BRPI0916292B1

BRPI0916292B1 - Método de regeneração de jatropha via embriogênese somática

Info

Publication number: BRPI0916292B1
Application number: BRPI0916292-5A
Authority: BR
Inventors: Ramesh Anbazhagan Vasudevan; Srinivasan Ramachandran
Original assignee: Tamasek Life Sciences Laboratory Limited
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2009-06-18
Publication date: 2019-09-24
Also published as: EP2315518A1; AU2009274653B2; AP2011005587A0; AU2009274653A1; WO2010011184A1; WO2010011184A8; IL210753A; CN102202495B; EP2315518A4; AP3097A; US8691577B2; IL210753A0; ZA201101408B; BRPI0916292A2; EP2315518B1; CN102202495A; ES2485015T3; US20110117652A1

Abstract

método de regeneração de jatropha via embriogênese somática a presente invenção refere-se ao campo da produção de embriões somáticos, em particular aos métodos para embriogênese somática de jatropha a partir de óvulos. mais especificamente, a presente invenção se refere a um método e composições de meios para embriogênese somática de jatropha curcas a partir de óvulos de botões florais fechados. o método é adequado para transformação de jatropha curcas para a produção de estoque de plantas clonais útil para plantação em grande escala de jatropha curcas e para a produção de haploides, haploides duplos, diploides e mudas livres de doença.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se ao campo da produção de embriões somáticos, particularmente aos métodos para embriogênese somática de Jatropha a partir de óvulos. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um método e composições de meios para a embriogênese somática de Jatropha curcas de óvulos de botões de flores fechados. O método é adequado para transformação de Jatropha curcas, para a produção clonal de estoque de plantas útil para plantação em larga escala de Jatropha curcas e para a produção de haploides, haploides duplos, diploides e mudas livres de doenças.

[002] As publicações e outros materiais usados aqui para ilustrar os antecedentes da invenção ou fornecer detalhes adicionais, respeitando a prática, estão incorporados por referência, e por conveniência estão, respectivamente, agrupados na Bibliografia.

[003] A Jatropha curcas, pertencente à família de Euphorbiaceae, é uma planta de origem latino-americana, amplamente difundida em todas as regiões áridas e semi-áridas tropicais do mundo. A Jatropha é um gênero grande composto por mais de 170 espécies. As espécies mais comuns na Índia são J. curcas, J. glandulifera, J. gossypifolia, J. multifida, J. nana, J. panduraefolia, J. villosa and J. podagrica. J. curcas é uma árvore pequena ou arbusto com casca cinzenta lisa, que exsuda látex, de cor esbranquiçada, aguado, quando cortada. Normalmente, ela cresce entre três e cinco metros de altura, mas pode atingir uma altura de até oito ou dez metros, em condições favoráveis. É uma planta resistente à seca, que vive até 50 anos e que cresce em terras marginais.

[004] J. curcas possuem grandes folhas verdes ou verdes páli

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2/32 das, que são alinhadas de forma alternada a suboposta. As folhas são de três a cinco lóbulos com uma filotaxia em espiral. O pecíolo das flores varia entre 6 a 23 mm de comprimento. As flores são formadas em estações quentes. Várias culturas são formadas desde que o solo tenha umidade boa e as temperaturas sejam elevadas. Em condições onde o crescimento contínuo ocorre, um desequilíbrio de pistilo ou de produção de flores estaminadas resulta em um maior número de flores femininas. As frutas são produzidas no inverno quando o arbusto é desfolhado. Cada inflorescência produz um grupo de aproximadamente 10 ou mais frutos ovoides. Três cocos bivalvulados são formados após as sementes amadurecerem e o exocarpo carnudo secar. As sementes amadurecem quando a cápsula altera de verde para amarelo, depois de dois a quatro meses após a fecundação. As sementes escuras, de casca fina são oblongas e se assemelham a pequenas sementes de mamona. Esta planta possui vários usos medicinais, especialmente em produtos nutracêuticos, farmacêuticos, dermatológicos e produtos para cuidados pessoais. O látex da Jatropha curcas tem propriedades anticancerígenas devido à presença de um alcaloide conhecido como jatrofina. Os rebentos tenros são utilizados para a limpeza dos dentes. O suco das folhas é usado para aplicação externa em hemorróidas. As raízes são utilizadas como um antídoto para mordidas de cobra. As sementes são usadas para fins anti-helmínticos. A casca rende um corante azul escuro utilizado para colorir pano, redes de peixes e linhas de pesca. A maioria das espécies de Jatropha é ornamental, exceto a J. curcas e J. glandulifera que são espécies que produzem óleo. As sementes dessas espécies contêm óleo semisseco, que foi considerado útil para fins medicinais e veterinários.

[005] O teor de óleo é de 25-30% nas sementes e 50-60% no núcleo. O óleo contém 21% de ácidos graxos saturados e 79% de ácidos graxos insaturados. O óleo de Jatropha contém ácido linolênico (C

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18:2) e ácido oléico (C18: 1) que juntos respondem por até 80% da composição do óleo. O ácido palmítico (C16:0) e o ácido esteárico (C18:0) são outros ácidos graxos presentes neste óleo. O óleo não é comestível, no entanto, tem o potencial de fornecer uma alternativa promissora e comercialmente viável ao óleo diesel, pois tem todas as características físico-químicas desejáveis e desempenho como o do diesel. A planta J. curcas ultimamente tem atraído especial atenção como uma planta de energia tropical. O óleo da semente pode ser utilizado como combustível para motor a diesel, pois ele possui características próximas às do óleo diesel fóssil. Além disso, devido à sua natureza não-tóxica e biodegradável, o biodiesel de Jatropha atende aos padrões europeus EN 14214 de um combustível automotivo puro e misturado para motores a diesel. O rendimento de sementes de Jatropha curcas se aproxima de 6-8 MT / ha com óleo ca 37%. Este rendimento poderia produzir o equivalente a 2100-2800 litros de óleo combustível / ha, cuja energia é equivalente a 19.800-26.400 kwh / ha (Gaydou et al., 1982). Devido à sua saponificação muito elevada e sua capacidade para queimar sem emissão de fumaça, o óleo das sementes é comercialmente útil. Por exemplo, é amplamente usado para fazer sabão. As atuais preocupações de segurança econômica, ambiental e energética mundiais forçam mudar de combustíveis fósseis para os biocombustíveis alternativos como o bioetanol e o biodiesel. Como os biocombustíveis podem ser produzidos a partir de um conjunto diversificado de culturas, cada país está adotando uma estratégia que explora as vantagens comparativas que tem em determinadas culturas.

[006] Entre as culturas de biocombustíveis diferentes, o Jatropha curcas é considerado como sendo o melhor candidato para a produção de biocombustíveis por causa dos fatores fisiológicos e naturais. O intenso interesse em óleo de jatropha curcas tem gerado uma enorme

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4/32 pressão para fornecer sementes suficientes que sejam homogêneas e produtivas o suficiente para o plantio. Dessa maneira, há uma necessidade urgente de se propagar árvores de elite em massa. Igualmente urgentes são os métodos para melhorar várias peculiaridades agronômicas de Jatropha curcas. A engenharia genética é reconhecida como um método rápido para a melhoria da cultura. A transformação de plantas é essencialmente um processo de duas etapas, ou seja, a entrega dos genes em uma célula hospedeira, seguido por regeneração das células transformadas em uma planta. Os calos embriogênicos somáticos ou culturas embriogênicas somáticas em suspensão são geralmente considerados como os métodos mais eficientes de regeneração, já que a maioria das células transformadas já adquiriu o potencial embriogênico que irá levá-las a se desenvolver em um embrião somático bastante espontaneamente, um processo similar a um óvulo fertilizado em um embrião zigótico (Dodeman, et al., 1997).

[007] Embriões somáticos são adequados para a transformação via Agrobacterium tuniefaciens (Mathews et al., 1992), microinjeção (Neuhaus et al., 1987) e bombardeio de partículas (Wilde et al., 1992). Além disso, os embriões somáticos ou calos embriogênicos somáticos podem ser criopreservados com nitrogênio líquido, sem perda de viabilidade. Estes são materiais ideais para a manutenção de germoplasma, bem como embriogenicidade celular.

[008] Embriões somáticos são clonais em origem e, portanto, a multiplicação usando embriões somáticos pode ter o potencial para excessivamente altas taxas de crescimento vegetativo e é, portanto, de interesse comercial considerável. A regeneração via embriogênese somática é uma opção atrativa para a cultura de tecidos vegetais. Embriões somáticos supostamente fornecem regenerantes mais estáveis do que brotos. Outra vantagem de usar sistemas de regeneração de embriões somáticos é a sua aparente origem em células únicas. Isso

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5/32 significa que é improvável que os regenerantes sejam de origem quimérica, uma vez que, se um regenerante origina de um aglomerado de células, em vez de uma célula única, os tecidos vegetais podem ser quiméricos ou instáveis e produzir variações.

[009] Para melhorar ainda mais essa cultura, técnicas biotecnológicas como a cultura de tecidos e transformação podem ser utilizadas. Durante mais de duas décadas, vários relatórios foram documentados na regeneração de Jatropha usando vários explantes usando diferentes composições de meios. Estes relatórios incluem a regeneração de plantas a partir de hipocótilos, pecíolos e explantes foliares (Sujatha e Mukta, 1996), explantes epicótilos (Pedido de Patente Chinês No. 200610020449.X), disco foliar (Publicação de Pedido de Patente Indiana n ° 490/MUM/2006), pontas de brotos e explantes nodais (Publicação de Pedido de Patente Europeia No. 1817956;. Datta et al,

2007) , embriogênese somática de calos de folhas (Jha et al, 2007), e transformação a partir de explantes cotiledonares de disco (Li et al,

2008) . Todos os estudos acima focaram na regeneração mediada por calo e meristemática de tecido. A produção de mudas via organogênese ou embriogênese somática a partir de tecidos reprodutivos (anteras ou óvulos) pode levar à produção de haploides, haploides duplos ou diploides, que pode resultar em verdadeiro caráter homozigoto, pagando o caminho do programa de melhoramento de plantas.

[0010] Determinações de ploidia têm sido tradicionalmente feitas pela contagem de cromossomos de pontas de raiz manchadas, mas esse método é laborioso e muitas vezes difícil com espécies que possuem cromossomos pequenos e níveis de ploidia altos e pode levar à germoplasma mal classificados (Brummer et al., 1999). Todos os cromossomos estão localizados no núcleo das células das plantas permitindo que o conteúdo de DNA nuclear seja usado como uma estimativa do nível de ploidia. Nos últimos anos, a citometria de fluxo tornou-se a

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6/32 técnica preferida para estimar a quantidade de DNA nuclear devido à sua facilidade, rapidez e precisão (Rayburn et al., 1989;. HeslopHarrison, 1995). Arumuganathan e Earle (1991a) determinaram o conteúdo de DNA nuclear de mais de 100 espécies de culturas de plantas importantes utilizando citometria de fluxo. Vogel et al. (1999) usaram a citometria de fluxo para determinar o conteúdo de DNA base dos genomas na Triticeae perene. A citometria de fluxo também tem sido utilizada para determinar o nível de ploidia de switchgrass (Panicum virgatum L.) (Hultquist et al, 1997;.. Lu et al, 1998), alfafa (Medicago sativa L.) (Brummer et al, 1999). e espécies de gramado (Arumuganathan et al., 1999). A quantidade de DNA nas células das plantas é expressa em picogramas (pg) bem como um valor C (Bennett & Smith, 1976). A letra C representa uma constante ou a quantidade de DNA em um núcleo haploide ou do genoma; valores 2C representam o conteúdo de DNA de um núcleo diploide somático. Quantidades de DNA em picogramas podem ser convertidas em pares megabase (Mbp), por meio do fator de conversão de 1 pg = 980 Mbp (Bennett et al., 2000).

[0011] Portanto, ainda há uma necessidade na técnica para a regeneração de mudas via embriogênese somática utilizando tecidos reprodutivos (anteras ou óvulos). Apesar destes sucessos comunicados, nesta investigação, relatamos pela primeira vez, a regeneração de alta frequência via embriogênese somática a partir de explantes óvulos isolados a partir de botões florais fechados de Jatropha curcas, que são econômicos e permitem a produção de haploides, haploides duplos ou diploides e mudas livres de doenças.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0012] A presente invenção refere-se ao campo da produção de embriões somáticos, particularmente a métodos para a embriogênese somática de Jatropha a partir de óvulos. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um método e composições de meios para a

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7/32 embriogênese somática de Jatropha curcas a partir de óvulos de botões florais fechados. O método é adequado para transformação de Jatropha curcas, para a produção de estoque clonal de plantas útil para o plantio em grande escala de Jatropha curcas e para a produção de haploides, haploides duplos, diploides e mudas livres de doença. O método também permite a transformação de alta eficiência desta planta.

[0013] Dessa maneira, em um aspecto da presente invenção proporciona um método para produzir embriões somáticos a partir de explantes obtidos a partir de óvulos de Jatropha curcas. De acordo com este aspecto, os explantes são obtidos de plantas mãe saudáveis de Jatropha curcas. Em uma modalidade, o explante óvulo é obtido a partir de um botão de flor fechada. Em outra modalidade, o óvulo é não fertilizado. Em uma modalidade adicional, o explante óvulo é esterilizado. Os explantes óvulos são colocados em um meio sólido de cultura de iniciação compreendendo meio basal MS (Murashige e Skoog, 1962) e contendo uma auxina para indução de calos e embriogênese somática. Em uma modalidade, a auxina é o ácido 2,4diclorofenoxiacético (2,4-D). Em uma modalidade, os explantes óvulos são cultivados no meio de iniciação no escuro para a formação de calos embriogênicos. Em outra modalidade, o calo embriogênico é transferido para meio fresco de iniciação e cultivados à luz para o desenvolvimento embrionário somático e maturação. Os embriões somáticos maduros são transferidos para um meio de germinação sólido com sais básicos de meio MS e contendo auxina e ácido giberélico (GA3). Em uma modalidade, a auxina é o ácido indol-3-butírico (IBA). Em uma modalidade, o meio de germinação também contém um ou mais citocininas. Em outra modalidade, o meio de germinação também contém um ou mais aditivos orgânicos. Em uma modalidade adicional, o meio de germinação também contém uma ou mais citocininas e um ou mais

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8/32 aditivos orgânicos. Em uma modalidade, a citocinina é cinetina (KN), 6-benzilaminopurina (BA), derivados da ureia de citocinina ativa (tal como tidiazuron (TDZ)) ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o aditivo orgânico é caseína hidrolisada (CH), sulfato de adenina (AdSO4) ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade, os embriões somáticos maduros são cultivados em meio de germinação na luz. As mudas germinadas são endurecidas e transferidas para uma estufa. [0014] O método da presente invenção compreende um sistema completo e eficiente que pode ser usado para a regeneração de plantas dos gêneros Jatropha, mais especificamente as espécies Jatropha curcas e seus híbridos artificiais. Numerosos embriões somáticos foram produzidos por este sistema e os regenerantes demonstraram ser completamente normais no desenvolvimento vegetativo e préprodução sexual.

[0015] Como mostrado aqui, as mudas produzidas a partir de óvulos não fertilizados através do método da embriogênese somática são haploides. Plantas diploides, por exemplo, plantas haploides duplas são produzidas por tratamento de calos embriogênicos com um inibidor mitótico, como a colchicina ou orizalina.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0016] As figuras 1A-1F mostram a embriogênese somática de óvulos de Jatropha curcas L. figura1A: iniciação de calos a partir de óvulos, após 20 dias. Figura 1B: a iniciação de calos embriogênicos a partir de óvulos, após 40 dias. Figura 1C: Origem dos embriões somáticos de calos ovulares. Figura 1D: Desenvolvimento de diferentes fases dos embriões somáticos (globular, em forma de coração, torpedo e estágio cotiledonar) a partir de calos ovulares depois de 75 dias. Figura 1E e Figura 1F: Desenvolvimento de embriões somáticos secundários a partir de embriões somáticos primários após 90 dias (tor: embriões somáticos em forma de torpedo; glo: embriões somáticos globulaPetição 870180154564, de 23/11/2018, pág. 14/48

9/32 res).

[0017] Figuras 2A-2F mostram diferentes fases de embriões somáticos a partir de óvulos de Jatropha curcas L. Figura 2A: a iniciação de calos embriogênicos a partir de óvulos. Figura 2B: embrião em estágio globular (glo) e embrião em forma de coração (h). Figura 2C: embrião em forma de torpedo (tor). Figura 2D e Figura 2E: embriões somáticos em forma de cotilédone (cot) (fase precoce e tardia). Figura 2F: embriões somáticos germinados (r: raiz).

[0018] As figuras 3A-3C mostram a análise de ploidia em uma planta regenerada em conformidade com a presente invenção. Figura 3A: Planta produzida aqui. Figura 3B: O conteúdo de DNA da planta de controle diploide determinado por citometria de fluxo mostra 2c. Figura 3C: conteúdo de DNA de plantas da figura 3A por determinados por citometria de fluxo mostra 1c indicando que a planta é haploide. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0019] A presente invenção refere-se ao campo da produção de embriões somáticos, particularmente a métodos para embriogênese somática de Jatropha curcas a partir de óvulos. Mais especificamente, a presente invenção se refere a um método e composições de meios para embriogênese somática de Jatropha curcas a partir de óvulos de botões florais fechados. O método é adequado para transformação de Jatropha curcas, para a produção de estoque clonal de plantas útil para plantio em grande escala de Jatropha curcas e para a produção de haploides, haploides duplos, diploides e mudas livres da doença. O método também permite a transformação de alta eficiência desta planta.

[0020] A propagação por embriogênese somática refere-se a métodos pelos quais os embriões são produzidos in vitro a partir de pequenos pedaços de tecido de planta ou de células individuais. Os embriões são referidos como somáticos porque são derivados de tecido

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10/32 (vegetativo) somático, ao invés do processo sexual. A propagação vegetativa via embriogênese somática tem a capacidade de capturar todos os ganhos genéticos de genótipos altamente desejáveis. Além disso, esses métodos são facilmente passíveis de automação e mecanização. Finalmente, a transformação de plantas de alta eficiência pode ser realizada usando a embriogênese somática para células transformadas regeneradas.

[0021] De acordo com a presente invenção, embriões somáticos são produzidos por induzir a formação de embriões somáticos no tecido do explante. Em uma modalidade, os embriões somáticos são induzidos a partir de explantes obtidos a partir de óvulos de uma planta do gênero Jatropha curcas. Em uma modalidade, os óvulos são obtidos a partir de flores fechadas. Em outra modalidade, os óvulos são não fertilizados. Os explantes óvulos são colocados em um meio sólido aqui referido como meio de iniciação. Em uma modalidade, o meio de iniciação é o meio MS e contém uma auxina. Em uma modalidade, a auxina é 2,4-D. Em uma modalidade, a concentração de 2,4-D no meio de iniciação é de cerca de 2,26 pM a cerca de 9,04 pM, de preferência cerca de 4,52 pM a cerca de 6,78 pM, mais preferivelmente cerca de 6,78 pM. Em uma modalidade, o meio de iniciação também contém uma fonte de carbono. Em uma modalidade, a fonte de carbono é a sacarose em cerca de 2% a cerca de 5%, de preferência cerca de 2% a cerca de 3%, mais preferivelmente cerca de 3%. Em outra modalidade, a fonte de carbono é a glicose em cerca de 2% a cerca de 5%, de preferência cerca de 3% a cerca de 5%. Em uma modalidade adicional, a fonte de carbono é a frutose em cerca de 2% a cerca de 5%, de preferência cerca de 2% a cerca de 3%. Em uma modalidade adicional, a fonte de carbono é maltose em cerca de 2% a cerca de 5%, de preferência cerca de 2% a cerca de 3%. Em outra modalidade, a fonte de carbono é uma mistura de sacarose e glicose, em cerca de 2% a

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11/32 cerca de 3%, de preferência cerca de 2% de sacarose e cerca de 2% a cerca de 3%, de preferência cerca de 2% de glicose. Em uma modalidade adicional, a fonte de carbono é uma mistura de frutose e glicose, em cerca de 1% a cerca de 2%, de preferência cerca de 1% de frutose e cerca de 2% a cerca de 3%, de preferência cerca de 2% de glicose. Em uma modalidade adicional, a fonte de carbono é uma mistura de maltose e glicose, em cerca de 1% a cerca de 2%, de preferência cerca de 1% de maltose e cerca de 2% a cerca de 3%, de preferência cerca de 2% de glicose.

[0022] Em uma modalidade, os explantes óvulos são cultivados no meio de iniciação por cerca de 30 dias a cerca de 60 dias, de preferência cerca de 40 dias. Em uma modalidade, a cultura é mantida em cerca de 25 ° C ± 2 ° C no escuro a 55% a 60% de um idade relativa. O cultivo dos explantes óvulos no meio de iniciação induz a formação de calos embriogênicos.

[0023] Após o cultivo no meio de iniciação no escuro para induzir a formação de calos embriogênicos, o tecido de calos embriogênicos é colocado em meio de iniciação fresco para o desenvolvimento e maturação dos embriões somáticos. Em uma modalidade, o tecido de calos é cultivado em meio de iniciação por cerca de quatro semanas a cerca de seis semanas, de preferência quatro semanas. Em uma modalidade, o tecido de calo embriogênico com desenvolvimento e maturação de embriões somáticos é subcultivado em intervalos de duas semanas. Em uma modalidade, a cultura de tecidos de calos embriogênicos para desenvolver e amadurecer embriões somáticos é mantida em cerca de 25 ° C ± 2 ° C com um fotoperíodo de 16h/8 h (claro / escuro) em 55% a 60% de umidade relativa. Em uma modalidade, o fotoperíodo de luz branca é sob luzes fluorescentes, com uma intensidade luminosa de cerca de 25 pE m^-2s^-1.

[0024] Após o cultivo para a produção de embriões somáticos ma

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12/32 duros, os embriões somáticos são colocados em um meio sólido aqui referido como meio de germinação. Em uma modalidade, os embriões somáticos maduros são em forma de embriões somáticos cotilédones. Em uma modalidade, o meio de germinação é o meio MS e contém uma auxina e GA3. Em uma modalidade, a auxina é IBA. Em uma modalidade, a concentração de IBA no meio de germinação é cerca de

1,23 pM a cerca de 4,92 pM, de preferência cerca de 1,84 pM a cerca de 2,46 pM, mais preferivelmente cerca de 2,46 pM. Em uma modalidade, a concentração de GA3 no meio de germinação é cerca de 0,72 pM a cerca de 5,76 pM, preferivelmente cerca de 1,44 pM a cerca de 2,88 pM, mais preferivelmente cerca de 2,88 pM. Em uma modalidade, o meio de germinação contem ainda uma ou mais citocininas. Em uma modalidade, a citocinina é KN, BA, derivados da ureia de citocinina ativa (tal como TDZ) ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade, a concentração de KN é de cerca de 1,16 pM a cerca de 9,28 pM, de preferência cerca de 2,32 pM a cerca de 4,64 pM, mais preferivelmente cerca de 4,64 pM. Em outra modalidade, a concentração de BA é de cerca de 1,10 pM a cerca de 8,86 pM, de preferência cerca de 2,21 pM a cerca de 4,43 pM, mais preferivelmente cerca de 4,43 pM. Em uma modalidade adicional a concentração de TDZ é de cerca de 1,13 pM a cerca de 9,08 pM, de preferência cerca de 2,27 pM a cerca de 4,54 pM, mais preferivelmente cerca de 4,54 pM. Em uma modalidade adicional, a citocinina é uma mistura de KN e BA em quantidades de cerca de 1,16 pM a cerca de 4,64 pM, preferivelmente 1,16 pM a cerca de 2,32 pM, mais preferivelmente cerca de 2,32 pM KN e cerca de 1,10 pM a cerca de 4.43 pM, preferivelmente 1,10 pM a cerca de 2,21 pM, mais preferivelmente cerca de 2,21 pM BA. Em outra modalidade, a citocinina é uma mistura de BA e TDZ em quantidades de cerca de 1,10 pM a cerca de 4,43 pM, preferivelmente 1,10 pM a cerca de 2,21 pM, mais preferivelmente cerca de 2.21 pM de BA e cerca de 1,13 pM

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13/32 a cerca de 4.54 μΜ, preferivelmente 1,13 μΜ a cerca de 2,27 μΜ, mais preferivelmente cerca de 2,27 μM de TDZ. Em uma modalidade adicional, a citocinina é uma mistura de KN e TDZ em quantidades de cerca de 1,16 μM a cerca de 4,64 μM, preferivelmente 1,16 μM a cerca de 2,32 μM, mais preferivelmente cerca de 2,32 μM KN e cerca de 1,13 μM a cerca de 4,54 μM, preferivelmente 1,13 μM a cerca de 2,27 μM, mais preferivelmente cerca de 2,27 μΜ de TDZ. Em outra modalidade, o meio de germinação contém ainda um ou mais aditivos orgânicos. Em uma modalidade, o aditivo orgânico é CH, ou AdSO4 ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o meio de germinação é suplementado com cerca de 0,25 g a cerca de 1,5 g, de preferência cerca de 0,5 g a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente de cerca de 1,0 g de CH. Em uma modalidade, o meio de germinação é suplementado com cerca de 25 mg a cerca de 200 mg, de preferência cerca de 50 mg a cerca de 100 mg, mais preferivelmente cerca de 100 mg de AdSO4. Em uma modalidade adicional, o meio de germinação é suplementado com uma ou mais citocininas e um ou mais aditivos orgânicos. O meio de germinação também contém uma fonte de carbono. A fonte de carbono no meio de germinação pode ser o mesmo que no meio de iniciação. Em uma modalidade preferida, a fonte de carbono é a sacarose em cerca de 2% a cerca de 5%, de preferência cerca de 2% a cerca de 3%, mais preferivelmente, cerca de 3%.

[0025] Em uma modalidade, os embriões somáticos maduros são cultivados em meio de germinação por cerca de uma semana a cerca de três semanas, de preferência duas semanas. Em uma modalidade, os embriões somáticos maduros são subcultivados em intervalos de duas semanas. Em uma modalidade, a cultura de embriões somáticos maduros é mantida em cerca de 25 ° C ± 2 ° C com um fotoperíodo de 16h/8h (claro / escuro) em 55% a 60% de umidade relativa. Em uma modalidade, o fotoperíodo de luz é sob luzes fluorescentes brancas,

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14/32 com uma intensidade luminosa de cerca de 25 μΕ m^-2s^-1. Os embriões somáticos germinados, ou seja, as mudas são, então, endurecidos. Em uma modalidade, as mudas são endurecidas em solo, areia, musgo, carvão (1:1:2:0.5 v / v / v / v) ou outro solo Houghland sozinho ou em uma combinação de relação definida de solo Houghland e areia ( 2:1 v / v).

[0026] As mudas produzidas a partir de óvulos não fertilizados pelo método de embriogênese somática, aqui descrito, produzem uma planta haploide, como demonstrado por uma análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo.

[0027] Plantas haploides duplas são produzidas por tratamento de calos embriogênicos com um inibidor mitótico. Em uma modalidade, os calos embriogênicos são tratados com o inibidor mitótico por um dia a três dias, de preferência três dias. Em uma modalidade, o inibidor mitótico é a colchicina. Em uma modalidade, o calo embriogênico é tratado com 0,1% a 0,5%, de preferência de 0,5% colchicina. Em outra modalidade, o inibidor mitótico é orizalina. Em uma modalidade, o calo embriogênico é tratado com 0,1% a 0,5%, de preferência 0,5% orizalina. O inibidor mitótico é adicionado ao meio de indução de calo embriogênico, descrito acima, antes da transferência dos calos para o meio de iniciação fresco. As condições de cultura para cultura na presença do inibidor mitótico são as mesmas para a indução embriogênica de calos embriogênicos. Após o tratamento com o inibidor mitótico, o calo embriogênico tratado é colocado em meio de iniciação fresco para o desenvolvimento e maturação de embriões somáticos e cultivados como descrito acima. Os embriões somáticos maduros são colocados no meio de germinação e cultivados como descrito acima para germinar mudas haploides duplas como descrito acima.

[0028] Além disso, a presente invenção fornece sistemas que podem ser utilizadas para a transformação de plantas do gênero Jatro

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15/32 pha curcas. O método de transformação / transfecção não é crítico para a transformação de plantas do gênero Jatropha curcas, vários métodos de transformação ou de transfecção estão atualmente disponíveis. Como novos métodos estão disponíveis para transformar as culturas ou outras células do hospedeiro elas podem ser aplicadas diretamente. Assim, uma grande variedade de métodos foram desenvolvidos para inserir uma sequência de DNA no genoma da célula hospedeira para obter a transcrição e / ou tradução da sequência para efetuar mudanças fenotípicas no organismo. Assim, qualquer método, que provê a eftiva transformação / transfecção pode ser empregado. Veja, por exemplo, Mathews et al. (1992), Neuhaus et al. (1987), Wilde et al. (1992), Patentes dos EUA N°s 7241937, 7273966 e 7291765 e Publicação de Patente dos EUA n°s 2007/0231905 e 2008/0010704. Veja também, Pedido Internacional Publicado N ° WO2005/103271.

[0029] Em uma modalidade, o tecido do explante pode ser cocultivados com uma cepa de Agrobacterium abrigando um construto de DNA contendo um gene ou do ácido nucleico de interesse através de técnicas bem conhecidas na técnica. Tecidos transformados podem ser selecionados utilizando técnicas convencionais conhecidas na técnica. Em outra modalidade, culturas embriogênicas de suspensão líquida podem ser cocultivadas com uma cepa de Agrobacterium abrigando um construto de DNA contendo um gene ou um ácido nucleico de interesse através de técnicas bem conhecidas na técnica. Tecidos transformados podem ser selecionados utilizando técnicas convencionais conhecidas na técnica. Em uma modalidade adicional, o DNA pode ser introduzido no tecido do explante ou de células da cultura embriogênicas em suspensão líquida, utilizando técnicas convencionais, como o bombardeamento de partículas. Tecidos transformados podem ser selecionados utilizando técnicas convencionais conhecidas na técnica. Plantas transformadas ou transgênicas podem ser regeneradas

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16/32 utilizando os métodos descritos neste documento.

[0030] Da mesma forma, o DNA que está inserido (o DNA de interesse) em plantas do gênero Jatropha curcas não é crítico para o processo de transformação. Geralmente, o DNA que é introduzido em uma planta faz parte de um construto. O DNA pode ser um gene de interesse, por exemplo, uma sequência de codificação para uma proteína, ou pode ser uma sequência que é capaz de regular a expressão de um gene, como uma sequência antissenso, uma sequência de supressão de senso, ou uma sequência miRNA. O construto tipicamente inclui regiões reguladoras operativamente ligadas ao lado 5' do DNA de interesse e / ou ao lado 3' do DNA de interesse. Um cassete contendo todos estes elementos também é referido aqui como um cassete de expressão. Os cassetes de expressão podem ainda conter sequências líder 5' no construto do cassete de expressão. As regiões reguladoras (ou seja, promotores, regiões reguladoras da transcrição e regiões de terminação translacional) e / ou o polinucleotídeo codificando uma âncora de sinal pode ser nativo / análogo ao da célula hospedeira ou uns aos outros. Em alternativa, regiões reguladoras e / ou o polinucleotídeo codificando uma âncora de sinal pode ser heteróloga para a célula do hospedeiro ou um para o outro. Vide Patente dos EUA n ° 7205453 e nos Pedidos de Publicação de Patente n^os 2006/0218670 e 2006/0248616. O cassete de expressão pode ainda conter genes marcadores selecionáveis. Vide Patente dos EUA n° 7205453 e nos Pedidos de Publicação de Patente n^os 2006/0218670 e 2006/0248616.

[0031] Geralmente, o cassete de expressão será constituído por um gene marcador selecionável para a seleção de células transformadas. Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Normalmente, o gene marcador selecionável de planta irá codificar a resistência aos antibióticos, com os genes adequados, incluindo pelo menos um conjunto de genes codifi

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17/32 cados para resistência ao antibiótico espectinomicina, o gene estreptomicina fosfotransferase (spt), que codifica para a resistência à estreptomicina, o gene neomicina fosfotransferase (nptll) que codifica resistência à canamicina ou geneticina, o gene higromicina fosfotransferase (hpt ou aphiv) que codifica a resistência a higromicina, genes de acetolactato sintase (als). Alternativamente, o gene marcador de planta seçlecionável irá codificar a resistência a herbicidas, tais como resistência aos herbicidas do tipo sulfonilureia, glufosinato, o glifosato, amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D), incluindo genes que codificam a resistência aos herbicidas que agem para inibir a ação de glutamina sintase, como fosfinotricina ou Basta (por exemplo, o gene bar). Ver, em geral, WO 02/36782, Patente dos EUA No. 7205453 e Pedido de Publicação de Patentes dos EUA N° s 2006/0248616 e 2007/0143880, e essas referências aqui citadas. Esta lista de genes marcadores de seleção não pretende ser uma limitação. Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado.

[0032] Um número de promotores pode ser utilizado na prática da invenção. Os promotores podem ser selecionados com base no resultado desejado. Ou seja, os ácidos nucléicos podem ser combinados com os promotores constitutivos, o tecido preferido, ou outros para a expressão na célula hospedeira de interesse. Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor principal de Rsyn7 (WO 99/48338 e Patentes dos EUA N ° 6072050); o promotor principal de CaMV^35S (Odell et al., 1985); actina de arroz (McElroy et al., 1990); ubiquitina (Christensen e Quail, 1989; Christensen et al., 1992); pEMU (Last et al., 1991); MAS (Velten et al., 1984); promotor ALS (Patente dos EUA No. 5659026), e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, aqueles descritos nas Patentes dos EUA n^os5608149, 5608144, 5604121, 5569597, 5466785, 5399680, 5268463 e 5608142.

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18/32 [0033] Outros promotores incluem promotores indutíveis, particularmente a partir de um promotor indutível por patógeno. Tais promotores incluem os de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidas após a infecção por um patógeno, por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Outros promotores incluem aqueles que são expressos localmente ou perto do local da infecção do patógeno. Em modalidades adicionais, o promotor pode ser um promotor induzido por ferida. Em outras modalidades, os promotores químicos regulados podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. O promotor pode ser um promotor um promotor induzível por substâncias químicas, onde a aplicação do produto químico induz a expressão gênica, ou um promotor químicorepressor, onde a aplicação do produto químico reprime a expressão do gene. Além disso, promotores de tecidos preferidos podem ser utilizados para atingir uma maior expressão de um polinucleotídeo de interesse dentro de um tecido vegetal particular. Cada um desses promotores está descrito nas Patentes dos EUA N^os 6506962, 6575814, 6972349 e 7301069 e Pedidos de Publicação de Patentes dos EUA n^os2007/0061917 e 2007/0143880.

[0034] Onde apropriado, o DNA de interesse pode ser otimizado para a expressão aumentada na planta transformada. Ou seja, as sequências de codificação podem ser sintetizadas usando códons de plantas preferenciais para a expressão melhorada. Métodos estão disponíveis na técnica para a síntese de genes da planta preferida. Veja, por exemplo, Patentes dos EUA N^os 5380831, 5436391 e 7205453 e Pedidos de Publicação de Patentes dos EUA N^os 2006/0218670 e 2006/0248616.

[0035] A prática da presente invenção emprega, salvo indicação em contrário, as técnicas convencionais de química, biologia molecu

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19/32 lar, microbiologia, DNA recombinante, genética, imunologia, biologia celular, cultura celular e biologia de transgênicos, que estão dentro da habilidade da técnica. Ver, por exemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Sambrook e Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, incluindo atualizações periódicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Russell, 1984, Molecular biology of plants: a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Guthrie e Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, New York, 1991); Harlow e Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Methods In Enzymology, Vols. 154 e 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Fire et al., RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge, 2005; Schepers, RNA Interference in Practice, Wil

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20/32 ey-VCH, 2005; Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology, DNA Press, 2003; Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowa, NJ, 2004; Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application, CRC, 2004.

EXEMPLOS [0036] A presente invenção está descrita por referência aos exemplos a seguir, que são oferecidos a título de ilustração e não se destinam a limitar a invenção de qualquer maneira. As técnicas padrão conhecidas na técnica ou as técnicas especificamente descritas abaixo foram utilizadas.

EXEMPLO 1

Preparação da planta-mãe [0037] Em certas modalidades, a planta mãe de onde os explantes são colhidos está sujeito à triagem para identificar espécimens saudáveis e / ou tratamento, quer para manter um estado livre de doença ou para tratar uma doença existente. A saúde pode ser determinada pela avaliação das plantas para o seu tamanho, peso, crescimento geral, aparência e ausência de infecção ou contaminação. Plantas J. curcas são comumente infectadas com frogeye (Cercospera spp.), insetos da ordem das Heteroptera e o besouro pulga dourado (espécies podagrica). A descontaminação pode ser feita por pulverização das plantas com agentes como fungicidas, inseticidas, pesticidas ou similares. Fungicidas preferidos para o pré-tratamento da planta-mãe incluem Bavistin ®, Captan ®, Ditane ou combinações dos mesmos, em uma concentração de cerca de 0,05% para 0,2%. Inseticidas preferidos para o pré-tratamento da planta-mãe incluem, mas não estão limitadod a, Rogor ®, Nuvacron, Fastac ®, Ultracid® 40 WP, Tiodane ® em uma concentração de cerca de 0,005% para 0,02%.

EXEMPLO 2

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Esterilização dos botões florais fechados [0038] Os botões florais fechados de Jatropha curcas L. foram coletados de plantas-mãe, em estufa da Temasek Lifesciences Laboratory, 1 Research Link, National University of Singapore, Singapore 117604 (gentilmente cedido pelo Dr. Hong Yon). Os botões florais foram lavados em lavagem cirúrgica clorexidina (duas gotas em 100ml de água esterilizada) por 20 minutos e, posteriormente, esses botões foram esterilizados em solução clorox 10% (alvejante comercial) por quinze minutos, seguido de lavagens com água esterilizada por cinco vezes . Para garantir a completa esterilidade, estes botões foram lavados novamente com álcool 70% durante três minutos e posteriormente lavados com água esterilizada por três vezes antes da dissecação para isolar o óvulo como explantes.

EXEMPLO 3

Meios e Hormônios [0039] O meio de iniciação foi o meio basal MS (sais minerais e vitaminas de MS) suplementado com sacarose (3%) como fonte de carbono e incluiu fitoagar (0,8%) como agente gelificante. O pH do meio foi de 5,8. O meio de germinação foi meio basal MS suplementado com sacarose (3%) como fonte de carbono e incluiu fitogel (0,25%) como agente gelificante. O pH do meio foi de 5,8. Os meios foram distribuídos em placas de Petri esterilizadas (90 X 15 mm de tamanho, de plástico de policarbonato, Canadá). Os produtos químicos usados para os meios de preparação foram de grau analítico (Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands e Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, EUA).

[0040] Diferentes hormônios foram adicionados aos meios para o desenvolvimento do método de acordo com a presente invenção. Em geral, os meios continham uma concentração reduzida de fitohormônios. Os hormônios que foram testados nos meios foram fitohormônios que irão afetar o crescimento da maneira desejada durante

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22/32 as diferentes fases da cultura de tecidos. Exemplos de fito-hormônios que foram testados incluem auxina natural ou sintética (2,4-D, ácido indol-3-acético (IAA), IBA), citocinina (BA, KN), GA3, ou derivados de ureia de citocinina ativa (tal como TDZ). Os hormônios foram testados separadamente ou em combinação. Para indução de calos embriogênicos, apenas 2,4-D (2,26, 4,52, 6,78 e 9,02 μΜ) foram efetivos. Outras auxinas IAA (0,71, 1,42, 2,85, 5,70 μΜ), IBA (0,615, 1,23, 2,46, 4,92 μΜ) e combinação de 2,4-D (2,26, 4,52, 6,78 e 9.02 μΜ) ou IAA (0,71, 1,42, 2,85, 5,70 μΜ) ou IBA (0,615, 1,23, 2,46, 4,92 μΜ) com citocininas, BA (1,10, 2,20, 4,43 μΜ), KN (1,16, 2,32, 4,64 μΜ) e TDZ (1,13, 2,27, 4,54 μΜ) individualmente e em combinações induziram somente calos não-embriogênicos.

[0041] Para germinação de embriões somáticos, a combinação de IBA (1,23, 1,84, 2,46, 4,92 μΜ) e GA3 (0,72, 1,44, 2,88, 5,76 μΜ) foi efetiva. IAA (1,42, 2,85, 5,7, 8,56 μΜ) e NAA (1,34, 2,68, 5,37, 8,04 μΜ) em combinação com GA3 (0,72, 1,44, 2,88, 5,76 μΜ) foi tentado mas não foi efetivo. A adição de citocininas (1,16, 2,32, 4,64, 9,28, μΜ de KN; 1,10, 2,21, 4,43, 8,86 μΜ de BA; 1,13, 2,27, 4,54, 9,08 μΜ de TDZ; 1,16, 2,32, 4,64 μΜ de KN e 1,10, 2,21, 4,43 μΜ de BA; 1,10, 2,21, 4,43 μΜ de BA e 1,13, 2,27, 4,54 μΜ de TDZ; 1,16, 2,32, 4,64 μΜ de KN e 1,13, 2,27, 4,54 μΜ de TDZ) e/ou aditivos orgânicos (0,25 g, 0,5 g, 1,0 g de CH; 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg de AdSO4; ou combinações dos mesmos) estimularam o crescimento de mudas germinadas.

ΕΧΕΜΡΙΟ 4

Isolamento e cultivo dos explantes de óvulos [0042] Os botões florais esterilizados foram dissecados com auxílio de microscópio estéreo e os óvulos foram isolados e feridos com agulha de dissecção. Os explantes de óvulo feridos foram inoculados em meio de iniciação suplementada com fito-hormônios diferentes e

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23/32 incubados no escuro por 40 dias. Os calos induzidos a partir desses óvulos foram transferidos para o meio de iniciação, frescos e cultivados no fotoperíodo de luz (16/8h (claro / escuro), intensidade luminosa de 25 μΕ m^-2s^-1) para o desenvolvimento de embriões somáticos e maturação. O calo com desenvolvimento e maturação de embriões somáticos foram subculturados a cada duas semanas. Os embriões somáticos maduros em forma de cotilédones que se desenvolveram a partir deste calo embriogênico foram transferidos para o meio de germinação para a germinação. Os embriões somáticos germinados foram subcultivados a cada duas semanas. As mudas germinadas foram endurecidas e transferidas para a estufa. Todas as culturas foram mantidas a 25 ° C ± 2 ° C com 55% -60% de umidade relati va. Aproximadamente 12-15 embriões maduros em forma de cotilédones foram desenvolvidos por 100 mg de calos embriogênicos, e 95% dos embriões somáticos foram desenvolvidos.

EXEMPLO 5 Embriogênese somática de Jatropha curcas [0043] Jatropha curcas é considerado o melhor candidato para a produção de biocombustíveis devido ao seu alto teor de óleo e ultimamente tem atraído especial atenção como uma planta de energia tropical. Devido a esses fatores fisiológicos de possuir alto teor de óleo, é importante melhorar a sua produção de biomassa. Por este motivo, técnicas biotecnológicas, como a cultura de tecidos e transformação podem ser utilizadas. Embora haja relatos de calos e regeneração de tecidos meristemáticos (Sujatha e Mukta, 1996; Pedido de Patente Chinesa No. 200610020449; Pedido de Publicação de PAtente Indiana n° 490/MUM/2006; (Pedido de Publicação de Patente Europeia No. 1817956;. Datta et al. 2007) e embriogênese somática de calos de folhas (Jha et al. 2007), não houve nenhum relatório de regeneração via embriogênese somática utilizando órgãos reprodutivos especialmente

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24/32 óvulo não fertilizado como explantes em J. curcas. No presente estudo, nós padronizamos a regeneração através da embriogênese somática utilizando óvulos não fertilizados de J. curcas.

[0044] A indução de calos ocorreu em meio MS contendo diferentes auxinas e citocininas tanto individualmente como em combinações. Entre os diferentes tipos de meios, o meio MS contendo 2,4-D foi eficaz na indução de calos embriogênicos (figuras 1A, 1B e figura 2A mostram usando 6,78 μΜ de 2,4-D) e desenvolvimento de embriões somáticos (em forma globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar) (figuras 1C e 1 D, figuras 2A-2E). O uso de outros fito-hormônios não resultou na indução de calos embriogênicos. A cultura contínua de embriões somáticos em meio MS contendo 2,4-D resultou na formação de embriões somáticos anormais sem germinação.

[0045] É de notar que a luz desempenhou um papel importante na indução de calos embriogênicos. A cultura de óvulos em meio MS suplementado com 2,4-D, no escuro, induziu calos embriogênicos. No entanto, a cultura de óvulos em meio MS suplementado com 2,4-D na presença de luz não resultou na indução de calos embriogênicos. Da mesma forma, os embriões somáticos se desenvolveram apenas em condições de luz e não no escuro.

[0046] A germinação de embriões somáticos ocorreu em meio MS suplementado com GA3 e IBA. A adição de citocininas (KN, BA, TDZ, KN / BA, KN / TDZ e BA / TDZ) e aditivos orgânicos (CH, AdSO4 e CH/AdSO4) estimularam o crescimento de mudas germinadas. Foi observado também que, juntamente com embriões somáticos primários, embriões somáticos secundários também ocorreram (figuras 1E e 1F). [0047] Em contraste, Jha et al. (2007) relataram que, calos embriogênicos em explantes de folhas de J. curcas foram induzidos em meio MS suplementado com KN (9,3 μΜ) e embriões somáticos foram desenvolvidas em meio MS suplementado com KN (2,3 μM) e IBA (1,0

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25/32 μΜ). Jha et al. (2007) também relataram que, a adição de sulfato de adenina (13,6 μM) estimulou o processo de desenvolvimento de embriões somáticos. No presente estudo, a adição de AdSO4 em meio de indução de calo resultou na indução de calo compacto esverdeado, que se torna não embriogênico. Apenas as condições 2,4-D e escura foram essenciais para indução de calos embriogênicos. Resultados semelhantes foram relatados por Kim et al. (2007), em Podophyllum peltatum. Jha et al. (2007) afirmaram que o sistema embriogênico somático em J. curcas leva doze a dezesseis semanas enquanto que no presente estudo, todo o sistema embriogênico somático pode ser concluído em menos de doze semanas, com 95% de germinação de embriões somáticos. Como os embriões somáticos se desenvolvem a partir de óvulos não fertilizados, este sistema pode ser usado para a produção de haploides, haploides duplos ou plantas diploides que são úteis no melhoramento de plantas e na criação de plantas transgênicas.

EXEMPLO 6

Determinação da ploidia das plantas regeneradas [0048] O objetivo deste estudo foi determinar o conteúdo de DNA nuclear de mudas derivadas de embriões somáticos a partir de botões florais não fertilizados de Jatropha curcas L e plantas diploides cultivadas in vivo cujo número cromossômico é 2n = 22.

[0049] Os procedimentos descritos por Arumuganathan e Earle (1991b) e Tuna et al. (2001) foram usados para determinar o conteúdo de DNA por núcleo. Resumidamente, o procedimento consiste na preparação de suspensões de núcleos intactos cortando tecidos vegetais e lise de protoplastos em um tampão de MgSO4 misturado com padrões de DNA e coloração dos núcleos com iodeto de propídio (PI) em uma solução contendo RNase sem DNase. As intensidades de fluorescência dos núcleos coloridos foram estimadas comparando as in

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26/32 tensidades de fluorescência dos núcleos de plantas diploide Jatropha curcas in vivo.

[0050] Aproximadamente 500 mg de tecido fresco, verde, de embriões somáticos derivados de brotos foi retirado e colocado no gelo em uma placa estéril 35 - 10 mm Petri de plástico. Cerca de 500 mg de tecido foliar de mudas de Jatropha curcas foram adicionados como um padrão. O tecido foliar foi cortado em segmentos de 0,25 - 1,0 mm em 1 ml de solução A (24 ml de tampão de MgSO4 (gelada); 25mg ditiotreitol, 500 pl de estoque de iodeto de propídio (5,0 mg de iodeto de propídio em 1,0 ml de água destilada duas vezes); 625pl de estoque de Triton X-100 (1,0 g de Triton X-100 em 10 pl de ddH2O). O homogenato foi filtrado através de uma malha de náilon de 33 pM em um tubo de microcentrífuga e centrifugada (microcentrífuga VS-15, Shelton Scientific, Shelton, CT) em 13000 RPM por 20s. O sobrenadante foi descartado, o sedimento foi ressuspenso em 400pl de solução B (7,5 ml de solução A, 17,5 pl de RNase (sem DNase), que foi incubada por 15 minutos a 37 ° C antes da análise de citometria de fluxo.

[0051] O material preparado foi analisado em um espectrofotômetro de nano gotas. Para a medição, os sinais de área de fluorescência PI (FL2-A) de 20000 núcleos foram coletados pelo software CellQuest (sistema de citometria de Becton Dickinson Immuno, San Jose, CA). Uma configuração de instrumento de portal vivo foi usada empregando parâmetros FL2-A e FSC-H, que permitiu a medida de fluorescência de núcleos a serem utilizados para gerar um histograma de FL2-A. A posição média do pico G0/G1 (núcleos) da amostra e padrão interno foram determinados através da análise dos dados pelo software CellQuest. O conteúdo de DNA médio por planta foi baseado nos 20000 núcleos digitalizados. A fórmula usada para converter valores de fluorescência para o conteúdo de DNA foi: conteúdo de DNA nuclear = (posição média do pico desconhecido) / (posição média conhecida) X

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27/32 conteúdo do padrão conhecido de DNA.

[0052] A análise de citometria de fluxo de folhas jovens de plantas diploide de controle de Jatropha curcas apresentou dois picos X do sinal de amplitude de pulso de DNA correspondente a conteúdo cromossômico 2C e 4C (figura 3B). Em caso de embriões somáticos derivados de mudas (figura 3A), apenas um pico foi observado que foi menor do que o sinal de amplitude de pulso de DNA correspondente a conteúdo cromossômico 2C e aproximadamente metade do conteúdo 2C de DNA (figura 3C). Esta observação única de pico indicou que as plantas a serem haploides, com número de cromossomos n = 11 e os dois picos observados a partir das plantas de controle mostra a planta a ser diploide com número cromossômico 2n = 22. O conteúdo de DNA de folhas de plantas haploides e diploides foi quantificado e observou-se que as folhas das plantas haploide e diploide contêm 254,15 ng / microlitro e 508,3 ng / microlitro, respectivamente. Como as mudas foram regeneradas via embriogênese somática mediada por calos a partir de óvulos isolados do ovário de botões florais não fertilizados de J. curcas, as mudas são haploides, confirmado por citometria de fluxo. Observação similar de produção de haploide do cultivo in vitro de óvulos não polinizados de Cucurbita pepo e beterraba (Beta vulgaris L.) foram relatados (Metwally et al (2004);. Gurel e Gurel (1998); Bossoutrot e Hosemans (1985).; Galatowitsch e Smith (1990); Geyt Van et al (1987)). A produção de plantas haploides a partir de plantas não fertilizadas é o primeiro relatório de jatropha.(Jatropha curcas). EXEMPLO 7

Produção de plantas duplo haploides regeneradas de Jatropha curcas [0053] Calos embriogênicos preparados como descrito no Exemplo 5, que está acima para se transformar em embriões somáticos (após quarenta dias de indução de calo embriogênico) foi tratada com diferentes concentrações de colchicina (0,1-1%) por três dias. As con

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28/32 dições de cultivo (temperatura, fotoperíodo e luz) são idênticas às descritas acima. Após o tratamento com colchicina, os calos embriogênicos tratados foram transferidos para meio de iniciação fresco (meio MS contendo 2,4-D (6,78 μΜ)) e cultivados como descrito no Exemplo 5, para o desenvolvimento de embriões somáticos. Os embriões somáticos maduros foram transferidos para meio de germinação (meio MS enriquecidos com GA3 e AIB) e cultivados como descrito no Exemplo 5, para o desenvolvimento das plântulas.

[0054] Entre os tratamentos diferentes de colchicina, 0,5% de concentração foi mais eficaz na produção de mudas de haploides duplos. Se a concentração aumentou acima de 0,5% o calo tornar-se castanho e morre. Os caracteres morfológicos das plântulas tratadas com colchicina são como haploides duplos. Esta técnica pode ser aplicada ainda para programas de melhoramento de plantas.

[0055] O uso dos termos a e um e o e referências similares no contexto da descrição da invenção, (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretadas abrangendo tanto o singular e o plural, a menos que indicado em contrário neste documento ou em clara contradição com o contexto. Os termos compreendendo, tendo, incluindo e contendo devem ser interpretados como termos em aberto (ou seja, significa incluindo, mas não limitado a,), salvo indicação em contrário. Citações de faixas de valores aqui contidas são simplesmente destinadas a servir como um método abreviado de referir individualmente para cada valor distinto no âmbito da escala, salvo indicação em contrário neste documento e cada valor separado é incorporado a relatório, como se fosse citado individualmente aqui. Por exemplo, se o intervalo de 10-15 é descrito, em seguida, 11, 12, 13 e 14 também são descritos. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, exceto quando indicado de outra forma aqui ou em clara contradição com o contexto. O

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29/32 uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, tal como) provida aqui, é destinada apenas para ilustrar melhor a invenção e não representa uma limitação no âmbito da invenção, a menos que de outra forma reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório deve ser interpretada como indicação de quaisquer elementos não reclamados como essencial para a prática da invenção. [0056] Será apreciado que os métodos e as composições da presente invenção pode ser incorporada na forma de uma variedade de modalidades, apenas algumas das quais são descritas aqui no presente. Modalidades desta invenção estão descritas a seguir, incluindo o melhor modo conhecido para os inventores para a realização da invenção. Variações dessas modalidades podem tornar-se aparentes para aqueles com habilidade comum na técnica pela leitura da descrição acima. Os inventores esperam que artesãos qualificados empreguem tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem para a invenção ser praticada, exceto quando especificamente descritos em contrário neste documento. Assim, a presente invenção inclui todas as modificações e seus equivalentes do assunto citado nas reivindicações em anexo, conforme permitido pela legislação aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis do mesmo é englobada pela invenção salvo indicação em contrário neste documento ou em clara contradição com o contexto.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de regeneração de Jatropha via embriogênese somática, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas:

(a) cultivar um explante de Jatropha em um primeiro meio que compreende meio basal MS e ácido 2,4-diclorofenóxi acético (2,4D) no escuro para induzir a formação de calo embriogênico, sendo que o explante de Jatropha é um óvulo dissecado a partir de um botão floral fechado;

(b) cultivar o calo embriogênico no primeiro meio em um fotoperíodo luz/escuro para induzir o desenvolvimento de embrião somático e maturação; e (c) cultivar embriões somáticos maduros em um segundo meio que compreende meio basal MS, ácido indol-3-butírico (IBA) e ácido giberélico (GA3) em um fotoperíodo luz/escuro para germinar mudas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a duração da cultura é:

de 30 dias a 60 dias no primeiro meio para induzir a formação de calo embriogênico;

de quarto semanas a seis semanas no primeiro meio para desenvolver e maturar embriões somáticos; e de uma semana a três semanas no segundo meio para germinar mudas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a duração da cultura em cada meio é:

de 40 dias no primeiro meio para induzir a formação de calo embriogênico;

de quatro semanas no primeiro meio para desenvolver e amadurecer embriões somáticos; e de duas semanas no segundo meio para germinar mudas.

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4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a duração da cultura é:

de 30 dias a 60 dias no primeiro meio para induzir formação de calo embriogênico;

de quatro semanas a seis semanas no primeiro meio com subcultura a cada duas semanas para desenvolver e amadurecer embriões somáticos; e de uma semana a três semanas no segundo meio com subcultura após duas semanas para germinar mudas.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a duração da cultura em cada meio é:

de 40 dias no primeiro meio para induzir formação de calo embriogênico;

de quatro semanas no primeiro meio com subcultura após duas semanas para desenvolver e amadurecer embriões somáticos; e de duas semanas no segundo meio para germinar mudas.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo meio contém ainda uma ou mais citocininas, um ou mais aditivos orgânicos ou uma mistura ou uma ou mais citocininas e um ou mais aditivos orgânicos.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a citocinina é cinetina (KN), 6-benzilaminopurina (BA), tidiazuron (TDZ) ou misturas das mesmas.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o aditivo orgânico hidrolisado de caseína (CH), sulfato de adenina (AdSÜ4) ou misturas das mesmas.
9. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que:

(a) a citocinina é cinetina (KN), 6-benzilaminopurina (BA), tidiazuron (TDZ) ou misturas dos mesmos, e

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3/6 (b) o aditivo orgânico é hidrolisado de caseína (CH), sulfato de adenina (AdSÜ4) ou misturas dos mesmos.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os meios compreendem:

primeiro meio: meio basal MS e 2,26 pM a 9,04 pM de 2,4D; e segundo meio: meio basal MS, 1,23 pM a 4,92 pM de IBA e 0,72 pM a 5,76 pM de GA3.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os meios compreendem:

primeiro meio: meio basal MS e 6,78 pM de 2,4-D; e segundo meio: meio basal MS, 2,46 pM de IBA e 2,88 pM de GA3.
12. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração da uma ou mais citocininas é:

(a) 1,16 pM a 9,28 pM de KN;

(b) 1,10 pM a 8,86 pM de BA;

(c) 1,13 pM a 9,08 pM de TDZ;

(d) 1,16 pM a 4,64 pM de KN e 1,10 pM a 4,43 pM de BA;

(e) 1,10 pM a 4,43 pM de BA e 1,13 pM a 4,54 pM de TDZ; ou (f) 1,16 pM a 4,64 pM de KN e 1,13 pM a 4,54 pM de TDZ.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a concentração da uma ou mais citocininas é:

(a) 4,64 pM de KN;

(b) 4,43 pM de BA;

(c) 4,54 pM de TDZ;

(d) 2,32 pM de KN e 2,21 pM de BA;

(e) 2,21 pM de BA e 2,27 pM de TDZ; ou (f) 2,32 pM de KN e 2,27 pM de TDZ.

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4/6
14. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a quantidade de aditivo orgânico é:

(a) 0,25 g a 1,0 g de CH;

(b) 25 mg a 200 mg de AdSÜ4; ou (c) 0,25 g a 1,0 g de CH e 25 mg a 200 mg de AdSÜ4.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade de aditivo orgânico é:

(a) 1,0 g de CH;

(b) 100 mg de AdSÜ4; ou (c) 1,0 g de CH e 100 mg de AdSÜ4.
16. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que (a) a concentração da uma ou mais citocininas é:

(i) 1,16 pM a 9,28 pM de KN;

(ii) 1,10 pM a 8,86 pM de BA;

(iii) 1,13 pM a 9,08 pM de TDZ;

(iv) 1,16 pM a 4,64 pM de KN e 1,10 pM a 4,43 pM de BA;

(v) 1,10 pM a 4,43 pM de BA e 1,13 pM a 4,54 pM de TDZ; ou (vi) 1,16 pM a 4,64 pM de KN e 1,13 pM a 4.54 pM de TDZ; e (b) a quantidade de aditivo orgânico é:

(i) 0,25 g a 1,0 g de CH;

(ii) 25 mg a 200 mg de AdSO< ou (iii) 0,25 g a 1,0 g de CH e 25 mg a 200 mg de AdSO4.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que:

(a) a concentração da uma ou mais citocininas é:

(i) 4,64 pM de KN;

(ii) 4,43 pM de BA;

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5/6 (iii) 4,54 μΜ de TDZ;

(iv) 2,32 μΜ de KN e 2,21 μΜ de BA;

(v) 2,21 μM de BA e 12,27 μM de TDZ; ou (vi) 2,32 μM de KN e 2,27 μM de TDZ; e (b) a quantidade de aditivo orgânico é:

(i) 1,0 g de CH;

(ii) 100 mg de AdSÜ4; ou (iii) 1,0 g de CH e 100 mg de AdSÜ4.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que os meios compreendem:

primeiro meio: Meio basal MS e 2,26 μM a 9,04 μM de 2,4D; e segundo meio: Meio basal MS, 1,23 μM a 4,92 μM de IBA e 0,72 μM a 5,76 μM de GA3.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que os meios compreendem:

primeiro meio: Meio basal MS e 6,78 μM de 2,4-D; e segundo meio: Meio basal MS, 2,46 μM de IBA e 2,88 μM de GA3.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que cada meio compreende ainda uma fonte de carbono;

sendo que a fonte de carbono é selecionada do grupo que consiste em sacarose, glicose, frutose, maltose, uma mistura de glicose e sacarose, uma mistura de frutose e glicose e uma mistura de glicose e maltose.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é selecionada do grupo consistindo em 2% a 5% de sacarose, 2% a 5% de glicose, 2% a 5% de frutose, 2% a 5% de maltose, uma mistura de 2% a 3% de sacarose e 2% a 3% de

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6/6 glicose, uma mistura de 1% a 2% de frutose e 2% a 3%, glicose e uma mistura de 1% a 2% de maltose e 2% a 3% de glicose.
22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa (a1) após a etapa (a) e antes da etapa (b) em que a etapa (a1) consiste do tratamento de calo embriogênico com um inibidor mitótico para induzira duplicação de cromossoma;

sendo que o inibidor mitótico é selecionado do grupo que consiste de colchicinas e orizalina.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o calo embriogênico é tratado com 0,1 % a 0,5% do inibidor mitótico.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o calo embriogênico é tratado por um dia a três dias.