CN1121766A - 生产无病毒蛇麻草根茎的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了生产无病毒蛇麻草根茎的方法，包括在生根培养基中生长被培养的无病毒蛇麻草植株，使之在其中生根，然后通过在含有高浓度糖的生产蛇麻草根茎的培养基中培养以形成蛇麻草根茎。在无菌条件下生产无病毒的蛇麻草根茎，它们没有受病毒、病原蠕虫或寄生虫传染的危险。该植物具有极大的安全性，能被妥善贮存。当被种植时，它们能有效地长出根和芽。

Description

生产无病毒蛇麻草根茎的方法
本发明涉及生产无病毒蛇麻草(Humulus lupulus L.)根茎的方法，该无病毒根茎能稳定贮存，当被种植时，可有效地长出根和芽。
目前尚无有关通过培养而成功生产蛇麻草冬眠芽无性繁殖组织(下文称为“蛇麻草根茎”)的报道。
在此之前，蛇麻草无性系是根据下列方法进行无性繁殖的：1.利用蛇麻草根茎的方法
在秋季切除带有冬眠芽的蛇麻草必要的地下茎，贮存之，然后在苗圃或植物栽培田里种值。因为根茎是具有冬眠芽的无性繁殖组织，故而它能被贮存，其特征在于它被栽种后能有效地长出根，并生长良好。2.栽种蛇麻草插枝的方法
切除蛇麻草的出芽茎、必要的地上茎或侧枝，种植具有至少一个或多个节的插枝使之长出根，然后将如此出根的插枝在苗圃田里生长一年，再将长成的一年生植物移植到植物栽种田里。3.组织培养法
经无病毒技术培养蛇麻草的苗端，并使所培养的无病毒植株得以进一步的离体培养和增殖。然后将增殖的植株移种于花盆中和苗圃田里，再以上述栽种蛇麻草插枝相同的方法移植于植物栽种田。
已有很多关于在栽种带有各种病毒的蛇麻草植物过程中存在污染之危险的报道。在根插利用根茎的方法或种植蛇麻草插枝的方法进行无性繁殖过程中，传染给原始蛇麻草植物的病毒被强加于增殖的蛇麻草植物上。这类在此之前已在日本知晓的病毒包括苹果花叶病毒(ApMV)、蛇麻草潜伏病毒(HLA)、蛇麻草花叶病毒(HMV)、紫红色坏死的环形斑点病毒(PNRV)等。
当经茎端培养获得的无病毒蛇麻草植株一旦从所用的试验试管中取出，并然后种植于花盆或田中，所生长的植物就很有可能通过载体(如蚜虫、线虫等)或通过修剪植物时落下的蛇麻草籽苗汁传染病毒。因此，为了防止栽种的无病毒蛇麻草植株遭受病毒传染，需要进行大量的劳动以提供一块完全隔离的无病毒田，严格地消灭并控制载体，并不时地进行必要的试验以证实在去除那些在早期传染了病毒的植株时所存在的植株不带病毒。
当因引进新品种和因试验栽培而进行国际传输蛇麻草植物时，需要对其进行检疫以防止传染了有害蠕虫等的蛇麻草植物输入。最近，许多国家通过法律手段对蛇麻草植物的进口施加影响，籍此，待进口的蛇麻草植物须被证明不带有所指定种类的病毒。
蛇麻草植物中病毒的检查是用ELISA法进行。然而，刚被病毒传染后的蛇麻草植物通常只具有较低的病毒浓度，致使值物的病毒检查产生阴性结果。因此，一般很难证明经利用蛇麻草根茎或种植蛇麻草插枝的常规方法获得的蛇麻草植物实质上不带病毒。
从理论上讲，这个问题可以通过经茎端培养获得的试管中的无病毒植物得以解决。然而，应用这类培养的无病毒蛇麻草植物涉及其它问题。一个问题是当植物要进行国际运输，生长的小植物要在花盆或在植物栽培田里种植时，需要特殊的仪器设备。另外一个问题是，在需要长时间的国际运输过程中，由培养的植物长成的小植物不能在花盆或植物栽培田里有效生成，则需要赋予被培养的无病毒蛇麻草植物更多的关注。
本发明的目的在于消除被培养的无病毒蛇麻草植物遭受病毒传染的危险，提供能稳定贮存的无病毒蛇麻草根茎，它在被种植时可有效地生长并长出根和芽，籍此，上述有关被培养的无病毒蛇麻草植株的问题都得以解决。
本申请人特别在根据蛇麻草根茎生长条件调查其离体生产情况的同时从事蛇麻草植物的育种和培养的研究多年，结果发现，不具有上述问题的无病毒蛇麻草根茎的生产可以是首先在生根培养基中制备足以长出根的被培养的无病毒蛇麻草植株，然后在含有高糖浓度的、生产蛇麻草根茎的培养基(下文称为生产蛇麻草根茎培养基)中继续培养。基于上述研究结果完成了本发明。
确切地说，本发明提供了生产无病毒蛇麻草根茎的方法，包括在生根培养基中生长被培养的无病毒蛇麻草植株，使之长出根，继而在含高糖浓度的生产蛇麻草根茎培养基中培养，以形成蛇麻草根茎。对于本发明方法的第一实施方案，生产蛇麻草根茎的培养基含有选自葡萄糖、果糖和蔗糖的一种或多种糖化物。对于本发明方法的第二实施方案，含高浓度糖的生产蛇麻草根茎的培养基含有浓度为0.15—1M的单糖。对于本发明方法的第三实施方案，含高浓度糖的生产蛇麻草根茎的培养基含有浓度为0.1—0.5M的二糖。对于本发明方法的第四实施方案，含高浓度糖的生产蛇麻草根茎的培养基含有浓度为0.15—1M的莆萄糖。对于本发明方法的第五实施方案，含高浓度糖的生产蛇麻草根茎的培养基包括向其中加入浓度为0.15—1M葡萄糖的基础MS培养基。对于本发明方法的第六实施方案，被培养的无病毒蛇麻草植株是经分生培养获得的。
获得用于本发明中经培养的无病毒蛇麻草植株可以通过在约35℃培养蛇麻草植物(即使已经传染了病毒)10—18天，然后采集1—5cm茎梢培养。然而，作为获得该植株更简便更精确的方法，可以从蛇麻草苗梢采集生长的尖端组织，再经分生培养获得预期的、经培养的无病毒蛇麻草植株。
为了证实如此获得的蛇麻草植株中不存在病毒，该植株要根据如上所述的ELISA法进行病毒检查。
植物的顶生芽和腋生芽通常都有称作生长尖端或苗端组织的苗端分生组织。生长尖端或苗端组织的培养是指分生培养。
苗端组织一般存在于芽的最里层部分，它主要由叶或小鳞片包裹而无菌。此外，据说在该组织尖端0.3mm部几乎不存在病毒。因此，有可能经切除并培养这部分组织生产无病毒的蛇麻草组织。根据这种分生培养，不仅可将病毒排除于被培养的组织之外，而且还可能获得其中无真菌无细菌的纯净组织。
下面介绍一种具体的分生培养法。切除适宜大小含顶生芽或腋生芽的蛇麻草组织部分，收集之。然后，借助置于洁净台阶上的立体显微镜去掉覆盖苗端的鳞片和叶组织使苗端组织暴露出来，再用无菌快刀(如外科刀等)将如此暴露的苗端组织切成0.15—0.3mm厚的小块，收集之。
当这些小块组织在刀端时将其收集起来，立即放入培养基中。该培养基可以是通常用于植物组织培养的普通种类，例如包括Murashige-Skoog(下文称为MS)培养基、White培养基、Lins-maier-Skoog培养基、Nitsch培养基等。最常用的是已加入植物激素(如植物生长素、细胞分裂素等)的MS琼脂培养基。一个优选的实施例介绍的是包含基础MS培养基的培养基，其中加入了2.0mg/L苄基腺嘌呤(BA)、0.2mg/L赤霉素(GA3)和20g/L葡萄糖(pH5.8；琼脂含量8g/L)。
置于培养基的苗端组织在室温下培养一个月，其上苗端组织生长成能够分为大约10个无性系(即该组织生长成具有大约10个顶生芽或腋生芽的培养植株)。培养一个多月后，分出的无性系进一步繁殖各产生大约10个无性系。培养物的增殖根据所需的无性系数目进行。例如，如果需要1000个无性系，置于培养基上的苗端组织将培养约3个月；而如果需要10000个无性系，则要培养大约4个月。
如此获得的组织要按照ELISA法进行病毒检查，籍此证实这些组织不带病毒。进一步培养被繁殖的无性系，生长一个月后进行生长培养。
接下来，无病毒组织进行生长培养以促进顶端优势期的生长。即培养植株的孤生分枝期有效地转化为顶端优势期。对于这一培养过程，优先使用的是上述MS琼脂培养基，其中已加入0.2mg/L吲哚乙酸和20g/L葡萄糖(pH5.8；琼脂含量8g/L)。
生长培养在室温下进行大约2个月。在证实如此培养的组织已转入顶端优势期后，然后将组织进行根培养。
利用已加入0.2mg/L吲哚丁酸和20g/L葡萄糖(pH5.8；琼脂含量8g/10的MS琼脂培养基进行根培养。具体说来，将培养的组织置于培养基上，再于室温培养2周至大约一月，使组织足以长出根来。
如此培养的无病毒蛇麻草(即已长出根的)在生产蛇麻草根茎培养基中进一步培养，以获得无病毒蛇麻草根茎。
作为生产蛇麻草根茎培养基的基础培养基，所用的可以是上述任何一种普通的植物组织培养的液体培养基，如液体MS培养基。用于本发明中的生产蛇麻草根茎的培养基含有高浓度的糖化物。具体说来，它含有一种或多种选自葡萄糖、果糖和蔗糖等的糖。对于单糖如葡萄糖、果糖等而言，培养基中的糖浓度可以是0.15—1M，优选的是0.2—0.4M；对于双糖如蔗糖等而言，糖浓度可以是0.1—0.5M，优选的是0.1—0.2M。如果糖浓度低于指定范围，培养基中预期的蛇麻草根茎产率明显降低，即使被培养的植株仍然存活其中。相反，如果糖浓度高于指定范围，培养植株的生长受阻或植株死亡。
培养基的一个优选例子包括液体的MS培养基，它含有0—2.0g/L吲哚丁酸，优选的是0.1—0.2mg/L，和30—150g/L葡萄糖，优选的是40—60g/L，培养基的pH值为5.8。
培养基可以有pH5.5—6.0，优选的是pH5.7—5.8。
培养在试验试管中进行，试管的大小为大约10×80－30×200mm，优选的是大约15×90－25×120mm。这是因为在小于上述给定范围的试管中培养的蛇麻草植株不可能充分地生长，而且未充分生长的植株即使被种植也只产生小的蛇麻草根茎。另一方面，如果培养的蛇麻草植株在大于指定范围的试管中生长，那么预期的蛇麻草根茎的产率也不理想。
根据本发明，经培养的无病毒蛇麻草植株移种于试管的培养基上，并于20—30℃，优选25℃，一直在3,000—25,000勒克司光照下作进一步培养，或者在头14—20小时于20—30℃，优选25℃，3,000—25,000勒克司光照下进一步培养，然后于10—20℃，优选15℃且无光照的条件下继续培养4—10小时。在这些条件下，当在后一种情况下重复循环时植株培养1—3月。被培养的无病毒蛇麻草植株将在生根培养基完全从植株中去掉后移种于培养基中。
如此培养约1月后，植株开始在其主干底部以上的任何部位增厚。大约2个月后，几乎所有被培养的植株都长出根茎。在这一阶段，被培养植株的顶干和叶子开始枯萎，而如此生产的根茎在进一步增厚。大约3个月后，可以允许冬眠仔苗的产率不再显著增加，培养过程结束。
根据上述方法培养的植株中有70～100％的在主干底部以上的任何位点产生增厚的根茎。
借助下面的实施例本发明得以更详细的描述，然而，下面的实施例无意于限定本发明的范围。实施例1
收集厚度为0.2mm的蛇麻草茎端的分生组织(生长点组织)，并将其置于17×105mm大小的试管中，该试管已装有包括基础MS培养基的培养基。该培养基含有由下列成分组成的组合物：370mg/L MgSO4·7H2O，440mg/L CaCl2·2H2O，1900mg/LKNO3，1650mg/L NH4NO3，170mg/L K2HPO4，27.8mg/L FeSO4·7H2O，37.3mg/L Na2-EDTA，22.3mg/L MnSO4·4H2O，8.6mg/L ZnSO4·7H2O，0.025mg/L CuSO4·5H2O，0.025mg/LCoCl2·6H2O，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，0.25mg/LNa2MoO4·2H2O，100mg/L肌醇，0.5mg/L烟酸，0.5mg/L盐酸吡哆醇，0.1—1mg/L盐酸硫胺素，2mg/L甘氨酸，并向其中加入2.0mg/L苄基腺嘌吟，0.2mg/L赤霉酸和20g/L葡萄糖。培养基的pH值为5.8，琼脂含量是8g/L。在循环条件下经茎端培养法在上述培养基中培养那些苗端大约3个月。一个培养循环为于25℃、光照16小时(5,000—20,000勒克司)然后无光照18小时的条件下培养顶端。在栽种过程中，用ELISA法证明被培养的植株不带病毒。如此培养的无病蛇麻草植株被分开、移植并亚培养二次，以再生产100个无病毒蛇麻草无性系。它们被再培养1个多月以进一步生长。
然后，将这100个无病毒蛇麻草无性系置于含有上述基础MS培养基的培养基中，其中已加入了0.2mg/L吲哚乙酸和20g/L葡萄糖。该培养基pH5.8，琼脂量为8g/L。它们于室温下培养大约2月，促进其中的顶端优势期的生长。
如此培养的100个无性系被放于含有基础MS培养基的培养基上，其中已加入0.2mg/L吲哚乙酸和20g/L葡萄糖。该培养基pH5.8，琼脂量8g/L。这些无性系在培养基中于室温下培养2周至大约一月，使之充分长生根。
接下来，在无菌条件下小心地去除附着在生根的无病毒蛇麻草无性系的根及其它部分上的培养基。这100个无性系用于在下一步中生产无病毒蛇麻草根茎。具体说来，无病毒无性系被移植到17×105mm大小的试管中，每一试管含有4ml包括基础MS培养基的液体培养基(pH5.8)，其中加入了0.2mg/L吲哚乙酸和40g/L葡萄糖，在循环条件下培养。一个培养循环为无性系先在25℃、光照(5,000—20,000勒克司)在培养16小时，然后于15℃、无光照条件下培养8小时。
如此培养1月后，无性系开始在其主干底部以上的任何位点增厚。2月后，发现82％的无性系生成了根茎。到此阶段，被培养无性系的顶茎和叶子开始枯萎，而所产生的根茎进一步增厚。3个月后，可以接受不再有根茎产率的显著增加，培养可以结束，收集如此生产的根茎。所产生的根茎的平均鲜重是0.26g(最小的重0.14g，最大的重0.42g)。实施例2
重复实施例1中同样的方法，除了茎端培养在25×120mm大小的试管中进行和生产蛇麻草根茎的培养也在25×120mm的试管中进行外。结果，79％被培养的无性系在3个月内产生了蛇麻草根茎，所产生根茎的平均鲜重是0.51g。实施例3
重复实施例1中同样的方法，除了茎端培养在30×200mm大小的试管中进行和生产蛇麻草根茎的培养也在30×200mm的试管中进行外，结果，26.7％被培养的无性系在3个月内产生了蛇麻草根茎，所产生根茎的平均鲜重是0.79g。
本发明在上文，尤其是有关优选实施方案中进行了详细描述，在耕地中收集的无病毒蛇麻草根茎有可能通过载体或在其耕种过程中又遭病毒传染。但是，根据本发明在无菌条件下生产的无病毒蛇麻草根茎没有受病毒、病原蠕虫或寄生虫传染的危险，因而是极安全的。此外，它们可以很好地贮存，在被种值时，能有效地长出根和芽。
在本发明被详细描述并根据具体的实施方案进行说明后，在不背离本发明精神和范围的前提下对此作出各种改变和修饰对于本领域的技术人员是显而易见的。

Claims (7)

1.一种生产无病毒蛇麻草根茎的方法，包括在生根培养基中生长被培养的无病毒蛇麻草植株，使之在培养基中生根，再在含高浓度糖的生产蛇麻草根茎的培养基中培养，在培养基中形成根茎。
2.根据权利要求1的方法，其中生产蛇麻草根茎的培养基中的糖是选自葡萄糖、果糖和蔗糖中的一种或多种糖。
3.根据权利要求1的方法，其中生产蛇麻草根茎的培养基含有浓度为0.15—1M单糖。
4.根据权利要求1的方法，其中生产蛇麻草根茎的培养基含有浓度为0.1—0.5M二糖。
5.根据权利要求1的方法，其中生产蛇麻草根茎的培养基含有浓度为0.15—1M的葡萄糖。
6.根据权利要求1的方法，其中生产蛇麻草根茎的培养基包括其中加入了浓度为0.15—1M葡萄糖的基础MS培养基。
7.根据权利要求1的方法，其中被培养的无病毒蛇麻草植株得自茎端培养。
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