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TECHNISCHES
GEBIET
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Die
Erfindung betrifft Verfahren zur Vermehrung bzw. Anzucht von Pflanzen.
Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Handhabung, zur
Aussaat und zur Keimung somatischer Planzenembryos.
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STAND DER
TECHNIK
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Der
Entwicklung somatischer Embryogeneseverfahren zur klonalen Reproduktion
von Pflanzen ist in der Vergangenheit erhebliche Aufmerksamkeit
gewidmet worden, was dazu führte,
dass die spezifischen Schritte der somatischen Embryogenese für eine große Vielfalt
von Pflanzenarten, einschließlich
Gymnospermen und Angiospermen, im Stand der Technik dokumentiert
sind. Alle Verfahren der somatischen Embryogenese sind als Gewebekulturverfahren
bekannt und beginnen in der Regel mit der Auswahl von Explantaten
aus einer gewünschten
Pflanze. Das Explantat wird durch Exzision aus dem Gewebe der Elternpflanze
entfernt und wird anschließend
auf wenigstens einem Medium kultiviert, um eine Zellmasse zu erzeugen,
welche zu weiterer Differenzierung und Entwicklung befähigt ist.
Diese Zellmasse kann im undifferenzierten Zustand unbegrenzt erhalten
und vermehrt werden, oder sie kann manipuliert werden, um die Differenzierung
in unreife somatische Embryostrukturen zu stimulieren, die dann
zu reifen Embryos kultiviert werden können (siehe z.B. US-Patente Nr. 4,957,866;
5,238,835; 5,294,549; 5,491,090; 5,501,972; 5,563,061; 5,677,185
sowie PCT-Veröffentlichung
Nr. WO 96/37096). Gereifte somatische Embryos können geerntet und sofort zum
Keimen gebracht, oder zunächst
getrocknet und dann zum Keimen gebracht, oder getrocknet und solange
gelagert werden, bis sie zur Auskeimung benötigt wer den (siehe z.B. US-Patente
5,183,835; 5,238,835; 5,413,930; 5,464,769 sowie die PCT-Veröffentlichung
WO 96/37095).
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Die
zur Proliferation und Vermehrung bzw. Anzucht von Pflanzenkulturen
in den verschiedenen Stufen der somatischen Embryogenese verwendeten
Gewebekulturmedien sind in der Regel mit Nährstoffmischungen angereichert,
die für
jede einzelne Pflanzenart und für
die verschiedenen Stufen der somatischen Embryogenese speziell formuliert
werden. Ein allen somatischen Embryogeneseverfahren gemeinsames
Problem ist die mikrobielle Kontamination, d.h. bakterielle oder
Pilz- oder Hefekontamination, der Medien und/oder Pflanzenexplantate
und/oder der resultierenden embryogenen Kulturen. Mikrobielle Kontaminanten
konkurrieren mit den embryogenen Kulturen um die in den Medien enthaltenen
Nährstoffe,
und vielfach infizieren, konsumieren oder parasitieren sie die Kulturen
oder pathogenisieren diese in anderer Weise. Folglich müssen Schritte
unternommen werden, um die mikrobielle Kontaminierung vom Beginn
das Embryogeneseverfahrens, d.h. dem Herausschneiden der Explantate
aus den Elterngeweben, an über
die Produktion, die Ernte, das Trocknen und die Keimung der somatischen
Embryos und deren anschließendes
Wachstum zu voll funktionsfähigen Transplantaten,
d.h. somatischen Sämlingen,
die in Erde oder in Gartenbaukulturmischungen versetzt werden können, zu
verhindern. Alle Manipulationen der Kulturen werden in jedem Schritt
der somatischen Embryogeneseverfahren üblicherweise unter Anwendung
aseptischer Techniken durchgeführt.
Embryogene Kulturen die in irgendeinem der Schritte des somatischen
Embryogeneseverfahrens Anzeichen für eine mikrobielle Kontaminierung
zeigen, werden sterilisiert und verworfen.
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Zwei
der größten Hindernisse,
die der Kommerzialisierung somatischer Embryogenese entgegenstehen,
sind die Verfahren des Aussäens
und der Keimung somatischer Pflanzenembryos. Zwar ist eine Vielzahl von
Protokollen für
das Aussäen
und Keimen somatischer Embryos und deren Aufzucht zu intakten, funktionstüchtigen
Sämlingen
bekannt, doch erwies sich keines dieser Protokolle als kompatibel
mit den herkömmlichen,
durch hochvolumige Durchsätze
gekennzeichneten Gartenbauausrüstungen
und -verfahrensweisen.
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Die
bekannten Protokolle zur Keimung somatischer Embryos lassen sich
im Allgemeinen in zwei Kategorien aufteilen. Die erste Kategorie
ist gekennzeichnet durch das Aussäen nackter somatischer Embryos, d.h.
Embryos ohne Samenschale, unter Anwendung aseptischer Verfahren
auf sterilisierte halbfeste oder flüssige Medien, die sich auf
einem festen Träger
befinden, um die Keimung zu erleichtern (z.B. US-Patente 5,183,757; 5,294,549; 5,413,930;
5,464,769; 5,506,136), sowie durch das anschließende Verpflanzen der auskeimenden
Samen in herkömmliche
Kultursysteme. Der bedeutendste Nachteil dieser Protokolle zur Aussaat nackter
somatischer Embryos besteht darin, dass jeder Embryo in den Keimungs-
und Verpflanzungsschritten in der Regel von Hand gehandhabt und
manipuliert werden muss. Zwar wurden verschiedene Optionen der Automatisierung,
einschließlich
Robotik und maschinelles Sehen, auf ihre Nützlichkeit im Hinblick auf
die kosteneffektive Reduktion oder Vermeidung der derzeit zur Aussaat
nackter Embryonen erforderlichen extensiven manuellen Handhabung
hin untersucht (Roberts et al., 1995), doch gibt es gegenwärtig keine
kommerzielle Ausrüstung,
mit der die In-vitro-Protokolle zur Keimung nackter somatischer
Embryonen und zum anschließenden
Verpflanzen in herkömmliche
Anzuchtsysteme zuverlässig,
aseptisch und kosteneffektiv durchgeführt werden können.
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Die
zweite Kategorie von Protokollen lehrt die Einkapselung somatischer
Embryonen (z.B. US-Patente 4,777,762; 4,957,866; 5,183,757; 5,482,857),
um einen Weg bereitzustellen, auf dem die Embryonen voraussichtlich
mittels mechanischer Geräte,
wie Sämaschinen
und Flüssigdrillmaschi nen,
in übliche
Anbausysteme gesät
werden können.
Es gibt jedoch eine Reihe von Nachteilen bei eingekapselten somatischen
Embryonen. Durch die physikalischen Eigenschaften der hydratisierten,
halbfesten eingekapselten Embryonen sind diese z.B. nicht zur Verwendung
mit konventioneller Säausrüstung geeignet,
die derzeit für
die kommerzielle Pflanzenanzucht erhältlich ist, da die halbfesten,
eingekapselten somatischen Embryonen dazu neigen, bei der Handhabung
zusammenzuklumpen und daher schwer zu vereinzeln und zu verteilen
sind. Außerdem
verstopfen die Zusammensetzungen eingekapselter Embryonen, die nach
dem Stand der Technik vorbereitet wurden, die konventionelle Ausrüstung und
es ist daher derzeit nicht möglich,
eingekapselte Embryonen mit konventionellen Sägeräten auszusäen. Folglich wurden neue Geräte speziell
dafür entwickelt,
eingekapselte somatische Embryonen in übliche Anbausysteme einzubringen.
Sakamoto et al. (1995) gibt einen Überblick über derartige Sägeräte, die
jedoch lediglich als Prototypen entwickelt und getestet wurden.
Aufgrund mechanischer Einschränkungen
und hoher Kosten, die mit den Prototypen mechanischer Sämaschinen
verbunden sind, die für
die Aussaat eingekapselter Embryonen entwickelt wurden, sind derzeit
keine im Handel zum Kauf oder zur Verwendung erhältlich.
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Ein
weiterer Nachteil eingekapselter somatischer Embryonen ist die fehlende
Verfügbarkeit
von Nährstoffen,
welche zygotische Embryonen charakteristischer Weise aus dem vorhandenen
Endosperm- oder Megagametophytengewebe erhalten. Daher wurde die
Einkapselungstechnik für
somatische Embryonen dahingehend erweitert, dass dabei auch verschiedene
Nährstoffe,
wie Zucker, Düngemittel
und Sauerstoff, in das Kapselmedium eingearbeitet werden (z.B. Carlson & Hartle, 1995;
U.S. Patente 4,583,320; 5,010,685; 5,236,469, die hierin sämtlich durch
konkrete Bezugnahme aufgenommen sind). Ein deutlicher Nachteil in
Verbindung mit eingekap selten Embryonen mit Nährstoffergänzung ist jedoch ihre Anfälligkeit
für den
Befall mit Mikroben während
der Herstellung, Lagerung und Keimung, wenn die Keimung auf nichtsterilen
Medien stattfindet.
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Außerdem muss
darauf hingewiesen werden, dass, obwohl ein bedeutender Teil des
Standes der Technik (z.B. PCT-Anmeldung
WO 94/24847 und U.S. Patente 5,010,685; 5,236,469; 5,427,593; 5,427,593; 5,451,241;
5,486,218) Verfahren zur Herstellung von „künstlichem Saatgut" lehrt, das aus somatischen
Embryonen besteht, welche in Gelen eingekapselt sind, die wahlweise
mit Nährstoffen
behandelt sein können oder
nicht, und die von einer starren Umhüllung umgeben sein können oder
nicht, und obwohl der Stand der Technik sich auf die Ex-vitro-Aussaat
besagten künstlichen
Saatguts in Keimungsmedien bezieht, die aus Erd- oder erdfreien
Mischungen bestehen, lehrt der Stand der Technik nur Verfahren zur
In-vitro-Keimung des künstlichen
Saatguts, d.h. auf sterilisierten, halbfesten Labormedien. Es werden
im Stand der Technik keine Verfahren für die Aussaat der eingekapselten
somatischen Embryonen und/oder des hergestellten und/oder künstlichen
Saatguts in konventionelle Anbausysteme unter Verwendung herkömmlicher
Säausrüstung gelehrt.
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Der
entscheidende Nachteil bei allen verfahren zur Einkapselung oder
anderweitigen Ummantelung von somatischen Embryonen, die im Stand
der Technik gelehrt werden, besteht jedoch darin, dass somatische Embryonen,
die nach diesen Protokollen behandelt wurden, als Folge davon typischer
Weise geringere Keimkraft und geringeren Keimerfolg aufweisen als
entsprechende zygotische Samen (Carlson & Hartle, 1995). Carlson & Hartle (1995)
kamen zu dem Schluss, dass noch beträchtlicher Forschungsaufwand
nötig ist,
bis „hergestelltes" oder „künstliches" Saatgut basierend
auf der Einkapselung und/oder Umhüllung von somatischen Embryonen praktischen
Nutzen aufweisen wird. Es ist jedoch anzumerken, dass die Keimkraft
nackter somatischer Embryonen, d.h. solche ohne Umhüllung oder
Einkapselung, die nach den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren
hergestellt werden, in etwa derjenigen der entsprechenden zygotischen
Samen entsprechen kann (z.B. über
85%) (Gupta & Grob,
1995).
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Es
wird ferner darauf hingewiesen, dass das US-Patent 5,506,136 an
Becwar et al, erteilt am 9 April 1996 und auf Westvaco Corporation,
New York, übertragen,
ein Verfahren mit mehreren Schritten offenbart, mit dem es möglich ist,
das gesamte regenerative verfahren der somatischen Embryogenese,
vom Sammeln der Explantate bis hin zum Einpflanzen, vollständig auszuführen (insbesondere
für Pflanzen
der Gattung Pinus und für
Pinus-Hybridpflanzen). Zwar handelt es sich hierbei um ein In-vitro-Verfahren,
doch wird auch auf die Verpflanzung von Setzlingen in Torfballen
in eine Topfmischung sowie auf die Unterbringung der Setzlinge in einer
Gewächshausnebelkammer
Bezug genommen. Dies bezieht sich jedoch auf die Akklimatisierung
von in vitro gekeimten somatischen Sämlingen, nachdem diese in Wachstumsmischungen
umgepflanzt wurden. Die Embryokeimung als solche ist nicht Teil
dieses Verfahrens.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Vereinfachung der Herstellung
von Sämlingen
aus somatischen Pflanzenembryonen.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung
eines Verfahrens, mit dem es möglich
ist, einen somatischen Embryo ex vitro auszusäen und zum Keimen zu bringen
und zu einem Sämling
heranzuziehen, und zwar unter Verwendung von herkömmlichen
gartenbaulichen und land wirtschaftlichen Ausrüstungen, Behältern, Wachstumssubstraten
und Wachstumsumgebungen.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines
Verfahrens, mit dem die Anwendung der Ex-vitro-Aussaat und Ex-vitro-Keimung somatischer
Embryos auf eine Reihe unterschiedlicher Gymnospermenarten möglich ist.
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Diese
sowie weitere Ziele und Vorteile werden mittels eines neuen, erfindungsgemäßen mehrstufigen Verfahrens
erreicht bzw. erhalten, mit dem es möglich ist, unter Verwendung
herkömmlicher
Säausrüstung somatische
Embryos ex vitro auszusäen
und zum Keimen zu bringen, und zwar in einer großen Vielfalt von Gartenbau-Vermehrungs-
bzw. Anzuchtbehältern,
die mit unterschiedlichen Arten von nichtsterilen Wachstumsmischungen,
wie sie üblicher
Weise bei der kommerziellen Vermehrung von Pflanzen im Gartenbau,
Waldbau und in der Landwirtschaft Anwendung finden, gefüllt sind.
Ein bedeutender Vorteil des Verfahrens der vorliegenden Erfindung
besteht darin, dass das Verfahren in herkömmlichen, zur Vermehrung bzw.
Anzucht von Pflanzen verwendeten Wachstumsumgebungen ohne die Notwendigkeit
aseptischer Handhabungsverfahren oder steriler Wachstumsumgebungen
angewandt werden kann.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die Ex-vitro-Keimung
somatischer Gymnospermenembryos bereitgestellt, das folgende Schritte
umfasst: das Aussäen
eines Gymnospermenembryos auf einem oder in ein Drei-Phasen-Substrat,
dessen Phasen feste, flüssige
und gasförmige
Phasen umfassen; Anordnen des den somatischen Embryo enthaltenden
Substrats in eine Pflanzenwachstumsumgebung mit gesteuerten Umgebungsbedingungen,
in welcher wenigstens ein Umgebungsfaktor gesteuert und manipuliert
werden kann; Manipulieren wenigstens eines Faktors, um das Keimen
des somatischen Embryos zu ermöglichen
und zu er leichtern, und über
einen Zeitraum im Bereich von vorzugsweise 3 bis 8 Wochen Zuführen von
Wasser und/oder Nährstofflösungen zu
dem Substrat in regelmäßigen Intervallen
während des
Zeitraums der Keimung des somatischen Embryos, wobei die Intervalle
vorzugsweise im Bereich von 1 Minute bis 24 Stunden liegen, so dass
es zu Imbibition, Keimung, Wachstum und Entwicklung des somatischen Embryos
kommt, dadurch gekennzeichnet, dass die Embryos nackt ausgesät und unter
nicht sterilen Wachstumsbedingungen zum Keimen gebracht werden,
wobei sowohl die Pflanzenwachstumsumgebung mit gesteuerten Umgebungsbedingungen
als auch das Drei-Phasen-Substrat
nicht steril sind.
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Die
Erfindung umfasst des Weiteren das Ziehen von Sämlingen aus derartigen Embryos
vorzugsweise durch Reduzieren des Wasser- und Nährstoffvolumens, das auf die
Oberfläche
des Drei-Phasen-Substrates in Form von Mikrotröpfchen aufgebracht wird, und
zwar während
des Zeitraums, in dem die gekeimten Embryos autotroph werden (gewöhnlich nach
einer Zeit von 3 bis 8 Wochen nach dem Beginn der Aussaat). Natürlich ist
es nicht notwendig, den Prozess nach dem Auskeimen und vor der weiteren
Entwicklung zu voll funktionsfähigen
Sämlingen
abzubrechen. Das gesamte Verfahren wird kontinuierlich durchgeführt, von
der anfänglichen
Aussaat bis zur Erzeugung des Sämlingsendproduktes.
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Die
Erfindung umfasst ebenfalls gekeimte Embryos und Sämlinge,
die mittels obiger Verfahren entwickelt und gezogen werden.
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Das
verfahren der Erfindung umfasst – ist jedoch nicht beschränkt auf – die Schritte:
Aussäen
somatischer Embryos unter Verwendung herkömmlicher Aussaatausrüstung in
Gartenbaubehälter,
die ein ausgewähltes
Wachstumssubstrat enthalten, sodann Unterbringen der Behälter in
Wachstumsumgebungen, in denen ein oder mehrere Umgebungsparameter,
umfas send Temperatur, Licht, Humidität, Feuchtigkeit und Nährstoffe,
derart gesteuert und manipuliert werden, dass innerhalb eines gewissen
Zeitraums die somatischen Embryos keimen und sich zu vollständigen Sämlingen,
die Wurzeln und Sprossen aufweisen, entwickeln.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden nackte (nicht eingekapselte) Embryos ex vitro in nicht-sterilen
Anzuchtbedingungen verwendet, wobei dem Wachstumssubstrat Wasser
und Nährstoffe
ausschließlich
mittels Mikrotröpfchen
zugeführt
werden. Es wird davon ausgegangen, dass der Vorteil des Einsatzes
von Mikrotröpfchen
darin besteht, dass die Embryos während der Keimung völlig ungestört bleiben
können.
Die Embryos bleiben hierbei nicht nur physisch ungestört, sondern
es treten auch keine raschen Veränderungen
der Temperatur, der Feuchtigkeit oder der Nährstoffkonzentration in der
Umgebung der Embryonen auf, wie dies möglicherweise bei konventionellen
Bewässerungs-
und Nährstoffzuführungsverfahren
(z.B. Berieseln, Tränken
usw., unter Verwendung von Flüssigkeitsströmen oder
großen
Tropfen) der Fall ist.
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Das
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung bietet mehrere Vorteile. Ein Vorteil besteht z.B. darin,
dass aseptische Verfahren und sterile oder desinfizierte Ausrüstung sowie
Keimungs-/Anzuchtumgebungen für
die erfolgreiche Keimung somatischer Embryonen und deren anschließende Entwicklung
zu vollständigen
Sämlingen
nicht erforderlich sind, womit es ermöglicht wird, sämtliche
Aussaat- und Keimungsschritte in kommerziellen Gewächshäusern oder
Pflanzenanzuchteinrichtungen durchzuführen. Ein weiterer Vorteil
besteht in der Möglichkeit
der Verwendung von nackten (nichteingekapselten) Embryos. Ein anderer
Vorteil ist, dass die somatischen Embryos mittels herkömmlicher
Säausrüstung, wie
Vakuum-Trommelsägeräte ("vacuum-drum seeders") oder Nadeldüsensägeräte ("needle-jet seeders") (ohne auf diese
be schränkt
zu sein), ausgesät
werden können.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass üblicherweise verwendete gartenbauliche
und landwirtschaftliche Produkte wie Sämlingsmischungen ohne Erde,
Steinwolle oder Schäume
und dergleichen (ohne auf diese beschränkt zu sein) als Träger verwendet
werden können,
auf welche die somatischen Embryos ausgesät werden und in die sie anschließend auskeimen
und mit ihren wurzeln eindringen können.
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Ein
zusätzlicher
Vorteil ist, dass, falls aufgrund der Bedingungen in den gewerblichen
Wachstumsumgebungen erforderlich, vorhandene kommerzielle Pestizidprodukte
wie, jedoch nicht ausschließlich,
Fungizide, Bakterizide, Antibiotika, Nematizide, Insektizide und
dergleichen, die für
die Verwendung für
die Pflanzenarten registriert sind, aus denen die somatischen Embryonen
hergestellt werden, auf die ausgesäten somatischen Embryonen gemäß Herstellerangaben
zur wirksamen Schädlingsbekämpfung aufgebracht
werden oder alternativ vor der Aussaat der somatischen Embryonen
auf die Anbausubstrate aufgebracht werden können.
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Ein
weiterer Vorteil ist, dass exogene Nährstoffe, die für die erfolgreiche
Keimung somatischer Embryonen erforderlich sind, mittels zahlreicher
Verfahren zugeführt
werden können,
die im gewerblichen Gartenbau üblicher
Weise verwendet werden, wobei diese Verfahren umfassen, jedoch nicht
eingeschränkt
sind auf, Bedunsten, Nebeln, Sprühen,
Wässern
und Tränken.
Die exogenen Nährstoffe
können
außerdem
in Verbindung mit herkömmlichen
Fertigungsverfahren aus dem Gartenbau zugeführt werden.
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Einige
Begriffe haben bekannter Weise unterschiedliche Bedeutungen, wenn
diese in der Fachliteratur des Gebiets verwendet werden. Es wird
davon ausgegangen, dass die folgenden Definitionen die gebräuchlichsten
im Bereich der Botanik und der somatischen Pflanzenembryogenese
sind und mit der Verwendung der Begriffe in der vorliegenden Beschreibung übereinstimmen.
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„Explantat" bezeichnet das Organ,
das Gewebe oder die Zellen, die von einer Pflanze abgeleitet sind und
in vitro kultiviert werden, um eine neue Pflanzenzell- oder Gewebekultur
anzulegen.
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„Embryogene
Kultur" ist eine
Pflanzenzell- oder -gewebekultur, die in der Lage ist, somatische
Embryonen zu bilden und Pflanzen durch somatische Embryogenese zu
regenerieren.
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„Somatische
Embryogenese" ist
das In-vitro-Verfahren zur Initiierung und Entwicklung von Embryonen aus
somatischen Zellen und Geweben.
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„Somatischer
Embryo" ist ein
Embryo, der in vitro aus vegetativen (somatischen) Zellen durch
mitotische Zellteilung gebildet wird. Somatische Embryonen in einer
frühen
Phase sind unreifen zygotischen Embryonen morphologisch ähnlich;
ein Bereich embryonaler Zellen liegt gestreckten Suspensorzellen
gegenüber. Die
embryonalen Zellen entwickeln sich zu reifen somatischen Embryonen.
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„Zygotischer
Embryo" ist ein
Embryo, der sich aus der geschlechtlichen Verschmelzung gametischer Zellen
ableitet.
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„Megagametophyt" ist haploides Nährgewebe
mütterlichen
Ursprungs des Gymnospermensamens, in dem sich die zygotischen Gymnospermenembryonen
entwickeln.
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„Endosperm" ist haploides Nährgewebe
von Angiospermensamen, mütterlichen
Ursprungs, in dem sich die zygotischen Angiospermenembryonen entwickeln.
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„Klon" bezeichnet in Zusammenhang
mit der Pflanzenaufzucht eine Sammlung von Individuen derselben
genetischen Beschaffenheit, die aus einer Kultur erzeugt worden
sind, die aus einem einzelnen Explantat hervorgeht.
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„Linie" ist eine andere
Bezeichnung für „Klon".
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„Nährstoffe" sind die anorganischen
Mikro- und Makromineralien, Vitamine, Hormone, organischen Zusätze und
Kohlehydrate, die für
das Kulturwachstum und die Keimung somatischer Embryonen benötigt werden.
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„IBA" ist Indolbuttersäure – ein Pflanzenwachstumsregulator.
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"NAA" ist Naphthalinessigsäure – ein Pflanzenwachstumsregulator.
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„Imbibition" ist die Absorption
und/oder Adsorption von Wasser durch bestimmte Kolloide, die in
Samen oder Embryonen vorliegen, was zum Anschwellen der Gewebe und
der Aktivierung enzymatischer und physiologischer Prozesse führt.
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„Keimung" bedeutet das Austreten
eines Sprosses und/oder einer Wurzel aus einem Embryo.
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„Mikrotröpfchen" ist eine in sich
geschlossene Einheit aus Flüssigkeit
(z.B. Wasser oder eine auf Wasser basierende Lösung), die kleiner ist als
ein Tropfen der gleichen Flüssigkeit,
der sich aus einer Düse
oder von einer festen Oberfläche
durch Einwirkung von Schwerkraft bildet; sie befindet sich im Allgemeinen
in einer Ansammlung ähnlicher
Mikrotröpfchen
(z.B. einer Wolke, leichtem Nebel, dichtem Nebel, feinem Sprühnebel oder
dergleichen), welche durch Ausübung
von Druck (z.B. Luft, Gas oder Flüssigkeit, die unter einem von
einer Pumpe erzeugten Druck fließen) auf einen Tropfen oder
einen Körper
(z.B. einen Strom) der Flüssigkeit entsteht.
Die Größe eines
Mikrotröpfchens
macht gewöhnlich
weniger als die Hälfte
der Größe (Durchmesser), und
möglicherweise
weniger als ein Viertel oder ein Zehntel der Größe, eines Tropfens der gleichen
Flüssigkeit aus
und ist vorzugsweise klein genug, um zeitweise in der Luft zu schweben
(d.h. wie ein Aerosol) und in den Strömungen der Luft zu treiben,
anstatt direkt zu Boden zu fallen.
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„Autotroph" bezieht sich auf
die Stufe der Pflanzenentwicklung, in der die photosynthetischen
Organellen und die damit verbundenen Enzyme und biochemischen Reaktionswege
voll funktionsfähig
und in der Lage sind, Lichtenergie, atmosphärisches Kohlendioxid und Wasser
in die benötigten
Kohlehydrate (z.B. Glucose) zu verwandeln, die Voraussetzung für weiteres
Pflanzenwachstum und die weitere Pflanzenentwicklung sind.
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BEVORZUGTE
AUSFÜHRUNGSFORMEN
DER ERFINDUNG
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
besteht die vorliegende Erfindung im Allgemeinen aus einem mehrstufigen
Verfahren zur Ex-vitro-Aussaat und -Keimung von somatischen Pflanzenembryos
unter Verwendung herkömmlicher
Ausrüstung
und Einrichtungen des Gartenbaus, welches die folgenden sequentiellen
Stufen bzw. Schritte umfasst, ohne notwendigerweise auf diese beschränkt zu sein:
- 1. Aussäen
der somatischen Pflanzenembryos in Anzuchtbehälter, die ein dreiphasiges
Substrat enthalten, wobei die drei Phasen des Substrats Feststoffe,
Flüssigkeiten
und Luft umfassen.
- 2. Die Anzuchtbehälter,
in die die somatischen Pflanzenembryonen eingesät sind, werden in eine übliche Pflanzen aufzuchtumgebung
gesetzt, in der Licht, Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Feuchtigkeitsgehalt
des Wurzelungssubstrats kontrolliert und beeinflusst werden können, um
die Keimung der somatischen Embryonen und ihre weitere Entwicklung
zu vollständigen
Sämlingen
zu ermöglichen
und zu erleichtern.
- 3. Zuführung
eines Aerosols zur Oberfläche
der Anzuchtbehälter,
in welche die somatischen Embryos eingesät sind, wobei das Aerosol die
zur Initiierung und Aufrechterhaltung des Keimungsprozesses der
somatischen Embryos erforderlichen Kohlehydrate enthält.
- 4. Die mikro- und makromineralischen Elemente sowie andere Nährelemente,
die erforderlich sind, um die Keimung der somatischen Embryos und
deren spätere
Entwicklung zu Sämlingen
zu unterstützen,
werden in Form eines Aerosols und/oder einer flüssigen Suspension und/oder
einer flüssigen
Lösung
verabreicht.
- 5. Während
des Zeitraums der Keimung der somatischen Embryos werden die Umgebungslichtstärke und diurnale
Photoperiode, Temperatur und Luftfeuchtigkeit entsprechend den Erfordernissen
angepasst, um die Entwicklung der gekeimten Embryos zu vollständigen Sämlingen
aufrecht zu erhalten.
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Ein
besonderer Vorteil dieses neuen Verfahrens, zumindest in seinen
bevorzugten Formen, besteht darin, dass keine besonderen hygienischen
und/oder aseptischen und/oder sterilen Handhabungsverfahren und/oder
Ausrüstungen
und/oder Einrichtungen erforderlich sind, um somatische Pflanzenembryos
erfolgreich zu handhaben, auszusäen
und zum Keimen zu bringen.
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Vorzugsweise
wird die vorliegende Erfindung auf somatische Pflanzenembryos angewendet,
die auf Feuchtigkeitsgehalte nahe denjenigen ihrer entsprechenden
zygotischen Samen getrocknet wurden, d.h. Feuchtigkeitsgehalte im
Bereich von 5–20%
und insbesondere im Bereich von 10–15%. Es ist jedoch möglich, die
vorliegende Erfindung auf somatische Embryos anzuwenden, die höhere Feuchtigkeitsgehalte
im Bereich von 20–78%
aufweisen, wobei die Begrenzung nach oben lediglich in dem höchsten Feuchtigkeitsniveau
besteht, bei dem die somatischen Embryos vereinzelt, gehandhabt
und mit herkömmlicher
Säausrüstung gehandhabt
werden können.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung unter Verwendung aller herkömmlichen
Sägeräte ausgeübt werden kann,
die für
die Aussaat von zygotischem Saatgut verwendet werden, wird vorzugsweise
eine Ausrüstung
verwendet, die Samen in Anzuchtcontainer mit mehreren Kammern verteilt,
die üblicher
Weise als Multitopfplatten für
Miniballen (miniplug trays), Anzuchtplatten (flats) oder Zellgebinde
(cell-packs) bezeichnet werden, wobei diese Behälter üblicher Weise verwendet werden,
um Pflanzballen (plant plugs) herzustellen, die mechanisch in größere Behälter oder
in Freilandaufzuchtumgebungen verpflanzt werden können.
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Ein
wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung, mindestens in ihren
bevorzugten Ausführungsformen, besteht
darin, dass sie mit einer großen
Auswahl an nicht sterilisierten Anbausubstraten durchgeführt werden kann,
die üblicher
Weise in der herkömmlichen
Pflanzenanzucht verwendet werden. Das bevorzugte Anbausubstrat basiert
auf Torf und wurde spezifisch für
die Keimung von zygotischen Samen formuliert; als Beispiele solcher
Mischungen dienen (a) 15,2 Kubikfuß Torf, 8 Kubikfuß Vermiculit,
680 g Dolomitkalk und 300 g Micromax® (eine
kommerzielle Düngerzusammensetzung,
die Mikroelemente umfasst wie Schwefel, Bor, Mangan, Magnesium,
Kobalt und Eisen, ohne auf diese beschränkt zu sein), und (b) 16,2
Kubikfuß Torf,
6,75 Kubikfuß Perlit,
4 Kubik fuß Vermiculit,
6 kg Dolomitkalk, 1,5 kg Gips, 375 g Kaliumphosphat, 250 g Micromax
und 35 g Benetzungsmittel. Alternativ können auch kommerziell formulierte
Mischungen wie PRO-MIX-G® oder PRO-MIX-PGX® (Premier
Peat Moss Ltd., Montreal, PQ, Kanada – ein kommerzielles Pflanzenwachstumsmedium
ohne Erde, das Torf, Perlit, Vermiculit und/oder Bimsstein enthält, ohne
auf diese beschränkt
zu sein), Sunshine Mix # 3 (Sun-Gro Horticulture Inc., Hubbard,
OR, USA) und Redi-Earth® (The Scotts Co., Marysville, OH,
USA – ein
kommerzielles Pflanzenwachstumsmedium ohne Erde, das Torf, Perlit,
Vermiculit und/oder Bimsstein enthält, ohne auf diese beschränkt zu sein)
mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Das Anbausubstrat
auf Torfbasis wird vorzugsweise bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt
im Bereich von 50–80%
befeuchtet und dann auf Mehrkammer-Topfplatten verteilt, die üblicher
Weise zur Herstellung von Pflanzballen verwendet werden. Obwohl
Beispiele solcher Topfplatten "Styrofoam
#252 miniplug trays" oder "Styrofoam #448 miniplug
trays", hergestellt
von Beaver Plastics Inc. (Edmonton, AB, Kanada), und "hard plastic #288
miniplug trays" oder "hard plastic #512
miniplug trays",
hergestellt von TLC Polyform Inc. (Plymouth, MN; USA, 55441) umfassen,
kann die vorliegende Erfindung mit anderen Arten von Mehrkammer-Topfplatten oder
alternativ mit einzelnen Töpfen
durchgeführt
werden. Es ist anzumerken, dass die Ausführung der vorliegenden Erfindung
nicht auf Mischungen auf Torfbasis eingeschränkt ist, sondern auch andere
Substrate umfasst wie Jiffy-7 Torfballen (peat plugs), kompostierte
oder geschredderte Kokosschalenfasern, die üblicher Weise als „Kokosbast" oder "Coir" bezeichnet werden
(1993 Crystal Co., St. Louis, MO, USA), polymerisierte Substrate (Grow
Tech Inc., San Juan Bautista, CA, USA; Preforma Inc.; Oberlin, OH,
USA), extrudierte Schäume
wie Oasis® (Smithers-Oasis Ltd., Kent,
OH, USA – ein
kommerzieller geschäumter
Schaum, der Harnstoffformaldehyd enthält), Steinwolle (Rockwool International
A/S, Hovedgaden 584, DK-2640, Dänemark)
und dergleichen. Ungeachtet des gewählten Wurzelungssubstrats,
sollten dessen physikalische Eigenschaften die Entwicklung und Aufrechterhaltung
einer hohen relativen Feuchte in der Gasphase innerhalb des Substrats
ermöglichen, d.h. über 75%
relative Feuchte, und gleichzeitig die Sättigung des Substrats mit der
flüssigen
Phase minimieren.
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Nach
Aussaat der vorgekeimten somatischen Embryonen auf die Oberflächen der
Wurzelungssubstrate können
die Embryonen falls gewünscht
mit einer dünnen
Schicht zusätzlichen
Wurzelungssubstrats bedeckt werden, das aus dem gleichen Material
bestehen kann wie das unterhalb der Embryonen, oder alternativ mit
einem anderen Materialtyp. Ein nicht einschränkendes Beispiel besteht darin,
die vorgekeimten Embryonen auf ein PRO-MIX-PGX-Medium auszusäen und dann
die Embryonen mit einer dünnen
Schicht Coir, d.h. Kokosschalenfasern zu bedecken.
-
Vorzugsweise
werden Anzuchtcontainer, in die die vorgekeimten somatischen Embryonen
eingesät sind,
in eine übliche
Pflanzenaufzuchtumgebung gesetzt, in der sich die Bedingungen, ohne
darauf eingeschränkt
zu sein, im Bereich von Temperaturen von 15–35°C, einer relativen Feuchte von
75–100%,
einer Lichtstärke
von 10–500
Footcandle und einem diurnalen Zyklus von 6 h Tag/18 h Nacht – 22 h Tag/2h
Nacht bewegen.
-
Vorzugsweise
wird für
die ersten 2–10
Tage nach der Aussaat ein sehr hoher Grad an Luftfeuchte, d.h. über 90%
relativer Luftfeuchte, um die Anzuchtcontainer herum beibehalten,
in die die vorgekeimten somatischen Embryonen eingesät sind,
um die Quellung und Keimung der somatischen Embryonen zu fördern. Es kann
eine Reihe von Verfahren verwendet werden, um die Luftfeuchte auf
diesem Niveau zu halten, diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf,
das Einbrin gen der Container in eine Gewächshausumgebung mit einer Bedunstungs-
oder Nebelungseinrichtung, die in geregelten Intervallen eingesetzt
wird, das Einstellen der Behälter
in ein Bedunstungs- oder Nebelungszelt oder -kammer, das Anordnen
von transparenten Kunststoffhauben über den Anzuchtcontainern,
und nachfolgend das periodische Entfernen der Hauben, um die eingesäten Embryonen
zu bedunsten oder einzunebeln, und danach das sofortige Wiederaufsetzen
der Hauben. Ein weiteres nicht einschränkendes Verfahren besteht darin,
einen Freiraum von 2 mm bis 10 mm über der Oberfläche des
Wurzelungssubstrats, auf das die Embryonen ausgesät sind,
und dem oberen Ende des Behälters
bereitzustellen und dann den oberen Teil des Anzuchtcontainers mit
einer Kunststofffolie zu bedecken, die entfernt wird, um ein Bedunsten
oder Einnebeln der ausgesäten
Embryonen zu ermöglichen,
und anschließend
sofort wieder auf dem Behälter
angeordnet wird. Nachdem die Keimung der somatischen Embryonen anhand
der Entwicklung von Spross- und Wurzelstrukturen festgestellt wurde,
können
die auskeimenden Samen von den Umgebungen mit hoher relativer Luftfeuchte
entwöhnt
werden, indem man allmählich
die Menge der angewandten Bedunstung/Einnebelung verringert und/oder
die Zeiträume
zwischen den Bedunstungs- oder Einnebelungsschritten verlängert.
-
Vorzugsweise
werden die ausgesäten
Embryonen für
3–7 Tage
(ohne Beschränkung
auf diesen Zeitraum) nach der Aussaat in einer Umgebung mit hoher
relativer Luftfeuchte, d.h. über
90%, belassen, um die Quellung der Embryonen vor der Zufuhr exogener,
für die
Embryonalkeimung erforderlicher Nährstoffe zu fördern.
-
Ein
weiteres Hauptmerkmal der Erfindung, mindestens in ihren bevorzugten
Ausführungsformen,
ist, dass die exogenen Nährstoffe,
einschließlich – jedoch
ohne Beschränkung
auf – Kohlehydrate,
Mineralien, Vitamine und Hormone, die für die erfolgreiche Keimung
und späteres
Wachstum und Entwicklung der somatischen Embryonen erforderlich
sind, als Aerosole angewandt werden können. Die Nährstofflösungen können mittels üblicher
Bedunstungs- und/oder Einnebelungsvorrichtungen zugeführt werden,
ohne dass eine Beschränkung
auf diese besteht. Obwohl die Nährstoffe
einzeln oder in einer Lösung
kombiniert zugeführt
werden können,
werden die Kohlehydrate vorzugsweise als eine Lösung und die übrigen Nährstoffe
in einer getrennten Lösung
zugeführt.
Ein nicht einschränkendes
Beispiel zur Durchführung
besteht in der Zufuhr einer Lösung,
die eine Zuckerquelle wie Sucrose (ohne auf diese beschränkt zu sein)
in einer Konzentration enthält, welche,
ohne Beschränkung
hierauf, in einem Bereich von 1,5–9%, vorzugsweise in einem
Bereich von 3–6% ausgewählt ist,
und zwar als Dunst auf die Oberfläche des Wachstumssubstrats,
das einen ausgesäten
Embryo enthält,
und der späteren
Zufuhr einer Lösung
als Dunst, welche eine Mischung mineralischer Nährstoffe enthält, die
so formuliert ist, dass sie 454 mg/l Stickstoff, 81 mg/l Phosphor,
704 mg/l Kalium, 50 mg/l Calcium, 39 mg/l Magnesium, 193 mg/l Schwefel,
3 mg/l Mangan, 0,5 mg/l Zink, 89 mg/l Chlor, 3 mg/l Eisen, 0,7 mg/l Jod,
0,6 mg/l Bor, 0,01 mg/l Molybdän,
0,01 mg/l Kobalt und 0,01 mg/l Kupfer zur Verfügung stellt (jedoch ohne Beschränkung auf
diese Substanzen). Alternativ können
die Makronährstoffe
auch als handelsübliche
Formulierung zugeführt
werden, wie PlantProd® Plant Starter Fertilizer
10-52-10 (Stickstoff-Phosphat-Kalium)
oder PlantProd® Forestry
Seedling Starter 11-41-8 (Stickstoff-Phosphat-Kalium) (Plant Products
Ltd., Brampton, ON, Kanada), ohne dass jedoch eine Beschränkung auf
diese Produkte besteht. Die PlantProd®-Produkte
sind handelsübliche
wasserlösliche
Düngemittel,
die mineralische Nährstoffe
wie Stickstoff, Phosphor und Kalium sowie einen Farbstoff enthalten.
-
Ein
alternatives nicht einschränkendes
Mittel zur Zufuhr exogener Nährstoffe
zu somatischen Embryonen, die auf drei phasige Wachstumsmedien in
Anzuchtcontainern ausgesät
sind, besteht in der Berieselung oder „Tränkung" der Medien mit Nährstofflösungen, die wie zuvor beschrieben
formuliert sind. Dies geschieht vorzugsweise unmittelbar bevor die
Embryonen auf das dreiphasige Wachstumsmedium ausgesät werden.
-
Da
Mikroorganismen, wie Pilze, Bakterien, Hefen und Algen, in herkömmlichen
Pflanzenaufzuchtsubstraten, Ausrüstungen,
Behältern
und Aufzuchtumgebungen allgegenwärtig
sind, steht eine große
Auswahl an chemischen und biologischen Pestizidprodukten zur Verfügung, um
Pflanzenpathogene zu bekämpfen
und zu vernichten. Es wurde jedoch überraschender Weise herausgefunden,
dass aseptische Handhabungsverfahren und sterilisierte Wachstumssubstrate,
Anzuchtcontainer und Umgebungen für die erfolgreiche Keimung
und Aufzucht somatischer Pflanzenembryonen nicht erforderlich sind.
Die Erfindung kann in der Tat in üblichen Pflanzenaufzuchtumgebungen
ausgeführt
werden, wobei nur die normalen gewerblichen Hygieneverfahren verwendet
werden. Es wurde außerdem überraschender
Weise gefunden, dass Pestizide wie Benlate® (eine handelsübliche Fungizidzusammensetzung,
die einen chemischen Wirkstoff enthält), Rovral® (eine
handelsübliche
Fungizidzusammensetzung, die einen chemischen Wirkstoff enthält), Trumpet® (eine
handelsübliche
Insektizidzusammensetzung, die einen chemischen Wirkstoff enthält) und ähnliche,
die für
die Schädlingsbekämpfung bei
Pflanzenkulturen registriert sind, mit somatischen Embryonen verwendet
werden können,
die mittels des neuen mehrstufigen Verfahrens der vorliegenden Erfindung
ausgesät
wurden, ohne dass dies eine abschwächende Wirkung auf die Keimung
hat.
-
Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung
weiter zu veranschaulichen und sind nicht so auszulegen als würden sie
die Erfindung in irgendeiner Weise einschränken.
-
BEISPIEL 1
-
Somatische
Embryos (SE) von Interior Spruce (Picea glauca engelmannii complex),
Linie 23-2672, wurden gemäß den Verfahren
von Roberts et al. (1990a; 1990b) und Webster et al. (1990) hergestellt.
Nach der Ernte wurden die SE (somatische Embryos) zwei Trocknungsbehandlungen
unterzogen; bei der ersten Behandlung handelte es sich um HRHT ("high relative humidiy
treatment" – Behandlung
mit hoher relativer Feuchte), während
es sich bei der zweiten um eine HRHT gefolgt von einer weiteren
Trocknung über
3 Tage bei einer relativen Feuchte (RH) von 85% handelte (die relative
Feuchte wurde in einer geschlossenen Kammer, die eine gesättigte KCl-Lösung enthielt,
bereitgestellt). Der Feuchtigkeitsgehalt der für Behandlung 1 (nur HRHT) erzeugten
SE betrug 69,7%, während
die für
Behandlung 2 (HRHT gefolgt von RH 85%) erzeugten SE einen Feuchtigkeitsgehalt
von 14,8% aufwiesen.
-
SE
aus den zwei Trocknungsbehandlungen wurden von Hand in Phytatrays
ausgesät,
welche Agar enthielten, der aus 0,55 Difco Noble Agar, ½ GMD-Nährstoffen
(Webster et al., 1990) und 2% Sucrose bestand. Drei Phytatrays,
jedes für
30 SE, wurden mit jedem der SE-Sätze
(d.h. Trocknungsbehandlungen 1 & 2)
besät und
sodann drei Wochen lang bei 23 °C
mit einem diurnalen Zyklus von 20 h Licht und 4 h Dunkelheit inkubiert.
-
Eine
individuell formulierte Sämlingswachstumsmischung
aus 16,2 Kubikfuß Torf,
6,75 Kubikfuß Perlit, 4
Kubikfuß Vermiculit,
6 Kilogramm Dolomitkalk, 1,5 kg Gips, 375 g Kaliumphosphat, 250
g Micromax und 35 g Benetzungsmittel (WestCreek Farms, Fort Langley,
B.C) wurde mit Benlate- Suspension
(0,5 g/l) vorbenetzt und wurde dann auf Beaver Plastics Styrofoam-Multitopfplatten
mit 252 Zellen (Töpfen)
(10 ml/Hohlraum) verteilt. Nach dem Befüllen der Miniballenzellen mit
der Wachstumsmischung wurden sie gedibbelt, um einen oberen Freiraum
von ¼''–½'' zwischen der Oberseite der Wachstumsmischung
und der Oberseite der Miniballenpalette zu erzielen.
-
SE
aus den zwei Trocknungsbehandlungen wurden in die Multitopfplatten
(60 SE/Behandlung/Platte) eingesät.
Die SE wurden sofort mit 2% Sucrose bedunstet und die Multitopfplatten
dann sofort fest mit Kunststofffolie (Saran Wrap) abgedeckt. Die
Platten wurden in einer handelsüblichen
Gewächshausumgebung
bei 20–25°C und einem
diurnalen Zyklus von 20 h Licht/4 Stunden Dunkelheit gehalten. Die
SE wurden jeden Morgen mit 2% Sucrose und jeden Nachmittag mit "Plant-Starter"-Düngemittelformulierung
mit 100 ppm N (PlantProd 10-52-0) bedunstet. Die Multitopfplatten
wurden mit Benlate-Suspension (0,5 g/l) gemäß den Erfordernissen bedunstet,
um Pilzwachstum zu verhindern. Nach jedem Bedunsten wurden die Multitopfplatten
fest mit Saran Wrap abgedeckt. Zwei Wochen nach der Aussaat wurde
das Bedunstungsregime durch Hinzufügen einer handelsüblichen
Wurzelungshormonformulierung (Dip'nGrow®, Astoria-Pacific
Inc., Portland OR, USA) – verdünnt, so
dass 20 ng IBA und 10 ng NAA abgegeben wurden – modifiziert. Die drei Wochen
nach der Aussaat gesammelten Daten sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
-
Tabelle
1: Vergleich der In-vitro- und Ex-vitro-Keimung von somatischen
Interior-Spruce-Embryos
-
Diese
Daten zeigen, dass aus Interior Spruce, Linie 23-2672, erzeugte SE ex vitro in einer
nicht-sterilen, auf Torf basierenden Wachstumsmischung, ergänzt durch
Applikationen exogener Nährstoffe
mittels Aerosolen, keimten, wenn sie in einer herkömmlichen,
handelsüblichen
Gewächshauseinrichtung
angezogen wurden.
-
BEISPIEL 2:
-
Somatische
Embryos (SE) von Interior Spruce (Picea glauca engelmannii complex),
Linie 107-1979, wurden gemäß den Verfahren
von Roberts et al. (1990a; 1990b) und Webster et al. (1990) hergestellt.
Nach der Ernte wurden die SE zwei Trocknungsbehandlungen unterzogen;
bei der ersten Behandlung handelte es sich um HRHT ("high relative humidiy
treatment" – Behandlung
mit hoher relativer Feuchte), während
es sich bei der zweiten um eine HRHT gefolgt von einer weiteren
Trocknung über
3 Tage in einer Kammer, in welcher eine relative Luftfeuchte von
85% aufrecht erhalten wurde, handelte. Der Feuchtigkeitsgehalt der
für Behandlung
1 (nur HRHT) erzeugten SE betrug 64,8%, während die für Behandlung 2 (HRHT gefolgt
von RH 85%) erzeugten SE einen Feuchtigkeitsgehalt von 42,6% aufwiesen.
-
Beaver
Plastics Styrofoam #252-Multitopfplatten wurden bis zu einem Abstand
von ¼''–½'' von der Oberseite der Platten mit einem
der folgenden erdlosen Wachstumssubstrate befüllt:
- (1)
ein individuell formuliertes Torfsubstrat, bestehend aus 16,2 Kubikfuß Torf,
6,75 Kubikfuß Perlit,
4 Kubikfuß Vermiculit,
6 Kilogramm Dolomitkalk, 1,5 kg Gips, 375 g Kaliumphosphat, 250
g Micromax und 35 g Benetzungsmittel (WestCreek Farms, Fort Langley,
BC, Kanada), vorbenetzt mit Benlate-Suspension (0,5 g/l)
- (2) Oasis-Schaum (Smithers-Oasis Ltd., Kent, OH) und
- (3) Rock Wool (Rockwool International A/S).
-
Vor
der Aussaat der SE wurden alle Substrate mit einer 2% Sucrose, 0,5
g/l Benlate und GMD halber Stärke
(gem. Webster et al., 1990) enthaltenden Lösung vorbenetzt. Nach der Aussaat
wurden die Multitopfplatten dicht mit Kunststofffolie (Saran Wrap)
abgedeckt und 3-5-mal täglich
mit einer Lösung
aus 4,5% Sucrose und PlantProd Forestry Seedling Starter-Düngemittel
11-41-8 mit 50 ppm N bedunstet. Die Multitopfplatten wurden außerdem alle
2–3 Tage
mit einer Rotation von Benlate, Thiram und Rovral bedunstet.
-
Die
zwei Wochen nach der Aussaat gesammelten Daten sind in Tabelle 2
zusammengefasst.
-
Tabelle
2: Erfolg der Ex-vitro-Keimung von HRHT-behandelten Interior-Spruce-SE, Linie
107-1917 auf unterschiedlichen
festen Substraten in herkömmlichen
Wachstumssystemen.
-
Diese
Daten zeigen, dass aus der Interior-Spruce-Linie 107-1917 erzeugte SE
ex vitro in unterschiedlichen Arten von nicht-sterilen Wachstumssubstraten,
umfassend eine Formu lierung auf Torfbasis, einen extrudierten Schaum
(d.h. Oasis) und Steinwolle, keimten, wenn diese durch Applikationen
exogener Nährstoffe mittels
Aerosolen ergänzt
und in einer herkömmlichen,
handelsüblichen
Gewächshauseinrichtung
angezogen wurden.
-
BEISPIEL 3:
-
Somatische
Embryos (SE) von Interior Spruce (Picea glauca engelmannii complex);
Linien 1-1281 und 107-1917 wurden gemäß den Verfahren von Roberts
et al. (1990a; 1990b) und Webster et al. (1990) hergestellt. Nach
der Ernte wurden die SE unter Anwendung des HRHT-Verfahrens getrocknet.
-
Beaver
Plastics Styrofoam #252-Multitopfplatten wurden vollständig mit
den folgenden drei erdlosen Wachstumssubstraten befüllt:
- (1) ein individuell formuliertes Torfsubstrat,
bestehend aus 16,2 Kubikfuß Torf,
6,75 Kubikfuß Perlit,
4 Kubikfuß Vermiculit,
6 Kilogramm Dolomitkalk, 1,5 kg Gips, 375 g Kaliumphosphat, 250
g Micromax und 35 g Benetzungsmittel, vorbenetzt mit einer Benlate-Suspension
(0,5 g/l),
- (2) Oasis-Schaum und
- (3) Rock Wool.
-
Vor
der Aussaat der SE wurden alle Substrate mit einer 2% Sucrose, 0,5
g/l Benlate und GMD halber Stärke
(gem. Webster et al., 1990) enthaltenden Lösung vorbenetzt. Nach der Aussaat
wurden die Multitopfplatten in einem Bedunstungs-/Nebelungszelt untergebracht, das auf
einer Gewächshausbank
in einem handelsüblichen
Gewächshaus
errichtet wurde. Die Multitopfplatten wurden 2 Wochen lang mittels
Bedunstungsdüsen
mit einer 1-mm-Öffnung
(Dramm Co., Manitowoc, WS, USA) in 2-Stunden-Intervallen 15 Sekunden
lang eingenebelt. Die Multitopfplatten wurden viermal täglich mittels
des Be dunstungssystems mit einer Lösung aus 4,5% Sucrose und PlantProd
Forestry Seedling Starter-Dünger
11-41-8 mit 50 ppm N benebelt. Die Multitopfplatten wurden außerdem alle
2–3 Tage
mit einer Rotation von Benlate, Thiram und Rovral bedunstet. Die
zwei Wochen nach der Aussaat gesammelten Daten sind in Tabelle 3
zusammengefasst.
-
Tabelle
3: Erfolg der Ex-vitro-Keimung der getrockneten Interior-Spruce-SE-Linien
1-1281 und 107-1917
auf unterschiedlichen nicht-sterilen, festen Substraten
-
Diese
Daten zeigen, dass aus Interior-Spruce-Linien 1-1281 und 107-1917
erzeugte SE ex vitro in unterschiedlichen Arten von nicht-sterilen
Wachstumssubstraten, umfassend eine Formulierung auf Torfbasis,
einen extrudierten Schaum (d.h. Oasis) und Steinwolle, keimten,
wenn sie in einem herkömmlichen
Bedunstungs-/Nebelungszelt untergebracht und durch Applikationen
exogener Nährstoffe
mittels Nebelung ergänzt und
in einer herkömmlichen,
handelsüblichen
Gewächshauseinrichtung
vermehrt wurden.
-
BEISPIEL 4:
-
Somatische
Embryos (SE) von Interior Spruce (Picea glauca engelmannii complex),
Linien 1-1281, 4-2809, 5-1702, 10- 1995, 23-2672, 119-2560, wurden gemäß den Verfahren
von Roberts et al. (1990a; 1990b) und Webster et al. (1990) hergestellt.
Nach der Ernte wurden die SE unter Anwendung des HRHT-Verfahrens getrocknet.
-
Eine
individuell formulierte Sämlingswachstumsmischung,
umfassend 16,2 Kubikfuß Torf,
6,75 Kubikfuß Perlit,
4 Kubikfuß Vermiculit,
6 Kilogramm Dolomitkalk, 1,5 kg Gips, 375 g Kaliumphosphat, 250
g Micromax und 35 g Benetzungsmittel (WestCreek Farms, Fort Langley,
B.C), wurde mit einer Suspension aus 3% Sucrose, Plant Products
Forestry Seedling Starter Fertilizer 11-41-8, mit einer Konzentration
von 50 ppm N, vorbenetzt und dann auf Styrofoam-Multitopfplatten
mit 252 Zellen (Töpfen)
(Beaver Plastics Ltd.) verteilt.
-
Die
SE wurden in die Multitopfplatten eingesät (1 Reihe pro Platte), die
Platten wurden dann mit einer dünnen
Schicht Coir (feine Fasern aus kompostierten Kokosnussschalen) bedeckt
und mit Wasser bedunstet. Die Multitopfplatten wurden dann in einem
Bedunstungs-/Nebelungszelt untergebracht, das auf einer Gewächshausbank
in einem handelsüblichen
Gewächshaus
errichtet wurde. Die Multitopfplatten wurden mittels Bedunstungsdüsen mit
einer 1-mm-Öffnung
(Dramm Co., Manitowoc, WS, USA) für einen Zeitraum von 1 Woche
in 4-Stunden-Intervallen
30 Sekunden lang eingenebelt. Die Multitopfplatten wurden außerdem 3-mal
täglich
mit einer Lösung
aus 4,5% Sucrose und Forestry Seedling Starter-Düngemittel 11-41-8 mit 50 ppm N
von Hand bedunstet. Den gesammelten Werten zufolge betrug die durchschnittliche
Tagestemperatur innerhalb des Bedunstungs-/Nebelungszeltes 25°C und die
durchschnittliche relative Luftfeuchte 92%.
-
Die
eine Woche nach der Aussaat gesammelten Werte sind in Tabelle 4
zusammengefasst.
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Tabelle
4: Vergleich der In-vitro-Keimung und Ex-vitro-Keimung unterschiedlicher Interior-Spruce-SE-Linien
-
Diese
Daten zeigen, dass aus sechs Interior-Spruce-Linien erzeugte SE,
welche auf ein Wachstumssubstrat auf Basis von Torf ausgesät und mit
einer dünnen
Schicht Coir bedeckt wurden, ex vitro keimten, wenn diese in einem
herkömmlichen
Bedunstungs-/Nebelungszelt untergebracht wurden und mit exogenen
Nährstoffapplikationen
durch Nebelung ergänzt
und in einer herkömmlichen,
handelsüblichen
Gewächshauseinrichtung
angezogen wurden.
-
BEISPIEL 5:
-
Somatische
Embryos (SE) von Interior Spruce (Picea glauca engelmannii complex),
Linie 23-2672, wurden gemäß den Verfahren
von Roberts et al. (1990a; 1990b) und Webster et al. (1990) hergestellt.
Nach der Ernte wurden die SE unter Anwendung des HRHT-Verfahrens
3 Wochen lang getrocknet und dann 20 Stunden lang bei 23°C in einer
abgedichteten Kammer weiter getrocknet, wobei die abgedichtete Kammer
eine relative Feuchte von 88,5% aufwies, die durch eine in der Kammer
angeordnete, ungesättigte
NaCl-Lösung aufrechterhal ten
wurde. Der Wassergehalt der Embryos wurde unmittelbar nach der HRHT-Behandlung
bestimmt, sowie nach der weiteren Trocknung bei 88,5% RH. Die getrockneten
Embryos wurden 18 Stunden lang in einer Umgebung mit einer relativen
Feuchte von 100% imbibiert und danach in Multitopfplatten mit 400
Hohlräumen
eingesät,
die ein nicht-steriles, auf Torf basierendes, erdloses und mit einem
Polymer geliertes Wachstumssubstrat (Grow Tech Inc., San Juan Bautista,
CA, US) enthielten. Nach abgeschlossener Aussaat wurden die Multitopfplatten
für 1 Woche
in eine feuchte Keimungskammer unter den folgenden Umgebungsbedingungen
eingesetzt: 95–98
RH, 25°/20°C Tages-/Nachttemperatur;
eine diurnale Periode von 18 h Licht/6 h Dunkelheit; Lichtstärke von
30–40 μM m-2s-1 photosynthetische
Photonenflußdichte.
Die Blöcke
wurden dann in eine Bedunstungskammer mit ähnlichen Umgebungsbedingungen
mit Ausnahme einer auf 120–150
m-2s-1 erhöhten Lichtstärke, umgesetzt.
Nach zwei weiteren Wachstumswochen wurde der Keimungserfolg ermittelt; die
Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
-
Tabelle
5: Erfolg der Ex-vitro-Keimung der Interior-Spruce-Linie 23-2672 auf einer nicht-sterilen, mit einem
Polymer gelierten Wachstumsmischung
-
Diese
Werte zeigen, dass somatische Spruce-Embryos, die auf einen Wassergehalt
nahe demjenigen zygotischer Spruce-Samen getrocknet wurden, auskeimten,
wenn sie direkt auf die Oberfläche
eines nicht-sterilen, auf Torf basierenden, mit einem Polymer gelierten
Wachstumssubstrats ausgesät
wurden.
-
BEISPIEL 6:
-
Reife
somatische Embryos von (1) Pinus patula Scheide et Deppe, und (2)
der westlichen weißkiefer(Pinus
monticola Dougl. ex D.Don) wurden direkt in nicht-sterile, erdlose
Sämlingsmischungen
gesät,
die aus 50% gesiebtem Torf und 50% feinem Perlit (Mischung B2),
in TLC-Polyform-288/ml-Multitopfplatten
(10 ml/Topf), bestanden. Nach der Aussaat wurden die Platten in
eine feuchte Wachstumskammer mit Umgebungsbedingungen von 95–98% RH,
Tages-/Nacht-Lufttemperaturen von 25/20°C und einer 18stündigen Photoperiode
von 90–120 μmol m-2s-1 photosynthetische
Photonenflußdichte.
Während
der ersten drei Tage nach der Aussaat wurde eine 3% Sucrose enthaltende
modifizierte GMD-Nährstofflösung zweimal
täglich
auf die Platten aufgesprüht.
Danach wurde die Applikation der Nährstofflösung auf einmal täglich reduziert.
Nach 3 Wochen wurden die Versuche beendet und der Keimungserfolg
tabellarisch zusammengefasst. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 wiedergegeben.
-
Tabelle
6: Ex-vitro-Keimungserfolg bei Pinus patula- und Pinus moticula-SE
-
Diese
Werte zeigen, dass somatische Embryos der Patula-Kiefer (Pinus patula) und der westlichen Weißkiefer
(Pinus moticola) direkt ex vitro in nicht-sterilen, erdlosen Wachstumssubstraten
zum Keimen gebracht werden können.
-
BEISPIEL 7:
-
Reife
somatische Embryos von (1) Pinus patula Scheide et Deppe, und (2)
der westlichen Weißkiefer(Pinus
monticola Dougl. ex D.Don) wurden direkt in Multitopfplatten mit
400 Töpfen
ausgesät,
welche ein nicht-steriles, auf Torf basierendes, erdloses, mit einem
Polymer geliertes Wachstumssubstrat (Grow Tech Inc., San Juan Bautista,
CA, USA) enthielt. Nach der Aussaat wurden die Platten in eine feuchte
Wachstumskammer eingestellt, die folgende Umgebungstemperaturen
aufwies: 95–98%
RH, Tages-/Nachttemperatur 25/20°C,
Lichtstärke
90–120 μmol m-2s-1 photosynthetische
Photonenflußdichte
und eine 18stündige
Photoperiode. Während
der ersten drei Tage nach der Aussaat wurde eine 3% Sucrose enthaltende
modifizierte GMD-Nährstofflösung zweimal
täglich
auf die Platten aufgesprüht.
Danach wurde die Applikation der Nährstofflösung auf einmal täglich reduziert.
Nach 3 Wochen wurden die Versuche beendet und der Keimungserfolg tabellarisch
zusammengefasst. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 wiedergegeben.
-
Tabelle
7: Ex-vitro-Keimungserfolg bei Pinus patula- und Pinus moticula-SE
auf einer nicht-sterilen, mit einem Polymer gelierten Wachstumsmischung
-
Wie
diese Werte zeigen, können
somatische Embryos der Patula-Kiefer (Pinus patula) und der westlichen
Weißkiefer
(Pi nus moticula) ex vitro in einem nicht-sterilen, auf Torf basierenden
Wachstumssubstrat, das mit einem Polymer geliert wurde, zum Keimen
gebracht werden.
-
BEISPIEL 8:
-
Reife
somatische Embryos von Pinus patula Scheide et Deppe und Pinus radiata
wurden 20 Stunden lang bei 23°C
in einer abgedichteten Kammer mit einer RH von 88,5%, aufrechterhalten
durch eine in der Kammer platzierte ungesättigte NaCl-Lösung, weiter
getrocknet. Embryos der westlichen Weißkiefer (Pinus monticola Dougl.
ex D.Don) wurden 72 h lang in der gleichen Umgebung, d.h. mit einer
RH von 88,5%, getrocknet. Die Wassergehalte der Embryos wurden unmittelbar
nach den HRHT-Behandlungen sowie nach den weiteren Trocknungen bei
88,5% RH ermittelt. Die getrockneten Embryos wurden 18 h lang in
einer Umgebung mit einer RH von 100% getrocknet und dann in Multitopfplatten
mit 400 Töpfen,
die ein nicht-steriles, auf Torf basierendes, erdloses und mit einem
Polymer geliertes Wachstumssubstrat (Grow Tech Inc., San Juan Bautista,
CA USA) enthielten, ausgesät.
Nach Abschluss der Aussaat wurden die Multitopfplatten für 1 Woche
in eine feuchte Keimungskammer eingestellt, welche die folgenden
Umgebungsbedingungen aufwies: 95–98% RH; 25°/20°C Tages-/Nachttemperatur; eine
diurnale Periode von 18 h Licht/6 h Dunkelheit; Lichtintensität 30–40 μmol m-2s-1 photosynthetische
Photonenflussdichte. Die Blöcke
wurden dann in eine Bedunstungskammer mit ähnlichen Umgebungsbedingungen,
mit Ausnahme einer auf 120–150 μmol m-2s-1 erhöhten Lichtstärke, umgesetzt.
Nach zwei weiteren Wachstumswochen wurde der Keimungserfolg ermittelt;
die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengefasst.
-
TABELLE
8: Ex-vitro-Keimungserfolg bei SE von Pinus radiata, Pinus patula
und Pinus moticula auf einer nicht-sterilen, mit einem Polymer gelierten
Wachstumsmischung
-
Wie
diese Werte zeigen, können
getrocknete somatische Embryos verschiedener Kiefernarten auskeimen,
wenn die Embryos direkt auf die Oberfläche eines nicht-sterilen, auf
Torf basierenden und mit einem Polymer gelierten Wachstumssubstrat
ausgesät
werden.
-
BEISPIEL 9:
-
Reife
somatische Embryos von Pinus patula Scheide et Deppe und Pinus radiata
wurden 24 Stunden lang bei 23°C
in einer abgedichteten Kammer mit einer RH von 92,4%, aufrechterhalten
durch eine in der Kammer platzierte ungesättigte NaCl-Lösung, getrocknet.
Die Embryos wurden dann in eine abgedichtete Kammer, in der eine
RH von 88,5% aufrechterhalten wurde, transferiert und weiter bei
5°C für 42 Stunden
getrocknet. Die Wassergehalte der Embryos wurden unmittelbar nach
den HRHT-Behandlungen sowie nach den weiteren Trocknungen bei 88,5%
RH ermittelt. Die getrockneten Embryos wurden 18 h lang in einer
Umgebung mit einer RH von 100% getrocknet und dann in Multitopfplatten
mit 400 Töpfen,
die ein nicht-steriles, auf Torf basierendes, erdloses und mit einem
Polymer geliertes Wachstumssubstrat (Grow Tech Inc., San Juan Bautista,
CA USA) enthielten, ausgesät.
Nach Abschluss der Aussaat wurden die Multitopfplatten für 1 Woche
in eine feuchte Keimungskammer eingestellt, welche die folgenden
Umgebungsbedingungen aufwies: 95–98% RH; 25°/20°C Tages-/Nachttemperatur; eine
diurnale Periode von 18 h Licht/6 h Dunkelheit; Lichtstärke 30–40 μmol m-2s-1 photosynthetische
Photonenflussdichte. Die Blöcke
wurden dann in eine Bedunstungskammer mit ähnlichen Umgebungsbedingungen,
mit Ausnahme einer auf 120–150 μmol m-2s-1 erhöhten Lichtstärke, umgesetzt.
Nach zwei weiteren Wachstumswochen wurde der Keimungserfolg ermittelt;
die Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengefasst.
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BEISPIEL
9: Auswirkung des Trocknungsprozesses auf die Ex-vitro-Keimung von
Pinus patula- und Pinus radiata-SE
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Wie
diese Daten zeigen, können
getrocknete somatische Embryos verschiedener Kiefernarten zum Keimen
gebracht werden, wenn die Embryos direkt auf die Oberfläche eines
nichtsterilen, auf Torf basierenden und mit einem Polymer gelierten
Wachstumssubstrats ausgesät
werden, und zwar unabhängig
davon, wie die Embryos während
der Trocknung behandelt wurden.
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BEISPIEL 10:
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HRHT-behandelte
somatische Embryos der Taedaföhre
(Pinus taeda L) wurden direkt in TLC-Polyform-Multitopfplatten mit
288 Töpfen,
die erdlose Mischungen aus gesiebtem Torf und feinem Perlit enthielten, ausgesät. Nach
Abschluss der Aussaat wurden die Platten in eine feuchte Wachstumskammer
mit Umgebungsbedingungen von 95–98%
RH, Tages-/Nacht-Lufttemperaturen von 26/20°C und einer 18stündigen Photoperiode
mit einer Lichtstärke
von 90–120 μmol m–2s–1 photosynthetische
Photonenflussdichte gestellt. Eine 3% Sucrose enthaltende modifizierte
GMD-Nährstofflösung wurde
einmal täglich
auf die Platten aufgesprüht. Der
Keimungserfolg wurde nach 2 Wochen bewertet. Die Ergebnisse sind
in Tabelle 10 zusammengefasst.
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Tabelle
10: Ex-vitro-Keimung von Pinus taeda-SE in nicht-sterilen Wachstumsmischungen
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Wie
diese Werte zeigen, können
somatische Embryos der Taedaföhre
(Pinus taeda) ex vitro in nicht-sterilen, auf Torf basierenden Wachstumssubstraten
zum Keimen gebracht werden.
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VERZEICHNIS
DER IN DER ANMELDUNG ERWÄHNTEN
LITERATUR
-
- 1. Carlson, W. C. and J. E. Hartle. (1995)
Manufactured Seeds of Woody Plants. IN Somatic Embryogenesis of
Woody Plants. Band I. S. M. Jain, P. K. Gupta und R. J. Newton (Eds.)
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande. pp. 253–263.
- 2. Gupta, P. and J. A. Grob. (1995) Somatic Embryogenesis in
Conifers. IN Somatic Embryogenesis of Woody Plants. Band I. S. M.
Jain, P. K. Gupta, und R. J. Newton (Eds.) Kluwer Academic Publishers,
Dordrecht, Niederlande. pp. 81–98.
- 3. Lichter, R. (1982) Induction of haploid plants from isolated
pollen of Brassica napus. Z. Pflanzenphysiol. 105: 427–434.
- 4. Roberts, D. R., B. S. Flinn, D. T. Webb, F. B. Webster, and
B. C. S. Sutton (1990a) Abscisic acid and indole-3-butyric acid
regulation of maturation and accumulation of storage proteins in
somatic embryos of interior spruce. Physiol. Plant 78: 355–360.
- 5. Roberts, D. R., B. C. S. Sutton, and B. S. Flinn (1990b)
Synchronous and high frequency germination of interior spruce somatic
embryos is achieved following partial drying at high relative humidity.
Can. J. Bot. 68: 1086–1090.
- 6. Sakamoto, Y., N. Onishi, and T. Hirosawa. (1995) Delivery
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Control in Plant Tissue Culture. J. Aitken-Christie, T. Kozai, and
M. L. A. Smith, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Niederlande.
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- 7. Webster, F. B., D. R. Roberts, S. M. Mclnnis, and B. C. S.
Sutton (1990) Propagation of interior spruce by somatic embryogenesis.
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