DE3520727A1

DE3520727A1 - Verfahren zur erzeugung suesser glykoside durch zuechtung von stevia-schoesslingsspitzen

Info

Publication number: DE3520727A1
Application number: DE19853520727
Authority: DE
Inventors: Naomi Fujioka; Hiroshi Koda; Hideki Miyagawa; Ryuso Tanaka; Kenji Hiroshima Taniguchi; Kazuo Yamasaki
Original assignee: Hiroshima University NUC
Current assignee: Hiroshima University NUC
Priority date: 1984-10-17
Filing date: 1985-06-10
Publication date: 1986-04-17
Also published as: DE3520727C2; JPS6196994A

Description

Verfahren zur Erzeugung süßer Glykoside
durch Züchtung von Stevia-Schößlingsspitzen Verfahren zur Erzeugung süßer Glykoside durch Züchtung von Stevia-Schößlingsspitzen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung süßer Glykoside durch Kultivierung von Stevia-Schößlingsspitzen. Die Erfindung ist insbesondere auf die Kultivierung oder Züchtung von Pflanzengeweben und auf dem Gebiet der Biologie, der Landwirtschaft, des Gartenbaus, der Pharmakologie und dergleichen anwendbar.
Stevia (Stevia rebaudiana BERTONI) gehört zu den perennierenden Kräutern. Ihr Standort ist Paraguay in Südamerika. Stevia enthält hauptsächlich in den Blättern Diterpenglykoside hoher Süße, z. B. Steviosid, Rebaudiosid A und dergleichen. Aufgrund dieser Eigenschaft haben die betreffenden Glykoside zunehmende Beachtung als natürliches Süßungsmittel anstelle von Saccharose gefunden.
Stevia besitzt eine starke Eigenunverträglichkeit, so daß ihre Vermehrung durch Versamung ihren Produktionsgrad vermindert. Aufgrund individueller Unterschiede schwankt darüber hinaus die Ausbeute an süßen Glykosiden von 5 bis 20%. Folglich wäre es zweckmäßig, eine homogene Stevia mit hohem Gehalt an den süßen Glykosiden in großen Mengen bereitzustellen. Solche süße Glykoside lassen sich jedoch nicht durch Züchtung von Pflanzengeweben gewinnen.
Suzuki und Mitarbeiter (vgl. "Agric. Biol. Chem.40't, 819 (1976)) und Nabeta und Mitarbeiter (vgl. "Agric. Biol.
Chem. 40", 2103, (1976)) führten Untersuchungen hinsichtlich der Züchtung von Pflanzengeweben durch und berichten über die Gewinnung von Rutin bzw. Stigmasterin.
Die genannten Autoren vermochten jedoch die süßen Glykoside nicht zu gewinnen.
Bei Züchtungsversuchen zur Gewinnung einer Pflanze mit stabilen Eigenschaften unter Verwendung von Stielen und Schößlingsspitzen ließen sich erfolgreich vermehrte Schößlinge gewinnen (vgl. "Shoyakugaku Zasshi" 38, 12 (1984)). Durch Topfkultivierung bzw. -züchtung der vermehrten Schößlinge konnte man Stevia-Sämlulge mit in etwa stabilem Gehalt an süßen Glykosiden erzeugen.
Da jedoch die vermehrten Schößlinge in den Teströhrchen kräftig wachsen, müssen sie innerhalb eines Monats in neue Kulturmedien verpflanzt werden. Demzufolge erfordert die Kultivierung bzw. Züchtung zur Konservierung relativ große Gefäße. Eine Langzeitlagerung z. B. eine Gefrierlagerung, ist unmöglich.
Bei der mit diesen Schwierigkeiten behafteten Pflanze Stevia erfolgte die künstliche Erzeugung des Schößlings-Primordiums im Hinblick auf die Gewinnung großer Mengen an homogenen Pflanzenkörpern mit hohem Gehalt an süßen Glykosiden. Das Schößlingsprimordium ist hinsichtlich seiner genetischen Formen sehr stabil und besitzt einen hohen Vermehrungsgrad. Das Schößlingsprimordium stellt ferner eine Masse von Spaltungszellen dar, die in einen Pflanzenkörper umgewandelt wird, d. h. es erfolgt rasch eine Umwandlung in einen Sämling. Das Schößlings-Primordium erhält man durch eine Art vegetativer Fortpflanzung anstelle einer Saat. Dieses Verfahren stellt eine neue Technik dar, Mit deren Hilfe kann man die Probleme von bei der Samenfortpflanzung, die durch Samen nur schwierig erreichbar ist, auftretenden Vererbungsphänomenen lösen. Ferner kann man nach dieser Technik virusfreie Sämlinge großziehen und diese über lange Zeit hinweg erhalten.
Die Erfindung besteht nun in einem Verfahren zur Erzeugung süßer Glykoside durch Rotations- oder Rollkultivierung von Schößlingsspitzen der die süßen Glykoside enthaltenden perennierenden Pflanze Stevia (Stevia rebaudiana BERTONI) zur künstlichen Erzeugung des Schößlingsprimodiums und Vermehrung des Schößlingsprimordiums (zur Gewinnung der süßen Glykoside).
Nachdem die Schößlingsspitzen von den Stevia-Stielen beschnitten worden sind, werden sie sterilisiert und mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Danach wird ein Teil der Schößlingsspitzen mit einigen Blättern von Blattprimordien abgenommen und in ein künstliches flüssiges Nährmedium mit einer Mischung anorganischer Salze und mindestens einem Pflanzenwachstumshormon verpflanzt.
Die Schößlingsspitzen werden dann bei einer Bestrahlungsintensität von etwa 2000 bis 10000 Lux, bei einer Temperatur von 15 bis 300C und bei einer Drehzahl von 0,5 bis 10 Umdrehungen pro Minute einer Rotations- oder Rollkultivierung unterworfen. Hierbei erhält man die Schößlingsprimordien. Als Mischung anorganischer Salze in dem künstlichen flüssigen Nährmedium verwendet man zweckmäßigerweise in unveränderter oder schwach modifizierter Form eine Mischung, wie sie in dem Medium Murashige-Skoog, Gamborg B5 und dergleichen enthalten ist.
Als Pflanzenwachstumshormone eignen sich Auxine, wie Indolessigsäure, Naphthalinessigsäure, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure und dergleichen, sowie Cytokinine, wie Kinetin, Benzylaminopurin und dergleichen. Die Kultur der Schößlingsprimordien benötigt starkes Licht. Als starke Lichtquelle eignet sich eine kontinuierliche, stabile Bestrahlungsintensität von 2000 bis 10000 Lux.
Liegt die Bestrahlungsintensität außerhalb des angegebenen Bereichs, wachsen die Schößlingsprimordien nicht gut. Die Kulturtemperatur wird mittels eines Thermostaten vorzugsweise bei 150 bis 300C gehalten. Liegt die Temperatur unterhalb der angegebenen Untergrenze, schreitet die Vermehrung nur langsam voran. Ist die Temperatur zu hoch, wird das Wachstum schlecht und instabil. Eine Rotations- oder Rollkultivierung bzw.
-kultur ist einer stationären Kultivierung oder Kultur vorzuziehen. Besonders gute Ergebnisse erreicht man bei einer langsamen Rotation mit 2,0 Umdrehungen pro Minute.
Ist die Umdrehungszahl zu hoch, werden schlechtere Ergebnisse erhalten. In einer stationären Kultur ist das Wachstum langsam. Darüber hinaus kann man keine Gewebe der Schößlingsprimordien erhalten.
Die erhaltenen Schößlingsprimordien liegen zunächst in Form fahlarüner, kleiner Kügelchen vor. Nach und nach gewinnen diese Kügelchen an Größe und Zahl und bilden dunkelgrüne, kugelige Massen. In dieser Stufe werden die Schößlingsprimordien mittels eines Stabes mit sterilisiertem Nichromdraht in einige Stücke unterteilt. Wenn dann die Stücke in die optimalen neuen Kulturmedien mit der Salzmischunq verpflanzt worden sind, erhält man in ähnlicher Weise neue Schößlingsprimordien. Das erste Schößlinosprimordium erhält man auf künstlichem Wege aus einer Kuppe einer Schößlingsspitze. Die Schößlingsprimordien, die man danach erhält, entstanden aus dem ersten Schößlingsprimordium. Zunächst erfolgt eine Reproduktion von Zellen der äußersten Schicht, die etwas unter dem kuppelartigen Spitzenteil der Schößlingsprimordien liegt, durch Spaltung an einer Achse einer periklinalen Schicht alleine. Danach beginnen sich die Zellen durch Spaltung an verschiedenen Achsen einer antiklinalen Schicht, einer geneigten Schicht, einer periklinalen Schicht und dergleichen zu reproduzieren.
Die durch diese Zellteilung entstandenen Zellen nehmen an Zahl zu. Wenn die Zahl etwa 60 erreicht, erhält man kleine Schößlingsprimordien. Die kleinen Schößlingsprimordien ändern sich in große Schößlingsprimordien, bei denen die äußersten Zellen aus einer Außenschicht und einer Innenschicht bestehen. Sämtliche Schößlings- primordien an den proximalen Seiten haften an kleinen Mengen Kallus.
Die Chr<rosomenzahl der künstlich erzeugten Schößlingsprimordien wurde in hundert Zellen der primären und sixndären Schößlingsprimordien untersucht. Hierbei zeigte es sich, daß die Chromosomenzahl 2n=22 wie bei der ursprünglichen Pflanze konstant ist. Karyotypänderungen lassen sich nicht beobachten.
Die in der geschilderten Weise erhaltenen Schößlingsprimordien lassen sich in großen Mengen vermehren und zur Gewinnung von Sämlingen in ein stationäres Nährmedium verpflanzen. Danach bildet das Schößlingsprimordium ein Blattprimordium an der harten Spitze zum Einwachsen in einen Pflanzenkörper. Schließlich läßt sich der erzeugte Pf lanzenkörper als Feldkultur pflanzen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
Beispiele Zunächst werden von Stevia-Stielen Schößlingsspitzen abgeschnitten. Nach Entfernen der nach außen geöffneten Blätter werden die Schößlingsspitzen auf etwa 1 cm Länqe zurechtgeschnitten. Die Schößlingsspitzenteile werden dann 5 min lang in 0,1 gew.-%iges Osvan, danach 5 min in 6 gew.-%iges Pulux und schließlich 2 bis 3 s in 70 gew.-%iges Ethanol eingetaucht.
Danach werden die Schößlingsspitzenteile zweimal mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Nun werden die Schößlingsspitzen mit einem (2) Stück(en) Blattprimordium (Blattprimordien) herausgepflückt, um Schnittstücke zum Pflanzen bereitzustellen.
Den verwendeten Testnährmedien Murashige-Skoog und Gamborg B5 werden jeweils 30 g/l (3%) Saccharose zugesetzt. Danach wird jedes Nährmedium durch Zusatz von 0,1N KOH und 0,1N HCl auf einen pH-Wert von 5,7 bis 5,8 eingestellt. Etwa 25 ml jeden Nährmediums werden in 27x200 mm große Teströhrchen pipettiert. Danach werden die Teströhrchen 15 min lang in einem Autoklaven bei 1200C und einem Druck von 117,7 kPa sterilisiert. Schließlich werden als Wachstumshormonzusatz Lösungen von Oc-Naphthalinessigsäure (NAA) und 6-Benzylaminopurin (BAP) in die Teströhrchen vor der ph-Einstellung eingetragen.
Tabelle 1

,BAP mgß

0,02 0,2 2,0

NAA m

1 1 6 11 16

0102 2 7 p 12 | 17

0,2 g 3 8 1 13 18

2,0 4 9 14 19

5 5 5 10 j 15 20

l

In der Tabelle bedeuten die Zahlen 1 bis 20 die Nährmediumzahlen.
Jedes Nährmedium wird nun im Rahmen einer Rotations-oder Rollkultivierung bei einer Umdrehungszahl von 0,5 bis 10 Umdrehungen pro Minute 24 h lang unter einer Bestrahlungsintensität von etwa 2000 bis 10000 Lux und bei einer Temperatur von 15 bis 300C getestet. Nach etwa 2 Monaten erhält man die Schößlingsprimordien in B5-18 (BAP 2mg/l, NAA 0,2 mg/l) und B5-19 (BAP 2 mg/l, NAA 2 mg/l) der Nährmediumzahlen in Tabelle 1 bei einer Bestrahlungsintensität von etwa 10000 Lux, bei einer Temperatur von 22f20C und bei einer Umdrehungszahl von 2 Umdrehungen pro Minute.
Danach werden die Nährmedien gemäß Tabelle 2 jeweils unter Verwendung von 2% bzw. 3% Saccharose getestet.
Es zeigt sich, daß die Nährmediumzahl mit der optimalen Zusammensetzung von Gamborg B5-Nährmedium B5-18 (BAP 2 mg/l und NAA 0,2 mg/l) in 3% Saccharose und B5-186 (BAP 2 mg/l und NAA 0,6 mg/l) in 2% Saccharose waren.
Tabelle 2

BAP BAP

\ 0,6 2,0

NAA mg/Q

0,2 1 181 18

I

0,6 182 186

2,0 183 19

Die künstlich erzeugten Schößlingspriinordien werden zur Vermehrung in der geschilderten Weise unter Zellteilung in die optimalen neuen Nährmedien der angegebenen Zusammensetzung verpflanzt.
Zur Gewinnung von Sämlingen aus den Schößlingsprimordien werden die stationären Kulturen von Gamborg B5, in dem 0,9 Gew.-% Agar, 2 Gew.-% Saccharose und eine durch Hormonzugabe eingestellte Lösung (vgl. Tabelle 1) zugesetzt wurden, getestet. Hierbei zeigte es sich, daß die Nährmediumzahl einer optimalen Zusammensetzung B5-6 (BAP 0,02 mg/l und NAA 0 mg/l) war. Dieses Schößlingsprimordium bildet innerhalb von einer oder 2 Woche(n) an seinem harten Ende ein grünes Blattprimordium und wächst dann zu einem kleinen Sproßpflanzenkörper. Während die Pflanzenkörper in Teilchen sterilisierten Vermikulits gezogen werden, werden sie nach und nach an die Umgebung auf dem Feld akklimatisiert.
Letzlich werden sie auf eine Feldkultur überführt.
In den Schößlingsprimordien und ihren Sämlingspflanzen sind bereits süße Glykoside, wie Steviosid, Rebaudiosid A und dergleichen enthalten. Diese Tatsache wird durch Extraktion derselben mit Methanol und anschließende dünnschichtchromatographische Analyse bestätigt.
Der Vermehrungsgrad der Schößlingsprimordien beträgt zahlenmäßig das Vierfache nach 7 Tagen.
Erfindungsgemäß erhält man über lange Zeit hinweg eine starke Selbstunverträglichkeit aufweisende Stevia in genetisch stabiler Form durch vegetative Fortpflanzung des Schößlingsprimordiums. Ferner läßt sich Stevia in großer Menge durch da s S das Schößlingsprimordium vermehren. Durch die Kulturzellen können wertvolle süße Substanzen in großer Menge erzeugt werden.
Erfindungsgemäß kann man virusfreie Sämlinge ziehen und diese über lange Zeit hinweg erhalten. Folglich läßt sich durch Erzeugen einer Pflanze, die morphologisch homogen ist und konstante Inhaltsstoffe enthält, die Arbeit für die Kultivierung wirtschaftlich gestalten. Die Kultivierungszeit kann bei drastisch verminderten Kosten verkürzt werden.
Erfindungsgemäß erhält man nicht nur süße Substanzen in großer Menge, man kann die Erfindung auch auf zahlreiche perennierende Pflanzen mit Selbstunverträglichkeit anwenden.

Claims

PATENTANSPRUCHE 1Verfahren zur Erzeugung eines süßen Glykosids durch Züchtung von Stevia-Schößlingsspitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem Stiel von Stevia (Stevia rebaudiana BERTONI), d. h. einer perennierenden Pflanze mit dem süßen Glykosid, den Schößlingsspitzenteil abpflückt, den gewonnenen Schößlingsspitzenteil in ein künstliches Nährmedium mit einem Gemisch anorganischer Salze und mindestens einem Pflanzenwachstumshormon verpflanzt, bei einer Temperatur von 150 bis 30"C und einer Umdrehungszahl von 0,5 bis 10 Umdrehung(en) pro Minute sowie bei einer Bestrahlungsintensität von 2000 bis 10000 Lux eine Rotations- oder Rollkultur durchführt, um ein Schößlingsprimordium zu induzieren, und schließlich das Schößlingsprimordium zur Gewinnung des süßen Glykosids vermehrt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mischung anorganischer Salze ein B5-Medium von Gamborg und als Pflanzenwachstumshormon 6-Benzylaminopurin und/oder Oc-Naphthalinessigsäure verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Rotations- oder Rollkultur bei einer Temperatur von 22j2 0C, einer Bestrahlungsintensität von 10000 Lux und einer Umdrehungszahl von 2 Umdrehungen pro Minute durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein künstliches Nährmedium mit 2 mg/l Benzylaminopurin, 0,2 mg/l t-Naphthalinessigsäure und 3 Gew.-% Saccharose verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein künstliches Nährmedium mit 2 mg/l 6-Benzylaminopurin, 0,6 mg/l α-Naphtalinessigsäure und 2 Gew.-% Saccharose verwendet.