DE3520727C2 - - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/256—Polyterpene radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung
süßer Glykoside durch Kultivierung von Stevia-Schößlingsspitzen.
Stevia (Stevia rebaudiana BERTONI) gehört zu den
perennierenden Kräutern. Ihr Standort ist Paraguay in
Südamerika. Stevia enthält hauptsächlich in den Blättern
Diterpenglykoside hoher Süße, z. B. Steviosid und Rebaudiosid
A. Aufgrund dieser Eigenschaft
haben die betreffenden Glykoside zunehmende Beachtung
als natürliches Süßungsmittel anstelle von Saccharose
gefunden.
Stevia besitzt eine starke Eigenunverträglichkeit,
so daß ihre Vermehrung durch Versamung ihren Produktionsgrad
vermindert. Aufgrund individueller Unterschiede
schwankt darüber hinaus die Ausbeute an süßen Glykosiden
von 5 bis 20%. Folglich wäre es zweckmäßig, eine
homogene Stevia mit hohem Gehalt an den süßen Glykosiden
in großen Mengen bereitzustellen. Solche süße Glykoside
lassen sich jedoch nicht durch Züchtung von
Pflanzengeweben gewinnen.
Suzuki und Mitarbeiter (vgl. "Agric. Biol. Chem. 40", 819
(1976)) und Nabeta und Mitarbeiter (vgl. "Agric. Biol.
Chem. 40", 2103, (1976)) führten Untersuchungen hinsichtlich
der Züchtung von Pflanzengeweben durch und
berichten über die Gewinnung von Rutin bzw. Stigmasterin.
Die genannten Autoren vermochten jedoch die süße
Glykoside nicht zu gewinnen.
Bei Züchtungsversuchen zur Gewinnung einer Pflanze mit
stabilen Eigenschaften unter Verwendung von Stielen
und Schößlingsspitzen ließen sich erfolgreich vermehrte
Schößlinge gewinnen (vgl. "Shoyakugaku Zasshi" 38, 12
(1984)). Durch Topfkultivierung bzw. -züchtung der
vermehrten Schößlinge konnte man Stevia-Sämlinge mit in
etwa stabilem Gehalt an süßen Glykosiden erzeugen.
Da jedoch die vermehrten Schößlinge in den Teströhrchen
kräftig wachsen, müssen sie innerhalb eines Monats
in neue Kulturmedien verpflanzt werden. Demzufolge
erfordert die Kultivierung bzw. Züchtung zur Konservierung
relativ große Gefäße. Eine Langzeitlagerung, z. B. eine
Gefrierlagerung, ist unmöglich.
Bei der mit diesen Schwierigkeiten behafteten Pflanze
Stevia erfolgte die künstliche Erzeugung des Schößlings-
Primordiums im Hinblick auf die Gewinnung größer Mengen
an homogenen Pflanzenkörpern mit hohem Gehalt an süßen
Glykosiden. Das Schößlingsprimordium ist hinsichtlich
seiner genetischen Formen sehr stabil und besitzt einen
hohen Vermehrungsgrad. Das Schößlingsprimordium stellt
ferner eine Masse von Spaltungszellen dar, die in einen
Pflanzenkörper umgewandelt wird, d. h. es erfolgt
rasch eine Umwandlung in einen Sämling. Das Schößlings-
Primordium erhält man durch eine Art vegetativer Fortpflanzung
anstelle einer Saat. Dieses Verfahren stellt eine
neue Technik dar. Mit deren Hilfe kann man die Probleme
von bei der Samenfortpflanzung, die durch Samen nur
schwierig erreichbar ist, auftretenden Vererbungsphänomenen
lösen. Ferner kann man nach dieser Technik virusfreie
Sämlinge großziehen und diese über lange Zeit
hinweg erhalten.
Aus Bot. Bull. Acad. Sinica 24, 115-119 (1983) ist es
bereits bekannt, Zellkulturen von Stevia unter Verwendung
von Naphthalinessigsäure als Pflanzenwuchshormon bei
einer Temperatur von 26±2°C sowie unter Verwendung von
diffusem Licht durchzuführen, mit dem Ziel, Glykoside
in höheren Ausbeuten zu erhalten. Diese Kulturart legt
jedoch nicht nahe, eine Massenvermehrung durch den Einsatz
von Schößlingsprimordien in Rotationskulturen zu
erreichen. Mit den angegebenen Mitteln läßt sich eine
solche Massenvermehrung nicht erzielen.
Die Erfindung besteht nun in einem Verfahren zur Erzeugung
eines süßen Glykosids durch Züchtung von Stevia-
Schößlingsspitzen, wobei man von einem Stiel von Stevia
(Stevia rebaudiana BERTONI) den Schößlingsspitzenteil
abpflückt, den gewonnenen Schößlingsspitzenteil in ein
künstliches Nährmedium, enthaltend ein Gemisch anorganischer
Salze in Form des B5-Mediums nach
Gamborg oder des Mediums nach Murashige-Skoog und
6-Benzylaminopurin und/oder a-Naphthalinessigsäure als
Pflanzenwachstumshormon, verpflanzt und die Temperatur bei 15°C bis 30°C hält, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man bei
einer Umdrehungszahl von 0,5-10 min-1
sowie bei einer Bestrahlungsintensität von 2000-10 000
Lux eine Rotationskultur durchführt und das Schößlingsprimordium
zur Gewinnung des süßen Glykosids in an sich
bekannter Weise vermehrt.
Nachdem die Schößlingsspitzen von den Stevia-Stielen
beschnitten worden sind, werden sie sterilisiert und
mit serilisiertem Wasser gewaschen. Danach wird ein Teil
der Schößlingsspitzen mit einigen Blättern von Blattprimordien
abgenommen und in ein künstliches flüssiges
Nährmedium mit einer Mischung anorganischer Salze und
mindestens einem Pflanzenwachstumshormon verpflanzt.
Die Schößlingsspitzen werden dann bei einer Bestrahlungsintensität
von etwa 2000-10 000 Lux, bei einer
Temperatur von 15-30°C und bei einer Drehzahl von
0,5-10 Umdrehungen pro Minute einer Rotationskultur
unterworfen. Hierbei erhält man die Schößlingsprimordien.
Als Mischung anorganischer Salze in dem künstlichen
flüssigen Nährmedium verwendet man in unveränderter
oder schwach modifizierter Form eine Mischung, wie sie
in dem Medium nach Murashige-Skoog oder Gamborg B5 enthalten
ist. Als Pflanzenwachstumshormone eignen sich
als Auxin Naphthalinessigsäure sowie als Cytokinin
Benzylaminopurin. Die Kultur der Schößlingsprimordien
benötigt starkes Licht. Als starke Lichtquelle eignet
sich eine kontinuierliche, stabile Bestrahlungsintensität
von 2000-10 000 Lux. Liegt die Bestrahlunsintensität
außerhalb des angegebenen Bereichs, wachsen
die Schößlingsprimordien nicht gut. Die Kulturtemperatur
wird mittels eines Thermostaten bei 15°C
bis 30°C gehalten. Liegt die Temperatur unterhalb der
angegebenen Untergrenze, schreitet die Vermehrung
nur langsam voran. Ist die Temperatur zu hoch, wird
das Wachstum schlecht und instabil. Eine Rotationskultur
ist einer stationären Kultur vorzuziehen. Besonders
gute Ergebnisse erreicht man bei einer langsamen
Rotation mit 2,0 Umdrehungen pro Minute. Ist
die Umdrehungszahl zu hoch, werden schlechtere Ergebnisse
erhalten. In einer stationären Kultur ist das
Wachstum langsam. Darüber hinaus kann man keine Gewebe
der Schößlingsprimordien erhalten.
Die erhaltenen Schößlingsprimordien liegen zunächst in
Form fahlgrüner, kleiner Kügelchen vor. Nach und nach
gewinnen diese Kügelchen an Größe und Zahl und bilden
dunkelgrüne, kugelige Massen. In dieser Stufe werden
die Schößlingsprimordien mittels eines Stabes mit sterilisiertem
Nichromdraht in einige Stücke unterteilt. Wenn
dann die Stücke in die optimalen neuen Kulturmedien mit
der Salzmischung verpflanzt worden sind, erhält man in
ähnlicher Weise neue Schößlingsprimordien. Das erste
Schößlingsprimordium erhält man auf künstlichem Wege
aus einer Kuppe einer Schößlingsspitze. Die Schößlingsprimordien,
die man danach erhält, entstanden aus dem
ersten Schößlingsprimordium. Zunächst erfolgt eine Reproduktion
von Zellen der äußersten Schicht, die etwas
unter dem kuppelartigen Spitzenteil der Schößlingsprimordien
liegt, durch Spaltung an einer Achse einer
periklinalen Schicht alleine. Danach beginnen sich die
Zellen durch Spaltung an verschiedenen Achsen einer
antiklinalen Schicht, einer geneigten Schicht, einer
periklinalen Schicht und dergleichen zu reproduzieren.
Die durch diese Zellteilung entstandenen Zellen nehmen
an Zahl zu. Wenn die Zahl etwa 60 erreicht, erhält man
kleine Schößlingsprimordien. Die kleinen Schößlingsprimordien
ändern sich in große Schößlingsprimordien,
bei denen die äußersten Zellen aus einer Außenschicht
und einer Innenschicht bestehen. Sämtliche Schößlingsprimordien
an den proximalen Seiten haften an kleinen
Mengen Kallus.
Die Chromosomenzahl der künstlich erzeugten Schößlingsprimordien
wurde in hundert Zellen der primären und
sekundären Schößlingsprimordien untersucht. Hierbei
zeigte es sich, daß die Chromosomenzahl 2n=22 wie bei
der ursprünglichen Pflanze konstant ist. Karyotypänderungen
lassen sich nicht beobachten.
Die in der geschilderten Weise erhaltenen Schößlingsprimordien
lassen sich in großen Mengen vermehren und
zur Gewinnung von Sämlingen in ein stationäres Nährmedium
verpflanzen. Danach bildet das Schößlingsprimordium
ein Blattprimordium an der harten Spitze zum
Einwachsen in einen Pflanzenkörper. Schließlich läßt
sich der erzeugte Pflanzenkörper als Feldkultur pflanzen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
Zunächst werden von Stevia-Stielen Schößlingsspitzen
abgeschnitten. Nach Entfernen der nach außen geöffneten
Blätter werden die Schößlingsspitzen auf etwa 1 cm
Länge zurechtgeschnitten. Die Schößlingsspitzenteile
werden dann 5 min lang in 0,1 gew.-%iges Osvan, danach
5 min in 6 gew.-%iges Pulux und schließlich 2 bis 3 s
in 70 gew.-%iges Ethanol eingetaucht.
Danach werden die Schößlingsspitzenteile zweimal mit
sterilisiertem Wasser gewaschen. Nun werden die Schößlingsspitzen
mit einem (2) Stück(en) Blattprimordium
(Blattprimordien) herausgepflückt, um Schnittstücke zum
Pflanzen bereitzustellen.
Den verwendeten Testnährmedien Murashige-Skoog und
Gamborg B5 werden jeweils 30 g/l (3%) Saccharose zugesetzt.
Danach wird jedes Nährmedium durch Zusatz von
0,1N KOH und 0,1N HCl auf einen pH-Wert von 5,7 bis
5,8 eingestellt. Etwa 25 ml jeden Nährmediums werden
in 27×200 mm große Teströhrchen pipettiert. Danach werden
die Teströhrchen 15 min lang in einem Autoklaven bei
120°C und einem Druck von 117,7 kPa sterilisiert. Schließlich
werden als Wachstumshormonzusatz Lösungen von
α-Naphthalinessigsäure (NAA) und 6-Benzylaminopurin
(BAP) in die Teströhrchen vor der pH-Einstellung eingetragen.
In der Tabelle bedeuten die Zahlen 1 bis 20 die Nährmediumzahlen.
Jedes Nährmedium wird nun im Rahmen einer Rotations-
oder Rollkultivierung bei einer Umdrehungszahl von 0,5
bis 10 Umdrehungen pro Minute 24 h lang unter einer
Bestrahlungsintensität von etwa 2000 bis 10 000 Lux und
bei einer Temperatur von 15 bis 30°C getestet. Nach etwa
2 Monaten erhält man die Schößlingsprimordien in B5-18
(BAP 2 mg/1, NAA 0,2 mg/l) und B5-19 (BAP 2 mg/l,
NAA 2 mg/l) der Nährmediumzahlen in Tabelle 1 bei einer
Bestrahlungsintensität von etwa 10 000 Lux, bei einer
Temperatur von 22±2°C und bei einer Umdrehungszahl von
2 Umdrehungen pro Minute.
Danach werden die Nährmedien gemäß Tabelle 2 jeweils
unter Verwendung von 2% bzw. 3% Saccharose getestet.
Es zeigt sich, daß die Nährmediumzahl mit der optimalen
Zusammensetzung von Gamborg B5-Nährmedium B5-18 (BAP
2 mg/l und NAA 0,2 mg/l) in 3% Saccharose und B5-186
(BAP 2 mg/l und NAA 0,6 mg/l) in 2% Saccharose waren.
Die künstlich erzeugten Schößlingsprimordien werden zur
Vermehrung in der geschilderten Weise unter Zellteilung
in die optimalen neuen Nährmedien der angegebenen Zusammensetzung
verpflanzt.
Zur Gewinnung von Sämlingen aus den Schößlingsprimordien
werden die stationären Kulturen von Gamborg B5, in dem
0,9 Gew.-% Agar, 2 Gew.-% Saccharose und eine durch
Hormonzugabe eingestellte Lösung (vgl. Tabelle 1) zugesetzt
wurden, getestet. Hierbei zeigte es sich, daß
die Nährmediumzahl einer optimalen Zusammensetzung
B5-6 (BAP 0,02 mg/l und NAA 0 mg/l) war. Dieses
Schößlingsprimordium bildet innerhalb von einer oder
2 Woche(n) an seinem harten Ende ein grünes Blattprimordium
und wächst dann zu einem kleinen Sproßpflanzenkörper.
Während die Pflanzenkörper in Teilchen sterilisierten
Vermikulits gezogen werden, werden sie nach
und nach an die Umgebung auf dem Feld akklimatisiert.
Letztlich werden sie auf eine Feldkultur überführt.
In den Schößlingsprimordien und ihren Sämlingspflanzen
sind bereits süße Glykoside, wie Steviosid und Rebaudiosid A
enthalten. Diese Tatsache wird durch
Extraktion derselben mit Methanol und anschließende
dünnschichtchromatographische Analyse bestätigt.
Der Vermehrungsgrad der Schößlingsprimordien beträgt
zahlenmäßig das Vierfache nach 7 Tagen.
Erfindungsgemäß erhält man über lange Zeit hinweg eine
starke Selbstunverträglichkeit aufweisende Stevia in
genetisch stabiler Form durch vegetative Fortpflanzung
des Schößlingsprimordiums. Ferner läßt sich Stevia
in großer Menge durch das Schößlingsprimordium vermehren.
Durch die Kulturzellen können wertvolle süße
Substanzen in großer Menge erzeugt werden.
Erfindungsgemäß kann man virusfreie Sämlinge ziehen und
diese über lange Zeit hinweg erhalten. Folglich läßt sich
durch Erzeugen einer Pflanze, die morphologisch homogen
ist und konstante Inhaltsstoffe enthält, die Arbeit für
die Kultivierung wirtschaftlich gestalten. Die Kultivierungszeit
kann bei drastisch verminderten Kosten verkürzt
werden.
Erfindungsgemäß erhält man nicht nur süße Substanzen in
großer Menge, man kann die Erfindung auch auf zahlreiche
perennierende Pflanzen mit Selbstunverträglichkeit anwenden.
Claims (1)
- Verfahren zur Erzeugung eines süßen Glykosids durch Züchtung von Stevia-Schößlingsspitzen, wobei man von einem Stiel von Stevia (Stevia rebaudiana BERTONI) den Schößlingsspitzenteil abpflückt, den gewonnenen Schößlingsspitzenteil in ein künstliches Nährmedium, enthaltend ein Gemisch anorganischer Salze in Form des B5-Mediums nach Gamborg oder des Mediums nach Murashige-Skoog und 6-Benzylaminopurin und/oder a-Naphthalinessigsäure als Pflanzenwachstumshormon, verpflanzt und die Temperatur bei 15°C bis 30°C hält, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Umdrehungszahl von 0,5-10 min-1 sowie bei einer Bestrahlungsintensität von 2000-10 000 Lux eine Rotationskultur durchführt und das Schößlingsprimordium zur Gewinnung des süßen Glykosids in an sich bekannter Weise vermehrt.
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---|---|---|---|
JP21606784A JPS6196994A (ja) | 1984-10-17 | 1984-10-17 | ステビアの茎頂培養による甘味配糖体の生産方法 |
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1984
- 1984-10-17 JP JP21606784A patent/JPS6196994A/ja active Pending
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1985
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