivují a propagují in vitro. Namnožené populace se potom přesadí do kořenáčů a do školky a nakonec na pole stejným způsobem jako při výše uvedených metodách sázení chmelových řízků.

Je k dispozici řada zpráv, které se týkají nebezpečí kontaminace chmelových rostlin různými viry během jejich pěstování. Při vegetativním množení chmele způsobem za použití chmelových oddenků nebo chmelových řízků jsou viry, kterými byla kontaminována původní chmelová rostlina nutně přeneseny na namnožené chmelové rostliny. Z těchto virů, které byly až dosud známy v Japonsku, je možno uvést virus mozaiky jablek (ApMV), latentní virus chmele (HLV), virus chmelové mozaiky (HMV), virus způsobující nekrotické kulaté skvrny na švestkách (PNRV) atd.

Když se bezvirové chmelové populace získané z kultury vrcholových buněk kmenového výhonu odeberou z použité zkumavky a zasadí do kořenáčů nebo na pole, existuje značná pravděpodobnost, že narostlé rostliny budou kontaminovány viry prostřednictvím takových vektorů, jako jsou mšice, nematodi atd. nebo prostřednictvím šťávy, která skápne při prořezávání chmelových semenáčků. Pro ochranu pěstovaných bezvirových chmelových populací před kontaminací viry je třeba vyvinout značné úsilí, které je spojeno s nutností izolace bezvirového pole, drastickým hubením a potlačováním vektorů, častým prováděním nutných zkoušek pro potvrzení, že při přemísťování populací nejsou viry skutečně přítomny a odstraňováním

-1 CZ 290248 B6 případných časných stádií kontaminovaných viry. Při dopravě chmelových rostlin v mezinárodním měřítku za účelem zavádění nových odrůd a experimentální kultivace se požadují záruky, že importované chmelové rostliny nejsou zamořeny červy atd. V poslední době mnohé země zavedly vlastní předpisy týkající se kontroly importovaných chmelových rostlin za účelem ověření, že jsou prosty virů stanovených druhů.

Pokud se provádí inspekce virů u chmelových rostlin, používá se ktomu metody ELISA. Chmelové rostliny bezprostředně kontaminované viry však často vykazují pouze nízkou koncentraci virů, takže inspekce rostlin na viry poskytuje negativní výsledek. Z toho důvodu je obtížné ověřit skutečnost, že chmelové rostliny, které byly získány konvenčními metodami za použití sázení oddenků nebo řízků, skutečně neobsahují viry.

Teoreticky lze tento problém vyřešit za použití bezvirových rostlin kultivovaných ve zkumavce, které byly získány z kultury vrcholu lodyhy. Použití takových bezvirových chmelových rostlin získaných kultivací je však spojeno s jinými problémy. Jedním problémem je, že pro práci s rostlinami dopravenými ze zahraničí, které jsou malé a pěstují se v kořenáčích a na poli, je zapotřebí zvláštních zařízení. Další problém spočívá v tom, že kultivované bezvirové chmelové rostliny jsou během dlouhotrvající dopravy v mezinárodním měřítku vystaveny značnému stresu, což má za následek, že malé rostliny vypěstované z kultivovaných rostlin nemohou v kořenáčích nebo na poli aktivně růst.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je odstranit výše uvedené problémy s kultivovanými bezvirovými chmelovými populacemi a zejména odstranit nebezpečí kontaminace kultivovaných bezvirových chmelových populací viry. Úkolem vynálezu je také vyvinout bezvirové chmelové oddenky, které jsou stabilní při skladování a po zasazení aktivně rostou a vyhánějí kořeny a výhony.

Původci tohoto vynálezu studovali množení a kultivaci chmelových rostlin mnoho let a zkoumali in vitro produkci chmelových oddenků, zejména pokud se týče podmínek růstu chmelových oddenků. Při tom zjistili, že bezvirové chmelové oddenky, které nejsou zatíženy výše uvedenými problémy, je možno získat tak, že se vytvoří kultivovaná bezvirová chmelová populace, tato populace se nechá v dostatečné míře vyhnat kořeny do zakořeňovacího média a potom se kultivuje v médiu za účelem produkce chmelových oddenků (toto médium je dále označováno názvem produkční médium pro chmelové oddenky) s vysokou koncentrací sacharidů. Vynález se opírá o tato zjištění.

Předmětem vynálezu je způsob výroby bezvirových chmelových oddenků, jehož podstata spočívá v tom, že se bezvirová chmelová populace kultivuje v zakořeňovacím médiu a po vyhnání kořenů do zakořeňovacího média se kultivuje v produkčním médiu pro chmelové oddenky s vysokým obsahem sacharidu za vzniku chmelových oddenků.

V prvním provedení způsobu podle vynálezu obsahuje produkční médium pro chmelové oddenky jeden nebo více sacharidů ze souboru zahrnujícího glukózu, fruktózu a sacharózu. Ve druhém provedení způsobu podle vynálezu produkční médium pro chmelové oddenky, vykazující vysokou koncentraci sacharidů, obsahuje monosacharid nebo monosacharidy v koncentraci v rozmezí od 0,15 do 1M. Ve třetím provedení způsobu podle vynálezu produkční médium pro chmelové oddenky, vykazující vysokou koncentraci sacharidů, obsahuje disacharid nebo disacharidy v koncentraci v rozmezí od 0,1 do 0,5M. Ve čtvrtém provedení způsobu podle vynálezu produkční médium pro chmelové oddenky, vykazující vysokou koncentraci sacharidů, obsahuje glukózu v koncentraci v rozmezí od 0,15 do 1M. V pátém provedení způsobu podle vynálezu produkční médium pro chmelové oddenky, vykazující vysokou koncentraci sacharidů, je tvořeno bazickým médiem MS, k němuž byla přidána glukóza v koncentraci v rozmezí od 0,15

-2 CZ 290248 B6 do 1M. V šestém provedení způsobu podle vynálezu se kultivovaná bezvirová chmelová populace získává kultivací meristemu.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu. Kultivované bezvirové chmelové populace pro použití při způsobu podle vynálezu je možno získat kultivací chmelových rostlin po dobu 10 až 18 dnů při asi 35 °C. Po této době se odeberou špičky lodyh v délce 1 až 5 cm a podrobí se kultivaci. Výchozí chmelové rostliny mohou být kontaminovány viry. Jednodušší a přesnější metoda pro získání požadované kultivované bezvirové populace spočívá v kultivaci tkáně z rostoucího konce vrcholu chmelového výhonu, tj. kultivaci meristému.

Pro potvrzení, že v takto získané chmelové populaci nejsou obsaženy viry, se populace podrobí inspekci za použit metody ELISA, zmíněné výše.

Koncová a osová očka rostliny vždy obsahují meristémovou tkáň vrcholu výhonu, která představuje místo vlastního růstu výhonu. Pod označením kultivace meristému se rozumí kultivace tkáně z rostoucího konce výhonu, tj. vrcholu výhonu.

Vrcholová tkáň výhonu je obvykle umístěna v nejvnitřnější části oček a většinou je obalena listy nebo ramenty, aby byla ochráněna před škodlivými zárodky. Kromě toho tato tkáň v podstatě neobsahuje žádné viry v části do 0,3 mm od vrcholu. Bezvirovou chmelovou tkáň je tedy možno získat odříznutím a kultivací této části tkáně. Kultivací meristému je nejen možno získat bezvirovou kultivovanou tkáň, nýbrž je možné získat i axenickou tkáň, která neobsahuje ani houby, ani bakterie.

Jedna konkrétní metoda kultivace meristému je uvedena dále. Odřízne se část chmelové tkáně o vhodné velikosti obsahující koncové nebo osové pupeny a potom se odstraní tkáně ramenta a listů zakrývajících tkáň vrcholu výhonu. Obnažená tkáň vrcholu výhonu se pod stereoskopickým mikroskopem (pracovní plocha pod mikroskopem musí být čistá) nařeže sterilním řezacím nástrojem, například skalpelem apod., na kousky o tloušťce 0,15 až 0,3 mm a kousky se shromáždí.

Tyto kousky se shromažďují na špičce řezacího nástroje a ihned se přenesou do média. Jako média se může používat obvyklého média obecně používaného pro rostlinné tkáňové kultury, jako je například médiu Murashige-Skoog (dále označované názvem médium MS), Whiteovo médium. Linsmaier-Skoogovo médium. Nitschovo médium atd. Populární je v této souvislosti agarové médium MS, k němuž byly přidány rostlinné hormony, jako je auxin, cytokinin atd. Jako jeden přednostní příklad vhodného média je možno uvést základní MS médium, k němuž bylo přidáno 2,0 mg/litr benzyladeninu (BA), 0,2 mg/litr kyseliny gibberellové (GA3) a 20 g/litr glukózy (pH 5,8; obsah agaru 8 g/litr).

Kultivace vrcholové tkáně výhonu přenesené do média se provádí asi 1 měsíc při teplotě místnosti, přičemž vrcholová tkáň z jednoho výhonu naroste tak, že je možno ji rozdělit do asi 10 klonů (tj. tkáň naroste tak, že je tvořena kultivovanou populací obsahující asi 10 koncových nebo laterálních oček). Po další jednoměsíční kultivaci se oddělené klony dále namnoží vždy na asi 10 klonů. Propagační kultura se uchovává po dobu, které je zapotřebí pro získání požadovaného počtu klonů. Když se například má získat 1000 klonů, kultivuje se vrcholová tkáň výhonu přenesená do média po dobu asi 3 měsíců. Pro získání 10 000 klonů je třeba kultivovat tkáň po dobu asi 4 měsíců.

Takto získané tkáně se podrobí inspekci na přítomnost virů metodou ELISA a přitom se potvrdí, že neobsahují viry.

Namnožené klony se potom dále kultivují a nechají růst další měsíc a potom se podrobí růstové kultivaci.

-3CZ 290248 B6

Při růstové kultivaci této bezvirové tkáně je podporován růst apikální dominantní fáze. Prekociální fáze větví v kultivované populaci se totiž účinně konvertuje na apikální dominantní fázi. Pro tuto kultivaci se přednostně používá výše uvedeného MS média s agarem, k němuž se přidá 0,2 mg/litr indoloctové kyseliny a 20 g/litr glukózy (pH 5,8, obsah agaru 8 g/litr).

Tato kultivace se provádí asi 2 měsíce při teplotě místnosti. Když se v takto kultivové tkáni potvrdí konverze na apikální dominantní fázi, tkáň se podrobí zakořeňovací kultivaci.

Zakořeňovací kultivace se provádí v MS agarovém médiu s přídavkem 0,2 mg/litr indolmáselné kyseliny a 20 g/litr glukózy (pH 5,8, obsah agaru 8 g/litr). Konkrétně se postupuje tak, že se kultivovaná tkáň přenese do média a v něm znovu kultivuje při teplotě místnosti po dobu od 2 týdnů do asi 1 měsíce, přičemž dojde k dostatečnému vyhnání kořenů.

Takto kultivovaná bezvirová chmelová populace (která vyhnala kořeny) se dále kultivuje v produkčním médiu pro chmelové oddenky, za účelem získání bezvirových chmelových oddenků.

Jako základního média se v produkčním médiu pro chmelové oddenky používá jakéhokoliv výše uvedeného běžného kapalného média pro kultivaci rostlinných tkání, jako je kapalné MS médium. Produkční médium pro chmelové oddenky pro použití při způsobu podle vynálezu obsahuje sacharid nebo sacharidy ve vysoké koncentraci. Konkrétně obsahuje jeden nebo více sacharidů zvolených ze souboru zahrnujícího glukózu, fruktózu, sacharózu atd. Koncentrace sacharidu v médiu může ležet v rozmezí od 0,15 do 1M, přednostně od 0,2 do 0,4M, v případě monosacharidů, jako je glukóza, fruktóza atd. V případě disacharidů, jako je sacharóza atd., může být tato koncentrace v rozmezí od 0,1 do 0,5M, přednostně od 0,1 do 0,2M. Když je koncentrace sacharidu nižší než odpovídá výše uvedenému rozmezí, produkce požadovaných chmelových oddenků v médiu se podstatně sníží, přestože kultivovaná populace může v tomto médiu zůstat živá. Když je naopak koncentrace sacharidů v tomto médiu vyšší než odpovídá výše uvedenému rozmezí, růst kultivované populace je retardován nebo populace zahyne.

Jako jeden přednostní příklad vhodného média je možno uvést kapalné MS médium s obsahem 0 až 2,0 mg/litr, přednostně 0,1 až 0,2 mg/litr, indolmáselné kyseliny a 30 až 150 g/litr, přednostně 40 až 60 g/litr, glukózy s hodnotou pH 5,8.

Médium může mít pH v rozmezí od 5,5 do 6,0, přednostně od 5,7 do 5,8.

Kultivace se provádí ve zkumavce, jejíž přibližné rozměry mohou být 10 x 80 až 30 x 200 mm. Přednostně se používá zkumavek o rozměrech 15 x 90 až 25 x 120 mm. Je tomu tak proto, že ve zkumavkách menších než odpovídá výše uvedenému rozmezí je dostatečný růst kultivované chmelové populace nemožný a populace, která nedostatečně narostla, poskytuje jen malé chmelové oddenky, i když se zasadí. Produkce požadovaných chmelových oddenků je však na druhé straně špatná i v tom případě, že se kultivovaná chmelová populace nechá růst ve zkumavkách, jejichž rozměr přesahuje výše uvedené rozmezí.

Podle vynálezu se kultivované bezvirové chmelové populace přenesou do média ve zkumavce a dále se v něm kultivují při teplotě 20 až 30 °C, přednostně při 25 °C, vždy za osvětlení 3000 až 25 000 lux, přednostně 15 000 až 20 000 lux. Další kultivace v tomto médiu se může také provádět při 20 až 30 °C, přednostně při 25 °C za osvětlení 3000 až 25 000 lux po dobu prvních 14 až 20 hodin a potom při teplotě 10 až 20 °C, přednostně při 15 °C bez osvětlení po dobu další 4 až 10 hodin. Za těchto podmínek se populace kultivují po dobu od 1 do 3 měsíců, přičemž ve druhém zvýše uvedených případů se cykly v průběhu této doby opakují. Kultivované bezvirové chmelové populace je zapotřebí transplantovat do média po úplném odstranění zakořeňovacího média.

-4CZ 290248 B6

Když se populace tímto způsobem kultivují po dobu asi 1 měsíce, začne se zvětšovat jejich tloušťka v některém místě nad základnou hlavní lodyhy. Po asi 2 měsících vytvoří téměř všechny kultivované populace oddenky. V tomto stádiu začnou špičky lodyh a listy kultivovaných populací vadnout, zatímco tloušťka vzniklých oddenků se dále zvětšuje. Po asi 3 měsících již nedochází k žádnému podstatnému zvýšení produkce dormantních semenáčků a kultivace se ukončí. 70 až 100 % populací kultivovaných výše popsaným kultivačním postupem vytvoří v některém místě nad základnou hlavního lodyhy ztluštělé oddenky.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Z konců lodyh chmelových rostlin se odebere meristém (růstový konec tkáně) v tloušťce 0,2 mm a přenese se na médium obsahující základní MS médium umístěné ve zkumavce o rozměrech 17x105 mm. Použité médium obsahuje 370mg/litr heptahydrátu síranu hořečnatého, 440 mg/litr dihydrátu chloridu vápenatého, 1900mg/litr dusičnanu draselného, 1650mg/litr dusičnanu amonného, 170 mg/litr dihydrogenfosforečnanu draselného, 27,8 mg/litr heptahydrátu síranu železnatého, 37,3 mg/litr dvojsodné soli ethylendiamintetraoctové kyseliny, 22,3 mg/litr tetrahydrátu síranu manganatého, 8,6 mg/litr heptahydrátu síranu zinečnatého 0,025 mg/litr pentahydrátu síranu měďnatého, 0,025 mg/litr hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 0,83 mg/litr jodidu draselného, 6,2 mg/litr kyseliny orthoborité, 0,25 mg/litr dihydrátu molybdenanu sodného, 100 mg/litr myoinositolu, 0,5 mg/litr kyseliny nikotinové, 0,5 mg/litr hydrochloridu pyridoxinu, 0,1 až 1 mg/litr hydrochloridu thiaminu a 2 mg/litr glycinu a bylo kněmu přidáno 2,0 mg/litr benzyladeninu, 0,2 mg/litr kyseliny gibberellové a 20 g/litr glukózy. Hodnota pH média je 5,8 a obsah agaru 8 g/litr. Vrcholky výhonů se na tomto médiu s cyklováním podmínek kultivují po dobu asi 3 měsíců. Jeden cyklus kultivace zahrnuje kultivaci při 25 °C za světla po dobu 16 hodin (osvětlení 5 000 až 20 000 lux) a potom za nepřítomnosti světla po dobu 8 hodin. Během kultivace se metodou ELISA potvrzuje, že populace neobsahují viry. Takto vzniklá bezvirová populace se rozdělí do subkultur (tento postup se celkem dvakrát opakuje) a reprodukcí se získá celkem 100 bezvirových chmelových klonů. Tyto klony se znovu kultivují ještě další měsíc.

Potom se těchto 100 bezvirových chmelových klonů přenese na médium obsahující výše popsané základní MS médium, k němuž bylo přidáno 0,2 mg/litr kyseliny indoloctové a 20 g/litr glukózy. Toto médium má pH 5,8 a obsahuje agar v množství 8 g/litr. Klony se kultivují na tomto médiu při teplotě místnosti asi 2 měsíce, čímž se stimuluje růst apikální dominantní fáze.

100 klonů kultivovaných tímto způsobem se přenese na médium obsahující výše popsané základní MS médium, k němuž bylo přidáno 0,2 mg/litr kyseliny indolmáselné a 20 g/litr glukózy. Toto médium má pH 5,8 a obsahuje 8 g/litr agaru. Klony se dále kultivují na tomto médiu při teplotě místnosti po dobu od 2 týdnů do asi 1 měsíce. Za tuto dobu dojde v dostatečné míře k vyhnání kořenů.

Potom se médium přilnuté ke kořenům a jiným částem zakořeněných bezvirových chmelových klonů za aseptických podmínek opatrně odstraní a vzniklých 100 klonů se použije v následujícím stupni pro produkci bezvirových chmelových oddenků. Konkrétně se postupuje tak, že se bezvirové klony přenesou do zkumavek (o rozměrech 17 x 105 mm), z nichž každá obsahuje 4 ml kapalného média (pH 5,8), které se skládá ze základního MS média, k němuž bylo přidáno

-5CZ 290248 B6

0,2 mg/litr kyseliny indoloctové a 40 g/litr glukózy. Kultivace se provádí s cyklováním podmínek. Jeden cyklus kultivace zahrnuje kultivaci při 25 °C za světla po dobu 16 hodin (osvětlení 5 000 až 20 000 lux) a potom za nepřítomnosti světla po dobu 8 hodin při 15 °C.

Poté co bylo v kultivaci pokračováno po dobu 1 měsíce, klony se začínají ztlušťovat v některém místě nad základnou hlavní lodyhy. Po asi 2 měsících se zjistí, že ze 100 klonů 82 (82%) vytvořilo oddenky. V tomto stádiu začínají špičky lodyh a listy kultivovaných klonů vadnout, zatímco vytvořené oddenky se dále ztlušťují. Po asi 3 měsících již není pozorován žádný nárůst tvorby oddenků, a proto se kultivace ukončí a takto vzniklé oddenky se shromáždí. Čerstvá hmotnost vzniklých oddenků je průměrně 0,26 g (hmotnost nejmenšího je 0,14 g a hmotnost největšího 0,42 g).

Příklad 2

Opakuje se postup popsaný v příkladu 1, pouze stím rozdílem, že se kultivace vrcholu lodyhy provádí ve zkumavkách o rozměrech 25 x 120 mm ave stejných zkumavkách se také provádí stupeň kultivace v produkčním médiu pro tvorbu oddenků. Za těchto podmínek poskytne za tři měsíce 79 % kultivovaných klonů chmelové oddenky, jejichž čerstvá hmotnost je průměrně 0,51 g.

Příklad 3

Opakuje se postup popsaný v příkladu 1, pouze stím rozdílem, že se kultivace vrcholu lodyhy provádí ve zkumavkách o rozměrech 30 x 200 mm a ve stejných zkumavkách se také provádí stupeň kultivace v produkčním médiu pro tvorbu oddenků. Za těchto podmínek poskytne za tři měsíce 26,7 % kultivovaných klonů chmelové oddenky, jejichž čerstvá hmotnost je průměrně 0,79 g.

V předchozím popisu byl vynález podrobně popsán zejména na svých přednostních provedeních. U bezvirových chmelových oddenků, které se získají při výrobě na poli existuje značná pravděpodobnost nové kontaminovace viry prostřednictvím vektorů nebo během pěstování. Naproti tomu chmelové oddenky získané za aseptických podmínek způsobem podle vynálezu jsou prosty virů a nejsou ohroženy kontaminací viry, patogenními červy nebo parazity, takže jsou vysoce bezpečné. Dobře se skladují a po zasazení aktivně vyhánějí kořeny a výhony.

Vynález se neomezuje na konkrétní provedení uvedená v popisu. Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že vynález lze různými způsoby obměňovat a vzniklé modifikace nepředstavují únik z rozsahu ochrany, pro nějž je rozhodující znění následujících patentových nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob výroby chmelových oddenků neobsahujících viry, vy znač uj ící se tím, že se bezvirová chmelová populace kultivuje v zakořeňovacím médiu a po vyhnání kořenů do zakořeňovacího média se kultivuje v produkčním médiu pro chmelové oddenky s vysokým obsahem sacharidu za vzniku chmelových oddenků.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se v produkčním médiu pro chmelové oddenky použije jako sacharidu jednoho nebo více sacharidů zvolených ze souboru zahrnujícího glukózu, fruktózu a sacharózu.
3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že produkční médium pro chmelové oddenky obsahuje monosacharid v koncentraci v rozmezí od 0,15 do 1M.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že produkční médium pro chmelové oddenky obsahuje disacharid v koncentraci v rozmezí od 0,1 do 0,5M.
5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že produkční médium pro chmelové oddenky obsahuje glukózu v koncentraci v rozmezí od 0,15 do 1M.
6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že produkční médium pro chmelové oddenky obsahuje základní MS médium, s přídavkem glukózy v koncentraci v rozmezí od 0,15 do 1M.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako bezvirové chmelové populace použije populace získané kultivací vrcholu lodyhy.