CN101543185A - 色素万寿菊的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
一种生物技术领域的色素万寿菊的组织培养方法，包括如下步骤：取万寿菊叶片，灭菌后诱导；诱导使用的分化培养基具体为MS基本培养基，添加剂为：3mg/L的6－BA，3mg/L的IAA，30g/L的蔗糖，6g/L的植物凝胶；培养条件为：温度23～27℃，光照时间10h～20h/d，光照强度2000～3000lux，不定芽的诱导时间为9～14d；将分化出的不定芽继代培养，诱导芽生长培养基与步骤一中的分化培养基相同，培养条件为：温度23～27℃，光照时间10h～20h/d，光照强度2000～3000lux，培养时间为30～50d；将分化伸长的芽进行生根培养，生根培养时间为30d，得到万寿菊再生植株。本发明的方法取材方便、可高频率地诱导出大量的万寿菊再生芽，再生植株成活率高，再生植株变异小和遗传稳定性较高。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的组织培养方法，具体是一种色素万寿菊的组织培养方法。
背景技术
万寿菊(Tagetes erecta)又名臭芙蓉，为菊科万寿菊属的一种，原产墨西哥及美洲地区，现世界各地均有栽培。按用途可将其分为观赏万寿菊和色素万寿菊，色素万寿菊花瓣内叶黄素含量极其丰富，是提取天然叶黄素的理想原料，叶黄素可广泛用于食品着色、医药及禽类饲料中，具有很高的经济价值。
近年来，国外万寿菊品种选育方面取得了长足的进展，而我国F1代万寿菊育种尚处于起步阶段，一些涉及F1制种技术如播种技术、育苗技术、亲本识别方法、授粉方法、父本和母本播种比例、种子采收时间及栽培范围等虽已有报道，但培育出与国外品种有竞争力的自主产权的品种还需时日，而通过常规的繁殖方法如种子繁殖，则后代易发生变异；插扦繁殖则耗时长，短时期无论法获得大量种苗。我国被认为是目前世界上最大的万寿菊潜在消费市场，对色素万寿菊种子的需求量大，除了加强制种技术的研制外，寻找及建立一种色素万寿菊的快速繁殖方法已成当务之急，采用组织培养法对具有优良品种特性的万寿菊进行快速繁殖，在短期内生产出大量整齐均匀的健壮种苗，建立一个高效的植株再生体系，有利于种质资源的保存和优良品种的推广，同时也为基因工程育种奠定了基础。
经对现有技术的文献检索发现，
邹永梅、黄雪芳在《江苏林业科技》2005年32卷6期17～19页发表了题为“万寿菊的组织培养和瓶苗开花研究”；苏福才、钱国珍在《内蒙古农牧业学院学报》1999年20卷3期第108～111页发表了“万寿菊茎段组织培养”。但两学者所选取的外植体均为茎段，其取材范围较窄；
Marilyn M.Belarmino等在《.Japan.J.Breed》(日本育种杂志)1992年42期第835～841页发表了“Callus induction and plant regeneration inAfrican Marigold(Tagetes erecta L.)”(非洲万寿菊愈伤诱导与植物再生)一文，该学者利用万寿菊胚轴、叶片为外植体诱导植株再生，但利用叶片建立万寿菊再生体系未能成功；
Pratibha Misra等在《In Vitro Cellular & Developmental Biology》(离体分子发育生物学)2001年10期466发表了“Direct differentiation of shootbuds in leaf segments of white marigold(Tagetes erecta L).”(白花万寿菊叶片直接诱导芽分化)一文，文中提到，利用白花万寿菊叶片为外植体诱导了植株再生，但可能由于品种基因型的差异，从预备试验结果看，其结果不适宜用于F1色素万寿菊植株再生；
Pablo E，Vanegas等在《Plant Cell Ti ssue and Organ Culture》(植物细胞组织与器官培养)2002年69期第279～283页发表了“Plant regenerationvia organogenesis in marigold”(通过器官发生万寿菊实现植株再生)一文，文中提到，利用万寿菊叶片为外植体建立了再生体系，但是存在着不定芽诱导率低的缺点(69.3％)，同时还发现在其条件下诱导植株再生，不定芽还存在着玻璃化的倾向，不能发育成正常苗。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种色素万寿菊的组织培养方法。本发明的方法取材方便、可提供的材料充足，可高频率地诱导出大量的万寿菊再生芽，再生植株成活率高，最高可达100％，而且具有再生植株变异小和遗传稳定性较高的优点；本发明为扩大万寿菊的繁殖系数、种质保存及其遗传转化奠定了良好的基础。
本发明是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤：
步骤一，取万寿菊叶片，灭菌后诱导；诱导使用的分化培养基具体为MS基本培养基，添加剂为：3mg/L的6-BA，3mg/L的IAA，30g/L的蔗糖，6g/L的植物凝胶；培养条件为：温度23～27℃，光照时间10h～20h/d，光照强度2000～3000lux，不定芽的诱导时间为9～14d；
步骤二，将步骤一诱导得到的不定芽进行继代培养，使用的生长培养基与步骤一中的分化培养基相同，培养条件为：温度23～27℃，光照时间10h～20h/d，光照强度2000～3000lux，培养时间为30～50d；
步骤三，将步骤二得到的分化伸长的芽进行生根培养，生根培养时间为30d，得到万寿菊再生植株。
步骤一中，所述灭菌具体为：取生长45～60d万寿菊植株的幼嫩叶片，用自来水冲洗1min，在超净台上用体积分数为75％的酒精浸泡5～8s，用无菌水冲洗3次，再用质量分数为1.0％的次氯酸钠溶液浸泡10s，再经无菌水冲洗5次，将消毒后的叶片切成0.5cm×0.5cm的小块。
步骤一中，所述培养条件具体为，光照时间为16h/d，光照强度为2500lux，诱导时间为13d。
步骤二中，所述培养条件具体为，光照时间为16h/d，光照强度为2500lux，诱导时间为40d。
本发明提供了一种万寿菊组织培养方法，该方法是以叶片作为外植体，通过器官发生途径得到再生植株。
本发明的方法取材方便、可提供的材料充足，可高频率地诱导出大量的万寿菊再生芽，再生植株成活率高，最高可达100％，而且具有再生植株变异小和遗传稳定性较高的优点；本发明为扩大万寿菊的繁殖系数、种质保存及其遗传转化奠定了良好的基础。
附图说明
图1为叶片外植体上诱导产生的不定芽照片图；
图2为不定芽伸长30d后的植株照片图；
图3为万寿菊再生苗照片图。
具体实施方式
以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
本实施例的万寿菊的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤一，取生长45～60d的万寿菊植株(万寿菊F1代种子)的幼嫩叶片，用自来水冲洗1min，在超净工作台上用体积分数为75％的酒精浸泡5～8s，用无菌水冲洗3次，再用质量分数为1.0％的次氯酸钠溶液浸泡10s，再经无菌水冲洗5次。将消毒后的叶片切成0.5cm×0.5cm的小块。之后进行诱导培养，诱导使用的分化培养基具体为MS基本培养基，添加剂为：3mg/L的6-BA，3mg/L的IAA，30g/L的蔗糖，6g/L的植物凝胶；培养条件为：温度23～27℃，光照时间为16h/d，光照强度为2500lux，诱导时间为13d，诱导效果见图1。其中，MS基本培养基的配制可参照Murashige T，Skoog F.在《Physiol.Plant》(植物生理)1962年15期473-497页发表的《A revised medium for rapid grouth and bioassayswith tobaccotissue cultures》(一种用于烟草组织培养中快速生长和生物测定的优化培养基)一文，其配制方法相同。
步骤二中，在超净台上将步骤一中诱导出的不定芽移至植物组织培养瓶中进行继代培养，使用的生长培养基与步骤一中的分化培养基相同，培养条件为：温度23～27℃，光照时间为16h/d，光照强度为2500lux，诱导时间为40d，效果见图2。
步骤三中，在超净台上将分化伸长的，已经长出真叶，高约3cm植株转移至生根培养基上，即MS基本培养基。所述培养条件具体为，光照时间为16h/d，光照强度为2500lux，30d后发育成完整植株，效果见图3。
对步骤三中经生根培养后得到的再生苗进行炼苗，待再生苗长出10～15片真叶时，将其与空气接触，23～27℃下生长5～10d；然后用流水洗去再生苗根上的培养基，将其移栽到消毒栽培基质(蛭石∶草炭＝1∶1，体积比)中培养，得到万寿菊再生植株，成活率达100％。
Claims (4)
1、一种色素万寿菊的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取万寿菊叶片，灭菌后诱导；诱导使用的分化培养基具体为MS基本培养基，添加剂为：3mg/L的6-BA，3mg/L的IAA，30g/L的蔗糖，6g/L的植物凝胶；培养条件为：温度23～27℃，光照时间10h～20h/d，光照强度2000～30001ux，不定芽的诱导时间为9～14d；
步骤二，将步骤一诱导得到的不定芽进行继代培养，使用的生长培养基与步骤一中的分化培养基相同，培养条件为：温度23～27℃，光照时间10h～20h/d，光照强度2000～30001ux，培养时间为30～50d；
步骤三，将步骤二得到的分化伸长的芽进行生根培养，生根培养时间为30d，得到万寿菊再生植株。
2、根据权利要求1所述的色素万寿菊的组织培养方法，其特征是，步骤一中，所述灭菌具体为：取生长45～60d万寿菊植株的幼嫩叶片，用自来水冲洗1min，用体积分数为75％的酒精浸泡5～8s，用无菌水冲洗3次，再用质量分数为1.0％的次氯酸钠溶液浸泡10s，再经无菌水冲洗5次，将消毒后的叶片切成0.5cm×0.5cm的小块。
3、根据权利要求1所述的色素万寿菊的组织培养方法，其特征是，步骤一中，所述培养条件具体为，光照时间为16h/d，光照强度为25001ux，诱导时间为13d。
4、根据权利要求1所述的色素万寿菊的组织培养方法，其特征是，步骤二中，所述培养条件具体为，光照时间为16h/d，光照强度为25001ux，诱导时间为40d。
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