JPS59132823A - 苗条原基による有用一年生植物の多年生化大量増殖法 - Google Patents

苗条原基による有用一年生植物の多年生化大量増殖法

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JPS59132823A
JPS59132823A JP58006554A JP655483A JPS59132823A JP S59132823 A JPS59132823 A JP S59132823A JP 58006554 A JP58006554 A JP 58006554A JP 655483 A JP655483 A JP 655483A JP S59132823 A JPS59132823 A JP S59132823A
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    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01HNEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques

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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学、農学、園芸学、薬学に応用する植物の
苗条原基(shootpri−mord:i−a )に
より多年生化して有用−化生植物を短時間に犬&1増殖
する方法に関するものである。
苗条原基とは、色素体をもつ細胞が、層化していない直
径50 lim−]−,0001tmの細胞集塊の一次
苗条原基と、二層化している100μm〜5,000μ
mの細胞集塊の二次苗条原基とを云い循環して栄養体増
殖すると細胞の半球状集塊体となるものを意味する。
有用−手生植物の遺伝子型及び染色体型の維持は、現在
、従来から行われて来た有性生殖法と、最近開発された
栄養体生殖法の2通りの手段で行われている。
■ 有性生殖法は、減数分裂と受精を通して種子−を得
て子孫を作っていく方法であるが、有用な遺伝子型及び
染色体型を維持するためには、大量の種子の中から選別
するという膨大な労力を要する。また、二倍体、雑種強
勢等の有用−化生他物については、遺伝子型や染色体型
の維持は殆んど不可能である。
■ 栄養体生殖法は、組織及び細胞培養法による方法で
ある。親植物の茎、茎頂、葉、機端等を滅菌した後、種
物生長ホルモンを添加した人工培地に移植し、これを培
養すると組織片の細胞が脱分化し、カルス(未分化細胞
集塊)が<=られる。このカルスを継代培養すると栄養
体細胞として枝期間にわたって保存することが可能で、
大量に増殖できる。このカルスを再分化用の培地に移植
すると、体細胞れる。この方法は、脱分化およびカルス
増殖までは、どの−年少植物についても比較的容易に可
能であるが、増殖の過程で、染色体突然変異や遺伝子突
然変異を多発し、遺伝子型や染色体型において親と同じ
ものが得られないことがある。一方、−年少植物の種類
によっては、再分化が困難なものが多くあって、また、
再分化が可能なKil、を物の場合でも長期にわたって
培養を行うと、11J分化能が著しく低下する。以」二
の様に、従来の栄養体生殖法では、−年少植物の貸伝子
型や染色体型の多年生植物的な長1υI間にわたる維持
が困か1Fであると共に、また、親と同じ型を+Q分化
さゼることのできない一手生植物も多かった。なお、カ
ルス細胞の場合には、色素体、油体、液胞、同化・貯威
!IN 質の生産が殆ど行われないため、カルス細胞の
培養によっては、桑用、生化学上、農学上等の有用代謝
物質の生産が殆ど不可能であった。
本発明の目的は、上記方法の問題点を解消し、有用−年
少植物の遺伝子型及び染色体型の多年にわたる維持と大
量増殖を行おうとするもので、体細胞によって維持増殖
をはかることにある。即ち、有用−年少植物について、
二倍体、異数体、染色体突然変異景、染色体組換型、突
然変異遺伝子型、雑種強勢、随柚性遺伝子型を多年にわ
たって維持増殖する方法の開発、及びこの維持・増殖の
基本となる本体(苗条原基)における色素体、油体、液
胞、同化・貯蔵物質の物質生産が、薬用、医用等の有用
物質の生産に応用できる方法の開発、及び食用植物と截
置用植物の増産方法の開発を目的とする。
本発明は、有用−手生植物の茎頂部を摘出し、これを人
工培地に移植し、−・定の温度、照明度および回転数に
て回転培養し苗条原基を増殖する。
次に得られた苗条原基を静置培養し苗化する。
本発明は、有用−年少植物、特に二倍体スイカの二倍性
の維持と大量株増殖、雑種強勢トウモロコシ松よびイネ
の雑種強勢の維持と大量株増殖、雑種性アサガオの各種
遺伝子型の維持と大量株増殖、その他の有用−化生薬用
および農園芸植物に広く適用可能である。本発明はまた
、上記スイカ・トウモロコシ、イネ、アサガオの他に、
薬用有用植物のセンブリ、ケシ等、食用有用植物の=+
ムキ、ダイズ幅4、工業用有用植物のアブラナ、ベニバ
ナ等、園芸用有用植物のペチュニア等の一手生植物に適
用可能である。
本発明は、苗条原基によって有用−年少植物を多年生的
に多年にわたって大量に栄養体増殖させる方法を提供す
るものである。この方法の構成を次に詳しく説明する。
有用−年少植物の茎頂を滅菌液で滅菌し、滅菌水で洗浄
した後、実体顕微伝下で茎頂部を摘出し、これを無機塩
類組成物および植物生長ホルモンを・含む人工液体培地
に移植する。15〜30°Cの温度、2..0110〜
9,000ルクスの照明度、および0.5〜1 o r
pmの回転数にて回転培養し、苗条原基を作出する。
苗条原基の作出には、植物によって人工培地の組成およ
び濃度を僅かに変える必要がある。人工培地の無機塩類
X(1成物としては、既知のムラシゲ−スクーグ(Mu
rashige −Skoog ) (以下MSと称す
)、ガンボーク璽Gamborg ) (7,) B5
(以下B5と称す)等の培地に含まれる組成物をそのま
ま若干組成を変えて用いることができる。イ1物生長ホ
ルモンとしては、インドール1’j’1酸、ナフタレン
酢酸、2 、4ニージクロルフエノキシ酔眼等のオーキ
シン類およびカイネチン、ベンジルアミノプリン等の刃
イトカイエン類を用いることができる。培養名潜度は1
5〜3o’cの□(旦ン晶が適当である。これより低い
温度では増殖の進行が遅れ、また温度が高すぎると生長
が悪く安定しなくなる。苗条原基の培養には強い光が必
要であり、連続した2、Q Q O〜9,000ルクス
の照明度が適当である。照明度がこの範囲外では、苗条
原基の生長が悪い。ざらに培養は静置培養よりも回つペ
培養が良く、特に0.5〜1 o rpmのゆるやかな
回転数で良い結果かイIIられる。静IN培養では生長
が遅く苗条jQ基の細織が出来輔く、また回転数が大き
過ぎるとカルスの部分が多くなり、良い結果が得られな
くなる。
本発明の増殖法は特に二倍体スイカ、MIJ 柿強勢ト
ウモロコシ、雑種強勢イネ、雑打1性アザガオに応用す
ると、活発に増η1(する苗条原基が得られる。
第]〜4・表には、培地の組成および濃度を変化させる
ことによって、これらの苗条原基が形成される最適培地
の実施例を示した。1′1“1条原基の増殖が最も速く
、かつ安定しているのは人工培地が、二倍体スイカでは
B5およびベンジルアミノプリン(B A、 P 、 
2.(l ppm )から成るとぎ(第1表)、り1を
種強勢トウモロコシではB5、ナフタレン酢嶋(NAA
、 、 0.25 ppm )おヨびベンジルアミノプ
リン(BAP 、 (1,125ppm )かう成ルト
キ(第2表)、外、穐強勢イネではB5、ナフタレン酢
酸(N A A 、 0.25 ppm )おヨヒペン
シルアミノフリン(B A P 、 0.1.25 p
pm )から成るトキ(第3表)、および雑イ41+性
アーリ−ガオではB5および2./I・−ジクロルフェ
ノキシ酢酸(2,/l□−jつ、 0.25p1)m 
)から成るときがよい(第4・表)。
得られた苗条原基は半球状の集塊であり、例えば二倍体
スイカ(第1図参照)および雑種性アサガオ(第4図)
では淡緑色ないし濃緑色の塊状体で、その基部付近にカ
ルスを伴う。雑種強勢トウモルコシ(第2図)および雑
種強勢イネ(第3図:では淡緑色の塊状体である。これ
らの苗条原基は、現在すでに6〜7ケ月間にわたり活発
に維持および増殖を続けている。
次に、これらの苗条原基を、苗化用の固型培地に移植し
、15〜30°C2約1,000〜4.旧)0ルクスで
静置培養すると、まず微小な茎葉体を多数生じ、その各
々の基部付近からは根を生じて、静置培養後2〜4ケ月
で親植物と同じ遺伝子型、染色体型及び表現型の植物体
が得られる。
苗条原基は、w期には表面がなめらかで、直径5 (1
〜8 (] l1mの隆起(第5 c+ )で、そのr
、’、v成細胞が一様に゛小型の多角細胞であって、細
胞の分裂軸が垂層、部層、斜B/j等の多4ηII的分
裂を行う。この苗条原基(−次苗条原基)は、次第に太
きくな、表皮系と皮層系との二層に分化し、最外層は1
〜2細胞層で、細胞の分裂軸は部層分裂のみがみられ、
それより内側の皮層系は多数のやや大きな細胞の集まり
で、この細胞の内側にはよく発達した;  葉緑体や液
胞、貯蔵物質顆粒が多数みられる。ざらに、この苗条原
基(二次苗条原基)は直径約500μm以上の台形状隆
起物となり、この時期の最外層の表皮系の細胞内には大
きな油体がみられ、内層の内皮系の細胞内では、葉緑体
の数が増加し、液胞も大きく発達している。この時期に
なると−この台形状隆起の周りに数個の前記の一次苗条
原基を新生する。以上の経路で、苗条原基は増え続け、
この1サイクルが約7〜】4日である。従って1つの苗
条原基は約7〜14日のう、ちに数的に約4倍となりつ
つ増殖する。
この苗条原基について遺伝的安定性の検定を行うため、
二倍体スイカ(2n == 88 )について染色体を
観測した結果、調べた苗条原基はすべて染色体数が親植
物と同じ2n=38(第7図)であが可能となった。従
って苗条原ジメ・によると、有用−年少植物の同−遺伝
子型植物または、同一染色体型植物を苗条原基(・こよ
って多年にわたって大量増殖することが可能である。
一方、苗条原書(、Qこは色素体、液胞、油体、貯蔵物
質類tit :デンブン、タンパク等)が盛んにIA、
′産される。従来0)カルス細胞法では、二次代謝産物
はほとんど生産されないとされているのに比べて、苗条
原基を用いると、生きた細胞による有用物質の人工的大
成生産の可能性がある。
ざらに苗条1う1基は約1回10゜5〜2ケ月σ)継代
培養によつで渭伝的及○・染色体的に安定な状態て綿持
し、犬h4に栄τで体増殖できる。
本発明による効果は、苗条原基によって翁用−手生植物
を多年生植物的に多年にわたって栄養(イ:増殖できる
こと、−及び、この苗条原基によって7ffJff−年
少植物において遺伝子型や染色体型を多年にわたって維
持し、その個体群を大はに行ることか可能となることで
ある。さらに、これに加えて生きた培養細胞Gこよって
生産される物質によって、桑用2食用、工業上等の有用
物質生産が可能とな。
る。なお、苗条原基の増殖速度は極めて速く、1個の茎
頂から、年間約412〜452倍の苗条原基が得られ、
大規模に大量生産することができる。
以下、本発明を実施例につき詳細1に説明する。
実施例1(二倍体スイカ) 〔増殖方法〕 二倍体スイカ用の基本培地として、ガンボーグB5の培
」也を改変したものを月1いた。糸[I成を第5表に示
ず。
/ 第    5    表 ガンボーグ B5改変培地 NaH2PO4,−2H20170,110KNO82
,500゜() (NH4)2SO41341゜() 0MgS04・71120     250゜f】Ca
Cl2          113.0FC!−EDT
A                41(+。014
r+sO464B20           ] ;B
3 [lH8BO3:;。0 ZnSO4−7H202,、+I N a2M O04・21120       0゜2
5CuSO4・5 B20        0゜025
GOG1゜・6H200゜025 KI                      o
、75ニコチン1会            ]。(1
チアミン、HCl         01.0ピリ ド
ギシン、HCI          1. i+ミオイ
ノシトール       1.no、0スクロース  
       2 +1.000゜(10ナフイレ/丙
IP1ツ         ()〜(,1,2506−
ベンジルアミノプリン   ()。125−2.OpH
: 5.7−5.8 、表中0印の化合物が改変されたものである。
まず、活発に生長しつつある二倍体スイカの幼苗の茎頂
部約15 anを切りとり、滅菌液で洗浄した後、実体
顕微鏡下でピンセットオよびメスを用いて外側の葉から
内部の葉へ次々とはぎとって、最も内(tt+Iの2〜
3個の微小な葉原基をともなった茎頂部約1〜1.5f
Illを摘出する。この摘出した茎頂部を前記基本培地
中で培養する。培養は、基本培地25 mlを分注した
27闘(φ) X 2 II 1111mσ1試験管内
で行い、これを1[)〜;う(l″C、2,non〜’
+0(1〔lルクスr  0.5〜10 rpmで回転
培養する。培養開始後1ケ月で16−径約’lOmFl
の緑色の苗条原〃、集塊が得られる。以後1ケ月毎Gこ
この1′J′1条原基集塊を直径約5〜1 (l m1
1に分割して、前記σ〕新痢I/r培地6S植え継ぎ増
殖をはかる。
〔H1化方法〕 1+IIi化用培地として、前記基本培地のうちスクロ
ース、ナフタレン酢西jf、 、  6−ベンジル・ア
ミ/プリンを除いて]15に稀釈し、これにスクロース
209/1,6−ベンジルアミノプリン[1,OF+ 
〜[1,5ppm。
、および寒天8 (1/lを加えてpH5,7〜5.8
に調整した固型培地を用いる。この培地を3oomlの
三角フラスコに約8 OTR1分注し、この上に直径が
3〜5間の苗条原基集塊を静置する。培養は15〜30
”C,4,000ルクス(16時間明期、8時間暗期)
の静置条件で行う。この結果、静置培養後2〜3週間で
3〜4mII+の濃緑色の茎葉体が苗条原基集塊1個あ
たり41〜6本生じる。
本方法によれは、−化生植物を多年生的に大量増殖させ
ることができる。二倍体スイカの場合、増殖速度は、1
ケ月に約3倍で、年間312キ5×1o5で、1個体の
親植物から、年間約50万本の幼苗が生産でき、工j;
!4生産が充分可能である。こうして作った苗条は、そ
れぞれ親植物と同じ二倍体であることを@″詔している
ので、二倍体の染色体型、遺伝子型の同質な個体群を工
場的に大量生産できる。
実施例2(雑種強勢トウモロコシ) 〔増殖方法〕 雑種強勢トウモロコシ用の基本培地として、ナフタレン
酢酸力o、 25〜1゜OTn9/lおよび6−ベンジ
ルアミノプリンが0゜125 ’m9/7である以外は
実施例1と同様の改変培地を用いた。実施例1と同様の
方法で、茎頂部約1鴎を摘出し前記の基本培地で培養し
、培養開始後1ケ月で直径20關の緑色の苗条原基集塊
が得られる。以後1ケ月毎にこの苗条原基集塊を直径約
5〜IQmsに分割して前記の新f[な培地に植え継ぎ
増殖させた。
〔苗化方法〕
苗化用培地は実施例1に用いたと同様の固型培□地を用
い、この培地を30ftm7! 三角フラス己に約s 
o mt分注し、この上Gこ直径が約15f111の苗
条原基集塊を静置する。培養は実施例1と同じ条件で行
い、この結果、2〜3週間で1()〜20朋の茎葉体が
生じ、その基部付近からは発根した。
nJI置装養後2ケ月で100〜15’ 0 ”mの幼
苗が、苗条原基集塊1個あたり2〜3本生じる。
雑種強勢トウモロコシの場合、増殖林度は1ケ月に約4
倍で、年間412===iaX1o6で、1個体の親植
物から年間約16011万本の幼苗が生産でき、工場生
産が充分可能である。こうし−6作った苗条は、それぞ
れ親植物と同じtAf、種強勢を示すことを盛認した。
従ってIAI′、種強勢の同質なII(・4体群を工場
的に大量゛生産できる。
実施例3(雑種強勢イネ) 〔増殖方法〕 雑種強勢イネ用の基本培地として、ナフタレン酢酸が0
025〜1゜fl mO/lである以外は実施例1と同
様の改変培地を用いた。実1イ1例1と同様の方法で、
茎頂部約1解を摘出1〜前記の基本培地で培養し、培養
開始後1ケ月で直径約5fi11−(7)淡緑色の苗条
原基集塊が得られる。以後1ケ月毎にこの苗条原基集塊
を直径約3〜41111に分−’+1 シて前記のSダ
j Ii、t’f:な培地に植え継ぎ増殖させた。
〔苗化方法〕
苗化用培地は、実11jJ例1と同様に基本培地のうち
スクロース、ナフタレンH+酊、c〜ベンジルアミノプ
リンを除いてV5に稀釈し、これにスクロース2 fl
 q/l 、寒天RVlを加えてpn5.7〜5.8に
調整した固型培地を用いる。この培地をa o o m
t三角フラスコに約8011R:分注し、この上。
に直径が約3〜5 vaの苗条原基@塊を静置する。
培養は実施例1と同じ条件で行い、この結果、2〜3過
間で5〜10間の茎葉体を生じ、その基部付近からは発
根し、静置培養後2ケ月で約7 (I mmの幼苗が、
苗条原基集塊1個あたり1〜2本生じる。
雑種強勢イネの場合、増殖速度はかなり速く、1ケ月に
約5倍で、年間5  =2.5X1(1で、1個体の親
植物から年間約2億5千万本の幼苗が生産でき、工場生
産が充分可能である。こうして作った苗条は、それぞれ
親植物と同じ雑種強勢を示すことご確認しているので、
帷抑強勢の同質な個体群を工場的Gこ大量生産できる。
実施例4(雑オ:ロ性アサガオ) 雑種t1:アサガオの基本培地として、ナフタレン酢酸
および6−ベンジルアミノプリンの代りに2゜4−ジク
ロルフェノ1キシ酢「1投を0.25〜1. fl r
n9/l用いた以・外は実施例1と同様の改変培地を用
い7こ。
実施例1と同様の方法で、茎頂部約0.5〜l、(Ji
m全摘出し前記の基本培地で培養し、培養開始′f)、
1t月で直径約5鰭の緑色の苗条原基集塊が得られる。
以後]ケ月毎Gここの苗条原フ2〔集#Uを直径約3〜
5mに分1ζ1]シて前記の〃「鮮な培地に横え継き゛
増殖させた。
C??i化方法〕 fj、7 ([Z用培地として、前記基本培地のうちス
クロースJ5よび2.づ1−ジクフルフェノキシ酢酔を
除いてv5に稀釈し、これにスクロース2 (、+ 9
/l 。
6−ベンジルアミノプリンi1.(15〜I)、5 p
J”ηおよび寒天89/ノを加えてp)I5.7〜5゜
8にml整し社実塀Z例1と同従の1Nil 2tす培
地をハ1いる。このJ71地を3 [) (1mlの三
角フラスコに約8 (l m〕分注し、(二の」二ニ!
fj、 行嵜カニ3〜5 mz (b i’7’7 条
jp ;;!、集JJA k ?ン’f’ ??9 L
 T、= トころ、WIFr ft’f培拶後1万間1
−1で1〜211・1の微小ηr孕4第f4・とみなさ
れる突起を生じる。
21Lわj(性アリーカオの場合、増//:1iii用
度は1t月に;l’i:]2倍で、年11″H121,
2−4・X][l”の、+、tii台で、]ヵ、J1(
の親+(□11物から年11シj約4 、 fJ il
 (1本の幼i’+“1が41ミ産でき、工場主21″
が充分可n;しである。
【図面の簡単な説明】
第1図は二倍uくスイカの苗条原基集塊を示TI¥11
(5倍)、 第21ズは雑オ″・R強勢l・ウモロコシσ)苗条原基
集塊を示す図、(2,5倍)、 第;3図は雑種強勢イネの苗条原人1ミ集塊栄示す図、
(6倍)、 第4・図は雑種性アサカ:オの苗茶原53集塊を示す1
>q、(8倍)、 第5図は二倍(イ・スイカの一次i’+’i条凍り、ζ
(中火の隆起している部分)の舟1.′[面を示す(A
 −、(3Fl o倍)、εじ(3図(j二倍体スイカ
の二次苗条jC(基の縦断面を示す図、(84イフ′?
)、 第7F%は二倍f71(スイカの苗条原:% (、こお
ける分?、lJ期間中1すJ染色3ζ2n==33を示
す図である。左(Σ14.5よひ右1″−Jは同一像′
5:焦点を変えて撮影したものであり、この図から33
個の染色体が算定され、三値性かAlfl持されている
ことがわかる。 尚、各図は生物の形態に関する図面に代る写真であって
、第5〜7図は顕微鏡写真である。 第1図 第2図 X2.5 第:3 K 第4図 8 第5図 x300 第6図 Xθ4 ’ニー;’; ・ン ゛・; ノー、:t、I

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1− 有用−化生植物の茎頂部を摘出し、これを無機塩
    類組成物および植物生長ホルモンを含む人工培地に移植
    し、】5〜30’Cの湿度、2.000〜9,000ル
    クスの照明度、および0.5〜]−Orpmの回転iV
    kにて回転培養し苗条原基を増殖し、得られた苗条原基
    を静置培養し苗化し、−化生植物を多年生柄物化して遺
    伝子型および染色体型を多年にわたって維持し得る有用
    −手生植物の苗を短時間に犬1辰に増殖させることを特
    ?1りとする苗条原基による有用−手生イ111物の多
    年生化大量増殖法。 2− 有用−手生植物が二倍体スイカ、釦柚強勢トウモ
    ロコシおよびイネ、および外III性アサガオの何れか
    より選択されたものである特許請求の範囲第1項記載の
    増殖法。 δ、 無機塩類組成物としてガンボーグのB5培地を用
    い植物生長ホルモンとしてナフタレン酢酸、2−4=ジ
    クロルフ工ノキシ酢1食、カイネチンおよびベンジルア
    ミノプリンから成る群から選ばれる化合物を用いる特許
    請求の範U++第1項または第2項記載の増殖法。 侃 静置培養を15〜30°Cの湿度および1.000
    −44,000ルクスの照明度で行う特許請求の範囲第
    1〜8J連のいずれか]項記載の増殖法。
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