DE4392367C2 - Verbesserungen bei der oder betreffend die Züchtung von Nadelbäumen - Google Patents

Description

Fachgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Züchtung von Nadelbäumen, ein Verfahren zur Herstellung von embryogenem (Embryoide hervor­ bringendem) Kallus aus Nadelbaumexplantaten und ein Verfahren zur Herstellung von Setzlingen.

Hintergrund der Erfindung

Die gewerbliche Forstwirtschaft befaßt sich beinahe aus­ schließlich mit Nadelbäumen, insbesondere Bäumen der Fichtengattung (z. B. der norwegischen Fichte Picea abies), der Kieferngattung (z. B. der Loblolly-Kiefer, Pinus taeda), der Douglas-Tanne (Pseudotsuga menziesii) und der Lärche (Larix sp.).

Ihre wirtschaftliche Bedeutung führte zu umfangreicher Forschung in der Züchtung und dem Anbau derartiger Nadelbäume. Diese Forschung wurde durch die Entwicklung der in vitro-Gewebekultursysteme unterstützt, die das Klonieren ausgewählter Stämme zuläßt.

Gegenwärtig gibt es zwei hauptsächliche Verfahren zur Herstellung multipler Klone von Nadelbäumen.

Eine Methode, die Organogenese, beinhaltet die Entnahme eines geeigneten Explantats und die Kultivierung des Gewebes in Kulturmedien, die sorgsam gesteuerte Nährstoff- und Hormonkonzentrationen enthalten, was zur Bildung eines Kallus führt. Dieser Kallus kann dann auf Knospungsmedien überführt werden. Die derart erhaltenen Knospen werden abgetrennt und können herangezogen werden, wobei einzelne Setzlinge erhalten werden (wie von von Arnold 1984 beschrieben).

Das andere routinemäßig eingesetzte Verfahren ist das der somatischen Embryogenese, die von von Arnold und Hackman (1988) und von der WO 91/05854 offenbart wurde. Dieses Verfahren, das weniger arbeitsaufwendig als die Organogenese ist, beinhaltet die in vitro-Bildung von embryogenem Kallus aus zygotischen Embryoexplantaten. Dieser Kallus führt zur Entstehung vieler pro-embryonaler Strukturen, die abgetrennt und zu Setzlingen herangezogen werden können.

Die somatische Embryogenese kann jedoch nur unter Verwendung von Embryonen oder jungem Cotyledon als Ausgangsmaterial durchgeführt werden. Zum Beispiel wurde ein Erfolg mit Cotyledonexplantaten aus 7 Tage alten Picea abies-Keimlingen (Lelu et al., 1984) und 30 Tage alten Keimlingen von Picea mariana und Picea caluca (Attree et al., 1990) erzielt, jedoch nicht aus älteren Bäumen.

In ähnlicher Weise ist die Organogenese nur erfolgreich, wenn das Explantat von sehr jungen Keimlingen genommen wird. Wenn Explantate von älteren Pflanzen verwendet werden, ist es möglich, Adventivknospen zu erhalten, aber diese können nicht zu Setzlingen herangezogen werden (Jansson & Bornman, 1983; von Arnold, 1984).

Das stellt ein Problem dar, weil die Vorhersage der Qualität des reifen Baums anhand eines jungen Keimlings oder Setzlings unmöglich ist. Auf diese Weise kloniert man unter Umständen ein minderwertiges Exemplar. Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, dieses Problem zu überwinden.

Demzufolge liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von embryogenem Nadelbaumkallus, der zur Erzeugung von Nadelbaumsetzlingen verwendet werden kann, bereitzustellen, das von wachstumsfähigem somatischen Gewebe aus einer Nadelbaumpflanze, die bereits ein über das Keimlingsstadium hinausgehendes Entwicklungsstadium erreicht hat, ausgeht.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von embryogenem Nadelbaumkallus mit den Merkmalen des Anspruchs 1 bereit, das die Kultivierung wachstumsfähigen, von einer Nadelbaumpflanze, die eine ruhende Knospe gebildet hat, stammenden somatischen Gewebes, in einer Weise, daß ein nichtembryogener Kallus erhalten wird, und anschließende Kultivierung des nicht­ embryogenen Kallus in Gegenwart eines embryogenen Kallus in einer Ammenkultur, in einer Weise, daß ein embryogener Kallus erhalten wird, umfaßt.

Ruhende Knospen werden am Ende der Wachstumsperiode hervorgebracht. Daher muß eine Nadelbaumpflanze, die der vorstehend definierten Erfindung zufolge eine ruhende Knospe hervorgebracht hat, das Ende zumindest einer Wachstumsperiode erreicht haben.

Üblicherweise ist das wachstumsfähige somatische Gewebe ein aus einer Nadel, einer Knospe, einem Sproß oder aus Wurzelge­ webe entnommenes Explantat.

Dieses Gewebe kann von einem reifen Baum genommen werden, was die Selektion ausgewählter Exemplare zur Klonierung erlaubt. Das Alter des Baums kann bei verschiedenen Arten variieren, das Verfahren ist jedoch erfolgreich unter Verwendung eines 26 Jahre alten Exemplars von Picea abies durchgeführt worden. "Reif" soll in diesem Zusammenhang "geschlechtsreif" bedeuten. Wie Fachleuten jedoch bekannt ist, muß ein reifer Baum nicht geblüht haben, weil norwegische Fichten im allgemeinen gemeinsam alle 5 bis 8 Jahre blühen. Daher kann ein Baum wohl zur Blüte fähig sein (und daher "reif" sein), wird es aber bis zum geeigneten Zeitpunkt nicht tun. So kann eine norwegische Fichte zum ersten Mal im Alter von 15 Jahren blühen, was jedoch außergewöhnlich ist. Im allgemeinen sind Bäume bei der ersten Blüte 20 bis 25 Jahre alt.

Forscher auf diesem Fachgebiet sind sich im allgemeinen einig, daß die norwegische Fichte (Picea abies) derjenige Nadelbaum ist, der am schwierigsten zu züchten ist. Daher ist dieses Verfahren auf alle Nadelbäume anwendbar, jedoch ist es insbesondere geeignet für andere Fichtenarten (Weißfichte, Schwarzfichte und Zimmerfichte), die Douglas-Tanne, die korsische Kiefer, die nordische Kiefer und die japanische und europäische Lärche und deren Hybride. Ersichtlich kann derart erhaltener embryogener Kallus zur Gewinnung von Setzlingen verwendet werden, z. B. mittels herkömmlicher Aufzucht­ verfahren.

Ammenkulturen sind Fachleuten im allgemeinen wohlbekannt; sie werden z. B. bei Transformationsexperimenten verwendet. Bei einer üblichen Ammenkultur werden ein embryogener Kallus juvenilen Ursprungs und der nichtembryogene Kallus in unmittelbarer Nähe an gegenüberliegenden Seiten einer mikroporösen Membran angeordnet, so daß es keinen direkten Kontakt zwischen den zwei Kallussen gibt und die einzige Verbindung über die Poren der Membran geschieht. Für Wachstum und Erhalt der Kallusse wird durch ein geeignetes Kuturmedium gesorgt.

Üblicherweise weisen die Poren der Membran einen Durchmesser von 0,22 Mikrometern auf. Die Membran kann aus Nitrocellulose oder einem anderen in der Einschätzung von Fachleuten geeigneten Material bestehen.

Vorzugsweise umfaßt die Ammenkultur embryogenes Gewebe der gleichen Spezies wie dasjenige, von dem der nichtembryogene Kallus stammt, jedoch kann das embryogene Gewebe von einem anderen Stamm oder einer anderen Spezies sein, was Fachleuten klar ist.

In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung von Setzlingen bereit, das die Züchtung eines nach dem vorstehenden Verfahren hergestellten Kallus in einer zur Gewinnung von Setzlingen geeigneten Weise umfaßt.

Derartige Medien für diesen Zweck sind Fachleuten ohne weiteres geläufig.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Nadelbaumsetzlingen bereit, das die Züchtung von wachstumsfähigem somatischen Gewebe, das von einer Nadelbaumpflanze stammt, die eine ruhende Knospe gebildet hat, in einer Weise, daß nichtembryogener Kallus erhalten wird, Züchtung des nichtembryogenen Kallus in der Gegenwart eines embryogenen Kallus in einer Ammenkultur in einer Weise, daß embryogener Kallus erhalten wird, und Züchtung des erhaltenen embryogenen Kallus in geeigneter Weise, so daß Setzlinge hervorgebracht werden, umfaßt.

Die Erfindung wird durch Bezugnahme auf das folgende Beispiel und die Abbildung näher erläutert, wobei Fig. 1 die Photographie eines nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten embryogenen Kallus zeigt.

Beispiel

Drei Quellen wurden zur Bereitstellung von nichtembryogenen Explantaten der norwegischen Fichte (Picea abies) verwendet:

1. Sterile Sprosskulturen

Diese waren das Ergebnis einer Organogenese aus zygotischen Embryoexplantaten nach einem zweistündigen Cytokininstoß (von Arnold and Hakman, 1988). Ursprünglich auftretende Sprossen sind als Klone behandelt und von 1988 ab regelmäßig transferiert worden. Die hierin beschriebenen Experimente haben 1990 begonnen, als die Kulturen bereits etwa 2 Jahre lang unterhalten worden sind. Sie befanden sich durchweg in freiem Wachstum und aus Axillarknospen trat eingeschränkte Multiplikation auf. Das verwendete ursprüngliche Saatgut entstammte einer Henndorf-Herkunft in Österreich.

2. Sechs Jahre alte Bäume

Diese wurden aus 5 eingetopften käuflichen Setzlingen einer unbekannten Herkunft in Deutschland herangezogen, die von der Baumschule der Forestry Commission in Scarborough erhalten wurden.

3. Schnitte aus einem reifen Baum

Verschiedene bewurzelte Schnitte einer Herkunft, die in IUFRO-Prüfungen (International Union of Forestry Research Organisations) vertreten sind, wurden verwendet. Dieses Material hatte zuvor in anderen Gewebekultursystemen - z. B. der Organogenese aus schlafenden Knospen - die besten Eigenschaften gezeigt. Die Herkunft ist Jilove n Prahy in der Tschechoslowakei; und Sämlinge wurden 1968 aus 1964er Saatgutsammlungen gepflanzt. Die reifen Bäume waren zum Zeitpunkt des in diesem Beispiel beschriebenen Versuchs 26 Jahre alt. Ein einzelnen 26-Jahre alter Baum wurde sowohl als Quelle bewurzelter Schnitte als auch zur Gewinnung von Knospenexplantaten benutzt, die dem Baum unmittelbar entnommen wurden (nachstehend beschriebene "embryogene Sprossenexplantate"). Die entnommenen Explantate decken somit 3 Punkte in der Reifung der norwegischen Fichte ab.

Kulturverfahren

Die Mehrzahl der Explantate waren schlafende Nadeln, die von zuvor oberflächensterilisierten Sprossen der 6 Jahre alten Bäume abgetrennt worden sind, und Schnitte. Bei den Sprossen in Kultur war keine Sterilisation notwendig. Die Konzentration und Dauer der Behandlung in Chloroxlösungen wurde variiert, ein Eintauchen in 70%igen Ethanol ging jedoch immer voran. Viele Chargen der Nadelexplantate waren ungeachtet der Sterilisationsbehandlung auch vollständig mit Pilzen kontaminiert. Die aus einer Nadel und einem Stammansatz bestehenden Gewebe wurden auf dem Medium angeordnet, das routinemäßig zur Etablierung und der Erhaltung von embryogenem Kallus aus zygotischen Embryos und Gametophyten verwendet wird. In verschiedenen Experimenten erfolgte eine Replikation von 20 auf 1000. Das verwendete, 1/2 ES bezeichnete Medium enthielt die folgende Bestandteile (in µMol/Liter) : KNO₃ (8400) MgSO₄×7H₂PO₄ (1200) CaCl₂×2H₂O (520), NH₄NO₃ (15000) ZnSO₄×7H₂O (5), MnSO₄×4H₂O (5) H₂BO₃ (5) KI (2.3), Na₂MoO₄×5H₂O (0,05), CuSO₄×5H₂O (0.008), CoCl₂×6H₂O (0,008), Na₂EDTA×2H₂O (0,03) FeSO₄×7H₂O (0,03), Mesoinito­ sitol (500), Nikotinsäure (0,8), Thiamin (1,4), Pyrodoxin × HCl (0,5), Glycin (2,6), Glutamin (0,002), Naphtylessigsäure (10), Benzylaminopurin (5), sowie 88 mMol Saccharose und 0,8% Difco-Agar.

Embryonale Sprossenexplantate wurden ebenfalls als Explantate des reifen Baums verwendet, die aus vegetativen Knospen seziert wurden. Diese Explantate wurden während der Ruheperiode (von Oktober bis April) gesammelt und werden am besten als embryonale Sprossen beschrieben, die ein Meristem, viele Nadelorgananlagen und die Krone umfassen. Die Explantate wurden, wie jeder daraus hervorgegangene Kallus, regelmäßig alle 6 Wochen in das gleiche Medium überführt. Nach 6 oder mehr Transferzyklen seit der Etablierung wurden alle hervorgebrachten nichtembryogenen Kallusse in eine Ammenkultur mit embryogenem Kallus gesetzt. Diese Ammenkulturen umfaßten embryogenen Kallus aus einer Linie, die von Joachim Buttgereit 1989 aus zygotischen Embryoexplantaten aus Saatgut einer Gerlitz-Herkunft (die routinemäßig zur Bildung somatischer Embryos veranlaßt werden kann) gewonnen wurde, und einen nichtembryogenen Nadel- oder Knospenkallus, der vom embryogenen Kallus durch eine 0,22 µm- Millipore-Filtermembran, wie in Fig. 1 gezeigt, räumlich getrennt war. Es wurde durchweg das gleiche Medium verwendet. Die Ammenkulturen wurden alle 4 Wochen mit großer Vorsicht, um die zwei Kallusse nicht zu vermischen, in frisches Medium überführt. Alle Kulturen wurden bei 22°C in Dunkelheit gehalten.

Tabelle 1 faßt die Zahl der Explantate zusammen, die nach 3 Transferzyklen nichtembryogenen Kallus hervorbrachten. Jeder Kallus entsprang dem Stammansatzende der Nadeln, und aus Tabelle 1 ist deutlich, daß das Alter der Pflanzen, denen die Explantate entnommen wurden, die Fähigkeit zur Kallusbildung beeinflußte. Die Knospenexplantate, die unmittelbar dem 26 Jahre alten Baum entnommen wurden, waren produktiver als Nadelexplantate aus bewurzelten Schnitten. Während der nachfolgenden Transferzyklen nahm die Zahl der Kallusse ab, bis bei Transfer 6 98 der 139 sterilen Sprosskulturen, die anfänglich nichtembryogenen Kallus produzierten, verblieben. Zwei der 6 Jahre alten Bäume hatten keine Explantate mit nichtembryogenem Kallus und von den 180 Kallussen aus den Knospenexplantaten, die dem 26 Jahre alten Baum entnommen wurden, überlebten 51.

Anschließend wurden aus einer repräsentativen Probe der nichtembryogenen Kallusse Ammenkulturen etabliert. Nach 8 bis 10 Transferzyklen traten in 8 Kulturen, die repräsentativ für 3 der sterilen Sprosskulturklone waren, und all denjenigen der 6 Jahre alten Bäume, die überlebende Kallusse hatten, embryogene schleimige Abschnitte auf. Wie in Fig. 1 gezeigt, wird der embryogene Kallus 10 als rasch wachsend und ausbreitend im Wachstumsverhalten leicht unterschieden. Seine Identität wurde durch das Vorliegen von Proembryonen und suspensorartigen Zellen nach dem Anfärben und lichtmikroskopischer Untersuchung bestätigt. Jeder neue embryogene Kallus wurde vom ursprünglichen nichtembryogenen Material wegisoliert. Die Ammenkulturen ließen nichtembryogenen Kallus überleben: nur 6 Kallusse, welche 2 der sterilen Sprosskulturklone repräsentierten, lebten nach 12 Passagen (ohne in Ammenkulturen gesetzt worden zu sein). Jedoch waren 19 der gleichen Linien (7 sterile Sprosskulturklone) als Ammenkulturen aktiv, und 26 der ursprünglich 180 Kallusse aus dem 26 Jahre alten Material überlebten in Ammenkulturen. Keine Kallusse aus dem 26 Jahre alten Baum überlebten ohne in eine Ammenkultur gesetzt worden zu sein. Keines von diesem Material brachte vor dem Transferzyklus 15 embryogene Abschnitte hervor.

Somatische Embryogenese wird durch die Verwendung von Explantaten aus dem jüngsten verfügbaren Gewebe begünstigt.

Die hier vorgelegten Ergebnisse zeigen jedoch, daß embryogener Kallus aus Explantaten aus älteren Bäumen mit niedriger Frequenz gewonnen werden kann. Die eingesetzten Ammenkulturen förderten das Wachstum und das überleben des langsam wachsenden Kallus, der aus älteren Bäumen erhalten wurde, und förderte die Bildung des embryogenen Kallus. Die produktivste Gruppe von Explantaten war diejenige von den 6 Jahre alten Bäumen, wobei 5 der 96 etablierten Ammenkulturen die Bildung von embryogenem Kallus zur Folge hatten.

Ein hauptsächlich begrenzender Faktor bei älteren Geweben ist die niedrige Frequenz der anfänglichen Kallusbildung, besonders bei Nadeln, die mit der Unzuverlässigkeit der Obenflächensterilisation von Explantaten aus im Freien gewachsenen Bäumen zusammenhängt. Knospenexplantate sind, obwohl sie produktiver sind, schädlich für den Ursprungsbaum. Eine andere wichtige Begrenzung ist die Zeit, die zum mehr als 12-monatigen Erhalten von Kulturen erforderlich ist. Es gibt ein Abwägen hinsichtlich der erlaubten Zeit, da Kallusse mit hoher Geschwindigkeit absterben, was durch die Tatsache gezeigt wird, daß nur Material aus 2 der ursprünglich 139 sterilen Sprosskulturen 12 Transferzyklen überlebten, ohne in einer Ammenkultur etabliert zu werden. Die Spanne von 6 Transferzyklen, bevor Versuche zur Induzierung der Embryogenese gemacht wurden, wurde bewußt gewählt, um Zellteilungen in einem unorganisierten Zustand ablaufen zu lassen, die den reifen Status des Gewebes eliminieren könnten. Ammenkulturen förderten das Überleben der Kallusse und unterstützten die Embryogenese. Obwohl der Ammenkallus und der nichtembryogene Kallus räumlich getrennt waren, befanden sie sich in engem chemischen Kontakt und es gibt mehrere Kandidaten für aktive, den Embryogenesebeginn anregende Moleküle, z. B. einige Iso-Formen der Peroxidase (van Engelen & de Vries, 1992) und Arabinoglutaminsäure­ laktanproteine (EP-A-91810315.1 = EP 0455597 A1).

Tabelle 1

Literaturverzeichnis

S. von Arnold, (1984). Importance of genotype on the potential for in vitro adventitious bud production of Picea abies.
S. von Arnold and I. Hakman (1988). Plantlet regeneration in vitro via adventitious buds and somatic embryos in Norway Spruce (Picea abies) in: Genetic manipulation of woody plants (eds. J.W. Hanover and D.E. Keathley), 199-219.
S.M. Attree, S. Budimir and L.C. Fowke. Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from cultured shoots and cotyledons of seedlings from store seeds of black and white spruce (Picea mariana and Picea clauca). Can. J. Bot., 68 30-34.
J.M. Bonga (1987). Clonal propagation of mature trees. Problems and possible solutions. In Cell and Tissue Culture in: Forestry (eds. J.M. Bonga, D.J. Durzan). Martinus Nÿhoff. Band 1, 249-272.
F.A. van Engelen and S.C. de Vries (1992). Extracellular proteins in plant embryogenesis. T.I.G., 8, (2), 66-70.
D.K. Gupta, D.J. Durzan and B.J. Finkle (1987). Somatic polyembryogenesis in embryogenic cell masses of Picea abies (Norway Spruce) and Pinus taeda (Loblolly Pine) after thawing from liquid nitrogen. Can. J. For. Res., 17, 1130-1134.
E. Jansson and C.H. Bornman (1983). Morphogenesis in dormant embryonic shoots of Picea abies. Influence of the crown and cold treatment. Physical Plant, 59, 1-8.
M-A. Lelu, M. Boulay and Y. Arnold. Obtention de cals embryogenes a partir de cotyledons de Picea abies (L) Karst preleves sur de jeunes plantes ag´es de 3 a 7 jours après germination. C.R. Acad. Sci. Paris, 305, III, 105-109.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von embryogenem Nadelbaumkallus, umfassend die Kultivierung von wachstumsfähigem somatischen Gewebe, das von einer Nadelbaumpflanze stammt, die eine ruhende Knospe hervorgebracht hat, in einer Weise, daß nichtembryogener Kallus erhalten wird, und die Kultivierung des nichtembryogenen Kallus in Gegenwart eines embryogenen Kallus in einer Ammenkultur in einer Weise, daß embryogener Kallus erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das wachstumsfähige somatische Gewebe ein aus einer Nadel, einer Knospe, einem Sproß oder aus Wurzelgewebe entnommenes Explantat ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das wachstumsfähige somatische Gewebe einem reifen Baum entnommen wird.

4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Ammenkultur einen embryogenen Kallus juvenilen Ursprungs der gleichen Spezies wie der nichtembryogene Kallus, mit dem er kultiviert wird, umfaßt.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der embryogene Kallus juvenilen Ursprungs und der nichtembryogene Kallus nahe an gegenüberliegenden Seite einer mikroporösen Membran angeordnet sind.

6. Verfahren zur Herstellung von Nadelbaumsetzlingen, umfassend das Kultivieren von embryogenem Kallus, der durch das Verfahren eines der vorstehenden Ansprüche hergestellt wurde, in einer zur Gewinnung von Setzlingen geeigneten Weise.